CN105037529A - 透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新型生物材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新型生物材料及其制备方法，该方法包括：用透明质酸酶降解大分子透明质酸，得到透明质酸寡糖；透明质酸寡糖与胶原蛋白交联，得到透明质酸寡糖与胶原蛋白的交联物。本发明的透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新材料中，透明质酸寡糖的分子量是明确且单一的，而非混合物，可由酶解、凝胶层析辅助ESI-MS的方法制备，可望具备与普通大分子透明质酸显著不同的诱导血管生成、促进创伤愈合等的功能。胶原蛋白与透明质酸都是来自肌体组织本身的纯天然材料，具有优良的生物相容性，使得透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新材料在良好的生物相容性的基础上，具备诱导血管生成、促进组织更好修复的性能。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料制备领域，特别涉及一类透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白生物材料及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白是生物体内细胞外基质的主要蛋白成分，其特有的三股螺旋肽链结构，赋予它许多优良性质：韧性弹性好、低免疫原性、生物可降解性、生物相容性、止血性和促进细胞生长，因此是生物材料及组织工程领域的优选材料。透明质酸多糖(HA)是细胞外基质中的一种糖胺聚糖，在维持组织的完整性和功能性，调控细胞的粘附、增殖、分化等方面起着重要作用。由于具有独特的流变学特性、粘弹性、吸湿性以及良好的生物相容性，在生物材料、组织修复与再生、药物载体等领域有着广泛应用。特别是随着分子量不同，HA具有不同的抗凝血和促血管化功能。尤其是在促进血管内皮细胞增殖和血管化方面，根据其分子量不同，HA有着相反的作用。大分子的HA多糖抑制血管内皮细胞增殖、迁移，从而抑制血管生成；小分子的透明质酸寡糖(o-HA)，特别是3-10双糖片段，可明显促进血管内皮细胞的增殖和迁移，从而促进血管的生成。尽管o-HA具有良好的促血管化功能，但是其本身为小分子不能作为血管修复材料。因此，如果考虑用o-HA修饰胶原蛋白，制备一种具有促血管化功能的新型血管修复材料，有望用于治疗当今严重威胁人类生命的心血管疾病。同时，其促血管化的功能，作为其它组织修复材料也可以促进再生组织的血管化，有利于组织的修复与再生。
Westetal.(1985),ChuangTWetal.(2009)等相继报道了HA的3-10双糖片段在刺激血管再生方面的作用。中国专利文件CN1927414A(申请号：200610076649.7)公开了层粘连蛋白通过碳二亚胺盐酸盐(EDC)和己二酸二酰肼(ADH)交联HA多糖，制备神经组织再生修复材料。中国专利文件CN103333349A(申请号：201310264026.9)公开了一种注射用透明质酸-胶原蛋白复合水凝胶及其制备方法，作为软组织填充材料。中国专利文件CN102836465A(申请号：201210314947.0)公开了一种注射用丝素蛋白/透明质酸复合凝胶及其制备与应用。但是，以上材料所用透明质酸都是大分子的HA多糖。目前用于血管及其它组织修复材料的HA也都是大分子多糖，至少也是在分子量5000Da以上的HA寡聚糖。这显然不能满足(3-10双糖)o-HA片段更好地促进血管再生的要求。这种局限性是由于o-HA大量制备比较困难，目前市面仅微量(一般微克，极少数毫克)级别的o-HA可得到，且价格昂贵。在组织工程修复材料的制备中，材料需求量大，至少需要克级。因此研究中未见报道将特定分子量o-HA(四糖、六糖、八糖、十糖)与胶原蛋白通过化学反应进行连接，制备透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白生物材料。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新型生物材料及其制备方法，以期用于血管及其它组织修复。本发明通过酶法水解和分离纯化，首先成功制备批量o-HA(四糖、六糖、八糖和十糖)，然后通过交联制备透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白。
本发明的技术方案如下：
一种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新型生物材料，是由透明质酸寡糖与胶原蛋白通过交联反应得到；所述的交联物中，透明质酸寡糖的质量百分比为0.2％-5.1％。
根据本发明，优选的，所述的透明质酸寡糖的分子量为397.33Da-3811.21Da，进一步优选的，所述的透明质酸寡糖为透明质酸四糖、透明质酸六糖、透明质酸八糖或/和透明质酸十糖。
