JP2018068154A - 足場材料から細胞を回収する方法、及び細胞培養用の多糖類足場材料 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞にダメージを与えることなく、効率的に細胞を回収する技術が求められている。
【解決手段】
細胞培養用の多糖類足場材料から細胞を回収する方法であって、多糖類足場材料がジエチルアミノエチル基で表面修飾されており、２６０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ₂Ｏ以上３２０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ₂Ｏ以下の浸透圧条件と、６．５以上８．０以下のｐＨ条件と、３５℃以上４０℃以下の温度範囲において、多糖類分解酵素を多糖類足場材料に作用させることにより細胞を回収することを含む、細胞の回収方法。
【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、細胞培養技術に関し、足場材料から細胞を回収する方法、及び細胞培養用の多糖類足場材料に関する。

細胞培養技術は、抗体医薬に代表されるような生物学的製剤の商業的生産や、細胞治療用幹細胞の増幅など、医薬及び医療の領域において重要な技術である。特に接着性細胞の培養を行うには、細胞の足場材料が必要とされる。足場材料としては培養の目的等に応じて様々な材質及び形態のものが知られている。粒子状の足場材料はマイクロキャリアと呼ばれ、一部の接着性細胞を用いる生物学的製剤の商業生産において実用化されている。

細胞の大量培養技術はまた、ワクチン製造においても重要な技術である。ワクチン製造に用いられるウイルス株は、宿主となる哺乳細胞に感染させて増幅される。その宿主となる細胞には、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ細胞、及びＭＲＣ−５細胞などの接着性細胞が有用であり、それらの細胞を大規模培養するために、マイクロキャリアの適用が検討されている（例えば、非特許文献１参照。）。

さらに近年では、接着性細胞の大量培養技術は、再生医療分野における幹細胞培養の研究においても注目されている。特に間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣｓ）や胚性幹細胞（Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｈＥＳＣｓ）を用いた細胞治療は、骨・関節疾患、心疾患、及びガンなどの治療分野での研究が盛んである。ＭＳＣｓやｈＥＳＣｓを治療に用いるためには、一人の患者当たり大量の細胞が必要とされ、治療に必要量の細胞を確保する技術としてマイクロキャリア培養技術が有望とされている（例えば、非特許文献２参照。）。

ワクチン製造や幹細胞培養において、マイクロキャリアから細胞を回収する工程は重要である。ワクチン製造においては、例えば特許文献１において、マイクロキャリア培養で細胞継代する際に、細胞集団の同期化のために、トリプシンに代表されるようなタンパク質分解酵素を使用して、マイクロキャリアから細胞を剥離する必要性が述べられている。幹細胞培養においては、培養した細胞そのものを治療のために患者に投与するため、機能性と安全性の両面において高品質かつ高回収率で細胞を回収することが必要である。

上述したトリプシンは、細胞とマイクロキャリアの間に存在するタンパク質を分解することで、マイクロキャリアの接着面から細胞を剥がす効果がある。トリプシン処理は、短時間で細胞を剥離することが可能であり、トリプシンが比較的安価であることから広く用いられている。しかし、トリプシン等のタンパク質分解酵素は、細胞表面に存在する他の機能性タンパク質にも少なからずダメージを与えることが知られている。このことは、未分化細胞と分化した細胞とで異なる膜タンパク質を発現し、細胞表面のタンパク質と細胞の機能が密接に関連することになる幹細胞培養においては、品質上の重大な問題となる。

細胞へのダメージを最小化できるマイクロキャリアからの細胞回収方法として、マイクロキャリアに直接作用する分解酵素などでマイクロキャリアを消化して細胞を回収する方法が知られている。マイクロキャリアに直接作用する酵素は、原理的には細胞にはダメージを与えない。例えば、特許文献２にはデキストラン系マイクロキャリアをデキストラナーゼで分解する方法や、セルロース系マイクロキャリアにセルラーゼを作用させる方法が開示されている。しかしながら、この方法によると、セルラーゼ単独で処理した際の細胞の回収率は５０％程度であり、より高い回収率を得るためにはトリプシン処理との併用が必要である。デキストラナーゼ単独で処理した場合でも、細胞の回収率は６０％程度であり、いずれの方法でも回収率は十分とは言えない。

