CN113574165A - 用于悬浮培养细胞的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了悬浮培养贴壁细胞的方法，所述方法包括：在第一悬浮液中，在第一基材上培养贴壁细胞；从第一基材收获贴壁细胞；以及使用电穿孔来转染收获的贴壁细胞。所述方法还包括，在转染步骤之后，将转染的贴壁细胞悬浮在第二悬浮液中。还提供了用于溶解第二微载体颗粒以收获细胞或细胞产物的溶解过程。所述溶解过程包括向第二悬浮液添加螯合剂(例如EDTA)并持续预定的时间，以使细胞与第二微载体分开；以及在预定的时间后，使细胞或细胞产物与第二悬浮液的剩余部分分离。所述溶解过程在没有酶(例如果胶酶或蛋白酶)的情况下进行。

Description

用于悬浮培养细胞的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C§120要求2019年1月16日提交的系列号为62/793,146的美国临时申请的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并通过引用将其全文纳入本文。
技术领域
本公开涉及用于培养细胞的系统和方法。具体地，本公开涉及悬浮培养贴壁细胞。
背景技术
由于在基因疗法和其他应用中的需求增长，细胞培养市场正以越来越快的速率壮大。然而，目前可用的培养系统和方法的收率不足以符合商业规模应用的需求。此外，细胞培养系统和方法的许多用户更喜欢在粘附平台上培养细胞，因为它们熟悉和了解它们当前在粘附平台上的工艺，并且传统上，由粘附平台实现的收率高。
细胞培养用于生长和收获细胞和细胞产物，包括病毒载体，例如腺相关病毒(AAV)载体。据估计，相信AAV载体的商业应用所需的规模要求约1018病毒滴度。虽然粘附平台似乎能产生高的AAV载体收率，但是当放大AAV病毒载体生产以用于商业规模生产工艺时，仍然存在问题。这些问题包括无菌步骤被污染的风险，过程是时间和劳力力密集型的，缺少监测和控制要素，在商业规模下，所有的问题均变大——不仅AAV病毒载体生产的复杂性增加，成本也增加。
发明内容
在实施方式中，本公开提供了一种悬浮培养贴壁细胞的方法。所述方法包括：在第一悬浮液中，在第一基材上培养贴壁细胞；从第一基材收获贴壁细胞；使用电穿孔来转染收获的贴壁细胞；以及，在转染步骤之后，将转染的贴壁细胞悬浮在第二悬浮液中。
在实施方式中，提供了使用所述悬浮培养贴壁细胞的方法来生产腺相关病毒(AAV)病毒载体的方法，其中，从经过培养的细胞或者从培养基收获AAV病毒载体。
在一个或多个实施方式中，一种培养细胞的方法包括：使用电穿孔来转染贴壁细胞；以及在转染步骤之后，将转染的贴壁细胞悬浮在培养悬浮液中。
在另一个实施方式中，一种收获经过培养的细胞的方法包括：提供处于悬浮的微载体颗粒上的贴壁细胞；以及使经过培养的细胞与螯合剂接触以使细胞与微载体颗粒分开。
附图说明
图1示出了在粘附平台上培养贴壁细胞的传统方法。
图2示出了根据本公开的一个或多个实施方式，悬浮培养贴壁细胞的方法。
图3示出了根据一个或多个实施方式的一个实例，相比于2D基材，使用悬浮中的微载体的细胞收率。
图4A示出了就每个样品的病毒基因组而言，使用粘附平台和悬浮平台，粘附和悬浮细胞的病毒基因组(VG)数(qPCR滴度)的比较。
图4B示出了就每个细胞的病毒基因组而言，使用粘附平台和悬浮平台，粘附和悬浮细胞的病毒基因组(VG)数(qPCR滴度)的比较。
图5A示出了图4A中的实例的感染滴度测量。
图5B示出了图4B中的实例的感染滴度测量。
图6A根据一个或多个实施方式，示出了溶解前微载体的显微图像。
图6B根据一个或多个实施方式，示出了溶解期间微载体的显微图像。
图6C根据一个或多个实施方式，示出了溶解后微载体的显微图像。
图7A是显示了在各种表面上回收的每个贴壁细胞样品的病毒基因组的图。
图7B是显示了在各种表面上回收的贴壁细胞的病毒基因组/细胞的图。
图8A是显示在各种表面上回收的每个贴壁细胞样品的感染滴度的比较的图。
图8B是显示在各种表面上回收的贴壁细胞的感染滴度/细胞的比较的图。
图9示出了相比于标准的电穿孔后溶解过程，使用本公开的电穿孔后溶解过程之后，细胞收率的比较。
具体实施方式
下面参考附图(如果有的话)对本公开的各个实施方式进行详细描述。参考各个实施方式不限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的范围限制。此外，在本说明书中列出的任何实施例都不是限制性的，并且仅列出了要求保护的本发明的诸多可能的实施方式中的一些实施方式。
本公开的实施方式包括用于生长和收获细胞和细胞产物，包括病毒载体，例如腺相关病毒(AAV)载体的细胞培养方法。具体地，一个或多个实施方式包括用于在基材上悬浮培养贴壁细胞的方法。在相同的转染条件下，粘附平台似乎比悬浮细胞产生更高的AAV载体收率和感染滴度，对于AAV基因组颗粒，收率可高达10倍或更大。但是，不同于粘附平台，悬浮平台提供了可放大的优势。本文公开的系统和方法通过悬浮培养，能够放大贴壁细胞培养，以在收获后实现更大的病毒载量，包括高至以及超过约1018病毒滴度。以前，切换到悬浮平台可能需要用户针对悬浮模式培养来开发新的细胞系或改进现有的细胞系，这可能导致得到更低的滴度收率，并且还可能需要开发新的培养基，例如化学定义上的无血清培养基，并且该培养基可与细胞生长和现有的转染试剂(例如磷酸钙(CaPi)或聚乙烯亚胺(PEI))相容。然而，用户通常不赞成这些调整。
根据本文的实施方式，微载体可用于悬浮生长贴壁细胞，并且这些微载体在收获时可溶解。因此，避免了与切换到悬浮平台相关的许多问题，但是可实现悬浮平台的放大能力。此外，本文中的实施方式使用电穿孔与悬浮中的微载体细胞基材的组合。本文公开的方法结合了贴壁细胞的优点和商业级别细胞培养应用(例如，AAV病毒载体生产工艺)中的悬浮细胞平台的优点。优点包括高的细胞产物(例如，AAV病毒载体)收率，由于用户了解细胞系和培养基，因此用户满意并且易于操作，工艺放大，成本，易于处理，以及最大程度减少了细胞污染的风险。
定义
“完全合成”或“全合成”是指细胞培养制品(例如微载体或者培养容器的表面)完全由合成源材料组成，并且不具有任何源自动物的或者动物来源的材料。所公开的完全合成的细胞培养制品消除了异种污染的风险。
