CN110038167A - 一种仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/plga复合骨组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

一种仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/plga复合骨组织工程支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工程支架及其制备方法。本发明以糖基化矿化胶原、糖基化壳聚糖和PLGA为原料制备多孔复合骨组织工程支架材料，通过调整原料的组成比例弥补了单一材料成型性差、力学强度低和细胞吸附性弱的缺点。PLGA具有良好的生物相容性、无毒和良好的成型性能，通过热致分相法将糖基化矿化胶原、糖基化壳聚糖与PLGA结合制备的三维孔洞网络结构，具有与天然骨极其相似的纳米结构，有利于细胞在支架材料表面的粘附、增殖与分化，一定的粗糙度和孔隙率也有利于新生骨组织长入植入体表面，并促进植入体/宿主组织界面处的骨整合过程。

Description

一种仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工 程支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工程支架及其制备方法，属于生物医用材料技术领域。
背景技术
骨的修复和再生是骨科手术中常见而复杂的临床问题。尽管自体移植和同种异体移植在临床治疗和研究中得到了广泛应用，但它们都存在一定的问题。自体移植物需要进行二次手术，增加患者的创伤和痛苦，同种异体移植物具有感染和免疫应答的风险。人工骨组织工程替代材料是治疗骨缺损的另一种选择，在自体骨不能实现自身修复的情况下，人工骨可以通过组织再生功能实现骨愈合和骨重建，目前已被誉为骨再生的替代策略。其典型方法是以具备骨传导性和骨诱导性的材料为仿生支架载体，结合特定的骨细胞或骨组织生长因子/细胞激素等，使其体内移植后能自然的诱导骨再生或替换缺陷组织。在组织工程研究中，细胞支架的选择是研究的焦点之一。为了促进新骨形成，支架在设计构建时应尽可能充分模拟天然骨的细胞外基质，这样可以为骨细胞的生理行为和骨再生提供良好的仿生微环境，也可以积极的促成或阻止某些积极或不良的生理反应。
常见的单一高分子支架材料有：聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)，丝蛋白，胶原、透明质酸、纤维蛋白等细胞外基质材料和壳聚糖、海藻酸盐等，他们可以为细胞的黏附、生长与分化提供合适的三维空间结构，并且充分模拟天然仿生骨基质的微环境。胶原是骨组织有机间质的主要成分，在用于骨组织工程时常常通过与磷灰石的复合进一步提高生物活性。在中国专利文献CN1325734(申请号：CN01129699.2)中公开了一种纳米相钙磷盐/胶原/聚乳酸骨复合多孔材料的制备方法，该方法以胶原为分子模板，制备出一定程度上排列有序的纳米相钙磷盐，并用先热致分相后冰冻干燥的方法使它与聚乳酸(PLA)共同组成多孔框架材料以制备出有一定强度、高孔隙率且生物相容性好的骨替代材料。透明质酸也可以作为构建组织工程支架的优良材料，具有近似于自然组织的物理性能并且为新生组织形成提供机械稳定性，此外，透明质酸寡糖(oHAs)还有促进血管生成、促进创伤愈合的功能，具有生物可降解性和良好的生物相容性，这有利于骨组织工程快速血管化的构建。
随着组织工程研究的深入，目前人们逐渐认识到单一种类的生物材料难以获得理想的活性人工仿生骨，因此将两种或几种不同性能的天然高分子材料或人工合成高分子材料复合，以结合不同材料的优势，构建新型的骨组织工程修复材料。在中国专利文献CN108421088A(申请号CN201810353944.5)中公开了一种矿化胶原基中等强度人工骨修复材料的制备方法。该方法以胶原分子为矿化模板制备矿化胶原，然后将不同浓度的高聚物溶液按一定质量比混合并冷冻干燥制备成聚合物/矿化胶原复合材料、硬质聚合物/矿化胶原复合材料颗粒和矿化胶原基中等强度人工骨修复材料。该发明虽然可以制备一定支撑强度的复合骨材料，但是材料颗粒直径为毫米级的硬质聚合物/矿化胶原复合物会明显降低支架的孔隙率，造成材料在体液环境中不易完全浸润，不适宜骨细胞的生长。
发明内容
针对现有骨修复材料临床应用上的缺陷，本发明在仿生的思路下和有机-无机复合材料的基础上，提供了一种仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工程支架及其制备方法。
术语说明：
PLGA：聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)，由两种单体乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物。
室温：具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃。
本发明的技术方案如下：
