CN114796621A - 一种复合生物材料及其制备方法和用途 - Google Patents
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- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
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Abstract
本发明提供了一种复合生物材料,由如下质量百分比的原料制备而成:胶原蛋白41%~90%,高分子量的单体透明质酸钠9%~51%;交联透明质酸盐2%~10%。本发明还提供了上述一种复合生物材料的制备方法。本发明生物组织支架是以胶原蛋白及高分子透明质酸为基础得到的复合材料,该材料具有良好的生物相容性,生物降解性和生物可吸收性,对多种来源的神经干细胞具有良好的生物相容性,促进神经干细胞向神经方向分化和降低细胞凋亡的作用,在脊髓损伤动物损伤区域中植入该材料可促进动物运动功能恢复及神经电生理功能恢复,该材料的神经损伤修复作用包括但不限于促进损伤区域神经细胞的增加及降低炎症反应。
Description
技术领域:
本发明属于生物工程领域,涉及一种复合生物材料,具体来是一种胶原蛋白与高分子量透明质酸制备而成的复合生物材料及其制备方法和用途。
背景技术:
近年来,组织工程支架应用在神经系统修复及神经细胞再生领域取得了比较迅速的发展,也有相关产品如(神桥,胶原蛋白纤维管)已经应用于临床。作为介导神经细胞粘附,存活、增殖的支架材料是目前神经再生领域的研究重点方向之一。支架材料为神经细胞的存活提供获取营养、支持形态、生长分化增殖的场所;理想的神经系统组织工程支架应具备以下基本条件1、针对神经系统的良好的生物相容性及生物机械性能;2、与损伤后神经细胞再生时程匹配的合适的生物降解性;3、具有潜在的促进神经细胞存活、分化、增殖等性能;4、易于灭菌、消毒。
目前研究较为广泛的支架材料大致分为:天然来源为基础的材料、不可降解的合成材料及可降解的合成材料三种。其中天然来源为基础的材料主要是以细胞外基质(ECM)来源成分修饰和组成,以其生物相容性高,促进细胞黏附、增殖、无抗原性和降解产物无毒性等优点成为导管支架材料研究的重点及热点,其主要组成成分包括胶原蛋白,透明质酸,纤连蛋白等。胶原蛋白(Collagen)是脊柱动物体内含量最多的蛋白质,是各种天然组织包括中枢神经组织中的主要ECM成分,已发现有20多种不同的亚型。其特殊的理化性质及良好的生物相容性赋予其作为组织工程支架的巨大潜力,胶原具有促进细胞黏附、增殖能力,对神经黏附和生长具有支持作用,同时容易被人体分解吸收。其很高的机械强度、良好的生物相容性以及较低的抗原性等优点被广泛认可。
各种体内外实验已证明,胶原支架既可作为神经细胞的良好载体,其本身的微结构信号也有助于引导轴突的定向再生。目前胶原基质已被制备成各种结构和形状的支架广泛应用于各种脊髓损伤实验性修复的基础研究。
透明质酸(HA)是一类糖氨聚糖,是天然中枢神经细胞胞外基质的基本成分。外源性高分子量透明质酸已被证实具有一定的抗菌和抗炎性能,高分子量透明质酸通过与炎症细胞和其他ECM蛋白的相互作用,能减轻SCI后的炎性损伤和纤维疤痕形成,对伤后神经功能的恢复也有一定的改善作用。高分子量的透明质酸能够抑制胶质细胞增殖,稳定胶质细胞位置,对神经损伤后胶质瘢痕的形成具有调控作用。透明质酸除被用来改善材料的生物学性能外,基于其高粘弹性还常用来与其它材料复合调控材料的力学性能,特别是组织支架的弹性模量指数,因此具有应用于脊髓损伤的天然优势。制备细胞外基质组分的组织工程支架的常用方法为冷冻干燥法,即将动物来源原料中的胶原蛋白提取出来后,将胶原或胶原与其他生物材料的混合溶液低温冷冻干燥,制备出特定形状的三维多孔支架,或通过化合物交联制备胶原或胶原与其他材料复合的多孔支架;关于胶原蛋与透明质酸复合构成组织支架的研究虽有很多,但其组织支架常见孔隙大小不一,均一性相对欠佳,批次差异严重,同时在力学强度上常有欠缺,无法满足有更高力学强度要求的组织修复所需,同时生物活性不强,没有显著的神经损伤修复活性。