非特許文献３には、心臓繊維芽細胞培養の足場としてセルロース系材料を用いる技術が開示されており、セルロース系足場材料上で培養した心臓繊維芽細胞を回収する方法としてセルラーゼ処理方法が検討されている。それらの検討において、セルロース系足場材料の分解は容易でなく、セルラーゼ処理の効率を上げるために、セルロース系足場材料のアルカリ処理が必要であったと述べられている。しかしながら、アルカリ処理したセルロース系足場材料を用いた検討事例においても、セルロース系足場材料の分解は完全でなかったことが示されている。

特許文献３には、ポリガラクツロン酸からなるポリマービーズ（ＰＧＡビーズ）マイクロキャリアをペクチナーゼで分解する方法が開示されている。しかしながら、ＰＧＡポリマービーズ表面は負電荷を帯びているため、細胞を付着できない。ＰＧＡポリマービーズの細胞付着性を改善するためには、細胞接着因子による表面修飾が不可欠であるが、細胞接着因子による表面修飾は高コストとなる要因である。

特表２０１３−５１５４７３号公報 特開平５−１９２１３５号公報 特表２０１６−５２３０８６号公報

Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ （Ｈａｎｄｂｏｏｋｓ ｆｒｏｍ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ） Ａｌｌｅｎ Ｋｕａｎ−Ｌｉａｎｇ Ｃｈｅｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ、２０１３、Ｖｏｌ．３１、１０３２−１０４６ Ｅｍｉｌｉａ Ｅｎｔｃｈｅｖａら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００４、 Ｖｏｌ．２５、５７５３−５７６２

医薬及び医療等の分野においてより高品質な細胞を得るために、短時間で足場材料を分解することができ、細胞にダメージを与えることなく、効率的に細胞を回収する技術が求められている。そこで、本発明は、細胞にダメージを与えることなく、効率的に細胞を回収可能な、足場材料から細胞を回収する方法、及び細胞培養用の多糖類足場材料を提供することを課題とする。

本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、比較的低コストで製造可能な多糖類足場材料においてジエチルアミノエチル基による表面修飾が、多糖類分解酵素による分解性を向上させることを見出した。また、多糖類足場材料の平均重合度を小さくすることによってさらに多糖類足場材料の分解性を向上できることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は以下のとおりである。

本発明の態様によれば、細胞培養用の多糖類足場材料から細胞を回収する方法であって、多糖類足場材料がジエチルアミノエチル基で表面修飾されており、２６０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ₂Ｏ以上３２０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ₂Ｏ以下の浸透圧条件と、６．５以上８．０以下のｐＨ条件と、３５℃以上４０℃以下の温度範囲において、多糖類分解酵素を多糖類足場材料に作用させることにより細胞を回収することを含む、細胞の回収方法が提供される。

上記の方法において、多糖類足場材料が放射線照射されていてもよい。

上記の方法において、放射線がγ線又は電子線であってもよい。

上記の方法において、放射線の照射量が１０ｋＧｙ以上６０ｋＧｙ以下であってもよい。

上記の方法において、多糖類足場材料が、セルロース、セルロース誘導体、デキストラン、及びデキストラン誘導体から選択される少なくとも一種を含んでいてもよい。

上記の方法において、セルロース誘導体が架橋セルロースであってもよい。

上記の方法において、多糖類分解酵素がセルラーゼであってもよい。

上記の方法において、デキストラン誘導体が架橋デキストランであってもよい。

上記の方法において、多糖類分解酵素がデキストラナーゼであってもよい。

上記の方法において、多糖類足場材料が粒子状であってもよい。

上記の方法において、細胞が接着性細胞であってもよい。

また、本発明の態様によれば、ジエチルアミノエチル基で表面修飾された、細胞培養用の多糖類足場材料が提供される。

上記の多糖類足場材料において、多糖類の重量平均分子量が５００００未満であってもよい。

上記の多糖類足場材料において、多糖類の平均重合度が３００未満であってもよい。

上記の多糖類足場材料が、放射線照射されていてもよい。

上記の多糖類足場材料が、放射線照射によって、放射線照射前と比較して重量平均分子量が低下しており、かつ、放射線照射後の重量平均分子量が５００００未満であってもよい。