“包括”、“包含”或类似术语意为包括但不限于，即内含而非排他。
根据本文的实施方式，“用户”是指使用本文公开的系统、方法、制品或试剂盒的人，包括培养细胞以收获细胞或细胞产物的人，或者使用所培养和/或收获的细胞或细胞产物的人。
用来描述本公开实施方式的修饰例如组合物中成分的量、浓度、体积、过程温度、过程时间、产量、流速、压力、粘度等数值及它们的范围或者组件尺寸等数值及它们的范围的“约”是指数量的变化，可发生在例如：用于制备材料、组合物、复合物、浓缩物、组件零件、制品或应用制剂的典型测定和处理步骤中；这些步骤中的无意误差；用来实施所述方法的原料或成分的制造、来源、或纯度方面的差异中；以及类似的考虑因素中。术语“约”还包括由于具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂陈化而不同的量，以及由于混合或加工具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂而不同的量。
“任选的”或“任选地”意为随后描述的事件或情形可能发生，也可能不发生，而且该描述包括事件或情形发生的情况和事件或情形不发生的情况。
除非另外说明，否则，本文所用的不定冠词“一个”或“一种”及其对应的定冠词“该(所述)”表示至少一(个/种)，或者一(个/种)或多(个/种)。
可采用本领域普通技术人员熟知的缩写(例如，表示小时的“h”或“hrs”；表示克的“g”或“gm”；表示毫升的“mL”；表示室温的“rt”；表示纳米的“nm”以及类似缩写)。
在组分、成分、添加剂、尺度、条件和类似方面公开的具体和优选的数值及其范围仅用于说明，它们不排除其他限定数值或限定范围内的其他数值。本公开的系统、试剂盒和方法可包括本文所述的任何数值或者各数值、具体数值、更具体的数值和优选数值的任何组合，包括显义或隐义的中间数值和中间范围。
本文公开的方法可适用于不同的细胞系。在一个或多个实施方式中，使用HEK293贴壁细胞，例如，包括HEK293T细胞，已经发现其能在可溶性微载体上有效地生长和培养。应理解，在本文所述的实施方式和实施例中提到的HEK293或HEK293T是示例性的实例，其不旨在将这些实施方式的范围限制在特定的细胞类型。根据本文的实施方式，可以培养任何类型的细胞，包括但不限于永生化细胞、原代培养细胞、癌细胞、干细胞(例如胚胎干细胞或诱导多能干细胞)等。所述细胞可以是哺乳动物细胞、禽细胞、鱼细胞等。所述细胞可以属于任何组织类型，包括但不限于肾、成纤维细胞、乳房、皮肤、脑、卵巢、肺、骨、神经、肌肉、心脏、结直肠、胰腺、免疫(例如，B细胞)、血液等组织类型。所述细胞可以为任何培养形式，包括分散(例如刚接种的)、融合、二维、三维、球体等。在基材(例如，可溶性微载体)上培养细胞可以包括在基材上接种细胞，这可以包括使基材与含有细胞的溶液接触。在将细胞接种在基材上期间，细胞可粘附于表面基材，包括进入到基材的孔中。如果基材是包含粘附聚合物涂层的微载体，则细胞可以进入微载体的孔并且粘附于支架材料。
一个或多个实施方式涉及培养细胞以及收获细胞或细胞产物，包括病毒载体或蛋白质。在具体的实施方式中，例如，方法涉及产生和/或收获AAV病毒载体或慢病毒载体。应理解，在本文所述的实施方式和实施例中提到的AAV病毒载体是示例性的实例，其不旨在将这些实施方式的范围限制在特定的细胞培养应用。例如，实施方式包括产生其他病毒载体、蛋白质和细胞产物，包括例如慢病毒生产。
本公开的实施方式的方面可关于AAV病毒载体生产方法的传统方法与本公开的方法之间的差别来理解。传统上，AAV病毒载体生产发生在粘附平台，其中，细胞在二维(2D)表面上生长。例如，如图1所示的传统生产过程100中所示，在步骤102中，利用2D表面(例如烧瓶103)来对贴壁细胞(例如HEK-293T细胞)进行放大试验。接着，在步骤104中，使用PEI或CaPi方法，在粘附于2D表面(例如，例如
Figure BDA0003263673870000051
烧瓶或其他层制容器105、107)的细胞上发生转染，并且细胞留在2D表面上以用于转染后的培养(步骤106)。最后，在步骤108中，从培养表面或培养基收获细胞或细胞产物。图1中的粘附平台方法面临的挑战包括可放大性，劳动力和时间密集属性，高的污染风险，2D培养表面的大的占据面积需要大型设备和实验室空间，由于尺寸原因导致难以管理，在过程中缺少控制，以及该过程成本高。
相较之下，根据本公开的一种或多种方法，使用可溶性微载体(DMC)基材，贴壁细胞(例如HEK293)得以在悬浮中放大，例如，如图2的过程110。该放大(步骤112)可以在三维(3D)体积113(例如，旋转烧瓶或生物反应器)中进行。在放大后，在步骤114处，可以从DMC基材收获细胞115，以使得可以在步骤116中使用电穿孔进行转染。在电穿孔后，将转染的贴壁细胞117回收在DMC基材或另一种悬浮形式上，以用于转染后的培养(步骤118；参见容器119)，并且之后进行收获(步骤120)。
通过在细胞培养放大(图2中的步骤112)期间将贴壁细胞培养容器从传统的2D表面切换到悬浮中的可溶性微载体，细胞收率增加。具体地，当采用相同的培养时间时，实现了细胞收率的1.5倍至2倍的增加。此外，细胞功能保持不变，细胞培养处理更加容易，实验室占用面积减小，并且最大程度地减少了污染风险。病毒基因组滴定和感染滴度滴定指示，来自DMC或来自2D表面的细胞放大处理之间没有差别。电穿孔步骤(步骤116)具有高转染效率，易于放大，批次间一致以及节约时间的优点。例如，在转染后的表达阶段，时间可减少多至约24小时或更多。在转染后的培养回收(步骤118)中，可实现如上文关于步骤112所述的相同的益处。
在微载体上培养细胞可以在生物反应器或类似容器中进行。在培养期间，细胞在微载体的表面上生长。一旦细胞培养过程完成，经过培养的细胞与微载体剥离，接着使含有细胞的经培养的溶液与微载体分离以使用或进一步处理。本公开的实施方式的方面包括：将细胞和细胞生长培养基加入到生物反应器系统的容器中，以及将可溶性微载体加入到所述容器中。另外，所述方法包括：溶解可溶性微载体，以及从容器移除具有溶解的微载体材料的废培养基。使微载体与包含剥离细胞的经培养的溶液分离可使用多种技术来进行，包括例如差异化梯度离心、声共振、切向流过滤、通过网筛的过滤、旋转过滤器以及使用锥形或倾斜板的沉降。