近年来,透明质酸经过修饰或交联后获得了一些生物相容性好的抗降解物,使其更适用于更高力学强度要求的组织修复所需,如脊髓组织的神经损伤后修复,本申请人利用BDDE作为交联剂实现了交联透明质酸的制备,见CN201410154316。本发明通过低温提取及稀酸短期处理,以获得未降解、高纯度、具有完整生物学活性的活性胶原,保留了其具有较高力学强度的天然结构,并且采用混合交联透明质酸及高分子量的单体透明质酸,通过特定的冻干工艺,保证了该多孔复合材料的孔径稳定性及体内的降解缓释性,同时具有良好的维持干细胞存活及促进神经系统损伤修复功能,可以用于伤口包覆材料及组织损伤修复;神经损伤再生的组织工程支架材料。
发明内容:
本发明的目的在于提供一种复合生物材料及其制备方法和用途,所述的这种复合生物材料及其制备方法和用途要解决现有以胶原为基础的组织工程支架其孔径不均一、批次差异大、力学强度差、生物降解性不稳定、生物活性差的技术问题。
本发明提供了一种复合生物材料,由如下质量百分比的原料制备而成:
胶原蛋白 41%~90%,
高分子量的单体透明质酸钠 9%~51%;
交联透明质酸盐 2%~10%。
进一步的,所述的高分子量的单体透明质酸钠的重均分子量为100万~300万,优选为180万~260万;所述的高分子量透明质酸钠的质量百分比浓度为5%~10%。
进一步的,所述的交联透明质酸盐为交联透明质酸钠盐。
进一步的,所述的交联透明质酸盐的动力粘度≧4.5x105 mpa.s。
进一步的,所述的胶原蛋白来自牛筋膜来源的具有完整三维结构的胶原蛋白,在透射电镜下可见清晰完整的螺旋相间条纹。
进一步的,所述的复合生物材料的孔径大小为1~10um,优选孔径大小为3~5um。
本发明还提供了上述一种复合生物材料的制备方法,包括以下步骤:
1)取含筋膜牛腿组织为原料,用灭菌消毒液浸泡灭菌15-30分钟;去除杂质,剥离肌肉及可见脂肪,清水冲洗去除污血;分离筋膜组织,然后在灭菌消毒液中浸泡10-30分钟,取出后以生理盐水冲洗;
2)将步骤1)分离筋膜组织于4℃,在体积百分浓度为10%的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡12-48小时;以灭菌双蒸水清洗至少2遍;继而用1M、pH为7.4-8.0的Tris-HCl缓冲液处理12-48小时,以灭菌双蒸水清洗至少2遍;随之用1mM~10mM 的盐酸溶液搅拌混合处理1-3次,每次1-5分钟,后用双蒸水冲洗6-8次至PH中性,获得活化胶原;
3)将步骤2)活化胶原在特定冻干参数下进行一次18-48小时的冻干过程,成为冻干胶原蛋白;所述的特定冻干参数为冷阱温度-45℃到-70℃之间,升华温度在-30℃到-15℃之间;
4)将重均分子量为100万~300万的透明质酸钠溶于水或生理盐水,配制成质量百分比浓度为5%~10%的透明质酸钠溶液A,将交联透明质酸盐配制为质量百分比浓度为2~10%的凝胶B,所述的凝胶B的动力粘度≧4.5x105 mpa.s,将A与B 以10:1~2:1的体积比例混合,形成复合液I;
5)将步骤3)冻干胶原蛋白与复合液I混合孵育24-72小时,所述的冻干胶原蛋白与复合液I的质量体积比为1:5~1:1,形成胶原透明质酸复合材料I;
6)步骤5)的胶原透明质酸复合材料I于特定冻干参数下完成40-60小时的冻干过程,得到冻干复合材料I;所述的特定冻干参数为冷阱温度-45到-70℃之间,升华温度在-30到-15℃之间;
7)将步骤6)所述的冻干复合材料I与透明质酸钠溶液A混合孵育24-72小时,其质量体积比为1:5~1:1,形成胶原透明质酸复合材料II;