根据本发明，上述透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新型生物材料的制备方法，包括步骤如下：
(1)利用透明质酸酶降解透明质酸或透明质酸钠，分离纯化，冷冻干燥得到透明质酸寡糖；
(2)将步骤(1)得到的透明质酸寡糖与胶原蛋白在交联剂作用下进行交联反应，得到透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新材料。
根据本发明方法，优选的，步骤(1)中所述的透明质酸酶的浓度为(0.1-2.0)×105U/L，所述的透明质酸或透明质酸钠的质量浓度为(0.5-2.0)mol/L，酶解温度为(25-60)℃，酶解时间为(10-24)h；
优选的，步骤(1)中所述的分离纯化方法采用SephdaxLH-20或Bio-gelP-6凝胶层析柱(规格：1.6㎝*80㎝)，上样流速为0.2-1.0mL/min；上样体积为0.5-2mL；流动相为0.05-0.5mol/L的碳酸氢铵；分离流速为0.1-0.5mL/min；紫外(UV)检测波长为232nm。采用电喷雾质谱(ESI-MS)测定透明质酸四糖、六糖、八糖和十糖的分子量分别为776,1155,1535和1914，其质谱图谱如图1所示。
根据本发明方法，步骤(2)中，优选的，所述的交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；
优选的，所述的EDC、NHS和透明质酸寡糖中羧基(oHA-COOH)的摩尔比为(3.0-9.0)：(1.0-3.0)：1.5，进一步优选为6.0：2.0：1.5；
优选的，所述的透明质酸寡糖与胶原蛋白的质量比为(1-3)：(7-9)，进一步优选为2:8；
优选的，所述的交联反应时间为1-5h，进一步优选为4h；
优选的，所述的交联反应温度为30-40℃，进一步优选为37℃。
根据本发明，上述透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新材料在组织修复材料制备中有潜在的应用。
本发明透明质酸寡糖与胶原蛋白交联的反应机理如下，以EDC/NHS作交联剂：
本发明未详尽说明的，均按本领域常规技术。
本发明的有益效果如下：
1、本发明的透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新材料中，透明质酸寡糖的分子量是明确且单一的，而非混合物，可由酶解、凝胶层析辅助ESI-MS的方法制备，可望具备与普通大分子透明质酸显著不同的诱导血管生成、促进创伤愈合等的功能。胶原蛋白与透明质酸都是来自肌体组织本身的纯天然材料，具有优良的生物相容性，使得本发明的透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新材料在良好的生物相容性的基础上，有望具备诱导血管生成、促进组织更好修复的性能。
2、本发明的透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新材料的制备过程简单，成本低廉，制备的新材料在组织修复材料和药物载体领域有潜在的广阔前景。
3、本发明通过酶解法酶解并分离纯化大量制备得到透明质酸寡糖，通过交联制备透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白，实现了透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白的批量化生产。
附图说明
图1为本发明中制备的透明质酸十糖(a)、八糖(b)、六糖(c)和四糖(d)的质谱图谱。
图2为本发明实施例1中透明质酸十糖含量为2.6wt％的透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新材料的红外光图谱。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所述的技术方案，下面结合实施例进行详细描述。应理解，本发明并不限于下述实施例。
实施例中所用原料均为常规原料，市购产品。其中，透明质酸酶：Sigma公司有售；胶原蛋白：成都市科乐生物技术有限公司有售，分子量：100kDa。
实施例1：透明质酸十糖修饰的胶原蛋白新材料的制备
(1)透明质酸十糖的制备：
配置1mol/L、pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，取一定量的透明质酸钠溶解于上述缓冲液中，配置成1wt％的透明质酸钠溶液；于50℃恒温磁力搅拌器上充分溶胀，待溶液澄清且不存在大量气泡后，在反应液中加入透明质酸酶，酶浓度为1.5×105U/L。反应20h后，将酶溶液煮沸使酶失活，转速8000r/min，离心15min，弃沉淀，将上清浓缩后冷冻干燥得到干品。取干燥后的样品100mg，用流动相缓冲液溶解，用0.22μm微孔滤膜过滤后以SephadexLH-20凝胶层析柱(规格：1.6㎝*80㎝)进行分离；分离参数：上样流速：0.5mL/min；上样体积：1mL；流动相：0.1mol/LNH4HCO3；分离流速：0.2mL/min；UV检测波长：232nm。采用负离子模式ESI-MS确定所得各分离组分对应寡糖分子量并分离、冷冻、干燥得到透明质酸十糖。
