JPS62500351A - 微粒子担体からの足場依存性細胞の分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の名称〕 微粒子担体からの足場依存性細胞の分離〔技術分野〕 本発明は細胞生物学の分野であり、陽性に荷電した微粒子担体または他の陽性に 荷電した物質からの足場依存性細胞（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ 　ｃｅｌｌ）の分離方法に関する。

〔背景技術〕

生化学的薬剤の産生に使用されている多くの型の補乳類細胞は足場依存性であり 、すなわち、それらはそれ自身が表面に付着できる場合のみ増殖できる。実にほ とんどの正常哨乳類細胞は足場依存性である。通常、足場依存性細胞は小さ々フ ラスコまたは回転瓶（その長軸が水平に位置されている円筒状容器で、連続的に 回転されている）中で増殖する。しかしながらこれらの容器は一般的には大量工 程には適していない。細胞培養のだめに提案されてきた別の方法には、プラスチ ック袋、積重ねプレート、らせん状薄膜、ガラスピーズ増殖器、人工毛細管およ び微粒子担体などが挙げられる。

微粒子担体と称される顕微鏡的に小さいビーズを用いる考えは、単一のバイオリ アクター中の付着のだめの表面面積の拡大であシ、足場依存性の細胞の増殖がフ ァン　ペッツエル（ｖａｎＷｅｚｅｌ）によシ示唆されている。ファン　（ツツ エルら、＜１９６７）″′均質培養中の微粒子担体上の細胞株および一次細は直 径が約５０から数百ミクロンの陽性に荷電したビーズで、典型的にはジエチルア ミノエチル（ＤＥＡＥ）−置換デキストランから構成されている。

細胞培養のための微粒子担体系は他の大量細胞増殖法を越えるある種の利点を提 供する。その１つは伝統的なおよび新しく進展した他の技術の両方と比較して、 よ勺高い容器容量に対する増殖の面積比（Ｓ／Ｖ　）を得る事ができる事である 。Ｓ／Ｖの増加が達成できると高い容量生産性のための単一装置の均質または擬 均質バッチまたは半バッチ式増殖器が構成できる。すなわち、単純にｐＨおよび ｐＯ２のフィードバック制御を持つ単一の撹拌タンク容器で多量の細胞のための 均質環境を提供し、高価で大きな空間を要する環境制御用のインキュイータ−の 必要性を排除する。また、産生される細胞の単位車力必要とされる操作の総数は 著しく少なくなる。その結果足場依存性細胞の産生において、微粒子担体は以前 の産生法に比較して、資本、場所および労働力を節約できる。

微粒子担体法では、単一制御環境で細胞が増殖するので、環境の連続性という利 点を提供できる。それは、一定で最適な細胞増殖を提供するように制御できる一 組の環境条件下の足場依存性哨乳類細胞の増殖の可能性を提供する。

微粒子担体技術を開発する為には、最初の接種物から細胞または細胞産生物の最 終収穫への規模拡大を通して、完全に微粒子担体上で細胞を連続的に増殖する必 要がある。しかしながら、微粒子担体の使用は、一般的に規模拡大工程の最終の 段階に限られていた。これらの使用における基本的障害は、培養物が続いてのよ り大きな規模のバッチのための接種物として働く場合の必要条件である生きてい る条件下での微粒子担体からの細胞の分離が困難な点であった。

はとんどの足場依存性細胞は自発的疼ビーズからビーズへ移動しないので、移動 を達成するには細胞をビーズから分離し、培地中に分散し、より多数のビーズに よシ提供されるよシ広い表面面積へ再付着させねばならない。ガラス壁またはプ ラスチック培養容器のごとき伝統的物質に付着している細胞の分離のために開発 された技術は微粒子担体上で増殖するほとんどの細胞には不適当である事が明ら かにされたぁ細胞をトリプシン（タンパク質分解性酵素）処理し、続いて機械的 に細胞を表面からはぎ取る一つの標準的技術〔ウェイマウス（Ｗａｙｍｏｕｔｈ ）、インビトロにおけるを椎動物細胞の増殖条件、ケンブリッジ大学出版、Ｎ、 Ｙ・＋ｐＨ８，本明細書に参考文献として含まれている〕では、著しい細胞損傷 および損失を伴う事なく微粒子担体から多くの足場依存性細胞を分離する事はで きない。同様に機械的はぎ取りのみでは（繰シ返し行うピベツテングのごとき） 多くの細胞死を引き起こす。

他の分離技術が試みられたが、はとんど成功しなかった。低周波超音波は細胞を 分離するが、同時にそれを溶解させる。ビーズを溶解し、非付着細胞を残すため の細胞付着デキストラン−基剤微粒子担体のデキストラナーゼ処理は、実際的に はうまく働かず、微粒子担体の再利用ができないという欠点も持っている。

（１９８１）は、足場依存性細胞株ＬＬＣ−ＭＫ２および非足場依存性ＣＨＯ− Ｋｌ細胞株を低カルシウム濃度の培地で増殖させる場合は、新鮮な培地に懸濁し た新鮮な微粒子担体を周期的に添加する単純な手段によ−り連続的な継代培養が 可能である事を示した。低カルシウム濃度は明らかに細胞−微粒子担体結合に影 響し、正常カルシウム濃度では決して起こらないピースからビーズへの移動を可 能にしている。しかしながら、この技術は低カルシウム培地で増殖でき、かつ付 着性が低カルシウム効果に感受性のある細胞株に限定される。ヒトおよびニワト リの線維芽細胞を含む多くの他の細胞株は最適な増殖には高水準のカルシウムを 必要とし、クレスビおよびチリ−の技術は広範囲には利用できない。

他の方法がジョセフ　フィーダー（Ｊｏｓｅｐｈ　Ｆｅａθｒ）およびウィリア ムＲ，トルバー）　（Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｒ，Ｔｏｌｂｅｒｔ）　（サイエンティ フィック　アメリカン、２４８．３６−４３（１９８３））によ、り示唆された 。彼らはもし細胞付着微粒子担体を沈降および会合させる事ができれば、微粒子 担体への細胞の付着が弱くなり、トリプシンによる簡単な処理で微粒子担体がら 細胞が放出される事を発見した。この技術は沈降および会合工程の間新鮮な培地 へ接触できないので、著しい損失を細胞におこすので、一般的には受けいれられ ていないようである。さらに、細胞を会合させると、通常それらを均等に分散さ せるのは困難であるので、規模拡大を困難にしている。

発明の概要 本発明はＤＥＡＴ２＝置換ポリデキストランビーズまたは他の陽性−荷電基質の ごとき陽性−荷電細胞培養微粒子担体から細胞を分離する方法を構成する。付着 した細胞を負っている微粒子担体を酵素トリプシンのごときタンイク質分解性試 薬（類）に比較的高ｐＨ（例えば、ｐＨ約７８から約１０．０、ｐＨ約８．２が 良好である）でさらす。高ｐＨでのタンノ々り質分解性処理の後、細胞を背負っ た微粒子担体を例えばガラスピーズカラムを通過させるなどの緩和なはぎ取りに かける。この処理によ、す、増殖できる状態で９０％以上の細胞が典型的には放 出される。

放出された細胞は別の微粒子担体および新鮮培地を含む新しい培養容器に接種で き、更に増殖させる。細胞増殖および細胞産生物形成はこの分離法によシ害され ない。

図面の簡単な説明 第１図は微粒子担体に付着した細胞の高ｐＨにおけるトリプシン処理により導か れるＦＳ−４細胞の形態的変化を示している。

第２図はトリプシン処理による微粒子担体からの細胞の分離におけるｐＨの効果 を示している。

第３図は微粒子担体培養におけるＦＳ−４細胞増殖の動力学を示している。矢印 は高ｐＨ）！Ｊプシン処理および新しい培養　′液へ接種した時を示している。

第４図はトリプシンのタンパク質分解性活性に対するｐＨの効果を示している。

第５図は選択された直径の微粒子担体上のＦＳ−４細胞の連続的増殖を示してい る。矢印は高ｐＨ）ＩＪプシン処理および新鮮培養液へ接種した時を示している 。

第６図は微粒子担体上のば口（Ｖｅｒｏ）細胞の連続的増殖を示している。

第７図は細胞分離の高ｐＨ）ＩＪプシン処理法を用い、微粒子担体上で連続的に 増殖するは口細胞による小水庖性ロ内炎ウィルス産生を示している。

〔発明を実施する為の最良の形態〕

微粒子担体培養系における細胞の連続的増殖を達成する為には細胞を細胞が国っ ている微粒子担体から新しい裸の微粒子担体へ移動させねばならない。ベトリ皿 または回転瓶のごとき通常の表面上で増殖する細胞はタンパク質分解性試薬（最 も多くはトリプシン）で処理し、続いて機械的に撹乱する事にょシ分離できる。