8)将步骤7)所述的胶原透明质酸复合材料II于特定冻干参数下在模具中完成40-60小时冻干过程,形成胶原透明质酸复合材料;所述的特定冻干参数为冷阱温度-45到-70℃之间,升华温度在-30到-15℃之间;
9)将步骤8)的胶原透明质酸复合材料采用钴60消毒灭菌即得所述的生物复合材料。
具体的,所述的胶原透明质酸复合材料Bio-C为多孔固性支架、网状或膜状结构。
具体的,冻干时程中预冻温度为-80℃到-40℃,预冻时间为4小时-24小时,步骤3)、6)和8)的升华时间为4小时-24小时。步骤2)、4)、5)、7)处理的温度均为2-8℃。
步骤1中灭菌消毒液可采用灭菌消毒液I (质量百分比浓度为75%的酒精)或灭菌消毒液II(质量百分比浓度为0.1%的苯扎溴铵)。
具体的,交联透明质酸钠盐的制备方法见 CN 201410154316。
本发明还提供了上述的复合生物材料在制备用于伤口包覆材料或者织损伤修复材料或者神经损伤再生的组织工程支架材料中的用途。
本发明的胶原与高分子量透明质酸结合的复合生物材料是由来源牛筋膜的胶原蛋白与高分子量的单体透明质酸及交联透明质酸结合构成的多孔生物复合材料。
本发明的方法与已有报道的不同:其中包括胶原蛋白的低温提取及稀酸瞬时活化,以获得未变性、高纯度、具有完整生物学活性的活性胶原,保留了其具有较高力学强度的天然结构,并且采用混合交联透明质酸及高分子量的单体透明质酸,通过特定的冻干工艺,同时保证了该多孔复合材料的孔径稳定性及体内的降解缓释性,具有良好的维持干细胞存活及促进神经系统损伤修复功能。工艺路线简单稳定,可控性强,清洁低成本。
本发明和已有技术相比,其技术进步是显著的。本发明中的胶原蛋白保有天然三股螺旋的纤维结构。本发明生物组织支架是以胶原及高分子透明质酸为基础,经过多步独特的处理方法得到的复合材料,具有良好的生物相容性,生物降解性和生物吸收性,本材料对多种来源的神经干细胞(包括脑来源的神经干细胞,脊髓来源的神经干细胞等)具有良好的生物相容性,促进神经干细胞向神经方向分化和降低细胞凋亡的作用,在脊髓损伤动物中植入该材料可促进动物行为功能及神经电生理功能恢复,该材料的神经损伤修复作用包括但不限于促进损伤区域的神经细胞的增加及降低炎症反应的作用,该材料可以用于伤口包覆材料及组织损伤修复;神经损伤再生的组织工程支架材料。
附图说明:
图1显示了本发明实施例1中胶原及高分子透明质酸钠复合材料Bio-C的扫描电镜(SEM )图(横截面及纵截面)。该胶原及高分子透明质酸钠复合材料Bio-C为多孔固性材料。
图2显示了本发明实施例1中胶原及高分子透明质酸钠复合材料Bio-C的材料孔径统计图,多批次的复合材料其孔径大小在3-5um之间。
图3显示了本发明实施例1中活化胶原的透射电镜TEM图,其中胶原显示完整的螺旋结构。
图4 显示了本发明实施例1中胶原及高分子透明质酸钠复合材料Bio-C的动物体内相容性及生物降解性实验,显示多批次的复合材料在植入动物背部皮下肌肉中都具有良好的生物可吸收性,植入8周后其材料降解率为85%以上,在植入全过程中无炎性反应,具有良好的生物相容性。
图5 显示了本发明实施例1中胶原及高分子透明质酸钠复合材料Bio-C对神经干细胞的抗凋亡作用。
图6 显示了本发明实施例 1中胶原及高分子透明质酸钠复合材料Bio-C促进多种神经干细胞向神经方向分化的作用。
图7 显示了本发明实施例1中胶原及高分子透明质酸钠复合材料Bio-C植入脊髓损伤动物体内后,促进动物运动功能恢复及神经电生理活动恢复的作用。
图8 显示了本发明实施例1中胶原及高分子透明质酸钠复合材料Bio-C植入脊髓损伤动物体内后促进损伤区域神经发生及抑制炎症发生的作用。
具体实施方式:
下面以下通过实施例对本发明做进一步详述,但本发明并不限于此:
实施例1:
