JP2001509675A - 細胞培養およびウイルス増殖のための方法 - Google Patents
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- 【特許請求の範囲】 1.細胞を培養するための方法であって: (a)該細胞を、マイクロキャリアの第1バッチにおいて、該細胞が実質的に コンフルエントになるまで培養する工程; (b)該細胞を、懸濁液から該マイクロキャリアを取り出さずに、該マイクロ キャリアから剥離する工程; (c)マイクロキャリアの第2バッチを添加する工程;および (d)該細胞をさらに培養する工程、 を包含する、方法。 2.前記マイクロキャリアの第1バッチから前記細胞を剥離する工程が、以下の 工程: (a)該マイクロキャリアおよび付着した細胞を洗浄して、可溶性物質を除去 する工程; (b)該マイクロキャリアおよび洗浄した細胞を、キレート剤と接触させる工 程; (c)該キレート剤を除去する工程; (d)該細胞を短時間トリプシン処理して、該細胞を該マイクロキャリアから 剥離する工程;および (e)該トリプシンをタンパク質の添加によって中和する工程、 を包含し、ここで(a)〜(e)が、1つの培養容器中で行われる、請求項1に記 載の方法。 3.前記キレート剤がEDTAである、請求項2に記載の方法。 4.前記トリプシンが、約0.05%〜約0.1%の濃度で、5〜10分間、工程(d)で 使用される、請求項2に記載の方法。 5.前記細胞に感染し得るウイルスが、工程(d)の間に添加される、請求項1 に記載の方法。 6.前記細胞が前記マイクロキャリア上で実質的にコンフルエントになった場合 に、前記ウイルスが添加される、請求項5に記載の方法。 7.前記ウイルスがアデノウイルスベクターを含む、請求項5に記載の方法。 8.前記ウイルスがACN53である、請求項7に記載の方法。 9.前記細胞が293細胞である、請求項1に記載の方法。 10.前記細胞が、3〜4日間インキュベートされる、請求項9に記載の方法。 11.マイクロキャリア上で培養されおり、ここから取り外されるようになる細 胞を、該マイクロキャリアから分離するための方法であって、細胞およびマイク ロキャリアの水性懸濁物を、注入口を通して分離デバイスに導入する工程を包含 し、該デバイスが: (a)注入口; (b)カラム; (c)細胞および該水溶液の回収のための放出口;ならびに (d)メッシュスクリーン; を含み、ここで該マイクロキャリアは、該分離デバイスにおいて上向きの流れに よって懸濁物中に保持され、そしてメッシュスクリーンによって該分離デバイス に保持され、そしてここで該細胞および水溶液が、該放出口を通して回収される 、方法。 12.前記細胞およびマイクロキャリアの水性懸濁物が、該細胞中で増殖したウ イルスをさらに含む、請求項11に記載の方法。 13.前記細胞が293細胞である、請求項11に記載の方法。 14.前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項12に記載の方法。 15.前記分離デバイスにおける流速が、約1〜約3cm/分である、請求項11 に記載の方法。 16.前記回収された細胞および水性培地が、微細濾過に供される、請求項11 に記載の方法。 17.前記微細濾過が、約2000〜10,000 l/秒の剪断速度を含む、請求項16に 記載の方法。 18.前記上向きの流れが、注入口を通して前記水溶液をくみ出すことによって 生成され、ここで該注入口が前記デバイスの底部に置かれ、そして前記放出口が 該デバイスの頂部に置かれる、請求項11に記載の方法。 19.前記カラムが、上部区画および下部区画を含み、該下部区画が、該カラム の用量の約20〜50%を含み、そして前記注入口を含む、請求項11に記載の方法 。 20.前記下部区画が円錐形である、請求項19に記載の方法。 21.前記下部区画の角度が、約15〜約45度である、請求項20に記載の方法。 22.水性培地中で培養された細胞から細胞成分を遊離するための方法であって 、該細胞を剪断速度に暴露する手段によって、該細胞を機械的に剪断する工程を 包含し、ここで該細胞を機械的に剪断するための該剪断速度が、マイクロフィル ターで該細胞を回収し、そして該マイクロフィルターを通して該水性培地を迅速 に 再循環することによって生成される、方法。 