根据一个或多个实施方式，使用电穿孔(EP)来转染(例如，图2的步骤116)收获(例如，在图2的步骤114处收获)的细胞。这克服了使用PEI和CaPi方法进行转染的传统方法所遇到的问题，这些传统方法对粘附于微载体的细胞并不有效。电穿孔要求单细胞悬浮，这通过从本公开的微载体收获细胞而成为可能。此外，电穿孔过程提供了以下益处：过程控制良好，具有高且一致的性能，节约了病毒载体表达的时间(电穿孔48小时，对比PEI或CaPi的72小时)，以及具有成本效益。图6A-6C示出了来自下述的进展：图6A示出了在微载体上的经过培养的细胞，图6B示出了在与消化酶或试剂接触的约3至4分钟内微载体溶解，并且图6C示出了在培养基中重悬后，单细胞的悬浮。
在电穿孔后，可以在微载体或另一种悬浮形式(例如，超低粘附烧瓶、旋转烧瓶或锥形摇瓶)上回收贴壁细胞。传统上，在用于转染后培养的2D表面中回收贴壁细胞，即使当使用电穿孔转染时也如此。然而，这样做可能抹杀了实施方式中的先前步骤的益处。例如，细胞将需要回到具有所有缺点(例如，大的空间要求等)的粘附平台。因此，本公开的实施方式的一个方面包括：使用替代方法回收，例如，在微载体上和其他悬浮形式。来自这些实施方式的实例的结果显示，贴壁细胞不需要2D表面来回收，微载体和其他悬浮形式(例如，旋转烧瓶、摇瓶等)也表现很好或者优于2D表面。在不同基材上回收的细胞的病毒基因组数的实例见图7A和7B，其在下文有所论述。因此，细胞可恢复成悬浮形式。
作为一个或多个实施方式的方面，当使用微载体作为电穿孔后的基材时，提供了一种新的微载体溶解过程。也即，一种新的溶解微载体的溶解过程，所述微载体用于电穿孔后的悬浮以收获细胞或细胞产物。标准的可溶性微载体溶解过程涉及三个步骤：1)洗涤微载体以去除残留血清；2)用含有一种或多种酶和/或螯合剂的溶液溶解微载体，所述溶液例如TrypLE、果胶酶和EDTA的组合；和3)在微载体消化后，洗涤细胞以去除残留的TrypLE和果胶酶。步骤1中的洗涤防止了血清干扰步骤2中的TrypeLE和果胶酶消化。步骤3中的洗涤消除了酶在下游处理中的潜在不利影响。为了使用根据本公开的一个或多个实施方式所述的可溶性微载体，开发了一种新的简化的溶解过程。
根据一个或多个实施方式，当在电穿孔后使用微载体来回收细胞时，可以使用这种新的溶解过程。这种溶解过程可以包括：向细胞培养基直接添加螯合剂(例如EDTA)，等待预定的时间，然后进展到分离和/或收集细胞或细胞产物。所述预定的时间例如可以是小于或等于约1小时，小于或等于约30分钟，或者约10分钟，或者约1分钟至约30分钟。当收获的目标是AAV病毒载体或慢病毒生产时，这种溶解过程是有效的。
溶解过程可以不具有洗涤步骤，优选可以在没有蛋白酶(例如TrypLE、胰蛋白酶)或其他酶(例如，果胶酶)的情况下进行，并且具有高的消化效率以在短时间内(例如，在小于或等于约30分钟内，或者在约10分钟内)溶解所有的微载体。由于微载体的相对较大的体积，以及它们能够干扰下游步骤(例如，细胞裂解和纯化过程)，因此，去除所有的微载体是有帮助的。
电穿孔后的溶解过程得益于无洗涤步骤。在收获的时候，由于病毒载体的表达或者其他细胞产物，一部分细胞可能与可溶性微载体剥离。为了收集粘附于微载体的细胞/细胞产物以及培养基中的细胞/细胞产物，可以使用更高的离心速度和时间。然而，高离心速度和/或长的离心时间的组合，大的微载体体积，和/或细胞与微载体的疏松粘附使得洗涤步骤难以操作并且可导致细胞损失和病毒滴度损失。此外，如果使用者想要收集细胞培养基中的病毒载体，洗涤将增加上清液体积，这增加了所涉及的时间和劳力，并且造成病毒载体在洗涤废品中而损失。
电穿孔后的溶解过程还得益于不需要使用酶，例如蛋白酶(例如TrypLE、胰蛋白酶)，果胶酶或其他酶。蛋白酶可切割细胞产物，例如AAV病毒载体，因此降低了收获的病毒载体的感染力。如果不得不使用蛋白酶，最大程度地减少随后的暴露和洗涤细胞的时间以保证病毒载体的功能将成为关键。
应注意，本公开的一个或多个实施方式包括一种细胞培养方法，其中，可使用标准溶解过程(例如，如上所述的三步过程：洗涤和添加酶，包括蛋白酶和/或果胶酶)来溶解电穿孔前的微载体，同时可根据上文所述的新的简化的溶解过程来溶解电穿孔后的微载体。这种新的溶解过程在先前未用于悬浮中的细胞，并且证明是意外有效的过程，其不需要有问题的酶以及标准过程的洗涤。
一旦培养的细胞达到汇合，胰蛋白酶常用于使贴壁细胞与基质分离。例如，第4,994,388号美国专利公开了一种使用涂覆有胶原的微载体珠来培养和收获锚着依赖性细胞的方法。一旦生长完成，则从微载体消化掉胶原，并且经过培养的细胞与不溶性微载体分离。然而，由于胰蛋白酶的蛋白水解活性，细胞表面蛋白常被切割，这可能导致细胞功能调节异常。已经报道了胰蛋白酶能够诱导蛋白质组改变和细胞生理学改变。Huang等人报道了胰蛋白酶化诱导下调生长相关及代谢相关的蛋白质表达和上调凋亡相关的蛋白质表达，提示用于细胞传代培养的胰蛋白酶对细胞生理学具有不利影响(参见Hsiang-Ling Huang等人,“Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammaliancells(哺乳动物细胞传代培养过程中胰蛋白酶诱导的蛋白质组改变)”,Journal ofBiomedical Science(《生物医学科学杂志》),2010,17:36)。