一种仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工程支架的制备方法，步骤如下：
(1)糖基化壳聚糖的制备：将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺加入反应体系中，36～38℃搅拌反应0.5～2h后加入壳聚糖，继续搅拌16～24h，离心获得上清液，调节pH至7.1，继续搅拌3～5h后调节pH至7.5，离心收集沉淀，将沉淀洗涤后，干燥获得糖基化壳聚糖；
所述反应体系为吗啉乙磺酸缓冲液，浓度为0.01～0.05M；所述透明质酸在反应体系中的浓度为1～5mg/mL，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在反应体系中的浓度为4～8mg/mL，所述N-羟基琥珀酰亚胺在反应体系中的浓度为6～7mg/mL，所述壳聚糖在反应体系中的浓度为4～8mg/mL；
(2)糖基化矿化胶原的制备：透明质酸与胶原在氰基硼氢化钠的作用下发生交联反应，35～40℃避光条件下磁力搅拌24h～36h，将交联溶液用醋酸稀释6～8倍，超滤除去未交联分子，冷冻干燥获得糖基化胶原；将糖基化胶原溶解于盐酸中得糖基化胶原溶液，向糖基化胶原溶液中缓慢滴加含有PO4 3-的水溶液，然后逐滴加入含有Ca2+的水溶液，调节pH至7.0，室温下静置24～48h，收集沉淀，沉淀洗涤后，干燥获得糖基化矿化胶原；
所述交联反应的反应体系为六氟异丙醇和碳酸氢钠水溶液按体积比3:(1～2)的混合溶液，碳酸氢钠水溶液的摩尔浓度为0.1～0.2M；所述透明质酸在反应体系中的浓度为4～6mg/mL，所述胶原在反应体系中的浓度为14～18mg/mL，所述氰基硼氢化钠在反应体系中的浓度为4～6mg/mL；
所述糖基化胶原溶液的浓度为0.5～0.8g/L；所述含有PO4 3-的水溶液为NaH2PO4溶液，加入PO4 3-的量为0.010～0.060mol/克糖基化胶原；含有Ca2+的水溶液为CaCl2溶液，加入Ca2+的量与PO4 3-的量的摩尔比为(1.6～1.8)：1；
(3)糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工程支架的制备：以溶剂溶解PLGA，得质量浓度为8％～10％的PLGA溶液，将步骤(1)和步骤(2)制得的糖基化壳聚糖和糖基化矿化胶原加入到PLGA溶液中，分散均匀后，将所得悬浊液注入到直径为1cm的圆柱形聚四氟乙烯模具中降温、成型、干燥后获得仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工程支架。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述透明质酸的重均分子量为700～5000Da；所述壳聚糖的重均分子量为50KDa，脱乙酰度为90％。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为0.05M；所述透明质酸在反应体系中的浓度为3mg/mL，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在反应体系中的浓度为6mg/mL，所述N-羟基琥珀酰亚胺在反应体系中的浓度为6.5mg/mL，所述壳聚糖在反应体系中的浓度为6mg/mL。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述搅拌反应的条件为：37℃搅拌反应0.5h后加入壳聚糖，继续搅拌20h。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述离心的条件为：8000rpm离心10min。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述调节pH采用浓度为0.10M的氢氧化钠溶液。在调节pH至7.1的过程中溶液逐渐出现浑浊，继续搅拌3～5h后调节pH至7.5，溶液中出现更加明显的浑浊现象。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述沉淀洗涤的过程为去离子水反复洗涤沉淀3次，每次洗涤后8000rpm离心，离心时间10min/次。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述透明质酸的重均分子量为700～5000Da；所述胶原为I型胶原。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述交联反应的反应体系为六氟异丙醇和碳酸氢钠水溶液按体积比3:1的混合溶液，碳酸氢钠水溶液的摩尔浓度为0.1M；所述透明质酸在反应体系中的浓度为4mg/mL，所述胶原在反应体系中的浓度为16mg/mL，所述氰基硼氢化钠在反应体系中的浓度为6mg/mL。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述交联反应的条件为：37℃避光条件下磁力搅拌24h。