上記の多糖類足場材料が、放射線照射によって、放射線照射前と比較して平均重合度が低下しており、かつ、放射線照射後の平均重合度が３００未満であってもよい。

本発明によれば、細胞にダメージを与えることなく、効率的に細胞を回収可能な、足場材料から細胞を回収する方法、及び細胞培養用の多糖類足場材料を提供可能である。

実施例１に係るセルラーゼ分解反応前のジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子の写真である。 実施例１に係るセルラーゼ分解反応後のジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子の写真である。 実施例３に係る酵素分解反応２０時間後の蛍光顕微鏡観察による細胞の生死確認の結果を示す写真である。 実施例４に係るγ線照射されたジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子のセルラーゼ分解反応前の写真である。 実施例４に係るγ線照射されたジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子のセルラーゼ分解反応３０分後の写真である。 比較例４に係る放射線未照射ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子のセルラーゼ分解反応前の写真である。 比較例４に係る放射線未照射ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子のセルラーゼ分解反応３０分後の写真である。

以下、本発明について詳細に説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。

本実施形態に係る足場材料は、酵素分解可能な多糖類足場材料であり、ジエチルアミノエチル基で表面修飾された多糖類足場材料である。従来、多糖類足場材料で細胞培養を行った後、多糖類分解酵素を多糖類足場材料に作用させて多糖類足場材料を分解することによって細胞を回収することが望まれてきているが、従来の多糖類足場材料は、酵素分解が困難である。本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに、ジエチルアミノエチル基で表面修飾された多糖類足場材料が、ジエチルアミノエチル基で表面修飾されていない多糖類足場材料と比べて、多糖類分解酵素による分解性が飛躍的に向上することを見出した。

細胞にダメージを与えることなく細胞を回収するため、多糖類足場材料の酵素分解反応は生理条件下で実施されることが好ましい。多糖類足場材料の酵素分解反応時の細胞周囲の溶液の浸透圧の範囲は、２６０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ₂Ｏ以上３２０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ₂Ｏ以下であり、好ましくは２７０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ₂Ｏ以上２９０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ₂Ｏ以下である。溶液のｐＨの範囲は、６．０以上８．０以下であり、好ましくは７．０以上７．６以下である。溶液の温度の範囲は、３５℃以上４０℃以下であり、好ましくは３７℃以上３８℃以下である。これらの条件を満たすため、酵素分解反応には、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）や培地等を用いて行うことができる。

酵素分解反応は撹拌条件下でも無撹拌条件下でも行うことが可能であるが、多糖類足場材料と多糖類分解酵素の反応系を均一に保つため、撹拌しながら行うことが好ましい。撹拌回転数などの具体的な撹拌の強さは、反応容器の大きさや形状等によって異なり、撹拌が弱すぎると足場材料が均一に拡散せず、強すぎると細胞がダメージを受けるため、あらかじめ試験的に最適範囲を決めておくことが好ましい。撹拌のためには、通常、撹拌翼が用いられるが、ポンプ等を用いて反応液を循環させても撹拌効果が得られる。その際、内径の細い中空糸等に流通させてシェアストレスを与えることにより分解を促進させることも可能である。

さらに本実施形態において、酵素分解可能な多糖類足場材料は、ジエチルアミノエチル基で表面修飾された多糖類足場材料であって、かつ、例えば放射線照射が施される等して、重合度が低い、あるいは分子量が小さい多糖類足場材料である。本発明者は、多糖類分解酵素による分解性の向上を追求し、驚くべきことに、重合度が低い、あるいは分子量が小さい足場材量を用いると、足場材料としての細胞の増殖性に影響することなく、分解性が向上することを見出した。