これらの細胞はその後別の培養の接種物として使用する。しかしながらこの分離 法は微粒子担体からの足場依存性細胞の多くの型の分離には適していない。結果 として微粒子担体培養での増殖細胞は一般的に他の培養への接種へ使用する事が できない。実際、回転瓶で増殖せしめた細胞が微粒子担体培養への接種に必要と される。多くの例において、微粒子担体系において所望の増殖速度および増殖程 度を達成するには、濃い接種濃度が必要とされるので、−回の微粒子担体培養へ の接種には多量の回転瓶が必要である。残念ながら、この事は特に大規模操作に おいての接種物調製を困難な仕事にしている。

本発明は微粒子担体のごとき陽性−荷電基質から細胞を分離する方法を提供する 。本方法は種微粒子担体培養から大量微粒子担体培養への直接接種を可能にし、 その結果、接種のだめの多量の回転瓶培養の調製という骨の折れる仕事を排除す る。それは種−培養から大量生産的培養まで完全に微粒子担体上での（または他 の陽性−荷電基質）足場依存性細胞の連続培養を可能にする。

本発明の方法に従うと、細胞が付着した微粒子担体を正常培養条件から上のｐＨ で（すなわち、ｐＨ約７８から約１０．０で）タンパク質分解性試薬で処理し、 その後微粒子担体から細胞を除去するため微粒子担体と細胞の間にはぎ取る力を 発生させる事によシ、増殖しうる状態で陽性−荷電微粒子担体から細胞を分離す る事ができる。この方法で分離した足場依存性細胞は増殖しうる状態で残ってお り、新鮮な微粒子担体に移して増殖させる。

足場依存性細胞の最初のまたは糟微粒子担体培養は、標準技術によ−り得られる 。例えばレビン（Ｌｅｖｉｎｅ）、Ｄ、Ｗ・、ウォング（Ｗａｎｇ）Ｄ、１．Ｃ ，およびシリ−（’ｒｈｉｌ１７）、　Ｗ、Ｇ−（１９７９）８２１−８４５を 参照されたい。細胞が任意の所望の増殖段階に達した時、本発明の方法によシ種 培養液中の微粒子担体から細胞を分離できる。細胞は通常コンフルエントに達し た時分離される。

分離過程の準備のため、細胞を付着した微粒子担体を増殖培地から分離する。任 意の適した分離方法が使用できる。例えば、き、培地上澄み液をデカンテーショ ／または吸引によシ除去する。もしくは懸濁された細胞付着微粒子担体を含む培 地の全部または一部を増殖容器から分離のため別の容器に移す事もてきタンパク 質分解性処理の前に、細胞付着微粒子担体は残存培地を完全に除く為に洗浄せね ばならない。細胞が力清供給培地で増殖されていた場合、血清がタンバク質分解 試薬の活性を阻害し、分離過程を妨害するので充分に洗浄せねばならない。細胞 はリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）またはＨｌｉＥＰＰＳのごとき水性等張緩衝液で 洗浄されるであろう。

細胞付着微粒子担体はその後ｐＨ７８，−１０，０でタンパク質分解性試薬で処 理する。これを達成する為沈降した微粒子担体をタンパク質分解性試薬を含む、 水性等張緩衝液に再懸濁し、操作範囲内の選択したｐＨに調製する。前記の範囲 内の最適なｐＨは特定のタンパク質分解性試薬、微粒子担体の型、細胞の型およ び培養状態などの多数の因子に依存しておシ、常用検査によりこれらの因子の任 意の組合せが決定できる。

一般的に、約１０−１５分のタンパク質分解性処理で高い度合いの分離を得るの に充分である。

エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のごときキレート剤をタンパク質分解性試 薬の溶液に添加しなければならない。キレート剤はカルシウムおよびマグネシウ ムのととき２価の陽イオンの捕捉剤として働く。２価の陽イオンは基質への細胞 接着に役割を果していると考えられてお、す、これらの除去は分離を助ける。

適したタンパク質分解性試薬はトリプシン、プロナーゼ、コラゲナーゼおよびプ ロテアーゼになどのプロテアーゼである。

２つまたはそれ以上のこれらの酵素の混合物も使用される。タンパク質分解性試 薬（類）の濃度は高い度合いの分離で細胞増殖能力の最小の損失を得る濃度であ るべきである。

良好なタンパク質分解性試薬はトリプシンである。種々のトリプシン調製試料が 市販されている。しばしば使用されるトリプシン調製試料はバクトープ７　ニア 　（Ｂａｃｔｏ−Ｄｉｆｃｏ）　ｌ　：　２５　Ｑである。約０．１−０．２％ の濃度（１００ｍｇ緩衝液当り０．１−０、２９　）　リブシン調製試料）が分 離過程に使用できる。ＤＥＡＥ−デキストラン微粒子担体上で増殖したＦＳ−４ 細胞は８２および９．０のｐＨ範囲で０．２％のこのトリプシン調製試料にょシ 容易に分離できる；分離された細胞は著しい増殖能力の損失なく新鮮な微粒子担 体に再付着し増殖した。ＦＳ−４細胞にはｐＨ８，２が通常使用され満足できる 結果が得られる。

他の適したトリプシン調製技料はワーシングトン　ジアグノステツクス［Ｗｅｒ ｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｌｌｉａｇｎｏｅｔｉ’ｃｓ）により供給さｎる２回再結晶 されたトリプシンである。このトリプシン調製試料の４．０％貯蔵溶液の１：５ ００希釈溶液で優れた分離が得られた。

温度は高ｐＨでタンパク質分解に影響する１つの因子である。

例えば、細胞がトリプシン処理される温度が継代培養の間の増殖能力に影響を与 える争はよく知られている。マンキーハル（Ｍｃｋｅｅｈａｎ）らは、低温度（ ４℃）での細胞トリプシン処理が、続いてのクローン増殖に著しい改良を示した 事を報告している。

マンキーハル、Ｗ、Ｌ、ら６血清巨大分子に対する必要性を減少させる低温度継 代培養および塩基性ポリマーで被覆した培養衣ｐｐ１１８−１５０、ケンブリッ ジ大学出版、１９８１．、ＦＳ−４細胞は室温での高ｐ　Ｈト’Ｊシアン処理に よ、り分離されうまく培養できる。しかしながら、ｐＨに感受性の細胞には高ｐ Ｈｓ低温および減少させたトリプシン濃度の組合せによ、り増殖能力が改善され るであろう。最も有効なパラメータの組合せは常用検査により任意の特定の型の 足場依存性細胞に対し決定できる。

本過程による細胞分離に影響するさらに別の因子には、増殖培地の組成、血清供 給の濃度、分離時における細胞のコンフルエントの程度およびコンフルエント状 態にあった細胞の時間の長さなどが挙げられる。これらの条件は変化するので、 最適な分離および細胞増殖能を得るようにタンパク質分解性試薬の濃度、温度、 任意のキレート剤の濃度およびｐＨｔ調整しなければならない。

高ｐＨでのタンノξり質分解後、緩かなはぎ取り力を適用して微粒子担体から細 胞を分離する。はぎ取り力は多くの方法にょシ発生できる。例えば、処理された 微粒子担体の再構成された懸濁液の単なるピペッティング（もし必要なら繰返す ）にょυ充分なはぎ取り力が得られる。大量培養では、有効にはぎ取る便利な方 法は、処理された微粒子担体をガラスピーズを充填したカラムに通す事である。