作为蛋白酶有害影响的另一个实例，还已知用蛋白酶(如胰蛋白酶)处理细胞使得从癌细胞中除去了抗原，因此可能使其不能用于开发抗癌治疗的疫苗。Lokhov等人报道胰蛋白酶化从细胞表面释放糖蛋白和糖[参见“A sialomucopeptide liberated by trypsinfrom the human erythrocyte(通过胰蛋白酶从人红细胞中释放的唾液粘肽),”Nature(《自然》),1960；188:1011-2,Gasic,G.“Removal and regeneration of the cellcoating in tumour cells(去除和再生肿瘤细胞中的细胞衣)”,Nature(《自然》),1962；196:170，以及Uhlenbruck,G.,“Action of proteolytic enzymes on the humanerythrocyte surface(蛋白水解酶对人红细胞表面的作用),”Nature(《自然》),1961；190:181以及“The isolation of living cells from animal tissues(从动物组织中分离活细胞)”,International Review of Cytology(《细胞学国际评论》),1956；7:587-647]，由此导致抗原性质丧失[参见David,J.R.等人，“The In Vitro,Desensitization ofSensitive Cells by Trypsin(胰蛋白酶对敏感细胞的体外脱敏)”，J Exp Med.(《实验医学杂志》),1964；120:1189-200,40,Weiss,L等人，“The demonstration of rupture ofcell surfaces by an immunological technique(用免疫学技术证明细胞表面破裂)”,Exp Cell Res.(《实验细胞研究》),1963；30:331-8,Osunkoya,B.O.,等人,“Synthesis andfate of immunological surface receptors on cultured Burkitt lymphoma cells(培养的伯基特淋巴瘤细胞上免疫表面受体的合成和命运)”,Int J Cancer(《国际癌症杂志》),1969；4(2):159-65,Takeichi,N,等人,“Accelerated regeneration of trypsin-treated surface antigens of simian virus 40-transformed BALB/3T3 cellsinduced by X-irradiation(X射线诱导的猿猴病毒40-转化BALB/3T3细胞的胰蛋白酶处理表面抗原的加速再生)”,Cancer Res.(《癌症研究》),1976；36(4):1258-62]。特别地，Takeichi等人证明，SV40转化的3T3细胞的胰蛋白酶处理降低了它们在足垫试验中的抗原性。类似地，已经证明用胰蛋白酶处理的多瘤病毒转化细胞在足垫肿胀试验中未能诱导针对肿瘤特异性抗原的迟发性超敏反应[参见，Molinari,J.A.,等人,“Modification ofsurface membrane antigens by trypsin(胰蛋白酶修饰表面膜抗原)”,Proc Soc ExpBiol Med.(《实验性生物医学刊物》),1975；148(4):991-4]。
Mundt等人的第5,100,799号美国专利公开了一种用于从微载体中释放细胞培养物的方法，其中，胰蛋白酶溶液在流动通过过程中被引导通过具有微载体的容器。该专利提到，释放的细胞需立即从载体取出，并且胰蛋白酶溶液在离开容器后被灭活、去除或既灭活又去除，以防止蛋白酶对收获的细胞具有有害影响。Mundt提到“高百分比的细胞释放得相当快，因此在胰蛋白酶溶液中保留很长时间。这导致胰蛋白酶的作用对这些细胞产生不利影响的缺点。特别受不利影响的是细胞生长和细胞在新的微载体上重新安置的能力。
如上所述，极其期望不使用胰蛋白酶或者在没有胰蛋白酶的情况下收获细胞。果胶酶是用于载体消化的另一种酶。果胶酶(聚半乳糖醛酸酶)是将复合的果胶分子分解成较短的半乳糖醛酸分子的酶。果胶酶催化聚半乳糖醛酸释出果胶寡糖(POS)。
能够在无血清的条件下，在化学限定的培养基中实现细胞扩增，并且允许在不添加蛋白酶(例如，TrypLE、胰蛋白酶等)或其他酶(例如果胶酶)的情况下收获细胞的系统和方法(如本申请中所公开的)将会是有用的。
根据一个或多个实施方式，提供了一种悬浮培养贴壁细胞的方法。所述方法包括：在第一悬浮液中，在第一基材上培养贴壁细胞；从第一基材收获贴壁细胞；以及使用电穿孔来转染收获的贴壁细胞。所述方法还包括，在转染步骤之后，将转染的贴壁细胞悬浮在第二悬浮液中。第一基材可以包括第一微载体颗粒，例如，如本文所述的可溶性微载体颗粒。
在电穿孔后，可以在悬浮的第二基材上或另一种悬浮形式中回收细胞。第二基材可以包括第二微载体，该第二微载体可以与第一微载体基本上相同，或者可以是不同类型的微载体。
一个或多个实施方式的一个方面是一种用于溶解第二微载体颗粒以收获细胞或细胞产物的溶解过程。所述溶解过程包括向第二悬浮液添加螯合剂；使经过培养的细胞与螯合剂接触预定的时间以使细胞与第二微载体分开；以及在预定的时间后，使细胞或细胞产物与第二悬浮液的剩余部分分离。螯合剂可以是乙二胺四乙酸(EDTA)或者合适的替代物。所述预定的时间可以是约1分钟至约30分钟；约5分钟至约20分钟，约8分钟至约12分钟，或者至少约10分钟。
在一个或多个实施方式中，所述接触以及使细胞与第二微载体分开是在没有蛋白酶、果胶酶或者蛋白酶和果胶酶二者的情况下进行的。此外，溶解过程可以不包括洗涤步骤，例如，磷酸盐缓冲的盐水洗涤。
细胞或细胞产物的分离可以包括对第二悬浮液进行离心或过滤，以使细胞或细胞产物与第二悬浮液的剩余部分分开。在一个或多个实施方式中，方法还包括：从第二悬浮液收获细胞或细胞产物。还可进行分离的细胞或细胞产物的裂解。
作为一些实施方式的一个方面，在第二悬浮液中的转染的细胞产生腺相关病毒(AAV)或慢病毒病毒载体以用于收获。
虽然不对用于培养的特定细胞进行限制，但是细胞可以是HEK293贴壁细胞，例如，HEK293-T细胞。
培养步骤可以包括生物反应器、摇瓶、旋转瓶或其他悬浮容器中容纳的第一悬浮液或第二悬浮液。
作为一个或多个实施方式的一个方面，进行约48小时或更少，约24小时或更少，约12小时或更少，约6小时或更少，约4小时或更少，约3小时或更少，约2小时或更少，约1小时或更少，约30分钟或更少，约10分钟或更少，或者约10分钟至约1小时的电穿孔。
第一微载体颗粒和/或第二微载体颗粒可包含基础基材，所述基础基材具有至少一种聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸或其盐。部分酯化的果胶酸可以包括1至40摩尔％的酯化度。第一微载体颗粒和/或第二微载体颗粒还可以包括至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物，或者水溶性增塑剂。聚半乳糖醛酸化合物可以是共价交联的、离子交联的、或者其混合物。部分酯化的果胶酸可包括烷基羧基酯，其烷基具有1至10个碳原子。
