CN107899086A - 一种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白纳米纤维血管修复材料及其制备方法 - Google Patents

一种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白纳米纤维血管修复材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白纳米纤维血管修复材料及其制备方法，该方法包括，通过还原胺化法得到透明质酸寡糖‑胶原蛋白偶联产物，然后通过静电纺丝方法制备得到该新型透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白静电纺丝纤维膜，通过对内皮细胞在纤维膜材料上的形貌观察、增殖情况分析和表型鉴定，表明该纤维膜材料有较好的生物相容性，有良好的促血管内皮化增殖效果，用透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白有望作为血管修复的支架材料。

Description

一种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白纳米纤维血管修复材料及 其制备方法
技术领域
本发明涉及一种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白纳米纤维血管修复材料及其制备方法，
属于生物医用材料制备领域。
背景技术
透明质酸(HA)是一种存在于细胞外基质中的糖胺聚糖，在维持组织细胞结构和功能完整性，调控细胞的粘附、增殖和分化等方面发挥重要作用。透明质酸特有的流变学特性、粘弹性、吸湿性、以及良好的生物相容性使其在生物医学领域有广泛应用，特别是低分子量的透明质酸在抗凝血和促进血管化方面，具有很好的利用前景。胶原蛋白是细胞外基质中主要的蛋白质成分，是由三条肽链形成的三螺旋结构的蛋白质，在组织工程和生物医学领域具有广泛应用。
中国专利文献CN103260628A(申请号201180048162.7)公开了一种促进血管生成的药物组合物，其中组合物的活性组分为分子量为12～2000kDa的透明质酸与选自胶原蛋白、明胶、细胞及生长因子中的一种或多种的组合，透明质酸的浓度为0.02～50mg/mL，有效用于促进血管生成。中国专利文献CN105037529A(申请号201510405796.3)公开了一种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新型生物材料及其制备方法，该发明指出透明质酸的3～10双糖片段有刺激血管再生的作用，所以该发明通过酶法水解和分离纯化，首先成功制备批量透明质酸3～10双糖片段，然后通过交联制备透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白，其中透明质酸寡糖的分子量为397.33～3911.21Da，在交联产物中，透明质酸寡糖的质量百分比为0.2～5.1％。
利用透明质酸寡糖(oHAs)修饰胶原蛋白，制备一种具有抗凝血和促进血管化功能的新型血管修复支架，有望用于血管移植，修复与再生，治疗严重威胁人类健康的心血管疾病。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白纳米纤维血管修复材料及其制备方法，通过还原胺化法得到透明质酸寡糖-胶原蛋白偶联产物，然后通过静电纺丝方法制备一种新型透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白静电纺丝纤维膜，并对纤维膜材料的生物相容性及促血管内皮化性能进行研究，为制备血管修复支架材料用于血管修复与再生奠定基础。
本发明的技术方案如下：
一种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白纳米纤维血管修复材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白的制备：通过氰基硼氢化钠还原透明质酸寡糖醛基与胶原蛋白上自由氨基缩合形成终产物席夫碱，在30～40℃条件下磁力搅拌20～30h得到反应液，除去反应液中未反应的透明质酸寡糖，得到透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白；
(2)糖基化胶原蛋白的纤维成型：利用静电纺丝工艺，将步骤(1)得到的透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白溶入有机溶剂中，磁力搅拌制备纺丝液，然后在15～25kV的高压电场下，调节纺丝液的给液速度为1.0～2.0mL/h，纺丝液总体积为0.5～1.5mL，静电纺丝制备三维多孔纳米纤维膜材料，并采用质量体积百分比浓度为20～30％的戊二醛水溶液熏蒸交联40～60h；