直径約３朔のガラスピーズが適しておシ；カラムの寸法は微粒子担体の量に依存 する。微粒子担体がカラムを通過する間にはぎ取る力が発生し、それは細胞の分 離に充分である。微粒子担体および分離された細胞を含有するカラム溶出液を集 め、それは新しい培養の接種物としてそのま＼使用する。

本発明の方法は細胞の付着に適した任意の陽性−荷電基質からの足場依存性細胞 の分離に有益であると信じられる。そのような基質の例は繊維、平板またはビー ズであろう。

典型的な微粒子担体は陽性に荷電した表面を持つ多孔性ビーズから成っている。

ビーズはデキストラン、デキストリン、でん粉、セルロース、ポリグルコースお よびこれらのポリマーの置換誘導体のごとき水酸基含有ポリマーから作られてい る。水酸基は荷電供給基（しばしば多くは第３級アミン）の付着のための部位を 提供する。市販の陽性荷電微粒子担体のいくつかの例は、ファ／Ｌｒマシア（Ｐ ｈａｒｍａｃｌ、ａ）によ、すＤＥＡＦＪ−セファデックスＡ　５０．　ＤＥＡ 、Ｅ−セファデックスＡ２５の商品名称で販売されているイオン交換レジンであ る。これらの微粒子担体はジエチルアミノエチル（ＤＥＡｋ：）基によシ置換さ れたデキストランポリマーからなっており、一般的にはＤＥＡＥ−置換ビーズと 称される。

最近、レビンらは微粒子担体上の陽性荷電能力の量はある範囲内に制御でき、そ の結果、足場依存性細胞の多くの種類が良好に増殖できるようになった。例えば 米国特許第４，１８へ５３４号を参照されたい。範囲は約１．０−２．８ミＩＪ 当量／乾燥未処理デキストランのグラム数である。範囲内の荷電能力を持つＤＥ ＡＥ−置換デキストランビーズはフローゼネラル社（Ｆ１ｏｗＧｅｎｅｒａ１工 ｎｃ）によ−リスパービーズ（Ｓｕｐｅｒｂｅａｄｓ　）の登録商標で販売され ている。前もって決められている微粒子担体の荷電能力はポリマー上に置換され ている荷電供給部分の量を制御する事によりチ作製できる。

本発明の分離法を用いて、ＤＥＡＥ−デキストラン微粒子担体上でヒト二倍体繊 維芽細胞（ＦＳ−４株）が連続的に増殖されになるまで増殖し、少くとも３０ベ ツ上容量のリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で数回洗浄する。ビーズをその後５容量 のトリプシンのＰＢＳ溶液に懸濁する。初期の実験では、トリプシン溶液のｐＨ は約８９から９．０の範囲であった。後期の実験ではｐＨは８．２まで減少でき る事が観察された。細胞および微粒子担体をトリプシン溶液に再懸濁後、微粒子 担体は放置して沈降させ、ガラスカラムまたは焼結したガラス漏斗から流し出す ようにした。トリプシン処理は５から１０分間進行せしめる。その後ビーズをす ばやく新鮮な培地に再懸濁し、３咽のガラスピーズを充填した（ベッド高２０ｃ １ｎ）　３０　Ｘ　１．５ｃｍのカラムを通過させた。Ａ型的には微粒子担体の ９０チ以上の細胞が放出された。

もし、かなシの部分の細胞が付着したま＼残っていたら、ビーズ懸濁液はさらに １またはそれ以上の回数カラムを通過させた。

細胞−微粒子担体混合物はその後新しい微粒子担体を含む前もって暖めた新鮮培 地を含んだ新しい培養容器内へ接種する。はとんどの細胞は３０分以内に微粒子 担体に再付着する。これらの細胞は対数的にコンフルエントになるまで増殖する 。

連続的サル腎臓細胞株（■ｅｒｏ）も本分離技術を用いる微粒子担体上で連続的 に培養された。本分離技術はチャイニーズ　ハムスター卵巣細胞およびベビーハ ムスター腎臓細胞のごとき表面および懸濁の両方で増殖できる細胞同様ニワトリ 胎児線維芽細胞を含む多くの足場−依存性細胞の連続的培養に応用できると信じ られる。

重要な事は本発明の分離過程を用いる微粒子担体上で連続的に増殖する細胞は生 成物形成ができる事である。例えば連続的に培養されたＦＳ−４細胞はベーター インターフェロンを産生じ、同じ方法で増殖されたＶｅｒＯ細胞は小水庖性口内 炎ウィルスの産生を保持している。この事は高ｐ　Ｈ）　ＩＪプシン処理は細胞 の産生能力に害がない事を示している。それ故、細胞は完全に微粒子担体上で大 量培養で増殖でき、細胞をウィルス、ワクチン、ホルモン、リンホカインまたは 他の細胞増殖副生成物の産生に使用できる。

本方法は以下の実施例によシ更に例示される。

、ヒト包皮線維芽細胞（ＦＳ−４）はニューヨーク大学、医学科、ニューヨーク 、ニューヨークのジャ／ウィルセック（ＪａｎＶ’ｈ１ａｅｋ）博士よシ得、マ サチューセッツ工科大学の細胞培養センターに供託されている。細胞は３７℃で １リツトルの回転瓶中（４９０ｄ）継代および維持された。各々の継代において １つのコンフルエントな回転瓶からの細胞は４つの別の回転瓶へ接種に使用され た。細胞は１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および５％コウシ胎児血清 （ｒｃｓ）を供給したダルベツコ改良イーグル（ＤＭＥ）培地中継代数１２（倍 化数２４）の時点で凍結する。凍結細胞を溶かし、回転瓶中で増殖させ、継代数 １５から２０の間のものを使用した。新しく継代する細胞の増殖培地は５％ｌ′ Ｃ８および５チコウシ血清（−Ｏ８）を供給したＤＭＥである。Ｄ［の組成を表 １に示した。

表　１ ＣａＣｆ１２２００．０　３３．２２ ＣｕＳＯ４５Ｈ２００，００２４９ ＦＱ（Ｎｏ３）３．９Ｈ２００，１０−−−ＦｅＳＯ４・７Ｈ２００，８３４ ＫＣＩＩ　４００　２２４ １ｔａＣ１６４００７６０Ｏ Ｎ　ａＨＣＯ３３７００１１７６ ＮａＨ２ＰＯ４”Ｈ２Ｏ１２５−−− Ｎａ２ＨＰＯ４１４２ Ｄ−グルコース　４５００　１８０２ ヒポキサンチン　４．１０ リノール酸　０．０８４ リポ酸　０，２１ フエノールレツド　１５．０　１．２０プトレシン２）１（４０、］６１ ピルビン酸ナトリウム　−−−１１Ｏ Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ−−−１５，ＯＬ−アルギニン・ＨＣｌ　Ｏ４，０２ １１Ｌ−アスパラギン酸　−−一’　１３．３Ｌ　−シ、＜ｆン４８．Ｏ２５， Ｏ Ｌ−グルタミン酸　１４．７ Ｌ−グルタミン　５８４　１４６ グリシン　３０．０　７．５１ Ｌ−ヒスチジｙＨＣｆｆｉ−Ｈ２０４２，０２１，ＯＬ−イソロイシフ　１０５ 　３．９４ Ｌ−ロイシン　１０５　１３．Ｉ Ｌ−リジン・ＨＣＱ　１４６　３６５ Ｌ−メチオニン　３０．０　４．４８ Ｌ−フェニルアラニン　６６．０　４．９６Ｌ−プロリン　３４．５ Ｌ−セリン　４２．０　１０．５ Ｌ−スレオニン　９５．０　１１．９ Ｌ−トリプトファン　１６．０　２．０４Ｌ−チロシン　７２．０　５．４　Ｏ Ｌ−バリン　９４．０　１１．７ ビオチン　０．００７３ Ｄ−パントテン酸Ｃａ　４．００　０．４８０塩化コリン　４．００　１３．９ ６０ 葉酸　４，００　１．３０ １−イノシトール　７．２０　１８．０ニコチンアミド　４．００　０．０３７ ビリドキサル・ＨＣ旦　４．００　、０．０６２リボフラビン　０．４０　０． ３８ チアミン・ＨＣＩ　４．００　０．３４０ビタミンＢ□２ −−−１．３６ Ｆ’Ｓ−４細胞は前の継代から接種した後６週間まで回転瓶に維持する。培地に は１週間毎に２％Ｆ’ＣＳおよび８％コウシ新生児血清（ＮＣ８）を補充したＤ ＭＥを補給する。