称取含筋膜牛腿组织2000克,用质量百分比浓度为75%酒精浸泡30分钟后,剥离可见皮毛,肌肉及脂肪组织,清水冲洗污血后分离出筋膜并称重,取30克筋膜用质量百分比浓度为75%酒精浸泡15分钟后,用5倍体积生理盐水冲洗5次。将30克筋膜于4℃,在150ML的体积百分浓度为10%十二烷基硫酸钠溶液中浸泡24小时后,以5倍体积灭菌双蒸水清洗3次。继而用1M、pH为7.4-8.0的150MLTris-HCl缓冲液处理24小时,以灭菌双蒸水清洗3遍;随之用150ML的10mM HCl搅拌混合处理2次(每次5分钟)后用双蒸水冲洗6-8次至PH中性,获得活化胶原;清洗后活性胶原置于无菌玻璃皿中,于-40℃预冻12小时以冷冻内容物;在冻干机中于冷阱温度-55℃下真空干燥16小时,后升温至冷阱温度-25℃,在相同温度下保持10小时;最后升温至冷阱温度4℃完成冻干过程,形成胶原材料。
将重均分子量为200万的透明质酸钠溶于水,配制成质量百分比为10%的透明质酸钠溶液A。将交联透明质酸钠盐溶解在生理盐水中,配制为质量百分比为4%的透明质酸钠溶液B,所述的透明质酸钠溶液B的动力粘度≧4.5x105 mpa.s,溶液A与溶液B以10:1的比例混合为复合液I。
冻干胶原材料称重后于3倍体积的复合液I溶液中浸泡48小时后置于无菌玻璃容器中,于-40℃预冻12小时以冷冻内容物;在冻干机中于冷阱温度-55℃下真空干燥25小时,后升温至冷阱温度-15℃,在相同温度下保持10小时;再次冷却至冷阱温度-45℃以下,在相同温度下保持3小时;最后升温至冷阱温度4℃形成冻干复合材料。
冻干复合材料称重后于5倍体积的透明质酸钠溶液A溶液中浸泡72小时后置于无菌玻璃容器中,于-40℃预冻12小时以冷冻内容物;在冻干机中于冷阱温度-55℃下真空干燥25小时,后升温至冷阱温度-15℃,在相同温度下保持10小时;再次冷却至冷阱温度-45℃以下,在相同温度下保持3小时;最后升温至冷阱温度4℃,形成多孔固性复合材料Bio-C。冻干复合材料无菌密封包装后置于钴60环境中照射消毒24小时。
通过此方法制备获得的复合材料Bio-C,通过透射电镜可见其具有多孔的固性结构(图1),其孔径均一,在多批次重复中孔径直径集中在3-5um范围(图2),证实该多孔材料制备工艺稳定,具有良好的孔径均一性;其主要成分胶原蛋白具有完整的螺旋三维结构(图3),保证其良好的力学强度。在植入小鼠背部皮下肌肉后,其生物相容性良好,具有稳定的可吸收性,在植入皮下8周后降解率达到85%以上(图4)。室管膜下区(SVZ)来源的成体神经干细胞中共孵育Bio-C材料,不影响干细胞的成球性,同时通过Annexin V细胞凋亡检测证实Bio-C不仅具有良好的神经干细胞安全性,而且具有神经营养作用,加入Bio-C的神经干细胞组与未加入的组相比,其细胞凋亡显著减少(图5),通过CCK8 ,RT-PCR及免疫染色的实验,都证实Bio-C材料在与SVZ来源的神经干细胞及脊髓来源的神经干细胞共孵育体系中,该材料可以增加多种神经干细胞的数目并促进神经干细胞向神经元方向分化(图6)。该材料植入脊髓全断小鼠的损伤区域后,通过旷场实验结合双盲后肢运动功能评分(BMS评分)对模型动物开展行为学检测,在术后不同时间点检测动物运动能力恢复,与对照组相比,Bio-C组BMS评分有显著性提高(图7A);运动诱发电位(MEP)是指电或磁刺激运动皮层区,产生兴奋,通过下行传导路径,使脊髓前角细胞或周围神经运动纤维去极化,在相应肌肉表面记录到的电位,主要反映下行运动通路的功能。MEP可用于检测锥体束功能和预测运动功能的恢复,是预后良好的指标。在脊髓造模后14周Bio-C组检测到MEP信号(图7B),统计结果显示Bio-C组中的MEP信号显著高于对照组(图7C)。进一步对脊髓损伤6周后的组织样本切片染色分析,Bio-C植入组中有更高比例的神经元(NF160+)和更低比例的炎症相关小胶质细胞(IBA+),与对照组相比具有显著性差异(图8)。证实该材料具有促进脊髓神经损伤修复的功能,且该功能可以通过但不限于促进神经发生及抑制炎症发生的作用得以实现。