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述交联溶液用醋酸稀释6倍，其中醋酸的质量浓度为5％；所述超滤采用截留分子量为30KDa的超滤管，超滤过程中4000g条件下离心4次，离心时间30min/次。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述盐酸的浓度为0.01M；所述糖基化胶原溶液的浓度为0.8g/L。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述调节pH采用浓度为0.05～0.50M氢氧化钠溶液。调节pH至5～6时开始出现沉淀，调节pH值为7时出现白色悬浊液，室温下静置24～48h。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述沉淀洗涤的过程为去离子水反复洗涤沉淀3次，每次洗涤后8000rpm离心，离心时间10min/次。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述PLGA的重均分子量为300-400KDa，PLGA的类型为75/25。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述溶剂为氯仿或1,4-二氧六环，进一步优选的，所述溶剂为1,4-二氧六环；所述PLGA溶液的质量浓度为8％。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述糖基化矿化胶原、糖基化壳聚糖和PLGA的质量比为5:1:4。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述分散为采用磁力搅拌24h后，400～500W超声处理20-60min，继续磁力搅拌24h。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述聚四氟乙烯模具上固定了直径为14mm的盖玻片，便于支架脱模。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述干燥为在-20℃预冷冻24h后真空冷冻干燥。
一种按照上述制备方法制备的仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工程支架。
一种仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工程支架的生物相容性检测方法，包括如下步骤：
a、将待检测的仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合支架置于48孔板中紫外杀菌1h后，在体积分数为70％的乙醇溶液中浸泡2～3h，然后加入PBS缓冲液浸泡2h，重复浸泡3～5次，然后用RPMI-1640培养基或DMEM/F-12培养基在培养箱中浸泡过夜，制得预处理后样品；
b、将前体成骨细胞MC3T3-E1与大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分别种植在步骤a制得的预处理后样品上，细胞种植密度为103～105个/cm2，37℃、5％CO2条件下培养，分别于培养后检测细胞的增殖情况，并在培养过程中检测其碱性磷酸酶ALP的表达情况，根据结果进行生物相容性评价。
上述生物相容性评价可采用本领域常规评价方法。
根据本发明优选的，步骤b中，所述培养的过程中每隔1天换培养基一次。
上述RPMI-1640培养基和DMEM/F-12(1:1)培养基均为本领域常规市售培养基。前体成骨细胞MC3T3-E1与大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)为本领域常规市售细胞。
有益效果
1.本发明利用分子量为770-5000Da的透明质酸交联矿化胶原作为支架中的主要成分，使其在硬组织的修复与再生研究中也有潜在应用；低分子量透明质酸与细胞表面受体的相互作用将增强细胞黏附、增殖等生理行为，也能促进骨基质分泌和骨矿化诱导新骨再生，同时也可赋予材料抗凝和促血管化的功能，支持支架移植体内后的长期存活，以实现骨缺损的修复与再生；
2.本发明采用生物仿生自组装的方法制备糖基化矿化胶原复合材料，以Ⅰ型胶原交联透明质酸为模板，在钙磷盐溶液中调制矿化而成，其矿物相晶粒度低，且晶体尺寸在纳米量级，经pH值的调节使晶体均匀分布于胶原基质上并具有一定的择优取向，充分模仿了天然骨中无机矿物质与生物大分子规则排列所组成的复合体的组成成分和骨单元均匀有序的分级结构；
3.本发明设计和制备了含有多种成分的多孔复合骨组织工程支架材料，通过调整材料的组成比例弥补了单一材料成型性差、力学强度低和细胞吸附性弱的缺点。PLGA具有良好的生物相容性、无毒和良好的成型性能，通过热致分相法将糖基化矿化胶原、糖基化壳聚糖与PLGA结合制备的三维孔洞网络结构，具有与天然骨极其相似的纳米结构，有利于细胞在支架材料表面的粘附、增殖与分化，一定的粗糙度和孔隙率也有利于新生骨组织长入植入体表面，并促进植入体/宿主组织界面处的骨整合过程。
附图说明