サル腎臓細胞株、（Ｖｅｒｏ）はフローラボラトリー（Ｆｌｏｗ　Ｌｏｂ−ｏ： ｒａｔｏｒｙ）　（マクリーン、ＶＡ）から得た。培養条件はＤＭＥ培地に１０ ％ウマ血清（Ｈ８）が補充されているφおよび各々のコンフルエントになった回 転瓶を継代光、す８つの回転瓶に接種するのに使用した事を除いてＦ’Ｓ−４の それと同一である。

すべての使用培地にはペニシリンＧ（１００単位／　ｍｌりおよびストレプトマ イシン（１００μ９／ゴ）が添加しである。

顕微鏡実験のための細胞の染色 培養期間の間細胞形態を定期的に顕微鏡で試験した。これは非染色細胞でも実施 できるが、非染色細胞の明暗は顕微鏡試料としては充分でない。細胞の染色には 、培養液から０．２　ｍｌの細胞付着微粒子担体を２４穴プレートに置く。０． ０５ｒノの固定可能染色溶液全試料含有穴に添加する事によシ固定と染色を同時 に実施する。固定可能染色溶液は４０％エタノールおよび０．５９／４１のクリ スタルバイオレットを含有している。固定および染色は約１分間通行させ、その 後１ｍｌのＰＢＳを注意深く添加して染色液を希釈する。過剰の希釈染色溶液を 吸引して除くと細胞は顕微鏡実験および顕微鏡写真試料として準備ができた状態 である。

微粒子担体の調製 微粒子担体はルバインら〔バイオテクノロジーアンドバイオエンジニアリング２ １，８２１−８４５（１９７９））　の方法に少し修正を加えて調製した。望ま しい大きさのビーズはセファデックスＴＭＧ−５０−８０またはＧ−５０−１５ ０をふるいにかけて得た。本研究で定期的に使用された微粒子担体は５３から７ ５μの直径を持つセファデックス　ビーズである。９０から１５０μの範囲の直 径を持つより大きなセファデックス　ビーズをいくつかの実験で使用した。

ジエチルアミンエチルクロリド−塩酸（ＤＥＡＥ（４−ＨＣｆｌ　；シグマケミ カル商会、セントルイス、ＶＯ）は微粒子担体の調製に使用する前に最初メチレ ンクロリドから再結晶する。荷電微粒子担体を調製するために、４０９のふるい にかけた乾燥セファデックスビーズを４８０ｍＪの蒸留水に懸濁し、２リツトル 丸底フラスコに入れる。２４０ｍＪの２　ＭＤＥＡＤ、ＨＣｕを添加しフラスコ を水浴中で回転させて反応混合物の温度を５０°に上げる。３０分後、２４０ｘ ｌの前もって暖めた３　Ｎ　ＮａＯＨの添加によシ反応を開始する。反応は５０ ℃にて実施し、その間水浴中で丸底フラスコを回転させる。反応は１時間放置し て進行させ、その後１リツトルの蒸留水の添加により停止する。ビーズを２つの ２リツトル焼結ガラス漏斗に注ぎ２０υの水、続いて１２　ｆｌノｏ、　Ｉ　Ｎ 　ＦＬＣｕ　オ！び２４．　ｆｌ　（７）　０．０００１　Ｎ　ＨＣｆｌ’洗浄 スる。

微粒子担体の荷電密度は洗浄直後に定量した。荷電密度の測定の為には、微粒子 担体を１０％（Ｗ／Ｗ）硫酸ナトリウム（７５ｍｅ／セファデックスＧ５０グラ ム当り）で洗浄し、溶出液を集める。溶出液をクロム酸カリウム指示薬存在下１ ．ＯＮ硝酸銀で滴定する。本過程で調製された微粒子担体は典型的には１．８か ら２．１ｍｅｑ／デキストランダラム当、りのイオン交換能力を持っていた。

微粒子担体の貯蔵懸濁液を調製するには、滴定した微粒子担体を２５容隈の蒸留 永続いて４０容量のカルシウムおよびマグネシウムを含有しないリン酸緩衝塩溶 液（ＰＢＳ）で洗浄する。

洗浄したビーズをＰＢＳに１０９／ｆｌで再懸濁し、オートクレーブした後、使 用するまで無菌状態に保つ。

微粒子担体培養 特に指示しない場合は、回転瓶中で増殖中の貯蔵培養物を微粒子担体に種付けす る。接種２日前、各々の回転瓶からの細胞ヲトリプシン処理し、２つの接種用回 転瓶中へ接種する。すべての１００罰の培養液の研究は、つるした磁気羽根車（ ０，８ｃｍｘ４ｃｍ）’を持つ２５０ゴのスピナー容器〔ウィルバーサイエンテ ィフィック（Ｗｉｌｂａｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）株式会社、ボストン、ＭＡ 〕中で実施した。羽根車は剪断による微粒子担体の破壊を避ける為フラスコの底 から１傷上に位置している。スピナーフラスコは微粒子担体の容器壁への接着を 妨ぐため使用前に１チプｏ　シｈ　（Ｐｒｏｅｉｌ、）　（ＶＷＲＳｃｉ、Ｃｏ ）でシリコン化する。

特に指定しないかぎり、微粒子培養に使用した培地はダルベツコ改良イーグル（ ＤＭＥ）培地である。Ｆ’Ｓ−４細胞には培地に５％コウシ胎児血清（Ｆｅ２　 ）　ｆ、Ｖｅｒｏ細胞には１０％ウマ血清全補給した。５９／ｆｌの微粒子担体 濃度全通常使用した。

スピナー培養液の調製には、リン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中の０．５ｇの微粒 子担体を放置して沈降させ、３０ｙ＋Ａ！のＤｌｉ’ｌＥで２回洗浄する。微粒 子担体は血清補給培地で８０ｍ／！とじ、スピナーフラスコに移す。スピナーフ ラスコを湿らせた二酸化炭素インキュベーターに置き、細胞の接種の前に温度お よびｐＨの両方を平衡化する。

接種物は００２％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）’ｊｉ含有する０、２％ トリプシンＰＢＳ溶液（カルシウム捷たはマグネシウムを含まない）でトリプシ ン処理した接種用回転瓶からの細胞から得られる。

トリプシン処理後、細胞を５ｏｏｘｑで１０分間遠心分離してにレット状にする 。Ｒレット化した細胞は培養培地に再懸濁し、血琢計算器を用いて色素排除法に より生育できる細胞の濃度を決定する。使用した色素は０１％トリバンプルーの ＰＢＳ溶液である。接種物の容量を前もって暖めた培地で２０ｍ１に増量し、微 粒子担体懸濁液に接種する。かきまぜる為６５から７５　ｒｐｍの羽根車速度を 使用した。

ＦＳ−４細胞の培養には、培養３日目に５０％の培養培地を取出し新しい培地を 補充した。６日以上継続の実験においては、６日目と８日目にさらに追加の５０ ％培地交換を実施した。ベロ細胞にはさらに頻繁な培地交換が必要であった。最 初の５０チ培地交換は接種後約６時間で実施し、４日後は培地を毎日交換した。

直径がよυ大きいマイクロキャリヤー（微粒子担体）上での培養には、スピナー の羽根を変えた。４５度のピッチの２枚の羽根（２，２ｘ　２２ｃｍ）を櫂の上 にとりつけて撹拌速度をおそくした（４５ｒｐｍ）。