实施例2:
称取含筋膜牛腿组织2000克,用质量百分比浓度为75%酒精浸泡30分钟后,剥离可见皮毛,肌肉及脂肪组织,清水冲洗污血后分离出筋膜并称重,取30克筋膜用质量百分比浓度为75%酒精浸泡15分钟后,用5倍体积生理盐水冲洗5次。将30克筋膜于4℃,在150ML的体积百分浓度为10%十二烷基硫酸钠溶液中浸泡24小时后,以5倍体积灭菌双蒸水清洗3次。继而用1M、pH为7.4-8.0的150MLTris-HCl缓冲液处理24小时,以灭菌双蒸水清洗3遍;随之用150ML的10mMHCl搅拌混合处理2次(每次5分钟)后用双蒸水冲洗6-8次至PH中性,获得活化胶原;清洗后活性胶原置于无菌玻璃皿中,于-40℃预冻12小时以冷冻内容物;在冻干机中于冷阱温度-55℃下真空干燥16小时,后升温至冷阱温度-25℃,在相同温度下保持10小时;最后升温至冷阱温度4℃完成一步冻干,形成胶原材料。
将重均分子量为200万的透明质酸钠溶于水,配制成质量百分比为10%的透明质酸钠溶液A。将交联透明质酸钠盐溶解在生理盐水中,配制为质量百分比为4%的透明质酸钠溶液B,所述的透明质酸钠溶液B的动力粘度≧4.5x105 mpa.s,溶液A与溶液B以10:1的比例混合为复合液I。
冻干胶原材料称重后于1倍体积的复合液I溶液中浸泡24小时后置于无菌玻璃容器中,于-40℃预冻12小时以冷冻内容物;在冻干机中于冷阱温度-55℃下真空干燥15小时,后升温至冷阱温度-15℃,在相同温度下保持10小时;再次冷却至冷阱温度-45℃以下,在相同温度下保持3小时;最后升温至冷阱温度4℃形成冻干复合材料。
冻干复合材料称重后于2倍体积的透明质酸钠溶液A溶液中浸泡48小时后置于无菌玻璃容器中,于-40℃预冻12小时以冷冻内容物;在冻干机中于冷阱温度-55℃下真空干燥12小时,后升温至冷阱温度-15℃,在相同温度下保持10小时;再次冷却至冷阱温度-45℃以下,在相同温度下保持3小时;最后升温至冷阱温度4℃,形成多孔固性复合材料Bio-C。冻干复合材料无菌密封包装后置于钴60环境中照射消毒24小时。
通过此方法制备获得的复合材料Bio-C,通过透射电镜可见其具有多孔的固性结构(类似图1),其孔径均一,在多批次重复中孔径直径集中在3-5um范围(类似图2),证实该多孔材料制备工艺稳定,具有良好的孔径均一性;其主要成分胶原蛋白具有完整的螺旋三维结构(类似图3),保证其良好的力学强度。在植入小鼠背部皮下肌肉后,其生物相容性良好,具有稳定的可吸收性,在植入皮下8周后降解率达到85%以上(类似图4)。室管膜下区(SVZ)来源的成体神经干细胞中共孵育Bio-C材料,不影响干细胞的成球性,同时通过Annexin V细胞凋亡检测证实Bio-C不仅具有良好的神经干细胞安全性,而且具有神经营养作用,加入Bio-C的神经干细胞组与未加入的组相比,其细胞凋亡显著减少(类似图5),通过CCK8 ,RT-PCR及免疫染色的实验,都证实Bio-C材料在与SVZ来源的神经干细胞及脊髓来源的神经干细胞共孵育体系中,该材料可以增加多种神经干细胞的数目并促进神经干细胞向神经元方向分化(类似图6)。该材料植入脊髓全断小鼠的损伤区域后,在术后不同时间点检测动物运动能力恢复,与对照组相比,Bio-C组BMS评分有显著性提高(类似图7上);运动诱发电位(MEP)是指电或磁刺激运动皮层区,产生兴奋,通过下行传导路径,使脊髓前角细胞或周围神经运动纤维去极化,在相应肌肉表面记录到的电位,主要反映下行运动通路的功能。MEP可用于检测锥体束功能和预测运动功能的恢复,是预后良好的指标。在脊髓造模后14周Bio-C组检测到MEP信号(类似图7中),统计结果显示Bio-C组中的MEP信号显著高于对照组(类似图7下)。进一步对脊髓损伤6周后的组织样本切片染色分析,Bio-C植入组中有更高比例的神经元(NF160+)和更低比例的炎症相关小胶质细胞(IBA+),与对照组相比具有显著性差异(类似图8)。证实该材料具有促进脊髓神经损伤修复的功能,且该功能可以通过但不限于促进神经发生及抑制炎症发生的作用得以实现。