其中，透明质酸寡糖的分子量范围为776～3000Da，偶联得到透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白中透明质酸寡糖的质量百分比为1.44％～2.66％。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述的缩合反应的溶剂为体积比3:2的六氟异丙醇和0.1mol/L NaHCO3溶液的混合体系，共5mL，pH 7.0。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述的磁力搅拌反应条件为37℃反应24h。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述除去反应液中未反应的透明质酸寡糖的方法为：将反应液与体积百分比浓度为5％的乙酸溶液按体积比1∶2的比例混合，选择截留分子量为30kDa的超滤管，转速3500～4000r/min超滤离心20～30min，再用体积百分比浓度为5％的乙酸重悬，按以上步骤再进行超滤4～6次。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的有机溶剂为质量体积百分比浓度8％的六氟异丙醇溶液，单位g/mL。
所述的纺丝液为肉眼可观的挂壁粘溶液。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的静电纺丝条件为在20kV的高压电场下，调节纺丝液的给液速度为1.5mL/h，纺丝液总体积为0.9mL，纺丝距离为90mm，纺丝用铝箔覆盖硬纸板尺寸为10cm×10cm。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的纺丝纤维膜熏蒸采用质量体积百分比浓度为25％的戊二醛水溶液，熏蒸交联48h。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的熏蒸方法为：将质量体积百分比浓度为25％的戊二醛水溶液盛放在直径10cm的培养皿中，置于直径21cm的干燥器底部，将透明质酸寡糖-胶原蛋白静电纺丝纤维膜置于干燥器的干燥盘上。
上述纤维膜材料在制备血管修复支架材料中的应用。
本发明采用的还原胺法对胶原蛋白进行透明质酸修饰的反应原理如下：
本发明未详尽说明的，均按本领域常规技术。
本发明的有益效果如下：
1.采用还原胺化法所得的偶联产物透明质酸寡糖含量在1.44％～2.66％之间，可在某种程度上从组分方面模仿、构建和天然血管基质具有类似组分的仿生基质；采用静电纺丝工艺对透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白进行静电纺丝，对所得的纺丝膜材料采用戊二醛蒸汽或EDC/乙醇法(含有EDC的95％乙醇体系)进行有效交联，材料纤维形貌仍能维持，所得产物与天然细胞外基质的纳米纤维网状结构类似。
2.透明质酸和胶原蛋白都是来自机体组织本身的纯天然材料，具有很好的生物相容性，是用于诱导血管生成的理想材料，所用的透明质酸寡糖可以促进血管内皮化，通过对内皮细胞在纤维膜材料上的形貌观察、增殖情况分析和表型鉴定，表明该纤维膜材料有较好的生物相容性，有良好的促血管内皮化增殖效果，用透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白在具有良好生物相容性的基础上，有望作为血管修复的支架材料。
3.采用还原胺法所得的透明质酸-胶原蛋白偶联产物易于加工处理，制备过程简单，成本较低，可以实现透明质酸寡糖对胶原蛋白修饰的批量化生产。
附图说明：
图1为本发明还原胺法制备的透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白血管修复材料的红外图谱。
图2为本发明静电纺丝纤维膜的扫描电镜照片。
图3为本发明静电纺丝纤维膜作为血管内皮细胞生长附着的支架下的细胞形貌照片。
图4为血管内皮细胞在纤维膜上的增殖结果柱状图。
图5为血管内皮细胞在纤维膜上的表型鉴定结果柱状图。
具体实施方式：
为了进一步阐明本发明所述的技术方案，下面结合实施例进行详细描述。应理解，本发明不限于下述实施例。
实施例中所有的原料均为常规原料，市购产品。其中胶原蛋白：成都市科乐生物技术有限公司；透明质酸酶及透明质酸分别购自Sigma和华熙福瑞达生物医药有限公司，透明质酸分子量5kDa。透明质酸寡糖按照中国专利CN105037529A公开的方法制备。
实施例1：还原胺化法制备透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白