従来、重量平均分子量が５００００以上であり、平均重合度が３００以上の多糖類が、多糖類足場材料としての素材として一般的に用いられている。これに対し、本発明者の知見によれば、平均重合度が低いほど、あるいは分子量が低いほど、多糖類の分解性は高くなるため、本実施形態に係る多糖類足場材料の素材は、重量平均分子量が５００００未満、及び／又は平均重合度が３００未満であることが好ましい。

重合度を低くする、あるいは分子量を小さくする手段は任意であるが、例として放射線照射が挙げられる。多糖類足場材料に高エネルギーな放射線を照射すると、多糖類高分子中の炭素と炭素の結合が、ラジカルを発生して開裂することが知られている。その結果、多糖類高分子の分子量がより小さな分子量の高分子へと変化し、多糖類分解酵素の作用しやすい多糖類の高分子末端が増加することによって、酵素分解性が高まるものと推察される。

本実施形態において、照射する放射線は、γ線又は電子線であることが好ましく、特にγ線が好ましい。γ線を発する照射源としてはγ線を発する放射性同位体であれば特に限定されないが、一般的にはコバルト６０がよく用いられる。照射線量は１０ｋＧｙ以上６０ｋＧｙ以下であることが好ましい。線量が低すぎると分解性向上の効果が低く、線量が高すぎると多糖類足場材料そのものが著しく分解されて細胞培養の機能が損なわれる傾向にある。照射条件は、大気条件下で、室温付近で照射されることが好ましい。真空条件化や超低温条件下での照射は、放射線照射によって発生するラジカルが長期にわたって残存する可能性がある。

本実施形態において、多糖類足場材料は、セルロース又はセルロース誘導体からなることが好ましく、より好ましくは架橋セルロースからなる。セルロース及びセルロース誘導体は、セルラーゼで分解することが可能である。セルラーゼは、細胞表面のタンパク質、糖鎖、及び脂質等に作用しないため、細胞にダメージを与えるおそれが低い。

本実施形態において、多糖類足場材料は、デキストラン又はデキストラン誘導体からなっていてもよい。デキストラン誘導体は架橋デキストランであってもよい。デキストラン及びデキストラン誘導体は、デキストラナーゼで分解することが可能である。デキストラナーゼもまた、細胞にダメージを与えるおそれが低い。

多糖類足場材料の形態は、細胞を培養する目的に応じてあらゆる形態をとることが可能であり、例えば、繊維状、膜状、及び粒子状である。このうち、粒子状の多糖類足場材料は、ワクチン製造や細胞治療用幹細胞の培養に適している。粒子は、非多孔質型でも多孔質型でもよいが、特に比表面積の高い多孔質型が、より高い細胞密度を達成できる点で好ましい。

本実施形態において、培養される細胞は、非接着性細胞でも接着性細胞のどちらでもよいが、培養の際に足場材料が必須となるのは一般的には接着性細胞である。接着性細胞の代表的なものとしては、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、及び繊維芽細胞等があげられる。

さらに、本実施形態は、多糖類足場材料の酵素分解性を向上させる前処理方法を含む。本実施形態によれば、多糖類足場材料に放射線照射による前処理を行うことによって、多糖類足場材料の多糖類分解酵素による分解性を向上させることができる。用いられる多糖類足場材料には特に限定はないが、ジエチルアミノエチル基で表面修飾された多糖類足場材料について、この前処理法は特に有効である。多糖類足場材料の材質は、放射線照射によって酵素による分解性が向上するものであれば特に限定はなく、セルロース、セルロース誘導体、デキストラン、及びデキストラン誘導体などがあげられるが、好ましくは、架橋セルロース又は架橋デキストランである。使用する多糖類足場材料は、使用者が自ら調製したものを用いてもよく、購入可能な市販品を用いてもよい。また、購入可能な市販品を使用者が自ら化学修飾や加工を施したものでもよい。