实施例3:
称取含筋膜牛腿组织500克,用质量百分比浓度为75%酒精浸泡30分钟后,使用手术器械剥离可见皮毛,肌肉及脂肪组织,清水冲洗污血后分离出筋膜并称重,取10克筋膜用质量百分比浓度为75%酒精浸泡10分钟后,用5倍体积生理盐水冲洗5次。将10克筋膜于4℃,在500ML的体积百分比浓度为10%十二烷基硫酸钠溶液中浸泡24小时后,以5倍体积灭菌双蒸水清洗3次。继而用1M、pH为7.4-8.0的500MLTris-HCl缓冲液处理24小时,以灭菌双蒸水清洗3遍;随之用500ML的10mMHCl搅拌混合处理3次(每次1分钟)后用双蒸水冲洗6-8次至PH中性,获得活化胶原;清洗后活性胶原置于无菌玻璃容器中,于-40℃预冻12小时以冷冻内容物;在冻干机中于冷阱温度-55℃下真空干燥16小时,后升温至冷阱温度-25℃,在相同温度下保持10小时;最后升温至冷阱温度4℃,在相同温度下保持10小时完成冻干形成胶原材料。
将重均分子量为200万的透明质酸钠溶于水,配制成质量百分比为10%的透明质酸钠溶液A。将交联透明质酸钠盐溶解在生理盐水中,配制为质量百分比为4%的透明质酸钠溶液B,所述的透明质酸钠溶液B的动力粘度≧4.5x105 mpa.s,溶液A与溶液B以9:1的体积比例混合为复合液I。
冻干胶原材料称重后于2倍体积的复合液I溶液中浸泡48小时后置于无菌玻璃容器中,于-70℃预冻8小时以冷冻内容物;在冻干机中于冷阱温度-70℃下真空干燥12小时,后升温至冷阱温度-15℃,在相同温度下保持10小时;冷却至冷阱温度-45℃以下,在相同温度下保持3小时;最后升温至冷阱温度4℃,形成冻干复合材料。
冻干复合材料称重后于2倍体积的透明质酸钠溶液A溶液中浸泡48小时后置于无菌六孔板中,于-80℃预冻8小时以冷冻内容物;在冻干机中于冷阱温度-70℃下真空干燥12小时,后升温至冷阱温度-15℃,在相同温度下保持10小时;冷却至冷阱温度-45℃以下,在相同温度下保持3小时;最后升温至冷阱温度4℃,形成多孔固性复合材料Bio-C,无菌密封包装后置于钴60环境中照射消毒24小时。
通过此方法制备获得的复合材料Bio-C,具有多孔的固性结构,其孔径均一,在多批次重复中孔径直径集中在3-5um范围(类似图2),证实该多孔材料制备工艺稳定,具有良好的孔径均一性;其主要成分胶原蛋白具有完整的螺旋三维结构(类似图3),保证其良好的力学强度。在植入小鼠背部皮下肌肉后,其生物相容性良好,具有稳定的可吸收性,在植入皮下8周后降解率达到85%以上(类似图4),该材料植入脊髓全断小鼠的损伤区域后,通过旷场实验结合双盲后肢运动功能评分(BMS评分)对模型动物开展行为学检测,在术后不同时间点检测动物运动能力恢复,与对照组相比,Bio-C组BMS评分有显著性提高(类似图7上);运动诱发电位(MEP)是指电或磁刺激运动皮层区,产生兴奋,通过下行传导路径,使脊髓前角细胞或周围神经运动纤维去极化,在相应肌肉表面记录到的电位,主要反映下行运动通路的功能。MEP可用于检测锥体束功能和预测运动功能的恢复,是预后良好的指标。在脊髓造模后14周Bio-C组检测到MEP信号(类似图7中),统计结果显示Bio-C组中的MEP信号显著高于对照组(类似图7下)。进一步对脊髓损伤6周后的组织样本切片染色分析,Bio-C植入组中有更高比例的神经元(NF160+)和更低比例的炎症相关小胶质细胞(IBA+),与对照组相比具有显著性差异(类似图8)。证实该材料具有促进脊髓神经损伤修复的功能,且该功能可以通过但不限于促进神经发生及抑制炎症发生的作用得以实现。
实施例4:
称取含筋膜牛腿组织2000克,用质量百分比浓度为0.1%的苯扎溴铵浸泡45分钟后,剥离可见皮毛,肌肉及脂肪组织,清水冲洗污血后分离出筋膜并称重,取30克筋膜用质量百分比浓度为75%酒精浸泡10分钟后,用5倍体积生理盐水冲洗5次。将30克筋膜于4℃,在150ML的体积百分浓度为10%十二烷基硫酸钠溶液中浸泡24小时后,以5倍体积灭菌双蒸水清洗3次。继而用1M、pH为7.4-8.0的150MLTris-HCl缓冲液处理24小时,以灭菌双蒸水清洗3遍;随之用150ML的10mMHCl搅拌混合处理3次(每次5分钟)后用双蒸水冲洗6-8次至PH中性,获得活化胶原;清洗后活性胶原置于无菌玻璃容器中,于-40℃预冻12小时以冷冻内容物;在冻干机中于冷阱温度-55℃下真空干燥16小时,后升温至冷阱温度-25℃,在相同温度下保持10小时;最后升温至冷阱温度4℃完成一步冻干,形成胶原材料。
将重均分子量为200万的透明质酸钠溶于水,配制成质量百分比为5%的透明质酸钠溶液A。将交联透明质酸钠盐溶解在生理盐水中,配制为质量百分比为4%的透明质酸钠溶液B,所述的透明质酸钠溶液B的动力粘度≧4.5x105 mpa.s,溶液A与溶液B以4:1的比例混合为复合液I。
冻干胶原材料称重后于2倍体积的复合液I溶液中浸泡48小时后置于无菌10CM直径浅口培养皿中,于-80℃预冻8小时以冷冻内容物;在冻干机中于冷阱温度-70℃下真空干燥12小时,后升温至冷阱温度-15℃,在相同温度下保持10小时;冷却至冷阱温度-45℃以下,在相同温度下保持3小时;最后升温至冷阱温度4℃,在相同温度下保持10小时。形成冻干复合材料。
冻干复合材料称重后于2倍体积的透明质酸钠溶液A溶液中浸泡48小时后置于无菌塑料容器中,于-70℃预冻8小时以冷冻内容物;在冻干机中于冷阱温度-70℃下真空干燥12小时,后升温至冷阱温度-15℃,在相同温度下保持10小时;冷却至冷阱温度-45℃以下,在相同温度下保持3小时;最后升温至冷阱温度4℃,形成多孔膜状复合材料Bio-C,冻干复合材料无菌密封包装后置于钴60环境中照射消毒24小时。
通过此方法制备获得的复合材料Bio-C,具有多孔的固性结构,其孔径均一,在多批次重复中孔径直径集中在3-5um范围(类似图2),证实该多孔材料制备工艺稳定,具有良好的孔径均一性;其主要成分胶原蛋白具有完整的螺旋三维结构(类似图3),保证其良好的力学强度。在植入小鼠背部皮下肌肉后,其生物相容性良好,具有稳定的可吸收性,在植入皮下8周后降解率达到85%以上(类似图4),该材料植入脊髓全断小鼠的损伤区域后,在术后不同时间点检测动物运动能力恢复,与对照组相比,Bio-C组BMS评分有显著性提高(类似图7上);运动诱发电位(MEP)是指电或磁刺激运动皮层区,产生兴奋,通过下行传导路径,使脊髓前角细胞或周围神经运动纤维去极化,在相应肌肉表面记录到的电位,主要反映下行运动通路的功能。MEP可用于检测锥体束功能和预测运动功能的恢复,是预后良好的指标。在脊髓造模后14周Bio-C组检测到MEP信号(类似图7中),统计结果显示Bio-C组中的MEP信号显著高于对照组(类似图7下)。进一步对脊髓损伤6周后的组织样本切片染色分析,Bio-C植入组中有更高比例的神经元(NF160+)和更低比例的炎症相关小胶质细胞(IBA+),与对照组相比具有显著性差异(类似图8)。证实该材料具有促进脊髓神经损伤修复的功能,且该功能可以通过但不限于促进神经发生及抑制炎症发生的作用得以实现。
上述的实施例表明该材料在制备和功能验证中性能一致,批次效应很好,涉及实施例1-4中的图1到图8的相关内容都有验证,多批次产品具有相同或者类似的结果。
最后,本复合材料申请的制备方法仅为较佳的实施方案,并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种复合生物材料,其特征在于,由如下质量百分比的原料制备而成:
胶原蛋白 41%~90%,