以体积比3:2量取六氟异丙醇和0.1mol/L的NaHCO3配制5mL混合液(pH 7.0)于反应瓶中，称取20mg透明质酸寡糖，80mg胶原蛋白，30mg氰基硼氢化钠加入反应体系中，震荡摇匀；磁力搅拌，37℃反应24h；反应结束后，向反应瓶中加入2倍反应液体积的5％(体积百分数)的乙酸；选取截留分子量为30kDa容积为15mL超滤管，转速3500～4000r/min超滤离心20～30min；用5％乙酸重悬，每次离心后检测产物中透明质酸寡糖的质量比，直至透明质酸寡糖质量比不再下降，确定产物中未偶联的透明质酸寡糖被完全除去。将所得的偶联产物清洗后置于-80℃冰箱过夜，于冻干机中冷冻干燥，获得透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白。
本实施例制得的透明质酸寡糖-胶原蛋白偶联物，透明质酸寡糖含量在1.44％～2.66％之间，其红外图谱如图1所示。
实施例2：透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白静电纺丝及交联
(1)透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白静电纺丝
将透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白加入到8％(g/mL)的六氟异丙醇溶液中，磁力搅拌至肉眼可观的挂壁粘溶液；纺丝时用铝箔覆盖在硬纸板上，硬纸板尺寸为10cm×10cm，置于针头下方90mm处作为接收器；纺丝时纺丝设备置于室温下的通风橱内，取1mL注射器吸取纺丝液，针头内径为0.46mm；将注射器固定于微量注射泵中，并通过电源线将注射器金属针头与高压发生器相连；打开静电高压发生器将电压调至20kV，形成高压电场；调节微量注射器给液速度为1.5mL/h，纺丝液总体积为0.9mL。纺丝完成后，将接收到纤维膜置于真空干燥箱，使六氟异丙醇尽量挥发干燥。
(2)透明质酸寡糖-胶原蛋白静电纺丝纤维膜交联
将10mL 25％(g/mL)的戊二醛溶液置于直径为10cm的培养皿，将培养皿置于内径为21cm的干燥器底部；然后将透明质酸寡糖-胶原蛋白静电纺丝纤维膜的薄板置于干燥箱盘上，加盖后用戊二醛蒸汽对静电纺丝纤维膜进行交联，交联48h后置于真空干燥箱放置一周左右，除去残余的戊二醛。用扫描电镜观察静电纺丝纤维膜的微观形貌并拍照。静电纺丝纤维膜交联后进行耐水实验，浸泡两天后进行电镜观察。
本实施例制得的静电纺丝纤维膜经交联后，所得纤维膜为多孔微纳米结构，与天然细胞外基质的纳米纤维网络结构相似，初步达到了从结构上模拟天然组织细胞微环境的目的，如图2所示。经过耐水实验后，较未浸泡前出现了一些溶胀但仍然保持明显的纤维形态，可用于仿生细胞外基质设计血管支架材料。
实施例3：血管内皮细胞在纤维膜上的生长形貌，增殖情况和表型鉴定
将上述得到的纺丝纤维膜先紫外杀菌1h，70％酒精浸泡3h，吸出酒精后晾干用磷酸缓冲液(PBS)清洗浸泡5次，每次加1mL，浸泡12h。然后将处理后的纺丝纤维膜纺在直径1.8cm的盖玻片上，置于24孔培养板中用于细胞培养。将猪髋动脉内皮细胞(PIEC)种植在膜材料上，细胞接种密度保持在103～104个/cm2，观察内皮细胞形貌，细胞增殖情况并鉴定内皮细胞表型。
(1)细胞形貌观察
取在纤维膜上生长3天的细胞，用PBS冲洗三遍后用3％(g/mL)的戊二醛溶液固定2h，随后依次用50％，70％，90％，95％以及100％的乙醇进行脱水，每个梯度脱水10min。将样品冷冻干燥，将有细胞生长的纤维膜镀金90s，在10kV加速电压下，用扫描电子显微镜观察细胞形态，电镜扫描结果如图3所示。
(2)细胞增殖情况
选取在CO2培养箱中培养1d，3d，5d，7d的细胞，吸去旧培养基，用37℃预热的PBS清洗3次；每孔加入37℃预热的DMEM1640培养基(不含血清和双抗)400μL；然后再加入37℃预热的MTT(5mg/mL溶于PBS中，pH 7.40)40μL，培养4h后在倒置相差显微镜下观察有紫色颗粒沉淀产生，吸出培养基及MTT，加入400μL的DMSO使沉淀溶解；取96孔板，每孔加入100μL在492nm处测得吸光度值，检测结果如图4。
如图4所示，比较不同分子量透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白纺丝纤维膜和组织培养板(TCP)上细胞的增值情况，结果显示，细胞增殖结果与培养时间呈正相关，且在不同的纺丝纤维膜中，本发明中的纺丝纤维膜上细胞增殖效果最好。
(3)血管内皮细胞的表型鉴定
取在纤维膜上生长3天的细胞，采用TRIZOL法提取总RNA，以B2M为管家基因，用于消除RNA定量、加样以及PCR反应等过程产生的误差，用实时荧光定量RCR(RT-qPCR)通过荧光信号检测每次PCR循环后产物总量，以内参或外参法定量分析待检样品中特定DNA序列。检测PIECs中细胞间粘附因子-1(ICAM-1)、增殖细胞核抗原(PCNA)、抑癌基因(p53)以及血小板-内皮细胞粘附因子-1(PECAM-1，即CD31)的mRNA水平的表达，检测结果如图5。