また、本実施形態は、細胞の回収方法を含む。本実施形態によれば、細胞の回収において、細胞を構成するタンパク質や脂質等の成分には直接作用しにくい多糖類分解酵素を用いるため、一般的なトリプシンなどのタンパク質分解酵素を用いた細胞回収方法に比べて、細胞へのダメージが少ない細胞回収方法を提供することが可能である。

以下、実施例及び比較例に基づいて本実施形態をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例及び比較例に限定されるものではない。

以下の実施例及び比較例において、粒子径分布、平均細孔径、及び荷電容量は、以下の方法で測定した。

（粒子径分布の測定）
乾燥粒子をリン酸緩衝液で膨潤させたのち、減圧式吸引ろ過器を用いて、リン酸緩衝液を３０重量パーセントＴｗｅｅｎ２０水溶液へと置換したものを測定資料とした。粒子径はコールターカウンター（Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４、ベックマン・コールター）を用いて測定した。

（平均細孔径の測定）
乾燥粒子を２０体積パーセントエタノール溶液に懸濁したのち、減圧式吸引ろ過器を用いて、段階的にエタノール濃度をあげながら溶媒置換を行って１００体積パーセントメタノールに置換した後、さらに、１００体積パーセントｔ−ブタノールに溶媒置換し、凍結乾燥を行ったものを用いて測定した。測定には水銀ポロシメーター（ＡｕｔｏＰｏｒｅ ＩＶ９５００、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ）を用いて測定した。

（荷電容量の測定）
荷電容量としてイオン交換容量の測定を行った。乾燥し風袋重量を測定したガラスフィルターに約１ｇの乾燥粒子を秤量し、０．３Ｎ塩酸水溶液で洗浄し吸引脱水後、１０重量パーセントＮａ₂ＳＯ₄水溶液で洗浄吸引脱水を行ったろ液を採取し、ろ液の滴定を行った。ろ液を採取後、粒子の残ったガラスフィルターは純水にて洗浄乾燥後、秤量して、乾燥粒子重量を求めた。ろ液中の塩化物イオン量を、０．１ｍｏｌ／Ｌクロム酸カリウムを指示薬として硝酸銀溶液で滴定するモール法を用いて求めた。求めた塩化物イオン量を秤量して求めた乾燥粒子重量で割った値を荷電容量とした。

（実施例１：ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子のセルラーゼを用いた酵素分解）
精製リンターを原料として、セルロース濃度が２重量パーセントのセルロース銅安溶液を調製した。調製したセルロース銅安溶液を、二流体ノズルを用いて窒素ガスと共に５００ｃｃ噴霧し、−４０℃に冷却したシリコンオイル１０リットル中に撹拌しながら受けた。その後、シリコンオイルを−２０℃に昇温し、続けて、−３５℃に冷却した４０重量パーセント硫酸１０リットルを投入した。硫酸投入後、８時間撹拌を続け、２０℃に昇温させ、シリコンオイルを除去した残りを水洗し、多孔質セルロース球状粒子を得た。続いて、架橋処理を行って、架橋多孔質セルロース粒子を得た。さらに、ジエチルアミノエチル基を導入する表面修飾反応を行った後、凍結乾燥を行い、ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子を得た。得られたジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子は、粒子径分布が２００μｍ以上２８０μｍ以下、平均細孔径３０μｍであった。荷電容量は、１．９０ｍｍｏｌＣｌ^-／ｇであった。

得られたジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子の乾燥粉末を１００ｍｇ計量し、１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．５、浸透圧２８０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ₂Ｏ）に懸濁した粒子懸濁液を調製し、セルラーゼによる酵素分解反応試験を行った。反応開始前の粒子を顕微鏡観察した結果を図１Ａに示す。調製した粒子懸濁液１ｍＬに対し、１６００Ｕ／ｍＬに調製したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来セルラーゼ（ＭＰ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）のＰＢＳ溶液を２ｍＬ添加し、３７℃にて振とうしながら、２時間の酵素分解反応を行ったところ、ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子は、酵素分解された。セルラーゼ反応後の粒子を顕微鏡観察した結果を図１Ｂに示す。