５００ｍ／の培養を１氾の容器中で実施した。８ｃｒ＋＋のシリコーンダム管（ 内径００５８インチ、外径０．０７　フインチ、ダウコーニング社のシラスチッ ク管材）を容器中に置いた。表面エアレータ−をベロ細胞の培養に使って酸素の 輸送を改善した。

ＦＳ−４細胞には、溶解酸素水準はシリコーンゴム管材なしでエアレーションに よって約４０％の飽和水準で維持することができた。

ＤＭＥ培地ておいては、培養ｐＨはＦ’Ｓ−４細胞については７．１５から７． ３５．４口細胞については７．００から７．３５の範囲であった。しかし、ＤＭ Ｅ／ｌ”１２混合物ＩＦ５−４細胞について用いるときには、ｐＨはｐＨ調節を 行なわない場合に著しく低下する。これらの実験においては、ｐＨは空気をシリ コーンゴム管材を通して通過させそれによって溶解ＣＯ２濃度を減らすコントロ ーラーを作動させることによって調節した。シリコーンゴム管材を通る空気流速 は約１００ｍ／／分であった。

マイクロキャリヤー上の細胞成育は前記のファン　ウエゼルの方法に従って監視 した。この方法はサンフォードらのＪ。

Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｅ、工ｎｅｔ・　７７２（１９４９）のもとの技法に基づい ている。培養の２罰の試料を十分混合したスピナー容器から抜出し、ＬＯＯＯｒ ｐｍ　で３分間遠心分離にかけた。上澄液をデカントし、ペレット状化したマイ クロキャリヤー２０，１Ｍクエｙ酸中（７）　０．１％（Ｗ／Ｗ）クリスタルバ イオレットの２ｒｔｔｌの中で再懸濁させた。３７℃で１時間のインキュベーシ ョンの後、この懸濁液をパスツールピペットで以て混合して細胞核をマイクロキ ャリヤーから剥離させた。染色した核を次にヘマトサイトメーターを使って数え た。

マイクロキャリアーからの細胞の剥離 マイクロキャリヤーをスピナーフラスコから抜出し、２５０ｙｌのプラスチック 製遠心分離管の中に入れた。上澄培地を取除いたのち、細胞とマイクロキャリヤ ーＩＰＢＳの３０容積（ゴ／　ｍｅビーズ）で以て徹底的に洗滌した。トリプシ ン溶液を、濃厚保存液を３ＱｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、４ｍＭのグルコース、３ ｍＭのＫＣＩ、１３０　ＮａＣＱ、　１　ｍＭのＮａ２ＨＯＰ、、および０−０ ０３３ｍＭのフェノールレッドを含むサリン溶液の中で１０倍稀釈することによ ってつくった。この稀釈トリプシン溶液は０．２％のトリプシンと０．０２％の ＥＤＴＡ　ｉ含んでいた。トリプシン溶液はまたＰＢＳ中でｐＨ１に調節してつ くることもできた。ｐＨは２　Ｎ　ＮａＯＨで以て８．９から９．０へ調節した 。ｐＨ８２から８．４の溶液もまた細胞をうまく剥離するのに使用された。

トリプシン処理は焼結ガラスロート（５０ｆｆｉ／）かクロマトグラフ・カラム （２，５Ｘ１０ｃｍ、ビオラドＣｏ　、、　’＝　ｚ　−ヨーク）の中で実施し て過剰のトリプシン溶液の除去を助けた。洗滌マイクロキャリヤーはレットの各 １０ｒｔｔｌへ５０ｍ１のトリプシン溶液を添加した。このマイクロキャリヤー 懸濁液を焼結ガラス漏斗またはクロマトグラフ・カラムへ移し、マイクロキャリ ヤーを沈降させ、過剰のトリプシンをマイクロキャリヤーによって形成されるベ ッドを通して流れさせる。マイクロキャリヤーの一部を顕微鏡検査のために周期 的に抜出した。細胞がより球状になったとき、残留トリプシンをマイクロキャリ ヤー・はラドの頂部から吸引して除いた。低い細胞トランスファー率（４より小 ）を使用するときには、残留トリプシンは細胞とマイクロキャリヤーとを５４Ｆ Ｃ８（あるいはベロ細胞については１０チ馬血清）′ｔ−添加したＤＭＥ培地の １容積で以て洗滌することによって除去した。高い増殖率を使用するときには、 次の培養段階へ持込まれるトリプシン量は小さく、従って血清含有培地による最 後の洗Ｍ！を省略した。トリプシン処理の継続時間は３から１０分であった。す べての場合において、形態変化をトリプシン処理の継続時間を決定する基準とし て使用した。

トリプシン処理後、マイクロキャリヤーを予備加温培地の中に懸濁させた。この ように処理された細胞は、容積が小さい場合には培地の反響ピペッティングによ って剥離することができる。容積が大きい場合には、マイクロキャリヤー懸濁液 を直径が約３柵のガラスピーズを詰めた高さ３０ｃｍ５直径１．５　ｃｍのカラ ムの中に通過させた。ガラスピーズのイツトの高さは２０傷であった。代表的に は、マイクロキャリヤー上の細胞の９０％以上がこの種の条件下で遊離された。

細胞のかなシの量が接着したままである場合には、マイクロキャリヤー懸濁液は カラム中を繰返して通過させた。細胞懸濁液は使用マイクロキャリヤーと一緒に 新しい培養容器の中へ次に接種した。この接種手順はマイクロキャリヤー培養部 において上述したのと同じであった。この使用条件下において、細胞は新容器中 への接種後半時間以内でマイクロキャリヤーへ再接着シタ。

トリプシン活性の測定 トリジン／の■自分解活性を色素源基質、アゾコラーゲン（アゾコール、シグマ −・ケミカルＣ０６）で以て測定した。異なるｐＨのアゾコールの溶液（１０〜 ／ｍｌ→’２３０ｍＭ緩衝液中でつくった。各種ｐＨのドブリシン溶液ｋ　３０ 　ｍＭ　ＨＦＥＰＥＳ緩衝液中でつくった。トリプシン活性を測定するには、ト リプシン溶液の４ｒｎｌｔ同じｐＨの基質溶液の等容積を含む試験管へ添加した 、混合物を３７℃で１５分間保温した。１１！１１の試料を各試験管から周期的 に抜出し、ｐ紙を通して涙過した。Ｆ液の色強度を分光光度計（５２０ｎｍ）で 以て測定した。

ｌｆｉ容器中のベロ細胞の５００Ｍ７！培養物をギアードら（１９７７年）によ り述べられているとおシのｖＳｖ生産に使用した。

（新たに開発したマイクロキャリヤー系によるウィルス生産”、Ａｐｐｌ、Ｔ２ ｎｖｉｒｏｎ、　ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ　３４ｔ　６６８−６７２）。　ウィルス ・ブラック形成単位（ＰＦ’Ｕ）対細胞数の比として定義される感染度（ｍｏｉ ）　は０．１であった。ｖＳ■添加の前に、マイクロキャリヤーを沈降させ、２ ５０ｍ６の培地を取除いて培養容積を減らした。１時間、ｐＨ’ｉｉ６．５と６ ８の間に保ち、培養を時々（１０分毎に約１分）撹拌してウィルスの細胞上への 均一な吸着を確実にさせた。その後、２５０ゴの培地を添加して培養容積Ｔｈ５ ００ｍＪへ戻した。ｐＨを７３へ再調節し、継続的撹拌を再び始めた。５ｍｌの 試料をウィルスのタイトレージョンのために周期的に抜出した。試料は２０００ ｒｐｍで４℃において１０分間遠心分離にかけて細胞の屑を除去した。上澄液は ウィルス・ブラック・アッセイを実施するまで一２０℃において冷凍した。

