JPS6152280A

JPS6152280A - 細胞培養床

Info

Publication number: JPS6152280A
Application number: JP59171603A
Authority: JP
Inventors: Keiichi Yamada; 敬一山田; Masao Kariya; 刈屋　雅雄; Yoshikazu Fukai; 深井　芳和; Masaaki Kitajima; 北島　政明
Original assignee: Japan Synthetic Rubber Co Ltd
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 1984-08-20
Filing date: 1984-08-20
Publication date: 1986-03-14

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、哺乳類動物を始めとする生物の細胞を培養す
るために使用される細胞培養床に関するものである。

従来の技術近年、生物の細胞の種々の条件下における反応、その他
の特性の研究あるいは特定の細胞の代謝活動による生成
物の研究が活発に行われており、特に純人工的には合成
不可能なあるいは合成が極めて困難な物質を、特定の細
胞の活動を利用して製造することが多方面において検討
されている。

そのような物質の具体例としては、例えばワクチン、イ
ンターフェロン、ホルモン、リンフ才力イン、その他を
挙げることができる。

発明が解決しようとする問題点かかる細胞の培養は、通常細胞を培養床に接種したもの
を例えば培地中に置き、核細胞に適応した環境条件下で
恒温培養することによって行われるが、種々の制約があ
って所期の細胞培養を行うことは相当に困難である。そ
の障害のうち大きなものとして培養床の問題がある。

即ち、正常２倍体細胞などの接着性細胞は、培養床に接
着して単層で増殖するものであるので、培養収量は使用
される培養床の状態、特にその増殖性の良否によって大
きく左右される。

従来においては、多糖類のような高分子物質、ある種の
合成重合体などが培養床として用いられているが、必ず
しも良好な結果を得ることができないため、新規で有用
な細胞培養床の出現が強く望まれている。

本発明は、かかる従来の技術的課題を背景になされたも
ので、その目的とするところは高い培養収率で細胞培養
を行うことのできる細胞培養床を桿供することにある。

問題点を解決するための手段本発明者らは新規な細胞培養床を求めて鋭意研究を重ね
た結果、天然由来の蛋白質の中で特定の材料を選択し、
更に架橋反応により架橋体とすることにより、接着依存
性細胞に対し大きな増殖性を有する細胞培養床を作製で
きることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成す
るに至ったものである。

即ち本発明は、可溶化フィブロインの架橋体により表面
が形成されていることを特徴とする細胞培養床である。

本発明の細胞培養床は、繭糸から化学的可溶化処理によ
り抽出した繭糸由来の蛋白質であるフィブロインから作
製されるが、これは繭糸由来の蛋白質の中、フィブロイ
ンは水不溶性であるために、化学的可溶化処理により抽
出するものである。

そしてこの可溶化フィブロインを物理的または化学的手
段を用いて架橋体となし、培養床を形成させるものであ
る。

繭糸の化学的可溶化処理によるフィブロインの抽出方法
としては、例えば下記ｉ）〜■）が挙げられる。

ｉ）繭糸に例えば１０００〜３０００倍量の水を加え、
１１０〜１３０℃程度で加熱し、次いで０．１〜２重量
％塩酸に２０〜３０時間浸し、水、エタノール、エーテ
ルなどを用いて順次洗浄する。

このようにして得られた精練繭糸を例えば銅エチレンジ
アミン錯塩、臭化リチウム、塩化カルシウム、硝酸カル
シウム、チオシアン酸、ジクロル酢酸などの０．１〜１
０重量％水溶液に溶かし、５〜２０重量％溶液となし、
次いで酢酸などで中和後、水に対し１０〜３０’Ｃで透
析し、低分子化合物を除去することにより可溶化フィブ
ロインを得る。

１ｉ）ｉ）と同様に精練繭糸を作製し、これを２０〜６
０重量％の塩化カルシウム水溶液に溶かし、水に対し１
０〜３０℃で透析し、低分子化合物を除去することによ
り可溶化フィブロインを得る。

１ｉｉ）ｉ）と同様に精練繭糸を作製し、例えば５〜１
００重量％の蟻酸水溶液または蟻酸に溶かし、水酸化ナ
トリウムなどで中和後、水に対し１０〜３０℃で透析し
、低分子化合物を除去することにより可溶化フィブロイ
ンを得る。

１ｖ）ｉ）と同様に精練繭糸を作製し、これを５０〜８
０重量％チオシアン酸リチウム水溶液に溶かし４０〜８
０重量％溶液となし、４０〜６０℃で１〜３時間攪拌す
る。これを水に対して１０〜３０℃で透析し、低分子化
合物を除去することにより可溶化フィブロインを得る。

■）蚕の絹糸腺内容物を、例えば水または０．０５〜０
．１５Ｍ塩化アンモニウムおよび０．０５〜０．１５Ｎ
アンモニア水混合液に溶解し攪拌する。生しる繊維状沈
澱物を５〜２０重量％の銅エチレンジアミン錯塩溶液に
溶かし０．１〜１０重量％溶液とし、これを酢酸で中和
後、水に対し１０〜３０℃で透析し、低分子化合物を除
去することにより可溶化フィブロインを得る。