（実施例２：ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子のセルラーゼを用いた酵素分解）
得られた粒子の荷電容量が１．００ｍｍｏｌＣｌ^-／ｇであった以外は、実施例１に記載の方法と同様にしてジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子の調製と、セルラーゼによる酵素分解反応試験を行った。ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子は、酵素分解されることを確認した。

（比較例１：ジエチルアミノエチル基未修飾架橋セルロース多孔質粒子のセルラーゼを用いた酵素分解）
ジエチルアミノエチル基を導入する修飾反応を行わなかったこと以外は、実施例１に記載の方法と同様にしてジエチルアミノエチル基未修飾架橋セルロース多孔質粒子の調製と、セルラーゼによる酵素分解反応試験を行った。ジエチルアミノエチル基未修飾架橋セルロース多孔質粒子は、酵素分解されなかった。

（比較例２：ジエチルアミノエチル基未修飾未架橋セルロース多孔質粒子のセルラーゼを用いた酵素分解）
架橋処理とジエチルアミノエチル基を導入する修飾反応を行わなかったこと以外は、実施例１に記載の方法と同様にして未架橋セルロース多孔質粒子の調製と、セルラーゼによる酵素分解反応試験を行った。未架橋セルロース多孔質粒子は、酵素分解されなかった。

（実施例３：ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子からのセルラーゼを用いた細胞の回収）
実施例１に記載の方法と同様にして調製したジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子を用いてｖｅｒｏ細胞の無血清培養を行った。無血清培地は、ＢＭｐｒｏ−Ｖ（細胞科学研究所）とＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１対１で混合した液体培地に、遺伝子組換えヒト上皮成長因子（和光純薬）、遺伝子組換えヒトインシュリン（和光純薬）、及びウシ血清アルブミン（和光純薬）を添加して調製した。ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１、登録商標）は、無血清培地に馴化させて用いた。培養面積７５ｃｍ²のＴ−フラスコを用いてコンフルエントに達するまで培養したｖｅｒｏ細胞をトリプシン処理して回収して細胞懸濁液を調製した。

ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子は、培養前にＰＢＳに懸濁してオートクレーブ滅菌を行った。１２５ｍＬスピナーフラスコ（Ｃｅｌｓｔｉｒ、登録商標、Ｗｈｅａｔｏｎ）に、滅菌したジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子を、乾燥重量として最終濃度が２ｇ／Ｌとなるように添加し、無血清培地を７０ｍＬ添加した。ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子を含む溶液に、細胞懸濁液を、細胞濃度が５ｘ１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で、５０ｒｐｍで撹拌しながら培養を行った。培養５日目以降、培地交換率１００％で毎日培地交換を行いながら、１２日間の培養を行った。細胞増殖の経過観察のため、培養４日目以降、毎日培養液をサンプリングして、細胞数を測定した。細胞数は、クリスタルバイオレットを含む脱核染色液を用いて細胞核数を計数して求めた。培養１２日目に、培養液当たり細胞数が１．１ｘ１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達した。

続いて、得られた細胞培養液をジエチルアミノ修飾架橋セルロース多孔質粒子が均一になるように撹拌しながら１５ｍＬ採取し、滅菌した１２５ｍＬスピナーフラスコに添加した。１０分間静置して粒子を沈降させた後、上澄み液を吸引して捨て、ＰＢＳ（ｐＨ７．５、浸透圧２８０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ₂Ｏ）を３０ｍＬ添加し、２０００Ｕ／ｍＬに調製したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来セルラーゼ（ＭＰ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）のＰＢＳ溶液を３０ｍＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター内で撹拌しながら反応を行った。２時間後に観察を行ったところ、粒子が分解している様子が観察されたが、分解が不完全であったため、さらに２０時間の酵素分解反応を行ったところ、ほとんどの粒子が分解された。細胞の生死確認のために反応液の一部を採取し蛍光試薬（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＥ、登録商標、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色を行って蛍光顕微鏡観察をおこなったところ、ほとんどの細胞の生存が確認された。蛍光顕微鏡観察の結果を図２に示す。６０ｍＬの反応液を滅菌した遠心管に回収し、５００ｘｇ、５分間の遠心を行った後、回収した細胞を１０ｍＬの無血清培地に懸濁して、濃縮細胞液を得た。回収した細胞数を測定した結果、細胞回収率９９％、生存率９０％であった。回収した細胞の生育性を確認するため、培養面積７５ｃｍ²のＴ−フラスコで無血清培地を用いて継代培養を行ったところ、５日目でほぼコンフルエントに達し、生育性に問題ないことが確認された。