如图5所示，比较不同分子量透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白纺丝纤维膜和空白的组织培养板(blank)上增殖细胞中mRNA的表达水平，结果显示，在本发明的纺丝纤维膜上增殖细胞的ICAM-1、PCNA、p53、CD31均能够正常表达。
通过对以上结果的检测和分析，表明该纤维膜材料有较好的生物相容性，有良好的促血管内皮化增殖效果，有望作为血管修复的支架材料。
对比例
透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白按照中国专利CN105037529A公开的方法制备，并按照本发明记载的静电纺丝工艺制备纳米纤维膜材料。
实验结果表明，按照该方法制备的透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白涉及胶原与透明质酸或胶原与胶原之间互相交联形成复杂网络交联结构，使其在后续的加工和溶解中遇到很多困难，而且在静电纺丝过程中不易形成多孔纳米纤维膜结构。

Claims (9)

1.一种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白纳米纤维血管修复材料的制备方法，包括步骤如下：
(1)透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白的制备：通过氰基硼氢化钠还原透明质酸寡糖醛基与胶原蛋白上自由氨基缩合形成终产物席夫碱，在30～40℃条件下磁力搅拌20～30h得到反应液，除去反应液中未反应的透明质酸寡糖，得到透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白；
(2)糖基化胶原蛋白的纤维成型：利用静电纺丝工艺，将步骤(1)得到的透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白溶入有机溶剂中，磁力搅拌制备纺丝液，然后在15～25kV的高压电场下，调节纺丝液的给液速度为1.0～2.0mL/h，纺丝液总体积为0.5～1.5mL，静电纺丝制备三维多孔纳米纤维膜材料，并采用质量体积百分比浓度为20～30％的戊二醛水溶液熏蒸交联40～60h；
其中，透明质酸寡糖的分子量范围为776～3000Da，偶联得到透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白中透明质酸寡糖的质量百分比为1.44％～2.66％。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，优选的，步骤(1)所述的缩合反应溶剂为体积比3:2的六氟异丙醇和0.1mol/L NaHCO3溶液的混合体系，共5mL，pH 7.0。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，优选的，步骤(1)中所述的磁力搅拌反应条件为37℃反应24h。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，优选的，步骤(1)中所述除去反应液中未反应的透明质酸寡糖的方法为：将反应液与体积百分比浓度为5％的乙酸溶液按体积比1∶2的比例混合，选择截留分子量为30kDa的超滤管，转速3500～4000r/min超滤离心20～30min，再用体积百分比浓度为5％的乙酸重悬，按以上步骤再进行超滤4～6次。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，优选的，步骤(2)中所述的有机溶剂为质量体积百分比浓度8％的六氟异丙醇溶液，单位g/mL。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，优选的，步骤(2)中所述的静电纺丝条件为在20kV的高压电场下，调节纺丝液的给液速度为1.5mL/h，纺丝液总体积为0.9mL，纺丝距离为90mm，纺丝用铝箔覆盖硬纸板尺寸为10cm×10cm。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，优选的，步骤(2)中所述的纺丝纤维膜熏蒸采用质量体积百分比浓度为25％的戊二醛水溶液，熏蒸交联48h。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，优选的，步骤(2)中所述的熏蒸方法为：将质量体积百分比浓度为25％的戊二醛水溶液盛放在直径10cm的培养皿中，置于直径21cm的干燥器底部，将透明质酸寡糖-胶原蛋白静电纺丝纤维膜置于干燥器的干燥盘上。
9.上述纤维膜材料在制备血管修复支架材料中的应用。
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