抽出された繭糸由来のフィブロインは水溶性となってお
り、これらを細胞培養用担体表面上において架橋するこ
とにより架橋体となし、水不溶性に改質する。

その方法としては、可溶化フィブロインを、グルタルア
ルデヒド、ホルムアルデヒドなどの化学的架橋剤により
架橋させる方法（化学的架橋）、または紫外線照射によ
り可溶化フィブロインを架橋する方法（物理的架橋）な
どが用いられる。

細胞培養担体は、種々の材質および形状のものを用いる
ことができる。

ここに材質および形状は特定されるものではないが、そ
の例を挙げると、材質としてはポリスチレン、ガラスな
どを、形状としてはシャーレ状、繊維状、粒子状などを
示すことができる。

架橋方法の例を挙げると、（＋）前記可溶化フィブロイ
ンを０．１〜２重量％濃度の水溶液とし、ポリスチレン
製シャーレに流し込み、室温で１０〜６０分間放置した
後、均一に架橋させるために可溶化フィブロイン溶液を
少量残してその大部分を除去し、シャーレを直ちに窒素
気流下に置き、低圧水銀灯で１〜２４時間紫外線を照射
する方法、または（ｉｉ）前記可溶化フィブロインを０
．１〜２重量％濃度の水溶液とし、ポリスチレン製シャ
ーレに流し込み、室温で１０〜６０分間放置した後、可
溶化フィブロインの大部分を除去し、空気中または窒素
気流下で乾燥後、ｐ　Ｈ７の１００ｍＭ燐酸ナトリウム
水溶液またはｐ　Ｈ８の１００ｍＭ炭酸ナトリウム水溶
液などのｐＨ７〜９の緩衝液に溶解した１〜５重量％ゲ
ルタンアルデヒドなどの化学的架橋剤を流し込み、室温
で１〜２４時間放置する方法などを示すことができる。

架橋処理を施した細胞培養床は、ｐＨ７前後の緩衝液、
好ましくは、ｐ　Ｈ７程度の１０〜１００　ｍ　Ｍｔ８
酸ナトリウムと水で洗浄後、低圧水銀灯などで１〜２時
間紫外線滅菌した後、細胞培養に供する。

本発明の細胞培養床は、種々の細胞の培養に用いること
ができる。細胞の種類は、特に限定されるものではない
が、その例を挙げると、ヒト子宮癌細胞Ｈｅ１ａ、チャ
イニーズハムスター肺細胞Ｖ−７９、ヒト胎児肺細胞Ｍ
Ｒ（、−５、ヂンパンジー肝繊維芽細胞、ヒト包皮細胞
、ニワトリ胎児繊維芽細胞などがある。

また本発明の細胞培養床は、種々の細胞培養液を用いて
種々の条件下で細胞を培養できる。

細胞培養液および培養条件は特に限定されるものではな
いが、その例を挙げると細胞培養液としては、１〜３０
重量％の子牛血清または牛胎児血清を含むミニマルーエ
ソセンシャル培地（ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａ
ｌ　ｍｅｄｉｕｍ、汎用細胞培養用基礎培地の一種）や
、１〜３０重量％の子牛血清または牛胎児血清を含むダ
ルベツコ変法イーグル培地などがあり、培養条件として
は、炭酸ガスインキュベーター（２〜５％炭酸ガスが好
ましい）で温度３５〜４０°Ｃ１好ましくは３６〜３８
℃などである。最適培養温度、培養雰囲気などは、培養
する細胞に応じて選択する。

作用本発明は、繭糸由来の可溶化フィブロインを得、これを
架橋することにより得られる架橋体を細胞培養床に利用
することにより、細胞の増殖を向上せしめるものである
。

実施例以下実施例を挙げ本発明を更に具体的に説明−するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１繭糸である絹糸１．０ｇを２１の蒸留水に浸し、１２０
℃で３時間加圧、加熱を行い、この操作を４回繰り返し
た後、１重量％塩酸２００ｍ１に室温で２４時間浸し、
その後蒸留水、エタノール、エーテルで洗浄した。

得られた精練絹糸０．７５ｇを０．８Ｍ銅エチレンジア
ミン錯塩水溶液５０ｒｒ＋２に溶かシ酢酸で中和後、蒸
留水に対し透析し、低分子化合物を除去した。

得られた可溶化フィブロインを０．２５重量％の水溶液
とし、これをポリスチレン製シャーレに流し込み室温３
０分間放置した後、ピペットを用いて可溶化フィブロイ
ンが薄くシャーレ表面を濡らす程度を残して吸い取った
。

次いで窒素気流下に置き、ＩＯＷの低圧水銀灯で２０時
間紫外線を照射した。１０〜１００ｍＭ燐酸ナトリウム
水溶液と蒸留水で洗浄し、自然乾燥した後、紫外線殺菌
してチャイニーズハムスター肺細胞（Ｖ−７９細胞）を
培養した。

培養液としては、１０重量％牛脂児血清を含むミニマル
ーエソセンシャル培地を用いた。

培地１ｍｐ当たりｌＸｌ０’個の培養細胞を播種し、５
％炭酸ガス雰囲気の温度３７゛Ｃの環境下、１４４時間
の培養で培地１ｍβ当たり平均３．７Ｘ１０６個となり
、良好な増殖が観察された。