■Ｓｖタイターを二次ニワトリ胎児の繊維芽細胞を使用してブラック・アッセイ によって測定した。生後１ｏ日のニワトリ胎児を使用して一次培養を確立した。

、ブラック・アッセイの２日前に、コンフルエントの一次ニワトリまたは胎児の 繊維芽細胞ヲトリプシン処理し、６ｃｍの直径のハトリ皿の中へ接種しく５Ｘ１ ０　セル７皿）て第二の培養を開始させた。第二培養用の培地は１％のニワトリ 血清、２％のトリプトース燐酸プロスおよび１チの子牛血清を添加したＤＭＥで あった。ブラック・アッセイを実施するには、Ｆ’Ｃ３（１０％）を添加したＤ ＭＥ中でウィルスの連続の１０倍稀釈液をつく、す、０２ｍｅの稀釈試料全容皿 上へ接種した。各試料を二連で評価し産。ウィルスは１時間の吸着期間、３７℃ において湿潤１０％Ｃｏ２雰囲気中に放置した。その吸着期間後、１％寒天被膜 （ＤＭＥ培地＋１０％Ｆ’Ｏ８，から成る）の２ゴを容器へ添加し、次に皿を３ ７℃で２日間保温した。ブラックはＰＢＳ中のニュートラルレッドの１　：　２ ，５００倍稀釈液で以て染色した。

産させた。この手順は３段階：プライミング、誘発および生産を含む。

プライミングは３７℃において実施した。マイクロキャリヤー上のＦＳ−４細胞 を血清を含壕ないＤＭＥで２回洗滌し、次に１％Ｆ’Ｃ８を添加したＤＭＥ培地 の中で再懸濁させた（１．０−１．２Ｘ１０　細胞／　ｒｒｔｌ　）。細胞はヒ トのベーターインターフェロンを５０単位／罰の濃度で添加することによってプ ライミング全行ない、このプライミングは１６時間実施した。

誘発については、細胞を血清を含まないＤＭＥ培地で以て２回洗滌した。誘発は 血清を含まないＤｆＪＥＥ培地中で３４℃において実施した。インデューサー、 ポリエ、ポリＣ（ＰＬ　Ｂｉｏ−ｃｈθｍ、　Ｃｏ、、ビスコンシン州ミルウオ ーキー）、を５０μ９／ｍｌで１０ν９／ｍｅのシクロヘキシミド（シグマ・ケ ミカル・Ｃｏ）と−緒に添加した。３４℃で４時間保温後、アクチノマイシンＤ （シグマ・ケミカル・Ｃｏ）ｉｌμｇ々Ｅ　の濃度を与えるよう添加した。２時 間さらに保温後、培地を除き、細胞ＩＤＭＥ培地中で２回洗滌し、その後、産生 培地中で再懸濁させた。

産生培地は０．５％プラズマネート（カッター・ラボラトリーズ　Ｉｎｃ、、カ リホルニア州バークレー）を添加したＤＭＥ培地であった。初期温度は３７℃で あった。１時間後、生産温度を３０℃へ変えた。２４時間後、上澄液を進め、新 しい培地を添加した。４８時間において、この場合にも培地を集め、マイクロキ ャリヤーを捨てた。集めた培養液ｔ２００Ｏｒｐｍ　で１０分間遠心分離にかけ 、上澄液はイータ−インターフェロンについて検定するまで一７０℃で凍結した 。

インターフェロン・アッセイ Ｆ’Ｓ−４細胞によるインターフェロン生産号上述のハベルおよびピルツエツク によって記述されているとおちのウィルス誘発細胞変性効果（ＣＰＥ）の阻止に ついての検定によって測定した。試料は９６穴マイクロプレートを使って二連で 検定した。

１００マイクロリツトル（＋ｌ）の培地（２％Ｆ’Ｏ３を添加したＤＭＥ）ｆ各 つェルへ添加した。予め稀釈した連続の２倍稀釈を１２のウェルの各列において 実施した。各ウェルへ、成育培地１００μ旦中の５Ｘ１０ＦＳ−４細胞を添加し た。その後、プレートを２４時間３７℃において保温した。次に細胞をウェルあ たりＶＳＶ　（インディアナ菌株）の１０，０ＯＯＰＦ’Ｕ　で以て感染処理し た。感染処理後、インターフェロンを添加しない対照標準ウェルが全細胞破壊２ 示すまで（４８−７２時間）、プレートラ保温した。プレートを題微鏡的に評価 し細胞の５０％破壊を示す試料の最大稀釈が終点と考えられた。国際標準Ｇ０２ ３−９０１−５２７とＧＯ２３−９０２−５２７（メアリーランド州ベセスダの Ｎａｔｉｏｎａｌ工ｎｅｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈがら入手）に対し て検量された内部標準品２各々の検定に含めた。

高ｐＨＭＪズシン処理による細胞剥離 マイクロキャリヤー上で全面成育したＦＳ−４２徹底して洗滌し、各種ｐＨにお いて緩衝させた２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳの中の０．２％トリプシン溶液の中で再懸 濁させた。３分間暴露後、細胞形態における額著な変化が観察された。第」図に おいて、細胞はトリゾシン処理前（第１Ａ図）、ｐＨ７，４におけるトリプシン 処理後（第１Ｂ図）、およびｐＨ８，６におけるトリプシン処理後、で示されて いる。トリプシン溶液のｐＨ増加とともに細胞は細長い分極形状からよフ縮んだ 丸い形へ変った。この細長形状の縮みは細胞培養において代表的に使用されるｐ Ｈ範囲（７，４−７，０）においては１５分間のトリプシン処理後においてすら おこらなかった。

高ｐＨにおいてトリプシン処理した細胞がマイクロキャリヤーへ接着し正常に成 育することができるかどうかを決めるために、ローラーボトル上で全面成育した ＦＳ−４ｉ胞ｋ　ｐ　Ｈ９，０においてトリプシン処理し、次にマイクロキャリ ヤー培養の中へ接種した。そのように処理した細胞は正常にコンフルエンス状態 へ成育した（データーは示していない）。このように、高ｐＨへの短時間露出は Ｆ’Ｓ−４細胞の成育に観察できる有害効果をもつとは見えなかった。

マイクロキャリヤー中で成育するＦ’Ｓ、４細胞全７゜０１こえる各種ｐＨ値に おいてトリプシン処理して剥離に対するｐＨ最適範囲を決定した。処理後、細胞 は反覆ピペッティングのようなおだやかな機械的操作によって、マイクロキャリ ヤーから剥離することができた。しかし、この検討において使用した培養容積に おいては、上述のとおりガラスピーズを詰めた小導管あるいはカラムを通じてト リプシン処理したマイクロキャリヤー懸濁ｉｔ通過させることによって細胞を取 出すことがよ−り便利である。細胞剥離に及ぼすｐＨの効果を定量化するために 、マイクロキャリヤー上のコンフルエンス状態の細胞ヲ各種ｐＨ値にある０、２ ％トリプシン溶液で以て処理し、次にガラスピーズ充填カラム中を通過させた。

第２図に示すとおり、トリプシン処理によるセルの剥離はｐＨ増加とともに漸次 改善される。その上、高ｐＨトリプシン処理によって剥離された細胞はマイクロ キャリヤーへ再接着し、生存状態のままにあった。７．８およびそれ以上のｐＨ においては剥離は約６５から９５％の範囲にあった。これらの結果に基づき、ト リプシン処理はその後の実験においては８４から８．８の範囲のｐＨにおいて実 施した。トリプシン溶液へよシ長く（１５分間）、露出する場合には、ＰＳ−４ 細胞はｐＨ８，２におけるトリプシン処理によって成功的に剥離されかつ再培養 された。

高ｐＨ）リプシン処理を使って細胞をマイクロキャリヤーから剥離させて、Ｆ’ Ｓ−４セルをマイクロキャリヤー培養中で連続的に増殖させた、この実験の結果 は表１に総括する。３から４の増殖比率を使用した。増殖比は新たに接種された 培養の中での細胞成育に利用できる全表面と、シード−マイクロキャリヤー培養 のそれとの比である。従って、同じマイクロキャリヤー濃度において４００ｍ１ の培養液を接種するのに使用される５９／皇のマイクロキャリヤー濃度における １００ｄ培讐は４の増殖比率を示す。得られる４００ｍ１の培養液は１．５９の 新しいマイクロキャリヤーと０．５９の持ち込みの使用ずみマイクロキャリヤー とを含む。