（比較例３：ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子からのセルラーゼを用いた細胞の回収）
セルラーゼによる分解反応の際に、ＰＢＳの代わりに２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ₂Ｏ）を用いた以外は、実施例３と同じ方法で培養とセルラーゼを用いた細胞回収を行った。２０時間の酵素分解反応後、ほとんどの粒子は分解されたが、ほとんどの細胞は死滅した。

（実施例４：γ線照射されたジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子のセルラーゼ分解）
実施例１に記載の方法と同様にして調製したジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子の乾燥粉末２０ｇをポリエチレン製容器に計量して密封した後、照射線量２５ｋＧｙでγ線を照射した。γ線照射されたジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子を、滅菌された容器に１００ｍｇ計量し、ＰＢＳを加えて２ｍｇ／ｍＬとなるように粒子懸濁液を調製した。反応開始前の粒子の様子を顕微鏡観察した結果を図３Ａに示す。調製した粒子懸濁液５ｍＬに対し、２０００Ｕ／ｍＬに調製したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来セルラーゼ（ＭＰ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）のＰＢＳ溶液を５ｍＬ添加し、３７℃にて振とうしながら、３０分間の酵素分解反応を行ったところ、γ線照射されたジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子は分解された。分解反応３０分後の顕微鏡観察結果を図３Ｂに示す。

（実施例５：γ線照射されたジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子のセルラーゼ分解）
照射線量を５０ｋＧｙとした以外は実施例４と同じ方法でγ線照射されたジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子の懸濁液の調製とセルラーゼ分解反応を行った。γ線照射されたジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子は分解された。

（比較例４：未照射ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子のセルラーゼ分解）
γ線照射をしなかったこと以外は実施例４と同じ方法で未照射ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子の懸濁液の調製とセルラーゼ分解反応を行った。反応開始前の粒子の顕微鏡観察結果を図４Ａに示す。分解反応３０分後の顕微鏡観察結果を図４Ｂに示す。未照射ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子の一部は分解したが粒子形状を維持していた。

（実施例６：γ線照射されたジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子からのセルラーゼを用いた細胞の回収）
実施例４に記載の方法と同様にして調製したγ線照射されたジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子を用いて実施例３と同じ方法でｖｅｒｏ細胞の無血清培養を行った。培養１２日目に、培養液当たり細胞数が１．０ｘ１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達した。続いて、得られた細胞培養液をジエチルアミノ修飾架橋セルロース多孔質粒子が均一になるように撹拌しながら１５ｍＬ採取し、滅菌した５０ｍＬ遠沈管に添加した。１０分間静置して粒子を沈降させた後、上澄み液を吸引して捨て、ＰＢＳを１５ｍＬ添加し、１０００Ｕ／ｍＬに調製したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属由来セルラーゼ（ＭＰ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）のＰＢＳ溶液を１５ｍＬ添加し、３７℃にて振とうしながら酵素分解反応を行ったところ、２時間後にはジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子が酵素分解された。回収した細胞を、培養面積７５ｃｍ²のＴ−フラスコの無血清培地に播種して継代培養を行ったところ、５日目でほぼコンフルエントに達し、生育性に問題ないことが確認された。