在一些实施方式中，第一微载体颗粒或第二微载体颗粒还包括在聚半乳糖醛酸化合物的表面上的粘附聚合物。在聚半乳糖醛酸化合物表面上的粘附聚合物可以包括肽或多肽。粘附聚合物涂层还可包括选自下组的肽：BSP、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、I型胶原、IV型胶原、变性胶原以及它们的混合物。粘附聚合物可以促进锚着依赖性活细胞粘附于基材。
本公开的一个或多个实施方式包括一种使用上述实施方式中所述的悬浮培养贴壁细胞的方法来生产腺相关病毒(AAV)病毒载体的方法，其中，从经过培养的细胞或者从培养基收获AAV病毒载体。
本公开的一个或多个实施方式包括一种培养细胞的方法，所述方法包括：使用电穿孔来转染贴壁细胞；以及在转染步骤之后，将转染的贴壁细胞悬浮在培养悬浮液中。所述方法还包括：使转染的贴壁细胞与微载体颗粒接触，以使细胞粘附于微载体，其中，粘附了细胞的微载体颗粒悬浮在培养悬浮液中。在转染步骤之前，可以在初始悬浮液中培养微载体上的贴壁细胞。在一个或多个实施方式中，在培养步骤之后以及在转染步骤之前，可以从微载体收获贴壁细胞。所述收获可包括：使培养悬浮液中的经过培养的细胞与螯合剂(例如EDTA)接触，以使细胞与微载体分开。
在另一个实施方式中，提供了一种用于收获经过培养的细胞的方法，所述方法包括：提供在悬浮中的微载体颗粒上的贴壁细胞；以及使经过培养的细胞与螯合剂接触以使细胞与微载体颗粒分开。可以从组合物中分离出被分开的细胞，以收获细胞或细胞产物。作为一个或多个实施方式的一个方面，微载体与螯合剂接触是在没有蛋白酶、果胶酶或者蛋白酶和果胶酶二者的情况下完成的。
实施例
如上所述，根据本公开的实施方式，当采用相同的培养时间时，实现了细胞收率的1.5倍至2倍的增加。图3例示了该细胞收率的增加，其中，在三个实验中，将在DMC上悬浮培养贴壁细胞得到的细胞收率与在TFT T-175烧瓶中在2D表面上培养贴壁细胞的细胞收率进行比较。在图3的实施#1-#3中的每个实验中，在孵育箱占用面积相似的情况下接种相同数目的细胞(10e6)，并且在每个实验中对每种类型的基材采用相同的培养时间。实验1示出了在相应表面上培养72小时后的收率，并且实验2和3示出了96小时后的收率。两种基材类型(DMC和2D烧瓶)的细胞回收率大于95％。然而，使用悬浮的DMC基材的收率比2D表面的收率高1.5至2倍。
图4A和4B例示了从TCT烧瓶中的2D表面上培养的293-T贴壁细胞以及根据本公开的实施方式从在DMC上培养的293-T贴壁细胞测得的病毒基因组数(qPCR)相当。此外，将这些感染滴度值与悬浮型293-F细胞的感染滴度值进行比较。结果显示，相比于悬浮293-F细胞，293-T贴壁细胞的感染滴度增加(平均约10倍)。使用电穿孔(EP)来转染细胞。
在图5A和5B中，比较来自图4A与4B的样品之间的感染滴度(通过TAQMAN TCID50测量)，并且显示出与图4A和4B所示相似的趋势。具体地，相比于悬浮型293-F细胞，293T贴壁细胞得到了更高的感染滴度，并且平均增加约10倍，使用DMC放大的293T细胞显示出与使用TCT表面放大的293T细胞相当的能力。
在图7A和7B中，比较了在不同基材上回收的细胞的病毒基因组数。如图7A和7B所示，在四种不同基材(可溶性微载体、TCT烧瓶、CellBind烧瓶和超低粘附烧瓶)上回收的293T细胞显示出，对于每个EP样品和每个细胞，具有相当的AAV病毒基因组(样品间的差异小于2倍)。在图8A和8B中，基于400μg/ml的电穿孔(EP)DNA浓度，比较了从不同回收表面获得的感染滴度。在这些实施例中，可溶性微载体和超低表面烧瓶在电穿孔后的回收中提供了最佳的感染滴度。
在图9中，比较了过程是使用标准的电穿孔后的溶解过程的细胞收率结果和过程是使用本公开的新的电穿孔后的溶解过程的细胞收率结果。如图9所示，相比于标准溶解过程的2.2e6/10ml样品的总细胞收率，新过程得到了约3.8e6/10ml样品的总细胞收率。也就是说，本公开的溶解过程使得总细胞收率有70％的增加。病毒载体收率相对于该细胞收率增加成比例地提高。
细胞培养基材
本公开的宿主细胞培养物可以在合适的培养基材上培养。在一个或多个实施方式中，基材可以处于悬浮状态，并且基材可以是所谓的微载体。合适的微载体制品和制造方法见述于第US20130071916号和第US20160145567号美国专利申请公开，以及美国临时专利申请62/632178，它们的内容通过引用全文纳入本文。在一些实施方式中，基材可以是涂覆有粘附聚合物的聚半乳糖醛酸(PGA)微载体。
通过使细胞在上面生长的微载体与果胶酶接触，以及任选与螯合剂[例如，乙二胺四乙酸(EDTA)]接触，而无需加入任何蛋白酶，微载体能够实现快速且完全的细胞收获。然而，根据本文公开的方法，通过使细胞在上面生长的微载体仅与螯合剂(例如，EDTA)接触，而且无需加入蛋白酶和果胶酶两者，使用微载体能够进一步实现快速且完全的细胞收获。因此，根据本公开的实施方式，仅使用螯合剂(例如EDTA)而无需使用蛋白酶和果胶酶对从微载体收获细胞意外地有效和高效，并且减少了完成收获所需的步骤数和材料(例如，诸如蛋白酶或果胶酶之类的酶)。在实施方式中，螯合剂例如可以是EDTA，类似的多齿螯合剂，或者其混合物。
根据一个或多个实施方式，一种涂覆细胞培养制品的表面的方法包括：将具有共价结合的多肽的聚合物溶解在水性溶液中以产生聚合物溶液。聚合物由单官能单体(即，不具有双官能度或更高官能度的单体)形成。多肽相对于与多肽偶联的聚合物的重量百分比足够地高，以使得与多肽偶联的聚合物具有水溶性。水性溶液基本上不含有机溶剂。所述方法还包括(i)将聚合物溶液放置在细胞培养制品的表面上以产生经涂覆的制品；以及(ii)使经涂覆的制品经受足够的热或电磁辐射，以将偶联有多肽的聚合物连接到细胞培养制品的表面。合适的偶联有肽的聚合物的例子包括，例如，p(MAA-PEG4-VN)和p(HEMA-co-MAA-PEG4-VN)，或者其混合物(参见US20160145567的图9和10)。在前文中，“MAA”是甲基丙烯酸，“HEMA”是甲基丙烯酸羟乙酯，“PEG4”是聚乙二醇四聚物，并且“VN”是偶联的玻连蛋白多肽。