マイクロキャリヤー懸濁液はローラーボトル中で成育したＦＳ−４で以て接種さ れた。細胞の対数増殖期の終りにおいて、１００ｍＡ！の培養物を抜出し、上述 のとおｉ　ｐ　Ｈ８，６においてトリプシン処理した。約９０％の細胞がマイク ロキャリヤーから剥離された。剥離された細胞はマイクロキャリヤー上に残留す る細胞と一緒に４００ｘ／培養物（表２中の培養物■）の中へ接種した。細胞接 着後、試料を抜出して細胞を数えた。４００ｍ１の培養物中の得られた細胞濃度 は３．４　Ｘ　１０　細胞／―であつた。培養物はさらに、細胞濃度がほとんど １０　細胞／　ｍｌに達するまで保温し、その後、１３０ｍ１？’ｌ抜出して次 の培養物（表１の培養物１１１）の接種に使用した。９５％の細胞剥離が達成さ れた。系列中のこの第三培養物も容積は４００ｍ１であ一す、得られた初期細胞 濃度は３．３Ｘ１０　細胞／　ｍｌであった。この培養全体を通して、使用培地 は５％ＦＣ８Ｉ添加したＤＭＥ培地であった。細胞増殖の速度は第３図に示され ている。矢印は高ｐＨにおけるトリプシン処理と新培養中への接種を示している 。

接種時の細胞濃度　３．０Ｘ１０　３．４Ｘ１０　３．３Ｘ１０５最終細胞濃度 　１．４Ｘ１０　９．６Ｘ１０　９．ｌＸ１０５次の接種に使用した細胞数　１ ．４Ｘ１０　１．２５Ｘ１０７剥離細胞数　１．２８Ｘ１０　１．１８Ｘ１０８ 剥離細胞　％　９１９５ ＦＳ−４細胞のｐ’Ｈ８，４−９，０における０、２％トリプシン溶液への短時 間暴露は形態的変化をもたらし、細胞をマイクロキャリヤーから剥離させ次の接 種に使用することを可能にした。

トリプシンの餐自分解活性はｐＨが酸性（ｐＨ７よシ低い）から塩基性（ｐＨ７ よシ高い）へずれるにつれて増す。しかし、細胞剥離に及ぼす高ｐＨの影響はト リプシン活性増大の結果であるということではなさそうである。通常のｐＨにお いてトリプシン濃度を３倍（０，６％トリプシン）に増しても細胞剥離を進める はずの形態的変化を誘起し得なかった。そして、第２図に示すとお一す、剥離は トリプシン濃度が増すときに多少増大するけれども、その効果は高ｐＨのときほ どに顕著でなかった。

第２図に示す結果はマイクロキャリヤーから剥離後の細胞の生存状態を示してい ない。形態変化後に剥離された細胞は再接種を続ける際にマイクロキャリヤーへ 再接着することが観察される。対照的に、ｐＨ７，４において剥離された大部分 の細胞はマイクロキャリヤーあるいは啄トリ皿のいずれへも再接着できトリプシ ン溶液の蛋白分解活性を各種において色素源基質、アゾコール、で以て評価した 。第４図に示すとおり、この酵素の蛋白分解活性はテス）ｐＨ範囲にわたって大 きく変化しなかった。活性度はｐＨの増加とともにｐＨ＝７．９−８．２　にお ける最大値へ増加した。さらにｐＨＴｈ増すと蛋白分解活性の減少をもたらした 。蛋白分解活性の増加は第２図に示す細胞剥離における観察された改善と一致し た。しかし、８．４より高いｐＨにおける蛋白分解活性のその後の低下は細胞剥 離を妨げなかった。

その上、テス）ｐＨ範囲にわたる蛋白分解活性の差は細胞剥離に及ぼす効果を説 明するには小さすぎた。

トリプシン活性のこの非感応性はノースロップとクニックのＪ、　Ｇｅｎ、　Ｐ ｈｙｓｉＯｌ、　１６．２９５−３２１（１９３２）によって報告されている。

結晶性トリプシンについて、彼等はトリプシン活性が７．５と９，０の間のｐＨ において最適値を示し、この最適範囲内においてトリプシンの活性度がほとんど 変化しないことを発見した。

（！、）ＩＪプシン処理後の高ｐＨの効果ｐＨの効果ヲトリプシン活性の効果と さらに区別するために、細胞ヲトリプシ／処理とｐＨ処理へ別々にかけた。Ｆ’ Ｓ−４細胞の培養物をほぼコンフルエンス状態へ増殖させ、２５０■のマイクロ キャリヤーの上の４．８Ｘ１０　細胞を各々の実験に使用した。トリプシン処理 と細胞剥離を上述のとおりに実施したが、ただし、次の変更を行なった。トリプ シン処理をクロマトグラフ・カラムではなく５０ｍＪの遠心分離管の中で実施し た。

ＰＢＳで以て完全に洗滌後、細胞ヲトリブシン溶液へ暴露した。

対照標準培養液においては、トリプシン溶液のｐＨは８．７と７．２でアシ、そ れぞれ以後の保温は行なわなかった。トリプシン処理を室温で５分間進行させ、 その後、マイクロキャリヤー’ｔ５０ＩＰＬｌのＰＢＳ中で再懸濁させ、次にガ ラスピーズ充填カラム中に通過させた。他の二つの場合においては、トリプシン 処理をまたｐ　Ｈ７，２で５分間実施したが、トリプシン処理後に、細胞を各種 ｐＨ値の緩衝液中で保温した。保温前に、マイクロキャリヤーを５０ｍ１のＰＢ Ｓ中で懸濁し、２００倍のＧで１分間遠心分離にかけた。上澄液を捨て、マイク ロキャリヤーを５０ｍ？／Ｑの大豆トリプシン阻止剤（シグマ・ケミカル・Ｃｏ ）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液と混合した。このＨＥＰＥＳ緩衝液の組成はトリプシ ン溶液に使用したのと同じであった。一つの場合には、ＨＥＰＥＳ緩衝液のｐＨ は８．７であ一す、他方の場合には７．２であった。室温で５分間緩衝液中で保 温後、上澄ｆｉ、ヲ抜出し、マイクロキャリヤーｔ　５０　ｍｌのＰＢＳ中で懸 濁させ、次いでガラスピーズ充填カラム中を通過させた。

８．７　その後の保温なし　４．４０Ｘ１０　９］７．２　その後の保温なし　 ］、２６Ｘ１０　２７７．２　８．７　３．８０Ｘ１０　７８７．２７゜２　１ ．４６Ｘ１０　３］ 分離された細胞はへマドシトメーターで数えた。表２に示すとお一す、細胞の９ ０％以上がトリプシン処理？高ｐＨで実施するときにマイクロキャリヤーから剥 離した。対照的に、　１）Ｈ７，２においては３０％よ、り少ない細胞が剥離さ れた。トリプシン除去後、生理的ｐＨにおいてさらに保温しても細胞剥離にほと んど影響しなかったが、一方、ｐＨ８，７における保温は細胞の剥離ケ著しく容 易にした。これらの結果は細胞とマイクロキャリヤー表面との間の結合がトリプ シン処理によって−たんゆるめられると、高ｐＨでの保温はマイクロキャリヤー からの細胞の剥離を助けることを示している。

さらに、細胞剥離の改善は高ｐＨにおける蛋白分解活性の増加以外の機構に基づ くものと思われる。

５００ｍ／の培養液全ローラーボトル成育Ｆ’Ｓ−４細胞で以て７×１０　細胞 ／ｍｅの濃度で接種した。実験室において日常的に使用するマイクロキャリヤー よシ４０％大きい中央値直径（ｍｅｄｉａｎ　ｄ−ｉａｍθｔｅｒ）をもつマイ クロキャリヤーの使用と５％ｒｃｓを添加したＤＭＦ’／Ｆ’−１２（５０：５ ０）混合物を培地として使用することとによって（］９０ミクロンの代乃に２７ ０ミクロンの中央値直径）、高い増殖率が得られた。この培養物からのコンフル エンス状態の細胞（培養液の４０ｍ１：１．３５Ｘ１０　細胞／コ）ヲ次にｐ　 Ｈ８，５においてトリプシン処理し、次に剥離させて、第二培養物に接種した。