（実施例７：γ線照射されたジエチルアミノエチル基修飾架橋デキストラン粒子のデキストラナーゼ分解）
ジエチルアミノエチル基修飾架橋セルロース多孔質粒子の代わりに、ジエチルアミノエチル基修飾架橋デキストラン粒子（Ｃｙｔｏｄｅｘ １、登録商標、ＧＥヘルスケア）を用いたこと以外は実施例４と同じ方法で粒子懸濁液を調製した。調製した粒子懸濁液５ｍＬに対し、１０００Ｕ／ｍＬに調製したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属由来デキストラナーゼ（和光純薬）のＰＢＳ溶液を５ｍＬ添加し、３７℃にて振とうしながら、３０分間の酵素分解反応を行ったところ、γ線照射されたジエチルアミノエチル基修飾架橋デキストラン粒子は分解された。

（比較例５：未照射ジエチルアミノエチル基修飾架橋デキストラン粒子のデキストラナーゼ分解）
γ線照射をしなかったこと以外は実施例６と同じ方法で未照射ジエチルアミノエチル基修飾架橋デキストラン粒子の懸濁液の調製とデキストラナーゼ分解反応を行った。未照射ジエチルアミノエチル基修飾架橋デキストラン粒子の一部は分解したが粒子形状を維持していた。

本発明によれば、多糖類足場材料から細胞にダメージを与えることなく、高品質で効率的な細胞回収が可能となるため、医薬及び医療の分野で産業上の利用可能性を有する。

Claims (17)

1. 細胞培養用の多糖類足場材料から細胞を回収する方法であって、
   前記多糖類足場材料がジエチルアミノエチル基で表面修飾されており、
   ２６０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ₂Ｏ以上３２０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ₂Ｏ以下の浸透圧条件と、
   ６．５以上８．０以下のｐＨ条件と、
   ３５℃以上４０℃以下の温度範囲において、
   多糖類分解酵素を前記多糖類足場材料に作用させることにより細胞を回収することを含む、細胞の回収方法。
2. 前記多糖類足場材料が放射線照射されている、請求項１に記載の細胞の回収方法。
3. 前記放射線がγ線又は電子線である、請求項２に記載の細胞の回収方法。
4. 前記放射線の照射量が１０ｋＧｙ以上６０ｋＧｙ以下である、請求項２又は３に記載の細胞の回収方法。
5. 前記多糖類足場材料が、セルロース、セルロース誘導体、デキストラン、及びデキストラン誘導体から選択される少なくとも一種を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞の回収方法。
6. 前記セルロース誘導体が架橋セルロースである、請求項５に記載の細胞の回収方法。
7. 前記多糖類分解酵素がセルラーゼである、請求項５又は６に記載の細胞の回収方法。
8. 前記デキストラン誘導体が架橋デキストランである、請求項５に記載の細胞の回収方法。
9. 前記多糖類分解酵素がデキストラナーゼである、請求項５又は８に記載の細胞の回収方法。
10. 前記多糖類足場材料が粒子状である、請求項１から９のいずれか１項に記載の細胞の回収方法。
11. 前記細胞が接着性細胞である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の細胞の回収方法。
12. ジエチルアミノエチル基で表面修飾された、細胞培養用の多糖類足場材料。
13. 多糖類の重量平均分子量が５００００未満である、請求項１２に記載の細胞培養用の多糖類足場材料。
14. 多糖類の平均重合度が３００未満である、請求項１２又は１３に記載の細胞培養用の多糖類足場材料。
15. 放射線照射されている、請求項１２に記載の細胞培養用の多糖類足場材料。
16. 前記放射線照射によって、放射線照射前と比較して重量平均分子量が低下しており、かつ、前記放射線照射後の重量平均分子量が５００００未満である、請求項１５に記載の細胞培養用の多糖類足場材料。
17. 前記放射線照射によって、放射線照射前と比較して平均重合度が低下しており、かつ、前記放射線照射後の平均重合度が３００未満である、請求項１５又は１６に記載の細胞培養用の多糖類足場材料。