高分子量的单体透明质酸钠 9%~51%;
交联透明质酸盐 2%~10%。
2.根据权利要求1所述的一种复合生物材料,其特征在于:所述的高分子量的单体透明质酸钠的重均分子量为100万~300万,优选为180万~260万。
3.根据权利要求1所述的一种复合生物材料,其特征在于:所述的高分子量透明质酸钠的质量百分比浓度为5%~10%,所述的交联透明质酸盐的动力粘度≧4.5x105 mpa.s。
4.根据权利要求1所述的一种复合生物材料,其特征在于:所述的交联透明质酸盐为交联透明质酸钠盐。
5.根据权利要求1所述的一种复合生物材料,其特征在于:所述的胶原蛋白来自牛筋膜来源的具有完整三维结构的胶原蛋白,在透射电镜下可见清晰完整的螺旋相间条纹。
6.根据权利要求1所述的一种复合生物材料,其特征在于:所述的复合生物材料的孔径大小为1~10um,优选孔径大小为3~5um。
7.权利要求1所述的一种复合生物材料的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)取含筋膜牛腿组织为原料,用灭菌消毒液浸泡灭菌15-30分钟;去除杂质,剥离肌肉及可见脂肪,清水冲洗去除污血;分离筋膜组织,然后在灭菌消毒液中浸泡10-30分钟,取出后以生理盐水冲洗;
2)将步骤1)分离筋膜组织于4℃,在体积百分浓度为10%的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡12-48小时;以灭菌双蒸水清洗至少2遍;继而用1M、pH为7.4-8.0的Tris-HCl缓冲液处理12-48小时,以灭菌双蒸水清洗至少2遍;随之用1mM~10mM的盐酸溶液搅拌混处理1-3次,每次1-5分钟,后用双蒸水冲洗6-8次至PH中性,获得活化胶原;
3)将步骤2)的活化胶原在特定冻干参数下进行一次18-48小时的冻干过程,成为冻干胶原蛋白;所述的特定冻干参数为冷阱温度-45℃到-70℃之间,升华温度在-30℃到-15℃之间;
4)将重均分子量为100万~300万的透明质酸钠溶于水或生理盐水,配制成质量百分比浓度为5%~10%的透明质酸钠溶液A,将交联透明质酸盐配制为质量百分比浓度为2~10%的凝胶B,所述的凝胶B的动力粘度≧4.5x105 mpa.s,将A与B 以10:1~2:1的体积比例混合,形成复合液I;
5)将步骤3)冻干胶原蛋白与复合液I混合孵育24-72小时,所述的冻干胶原蛋白与复合液I的质量体积比为1:5~1:1,形成胶原透明质酸复合材料I;
6)步骤5)的胶原透明质酸复合材料I于特定冻干参数下完成40-60小时的冻干过程,得到冻干复合材料I;所述的特定冻干参数为冷阱温度-45到-70℃之间,升华温度在-30到-15℃之间;
7)将步骤6)所述的冻干复合材料I与透明质酸钠溶液A混合孵育24-72小时,其质量体积比为1:5~1:1,形成胶原透明质酸复合材料II;
8)将步骤7)所述的胶原透明质酸复合材料II于特定冻干参数下在模具中完成40-60小时冻干过程,形成胶原透明质酸复合材料;所述的特定冻干参数为冷阱温度-45到-70℃之间,升华温度在-30到-15℃之间;
9)将步骤8)的胶原透明质酸复合材料消毒灭菌,即得所述的生物复合材料。
8.根据权利要求7所述的一种复合生物材料的制备方法,其特征在于:将步骤8)的胶原透明质酸复合材料采用钴60消毒灭菌,即得所述的生物复合材料。
9.根据权利要求7所述的一种复合生物材料的制备方法,其特征在于:冻干时程中预冻温度为-80℃到-40℃,预冻时间为4小时-24小时,步骤3)、6)和8)的升华时间为4小时-24小时。
10.权利要求1所述的复合生物材料在制备用于伤口包覆材料或者织损伤修复材料或者神经损伤再生的组织工程支架材料中的用途。
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