23.前記剪断速度が、約2000〜10,000 l/秒である、請求項22に記載の方法 。 24.細胞片が、前記微細濾過によって回収され、そして前記所望の細胞成分が 通過する、請求項22に記載の方法。 25.前記細胞成分がウイルスである、請求項22に記載の方法。 26.前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項25に記載の方法。 27.前記アデノウイルスが異種遺伝子を保有する、請求項26に記載の方法。 28.細胞が培養されているマイクロキャリアから、該細胞を分離するためのシ ステムであって、該システムが: (a)該細胞が該マイクロキャリア上で培養されるバイオリアクター; (b)該バイオリアクターから分離デバイスへの流路; (c)以下を含む分離デバイス (i)注入口; (ii)カラム; (iii)該細胞および該水溶液の回収のための放出口;ならびに (iv)メッシュスクリーン を包含し、ここで該マイクロキャリアが、該分離デバイスにおける上向きの流 れによって懸濁物中に保持され、そしてメッシュスクリーンによって該分離デ バイス中に保持され、そして該細胞および該水溶液が、該放出口を通して回収 され;および (d)該バイオリアクターから該放出口への該水溶液の流れを指向するポンプ 、を包含する、システム。 29.マイクロフィルターをさらに含み、ここで前記工程(c)の細胞および水 溶液が、微細濾過に供される、請求項28に記載のシステム。 30.限外濾過膜をさらに含み、ここで請求項46の産物が、限外濾過に供され る、請求項29に記載のシステム。 31.前記細胞が293細胞である、請求項28に記載のシステム。 32.前記上向きの流れが、前記注入口を通して前記水溶液をくみ出す工程を包 含し、ここで該注入口が、前記デバイスの底部に置かれ、そして前記放出口が、 該デバイスの頂部に置かれる、請求項28に記載のシステム。 33.前記カラムが、上部区画および下部区画を含み、該下部区画が、該カラム の用量の20〜50%を含み、そして前記注入口を含む、請求項28に記載のシステ ム。 34.前記下部区画が円錐形である、請求項33に記載のシステム。 35.前記下部区画の角度が、約15〜約45度である、請求項34に記載のシステ ム。 36.遺伝子治療のための組換えウイルスを産生するための方法であって、該方 法は以下を包含する、 (a)細胞を、マイクロキャリアの第1バッチにおいて、該細胞が実質的にコ ンフルエントになるまで培養する工程; (b)懸濁物から該マイクロキャリアを取り出さずにトリプシンを添加するこ とにより該マイクロキャリアから該細胞を剥離することによって、そして該マイ クロキャリアの第2バッチを添加することによって、該マイクロキャリアから該 細胞を移入する工程; (c)該細胞を組み換えウイルスで感染させる工程; (d)工程(c)の細胞を、該細胞が培養されているが取り外されるようになっ た該マイクロキャリアから分離する工程であって、該細胞およびギアマイクロキ ャリアの水性懸濁物を、注入口を通して分離デバイスに導入する工程を包含し、 該デバイスは以下を含む: (i)注入口; (ii)カラム; (iii)該細胞および該水溶液の回収のための放出口;ならびに (iv)メッシュスクリーン; ここで、該マイクロキャリアが、該分離デバイスにおける上向きの流れによっ て懸濁物中に保持され、そしてメッシュスクリーンによって該分離デバイスに 保持され、そして該細胞および該水溶液が、該放出口を通して回収され;そし て (e)工程(d)の回収した細胞からウイルスを遊離させる工程であって、該細 胞を剪断速度に暴露する手段によって該細胞を機械的に剪断する工程を包含し、 ここで該細胞を機械的に剪断するための剪断速度が、マイクロフィルターにおい て該細胞を回収し、そして該マイクロフィルターを通して水性培地を迅速に再循 環させる工程によって生成される、方法。 37.前記ウイルスがアデノウイルスベクターを含む、請求項36に記載の方法 。 38.前記ウイルスがACN53である、請求項37に記載の方法。 39.前記細胞が293細胞である、請求項36に記載の方法。
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