(2)透明质酸十糖与胶原蛋白交联：
取80mg胶原蛋白置于5ml,0.05mol/LMES(pH5.6),室温溶胀30min；取20mg步骤(1)制备的透明质酸十糖，40mgEDC，8mgNHS,置于300uL0.05mol/LMESbuffer(pH5.6)中，室温激活10min；吸出预置好的胶原蛋白中的液体，将胶原蛋白与上述透明质酸溶液混合，并向该溶液中加入3mlPBS(pH7.4，配方：80gNaCl、2.0gKCl、14.4gNa2HPO4、2.4gKH2PO4溶于1L去离子水中保存，使用时稀释十倍)，用20uL左右3mol/LNaOH调pH至7.4左右，于恒温振荡培养箱中，37℃每分钟60转轻微震荡反应4h；用PBS清洗反应产物，清洗过程在恒温振荡培养箱中进行，25℃，每分钟60转轻微震荡，每次清洗30min，共清洗4次；将清洗后的交联物置于-80℃冰箱中过夜后，于冷冻干燥器中冻干，制备得到透明质酸十糖与胶原蛋白交联物。
本实施例制得的交联物中，透明质酸十糖的质量百分比为2.6wt％；其红外光图谱如图2所示。
实施例2：透明质酸八糖修饰的胶原蛋白新材料的制备
如实施例1所述，不同之处在于：所使用透明质酸寡糖为透明质酸八糖，其他工艺及方法与实施例1相同。
本实施例制得的交联物中，透明质酸八糖的质量百分比为2.2wt％。
实施例3：透明质酸六糖修饰的胶原蛋白新材料的制备
如实施例1所述，不同之处在于：所使用透明质酸寡糖为透明质酸六糖，
步骤(2)中胶原蛋白的质量为90mg，透明质酸六糖的质量为10mg；
交联反应温度为30℃，反应时间为3h。
本实施例制得的交联物中，透明质酸六糖的质量百分比为0.9wt％。
实施例4：透明质酸四糖修饰的胶原蛋白新材料的的制备
如实施例1所述，不同之处在于：所使用透明质酸寡糖为透明质酸四糖，
步骤(2)中胶原蛋白的质量为70mg，透明质酸四糖的质量为30mg；
交联反应温度为40℃，反应时间为2h。
本实施例制得的交联物中，透明质酸四糖的质量百分比为1.0wt％。
Claims (10)
1.一种透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新型生物材料，其特征在于，该生物材料是由透明质酸寡糖与胶原蛋白通过交联反应得到；所述的交联物中，透明质酸寡糖的质量百分比为0.2％-5.1％。
2.根据权利要求1所述的透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新型生物材料，其特征在于，所述的透明质酸寡糖的分子量为397.33Da-3811.21Da。
3.根据权利要求1所述的透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新型生物材料，其特征在于，所述的透明质酸寡糖为透明质酸四糖、透明质酸六糖、透明质酸八糖或/和透明质酸十糖。
4.根据权利要求1-3任一项所述的透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新型生物材料的制备方法，包括步骤如下：
(1)利用透明质酸酶降解透明质酸或透明质酸钠，分离纯化，冷冻干燥得到透明质酸寡糖；
(2)将步骤(1)得到的透明质酸寡糖与胶原蛋白在交联剂作用下进行交联反应，得到透明质酸寡糖修饰的胶原蛋白新材料。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的透明质酸酶的浓度为(0.1-2.0)×105U/L，所述的透明质酸或透明质酸钠的质量浓度为(0.5-2)mol/L，酶解温度为(25-60)℃，酶解时间为(10-24)h。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的分离纯化方法采用SephdaxLH-20或Bio-gelP-6凝胶层析柱，上样流速为0.2-1.0mL/min；上样体积为0.5-2mL；流动相为0.05-0.5mol/LNH4HCO3；分离流速为0.1-0.5mL/min；UV检测波长为232nm。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；
优选的，所述的EDC、NHS和透明质酸寡糖中羧基(oHA-COOH)的摩尔比为(3.0-9.0)：(1.0-3.0)：1.5。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中透明质酸寡糖与胶原蛋白的质量比为(1-3)：(7-9)。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中交联反应时间为1-5h。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中交联反应温度为30-40℃。
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