本公开的合成微载体例如可以由至少一种离子移变交联的生物聚合物制备，所述离子移变交联的生物聚合物例如选自：果胶酸(也被称为PGA)；或者部分酯化的果胶酸(也被称为果胶酯酸)(PE PGE)；或其盐，或其混合物。当选择部分酯化的果胶酸时，酯化度例如可以小于或等于约40摩尔％，例如，1摩尔％至39摩尔％，5摩尔％至35摩尔％，10摩尔％至30摩尔％，包括中间值和范围。
在实施方式中，本公开的微载体有利且优选地由具有微球体尺寸的果胶酸或果胶酯酸珠，或其盐制成，所述珠被细胞粘附促进肽官能化，更优选地，通过用带有粘附肽的合成聚合物涂覆来官能化。粘附肽能够使经过培养的细胞实现生物特异性粘附。所公开的微载体适于使贴壁细胞在无血清的培养中进行大规模扩增和回收。
细胞培养基材组合物例如可至少包括果胶酸，部分酯化的果胶酸，或它们的盐，以及它们的混合物；以及至少一种促进锚着依赖性细胞粘附的肽。
优选地，所述组合物包括肽-聚合物偶联物，该偶联物促进了锚着依赖性细胞的粘附，更优选地，所述肽-聚合物偶联物是包含粘附肽的聚(甲基)丙烯酸酯或聚(甲基)丙烯酰胺共聚物，更优选地，所述肽-聚合物偶联物是
Figure BDA0003263673870000141
II。
本公开的合成微载体可由至少一种离子移变交联的多糖制成，该多糖例如选自果胶酸[其也被称为聚半乳糖醛酸(PGA)]或其盐，或者部分酯化的果胶酸(PE PGA，其也被称为果胶酯酸)或其盐。当选择果胶酯酸时，酯化度优选小于约40摩尔％，因为较高的酯化度使得不能有效地通过离子移变交联来形成珠。不囿于理论，认为可能需要最小量的游离羧酸基团来获得可接受的离子移变交联水平。所述交联可以通过离子交联凝胶化方法获得，并且包括通过至少一种内部凝胶化方法获得的交联。
用作本公开微载体的珠可以由果胶酸或果胶酯酸的混合物制备。果胶酸可通过果胶的某些酯的水解形成。果胶是细胞壁多糖，其在植物中具有结构性作用。果胶主要是基于1,4-连接的α-D-半乳糖醛酸酯骨架的线性聚合物，所述骨架被1,2-连接的L-鼠李糖随机中断。平均分子量为约50,000至约200,000道尔顿。
果胶的两个主要来源例如是柑橘属物质的皮(主要是柠檬和酸橙的皮)或苹果皮，并且可通过对它们进行提取获得。
果胶的聚半乳糖醛酸链可被甲基基团部分酯化，并且游离的酸基团可以被单价离子，例如钠、钾或铵离子部分或完全中和。用甲醇部分酯化的聚半乳糖醛酸被称为果胶酯酸，其盐被称为果胶酯酸盐(pectinate)。
商购的高甲氧基(HM)果胶的甲基化程度(DM)通常可为例如60摩尔％至75摩尔％，低甲氧基(LM)果胶的甲基化程度可为1摩尔％至40摩尔％，10摩尔％至40摩尔％，和20摩尔％至40摩尔％，包括中间值和范围。
本公开的微载体优选由LM果胶制备，优选地，聚半乳糖醛酸包含小于20摩尔％的甲氧基基团，更优选地，聚半乳糖醛酸不具有或者仅具有可忽略不计的甲酯含量来作为果胶酸。为简单起见，不具有或仅具有可忽略不计的甲酯含量的果胶酯酸以及低甲氧基(LM)果胶在本公开中都被称为PGA。
PGA珠可被促进细胞粘附的部分官能化，例如，被肽官能化。一些肽含有某些氨基酸序列，这些氨基酸序列可被整联蛋白族的蛋白质识别，或者导致与能够维持细胞粘附的细胞分子相互作用，这些肽是使本公开的微载体官能化的候选物。优选的肽例如可选自BSP、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、胶原，以及类似的肽和它们的混合物。具体的示例性肽为分别具有以下序列的玻连蛋白(VN)和BSP肽：Ac-Lys-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2(seq.ID No.:1)，和Ac-Lys-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2(seq.ID No.:2)。
如果需要，本公开的微载体可以有利地通过简单的聚合物(例如，粘附肽)物理吸附来官能化。
促进细胞粘附的合适的聚合物可以包括合成聚合物。这种带有肽并且促进细胞粘附和生长的合成聚合物实例包括康宁股份有限公司(Corning Incorporated)的
Figure BDA0003263673870000151
II。通过采用粘附促进聚合物的物理吸附而从制造过程中去除化学衍生化似乎是有吸引力的，因为化学衍生化耗时，是劳动密集型的，需要大量试剂，并且产生大量废弃化学品。
当在通过内部凝胶化交联过的珠上进行时，由包含粘附肽的聚合物制备的涂层特别有效。
根据消化时间、温度和添加的螯合剂或酶的量，可选择或预先确定微载体珠的消化程度。在一些情况中，在整个珠被完全消化之前，细胞可从表面剥离，因此可在珠未完全消化的情况下或者珠完全消化之后收获细胞。在前一情况中，需通过物理过程使珠与细胞分开，例如，通过过滤、倾析、离心及类似处理或者其组合。
本公开的宿主细胞培养物可在悬浮培养基中培养，例如，化学限定的培养基或无血清的培养基。
示例性实施方案
以下是对所公开的主题的各个实施方案的方面的描述。每个方面可以包括所公开的主题的各种特征、特性或优点中的一种或多种。实施方案旨在例示所公开的主题的几个方面，并且不应被认为是对所有可能的实施方案的全面或详尽的描述。
方面1涉及一种悬浮培养贴壁细胞的方法，所述方法包括：在第一悬浮液中，在第一基材上培养贴壁细胞；从第一基材收获贴壁细胞；使用电穿孔来转染收获的贴壁细胞；以及，在转染步骤之后，将转染的贴壁细胞悬浮在第二悬浮液中。
方面2涉及如方面1所述的方法，其中，在电穿孔后，在悬浮的第二基材上或另一种悬浮形式中回收细胞。
方面3涉及如方面1或方面2所述的方法，所述方法还包括：从第二悬浮液收获细胞或细胞产物。
方面4涉及如前述方面1-3中任一方面所述的方法，其中，第一基材包括第一微载体颗粒。
方面5涉及如前述方面1-4中任一方面所述的方法，其中，转染的贴壁细胞位于第二基材上并被悬浮在第二悬浮液中。
方面6涉及如方面5所述的方法，其中，第二基材包括第二微载体颗粒。
方面7涉及如方面6所述的方法，所述方法还包括用于溶解第二微载体颗粒以收获细胞或细胞产物的溶解过程。
方面8涉及如方面7所述的方法，其中，所述溶解过程包括：向第二悬浮液添加螯合剂；使经过培养的细胞与螯合剂接触预定的时间以使细胞与第二微载体分开；以及在预定的时间后，使细胞或细胞产物与第二悬浮液的剩余部分分离。