実施例２繭糸である絹糸１．０ｇを２ρの蒸溜水に浸し、１２０
℃で３時間加圧、加熱を行い、この操作を４回繰り返し
た後、１重量％塩酸水溶液２００ｍ１に室温で２４時間
浸し、その後蒸溜水・エタノール、エーテルで洗浄した
。

得られた精練絹糸０．７５ｇを７０重量％チオシアン酸
リチウム水溶液５０ｍβに溶かし、５０°Ｃで２時間攪
拌した。その水溶液を蒸溜水に対して室温で２日間透析
し、低分子化合物を除去した。

得られた可溶化フィブロインを０．２５重量％の水溶液
とし、これをポリスチレン製シャーレに流し込み、室温
に３０分間放置した後、ピペットを用いて可溶化フィブ
ロイン？容液が薄くシャーレ表面を濡らす程度を残して
吸い取った。

直ちに窒素気流下に置き、１０Ｗの低圧水銀灯で２０時
間、紫外線を照射した。生理食塩水と蒸溜水で洗浄し、
自然乾燥した後、紫外線殺菌して、■−７９細胞を培養
した。

培養液としては、１０重量％牛脂児血清を含むミニマル
ーエソセンシャル培地を用い、培養条件を５％炭酸ガス
雰囲気、３７℃としたところ、培地１ｍ［当たり２Ｘ１
０’個の細胞が７２時間で培地１ｍｐ当たり平均１×１
０６個となり、良好な増殖が観察された。

実施例３繭糸である絹糸］、Ｏｇを２１の蒸溜水に浸し、１２０
℃で３時間加圧、加熱を行い、この操作を４回繰り返し
た後、１重量％塩酸水溶液２００ｍｌ１に室温で２４時
間浸し、その後蒸溜水、エタノール、エーテルで洗浄し
た。

得られた精練絹糸０．７５ｇを蟻酸５０ｍ１ｌ！に溶か
し、水酸化ナトリウムで中和後、水に対して２５°Ｃで
透析し、低分子化合物を除去し、得られた可溶化フィブ
ロインを０．２５重量％の水溶液とし、これをポリスチ
レン製シャーレに流し込み、室温に３０分間放置した後
、ピペットを用いて可溶化フィブロイン溶液が薄くシャ
ーレ表面を濡らす程度を残して吸い取った。

直ちに窒素気流下に置き、ＩＯＷの低圧水銀灯で２０時
間、紫外線を照射した。生理食塩水と蒸溜水で洗浄し、
自然乾燥した後、紫外線殺菌して、■−７９細胞を培養
した。

培養液としては、１０重量％牛脂児血清を含むミニマル
ーエソセンシャル培地ヲ用い、培養条件を５％炭酸ガス
雰囲気、３７°Ｃとしたところ、培地１ｍβ当たり２Ｘ
１０’個の細胞が９６時間で培地１ｍβ当たり平均１．
８Ｘ１０６個となり、良好な増殖が観察された。

実施例４繭糸である絹糸１．０ｇを２１の蒸溜水に浸し、１２０
℃で３時間加圧、加熱を行い、この操作を４回繰り返し
た後、１重量％塩酸水溶液２００ｍ１に室温で２４時間
浸し、その後蒸溜水、エタノール、エーテルで洗浄した
。

得られた精練絹糸０．７５ｇを０．８Ｍ銅エチレンジア
ミン錯塩水溶液５０ｍ１に溶かし、酢酸で中和後、蒸溜
水に対して２５℃で透析し、低分子化合物を除去した。

得られた可溶化フィブロインを１重量％の水溶液とし、
これに平均粒径１８０μｍのポリスチレン粒子を入れた
。

室温で１時間放置した後、可溶化フィブロイン溶液が薄
く粒子表面を濡らす程度を残して除去し、窒素気流下で
１０Ｗの低圧水銀灯で２０時間、紫外線を照射した。

生理食塩水と蒸溜水で洗浄し、自然乾燥した後、紫外線
殺菌して、Ｖ−７９細胞を培養した。

培養に当たっては、培養液１１に対して約１゜２Ｘ１０
７個の前記で得られた粒子を用いた。

培養液としては、１０重量％牛脂児血清を含むミニマル
ーエソセンシャル培地を用い、培養方法は、内容積２０
０ｍｎのスピンナー瓶を用い、回転数３Ｑｒｐｍで培養
する方法とした。

培地１ｒｒ＋４２当たりＩ　Ｘ　１０’個の培養細胞を
播種し、５％炭酸ガス雰囲気で温度３７°Ｃの環境下、
１４４時間の培養で培地１ｍ７！当たり平均４．２１０
６個となり、良好な増殖が観察された。

発明の効果前記のように本発明によれば、高い培養収率で細胞培養
を行うことができる細胞培養床を提供することができる
。

Claims

【特許請求の範囲】

１、可溶化フィブロインの架橋体により表面が形成され
ていることを特徴とする細胞培養床。