この第二培養物において、細胞は１．、３０　Ｘ　１０　細胞／　ｒｎｌのコン フルエンス状態濃度に達するまで正常に増殖した。二段培養において約２００倍 の細胞数増加が達成された。細胞増殖の動力学は第５図に示した。矢印は高ｐＨ におけるトリプシン処理と再接種を示している。

この方式で増殖させた細胞が生産物形成（ｐｒｏｄ、ｕｄｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏ ｎ）可能であるかどうかを決定するために、この連続増殖培養からのＦＳ−４細 胞は上述のギアードらの超誘発法によるベーターインターフェロン全産生するよ う誘発されたつ対照標準培蓋液にはローラーボトル中で増殖した細胞を接種した 。産生培地には産生段階の開始後１日で新しい培地を補充した。第１日と第２日 に生産されたベーターフエロンは上記のとおり検定した。

表３に示すとお、す、マイクロキャリヤー上で連続的に増殖させた細胞のインタ ーフェロン生産性はローラーボトルから接種された培養物のそれと匹敵した。こ のように、このトリプシン処理方法を使用するマイクロキャリヤー上で増殖させ たＦ′Ｓ−４細胞は正常に増殖ができインターフェロン産生が可能である。

０−２４時間　２４０００　２４０００　１５．０００２４−４８時間　ＩＬＯ ＯＯａ６００　７：６００この継代培警法が他の細胞の種類へ適用できるがどう かを試験するために、猿の腎臓の上皮細胞（−？口）を試験した。これらの細胞 は通常はワクチン産生のために使用される。培養物は３、　ＯＸ　ｉ　Ｏ細胞／ Ｍｌの濃度において接種してコンフルエンス状態まで増殖させた。コンフルエン ス状態の細胞濃度は３．８×１０　細胞／ｍｌであった。このコンフルエンス状 態の培養物の４０ゴを上記手順で以てｐ　Ｈ９，０においてトリプシン処理し、 ３、ｌＸ１０　細胞／罰の細胞密度で５００ｍ／の培養物の接種に使った。得ら れた娘培養の接種物細胞濃度は３．ＩＸ］０５細胞／　ａｔであった。第６図に 示すとお一す、このようにして培養されたイロ細胞はきわめてよく増殖し、認め られる遅滞期すなわち増殖速度の減少がなかった。細胞がコンフルエンス状態へ 増殖した後、上水庖性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）１ｚ感染させてウィルス産生に 及ぼす直接的接種の影響をテストした。結果を第７図に示す。産生期間は約１５ 時間続いた。得られたウィルスのタイターは上述ギアー１・゛らの文献に報告さ れているのと匹敵した。

等価方式 画業熟練者は、日常的実験のみを使用するだけで、本明細書において記述した特 定的の物質と手順と同等の数多くの等価方式全認め、あるいは確かめることが可 能である。そのような等価方式は本発明の領域内にあると考えられ、以下の請求 の範囲によって含まれる。

浄７Ｂ（内容に変更なし） ７．０　７．４　７．８　８．２　８．６　９．０ｔ−ｉ 浄書（内容に変更なし） Ｂ１　間　（旧　ン） 浄書（内容に変更なし） Ｈ 浄書（内容に変更なし） ｌ頓ト　ア♂へ　（エコ　」１友二） 浄書（内容に変更なし） １１Ｉ今　閏　（ぢ４炙） 浄書（内容に変更なし） 時間（’ｒｙｓ） 手続補正書く方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８５１０１６１５ ２、発明の名称 微粒子担体からの足場依存性細胞の分離３、補正をする者 事件との関係　出　願　人 住所 名　称　マサチコーセッツ・インスデブユート・Ａブ・テクノロジー ４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６号室 ６、補正の対象 （１）　出願人の代表者基を記載した所定の書面く２）　委任状及訳文 （３）　タイプした明１ｉｌＳ及び請求の範囲の翻訳文国際調査報告 ＡＮＮＥＸＴｏＴ）ＩＥＩＮＴＥＲＮＡＴ工０ＮＡＬＳＥＡＲＣＨＲＥＰＯＦｔ ＴＯＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．正荷電支持体から足場依存性細胞を剥離する方法であつて、細胞が付着した 支持体を蛋白分解酵素の溶液で以て約７．８から約１０．０のｐＨにおいて処理 し、次にその被処理支持体に剥離力を及ぼしそれによつて細胞を支持体から剥離 するのに十分な力を受けさせる、ことから成る方法。 ２．正荷電のマイクロキャリヤーから足場依存性細胞を剥離する方法であつて、 細胞が付着したマイクロキャリヤーを蛋白分解酵素で以て約７．８から約１０． ０のｐＨにおいて処理し、次にその被処理マイクロキヤリヤーに、剥離力を及ぼ しそれによつて細胞をマイクロキヤリヤーから剥離するのに十分な力を受けさせ る、ことから成る方法。 ３．マイクロキャリヤーが正荷電のポリデキストラン・ビーズである、請求の範 囲第２項に記載の方法。 ４．蛋白分解酵素がトリプシン、プロナーゼ、コラゲナーゼ、およびプロテイナ ーゼＫ、あるいはこれらの酵素の二つまたは二つより多くの混合物、から成る群 から選ばれる酵素である、請求の範囲第２項に記載の方法。 ５．ｐＨが約８．２から約９．０である、請求の範囲第２項に記載の方法。 ６．マイクロキヤリヤーに剥離力を及ぼす段階がマイクロキヤリヤーをガラスビ ーズのカラム中に通すことから成る、請求の範囲第２項に記載の方法。 ７．マイクロキャリアーに剥離力を及ぼす段階がマイクロキヤリヤーを小導管中 に通すことから成る、請求の範囲第２項に記載の方法。 ８．正荷電マイクロキヤリヤー上で足場依存性細胞を連続的に培養する方法であ つて、 ａ．成育培地中で懸濁した正荷電マイクロキヤリヤー上で足場依存性細胞を所望 の成育段階まで培養し、ｂ．その後、細胞が付着したマイクロキヤリヤーを成育 培地から分離し、 ｃ．細胞が付着したマイクロキヤリヤーを蛋白分解酵素の溶液で約７．８から約 １０．０のｐＨにおいて処理し、ｄ．この被処理マイクロキヤリヤーに、剥離力 を及ぼしそれによつて細胞をマイクロキヤリヤーから剥離するのに十分な力を受 けさせ、 ｅ．剥離した細胞を、新なな正荷電マイクロキヤリヤーが懸濁している第二成育 培地の中へ接種し、ｆ．細胞を第二成育培地中で所望成育段階まで培養する、各 工程から成る方法。 ９．足場依存性細胞の増殖副生成物の製造方法であつて、ａ．足場依存性細胞を 成育培地中に懸濁させた正荷電マイクロキヤリヤー上で所望成育段階まで培養し 、ｂ．その後、細胞が付着したマイクロキヤリヤーを成育培地から分離し、 ｃ．細胞が付着したマイクロキャリヤーを蛋白分解酵素の溶法線約７．８から約 １０．０のｐＨにおいて処理し、ｄ．この被処理マイクロキヤリヤーに、剥離力 を及ぼしそれによつて細胞をマイクロキヤリヤーから剥離するのに十分な力を受 けさせ、 ｅ．この剥離細胞を正荷電マイクロキヤリヤーが懸濁している第二成育培地の中 へ接種し、 ｆ．細胞を第二成育培地中で細胞増殖副生成物の産生を助ける条件の下において 培養し、 ｇ．細胞増殖副生成物を回集する、 各工程から成る方法。 １０．細胞増殖副生成物がホルモンである、請求の範囲第９項に記載の方法。 １１．細胞増殖副生成物がウイルスである、請求の範囲第９項に記載の方法。 １２．細胞増殖副生成物がリンホカインである、請求の範囲第９項に記載の方法 。