方面9涉及如方面8所述的方法，其中，所述螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。
方面10涉及如方面8或方面9所述的方法，其中，所述分离包括对第二悬浮液进行离心或过滤，以使细胞或细胞产物与第二悬浮液的剩余部分分开。
方面11涉及如前述方面8-10中任一方面所述的方法，其还包括：对所分离的细胞或细胞产物进行裂解。
方面12涉及如方面8-11中任一方面所述的方法，其中，所述接触以及使细胞与第二微载体分开是在没有蛋白酶、果胶酶或者蛋白酶和果胶酶二者的情况下进行的。
方面13涉及如方面7-12中任一方面所述的方法，其中，所述溶解过程不包括洗涤步骤。
方面14涉及如方面7-13中任一方面所述的方法，其中，所述溶解过程不包括磷酸盐缓冲的盐水洗涤。
方面15涉及如方面8-14中任一方面所述的方法，其中，所述预定的时间是约1分钟至约30分钟；约5分钟至约20分钟，约8分钟至约12分钟，或者至少约10分钟。
方面16涉及如前述方面1-15中任一方面所述的方法，其中，在第二悬浮液中的转染的细胞产生腺相关病毒(AAV)或慢病毒病毒载体以用于收获。
方面17涉及如前述方面1-16中任一方面所述的方法，其中，贴壁细胞是HEK293细胞。
方面18涉及如前述方面1-17中任一方面所述的方法，其中，所述培养步骤包括生物反应器、摇瓶或旋转瓶中容纳的第一悬浮液或第二悬浮液。
方面19涉及如前述方面1-18中任一方面所述的方法，其中，进行约48小时或更少，约24小时或更少，约12小时或更少，约6小时或更少，约4小时或更少，约3小时或更少，约2小时或更少，约1小时或更少，约30分钟或更少，约10分钟或更少，或者约10分钟至约1小时的电穿孔。
方面20涉及如方面4-19中任一方面所述的方法，其中，第一微载体颗粒或第二微载体颗粒包含基础基材，所述基础基材包含至少一种聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸或其盐。
方面21涉及如方面20所述的方法，其中，部分酯化的果胶酸包括1至40摩尔％的酯化度。
方面22涉及如方面20-21中任一方面所述的方法，其中，第一微载体颗粒或第二微载体颗粒还包含至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物，或者水溶性增塑剂。
方面23涉及如方面20-22中任一方面所述的方法，其中，聚半乳糖醛酸化合物是共价交联的，离子交联的，或者是它们的混合。
方面24涉及如方面20-23中任一方面所述的方法，其中，部分酯化的果胶酸包括烷基羧基酯，其烷基具有1至10个碳原子。
方面25涉及如方面20-24中任一方面所述的方法，其中，第一微载体颗粒或第二微载体颗粒还包含在聚半乳糖醛酸化合物表面上的粘附聚合物。
方面26涉及如方面25所述的方法，其中，在聚半乳糖醛酸化合物表面上的粘附聚合物包含肽或多肽。
方面27涉及如方面25或方面26所述的方法，其中，粘附聚合物涂层包括肽，所述肽选自下组：BSP、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、I型胶原、IV型胶原、变性胶原以及它们的混合物。
方面28涉及如方面25-27中任一方面所述的方法，其中，粘附聚合物促进锚着依赖性活细胞粘附于基材。
方面29涉及使用如方面1-28中任一方面所述的悬浮培养贴壁细胞的方法来生产腺相关病毒(AAV)病毒载体的方法，其中，从经过培养的细胞或者从培养基收获AAV病毒载体。
方面30涉及一种培养细胞的方法，所述方法包括：使用电穿孔来转染贴壁细胞；以及在转染步骤之后，将转染的贴壁细胞悬浮在培养悬浮液中。
方面31涉及如方面30所述的方法，所述方法还包括：使转染的贴壁细胞与微载体颗粒接触，以使细胞粘附于微载体颗粒，其中，粘附了细胞的微载体颗粒悬浮在培养悬浮液中。
方面32涉及如方面30或方面31所述的方法，所述方法还包括：在转染步骤之前，在初始悬浮液中，在微载体上培养贴壁细胞。
方面33涉及如方面30-32中任一方面所述的方法，所述方法还包括：在培养步骤之后以及在转染步骤之前，从微载体收获贴壁细胞。
方面34涉及如方面30-33中任一方面所述的方法，其还包括：使培养悬浮液中的经过培养的细胞与螯合剂接触，以使细胞与微载体分开。
方面35涉及如方面34所述的方法，其中，所述螯合剂是EDTA。
方面36涉及用于收获经过培养的细胞的方法，所述方法包括：提供处于悬浮的微载体颗粒上的贴壁细胞；以及使经过培养的细胞与螯合剂接触以使细胞与微载体颗粒分开。
方面37涉及如方面36所述的方法，其还包括：从组合物中分离出分开的细胞。
方面38涉及如方面36或方面37所述的方法，其中，所述螯合剂是EDTA。
方面39涉及如方面36-38中任一方面所述的方法，其中，所述接触是在没有蛋白酶、果胶酶或者蛋白酶和果胶酶二者的情况下完成的。
除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任意方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。
对本领域的技术人员而言，显而易见的是可以进行各种修改和变动而不偏离公开的实施方式的精神或范围。因为本领域技术人员可以结合实施方式的精神和实质，对所公开的实施方式进行各种改良、组合、子项组合和变化，因此，应认为本公开的实施方式包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。

Claims (39)

1.一种悬浮培养贴壁细胞的方法，所述方法包括：
在第一悬浮液中，在第一基材上培养贴壁细胞；
从第一基材收获贴壁细胞；
使用电穿孔来转染收获的贴壁细胞；
在转染步骤之后，将转染的贴壁细胞悬浮在第二悬浮液中。
2.如权利要求1所述的方法，其中，在电穿孔后，在悬浮的第二基材上或另一种悬浮形式中回收细胞。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，所述方法还包括：从第二悬浮液收获细胞或细胞产物。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，第一基材包括第一微载体颗粒。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，转染的贴壁细胞位于第二基材上并被悬浮在第二悬浮液中。
6.如权利要求5所述的方法，其中，第二基材包含第二微载体颗粒。
7.如权利要求6所述的方法，所述方法还包括用于溶解第二微载体颗粒以收获细胞或细胞产物的溶解过程。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述溶解过程包括：
向第二悬浮液添加螯合剂；
使经过培养的细胞与螯合剂接触预定的时间以使细胞与第二微载体分开；以及
在预定的时间后，使细胞或细胞产物与第二悬浮液的剩余部分分离。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。
10.如权利要求8或权利要求9所述的方法，其中，所述分离包括对第二悬浮液进行离心或过滤，以使细胞或细胞产物与第二悬浮液的剩余部分分开。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其还包括：对所分离的细胞或细胞产物进行裂解。
12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其中，所述接触以及使细胞与第二微载体分开是在没有蛋白酶、果胶酶或者蛋白酶和果胶酶二者的情况下进行的。
13.如权利要求7-12中任一项所述的方法，其中，所述溶解过程不包括洗涤步骤。
14.如权利要求7-13中任一项所述的方法，其中，所述溶解过程不包括磷酸盐缓冲的盐水洗涤。
15.如权利要求8-14中任一项所述的方法，其中，所述预定的时间是约1分钟至约30分钟；约5分钟至约20分钟，约8分钟至约12分钟，或者至少约10分钟。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在第二悬浮液中的转染的细胞产生腺相关病毒(AAV)或慢病毒病毒载体以用于收获。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述贴壁细胞是HEK293细胞。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述培养步骤包括生物反应器、摇瓶或旋转瓶中容纳的第一悬浮液或第二悬浮液。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，进行约48小时或更少，约24小时或更少，约12小时或更少，约6小时或更少，约4小时或更少，约3小时或更少，约2小时或更少，约1小时或更少，约30分钟或更少，约10分钟或更少，或者约10分钟至约1小时的电穿孔。
20.如权利要求4-19中任一项所述的方法，其中，第一微载体颗粒或第二微载体颗粒包含基础基材，所述基础基材包含至少一种聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸或其盐。
21.如权利要求20所述的方法，其中，部分酯化的果胶酸包括1至40摩尔％的酯化度。
22.如权利要求20-21中任一项所述的方法，其中，第一微载体颗粒或第二微载体颗粒还包含至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物，或者水溶性增塑剂。
23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中，聚半乳糖醛酸化合物是共价交联的，离子交联的，或者是它们的混合。
24.如权利要求20-23中任一项所述的方法，其中，部分酯化的果胶酸包括烷基羧基酯，其烷基具有1至10个碳原子。
25.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其中，第一微载体颗粒或第二微载体颗粒还包含在聚半乳糖醛酸化合物表面上的粘附聚合物。
26.如权利要求25所述的方法，其中，在聚半乳糖醛酸化合物表面上的粘附聚合物包含肽或多肽。
27.如权利要求25或权利要求26所述的方法，其中，粘附聚合物涂层包括肽，所述肽选自下组：BSP、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、I型胶原、IV型胶原、变性胶原以及它们的混合物。
28.如权利要求25-27中任一项所述的方法，其中，粘附聚合物促进锚着依赖性活细胞粘附于基材。
29.一种使用如权利要求1-28中任一项所述的悬浮培养贴壁细胞的方法来生产腺相关病毒(AAV)病毒载体的方法，其中，从经过培养的细胞或者从培养基收获AAV病毒载体。
30.一种培养细胞的方法，所述方法包括：
使用电穿孔来转染贴壁细胞；以及
在转染步骤之后，将转染的贴壁细胞悬浮在培养悬浮液中。
31.如权利要求30所述的方法，其还包括：使转染的贴壁细胞与微载体颗粒接触，以使细胞粘附于微载体颗粒，
其中，粘附了细胞的微载体颗粒悬浮在培养悬浮液中。
32.如权利要求30或权利要求31所述的方法，所述方法还包括：在转染步骤之前，在初始悬浮液中，在微载体上培养贴壁细胞。
33.如权利要求30-32中任一项所述的方法，所述方法还包括：在培养步骤之后以及在转染步骤之前，从微载体收获贴壁细胞。
34.如权利要求30-33中任一项所述的方法，其还包括：
使培养悬浮液中的经过培养的细胞与螯合剂接触，以使细胞与微载体分开。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述螯合剂是EDTA。
36.一种用于收获经过培养的细胞的方法，所述方法包括：
提供处于悬浮的微载体颗粒上的贴壁细胞；以及
使经过培养的细胞与螯合剂接触以使细胞与微载体颗粒分开。
37.如权利要求36所述的方法，其还包括从组合物中分离出分开的细胞。
38.如权利要求36或权利要求37所述的方法，其中，所述螯合剂是EDTA。
39.如权利要求36-38中任一项所述的方法，其中，所述接触是在没有蛋白酶、果胶酶或者蛋白酶和果胶酶二者的情况下完成的。
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