图1为Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA的扫描电子显微镜照片；
图2为Col/HA/HAP-HA/CTS-PLGA的扫描电子显微镜照片；
图3为Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA超薄切片的透射电子显微镜照片；
图4为PLGA，Col/HAP-PLGA，Col/HAP-CTS-PLGA，Col/HA/HAP-HA/CTS-PLGA，Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA的抗压强度柱状图；
图5为前体成骨细胞MC3T3-E1在PLGA，Col/HAP-PLGA，Col/HAP-CTS-PLGA，Col/HA/HAP-HA/CTS-PLGA，Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA支架上增殖结果柱状图；
图6为前体成骨细胞MC3T3-E1在PLGA，Col/HAP-PLGA，Col/HAP-CTS-PLGA，Col/HA/HAP-HA/CTS-PLGA，Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA支架上ALP酶活检测结果柱状图；
图7为大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)在PLGA，Col/HAP-PLGA，Col/HAP-CTS-PLGA，Col/HA/HAP-HA/CTS-PLGA，Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA支架上增殖结果柱状图；
图8为大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)在PLGA，Col/HAP-PLGA，Col/HAP-CTS-PLGA，Col/HA/HAP-HA/CTS-PLGA，Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA支架上ALP酶活检测结果柱状图。
具体实施方式
结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明的保护范围并不仅限于这些实施例。
实施例中所有的原料均为常规原料，市购产品。其中I型胶原购自成都市科乐生物技术有限公司，分子量10KDa；透明质酸(HA)购自华熙福瑞达生物医药有限公司，分子量5KDa；PLGA(75/25)，购自济南岱罡生工程有限公司，分子量320KDa；壳聚糖(CTS)购自济南海得贝海洋生物工程有限公司，平均分子量50KDa。
透明质酸寡糖(oHAs)为5KDa的透明质酸经酶解、分离纯化后得到的四糖、六糖、八糖、十糖、十二糖及其混合物，分子量范围在776-2293Da。透明质酸寡糖的制备步骤参见《透明质酸酶催化透明质酸水解反应的最适条件》(崔向珍，倪运杰，王凤山等，中国生化药物杂志[J].2007,25(3):62-64)。
实施例1
糖基化壳聚糖(HA/CTS，oHAs/CTS)的制备，步骤如下：
分别称取透明质酸(HA)450mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)900mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)975mg，溶解于150mL吗啉乙磺酸(MES)缓冲液(浓度0.05M)中，37℃搅拌反应1h后加入900mg壳聚糖，继续搅拌20h，8000rpm离心10min获得上清液，用浓度为0.1M的NaOH溶液缓慢调节pH至7.1，调节过程中溶液逐渐出现浑浊，继续搅拌4h后，调节pH至7.5，溶液中出现更加明显的浑浊现象，8000rpm离心10min收集沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀3次，每次洗涤后8000rpm离心，离心时间10min/次；冷冻干燥，研磨后得到透明质酸修饰的壳聚糖粉末，即糖基化壳聚糖，用HA/CTS表示。
分别称取透明质酸寡糖(oHAs)450mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)900mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)975mg，按照以上方法制备得到透明质酸寡糖修饰的壳聚糖粉末，即糖基化壳聚糖，用oHAs/CTS表示。
实施例2
糖基化矿化胶原(Col/HA/HAP，Col/oHAs/HAP)的制备，步骤如下：
1)分别称取胶原128mg、透明质酸(HA)32mg、氰基硼氢化钠48mg溶解于8mL交联反应体系中，交联反应体系为六氟异丙醇和0.1M的碳酸氢钠水溶液按体积比3:2的混合溶液，避光条件下37℃磁力搅拌反应24h，得交联溶液；
2)将步骤1)中的交联溶液用质量浓度为5％的醋酸稀释6倍，在截留分子量为30KDa的超滤管中置换4次，4000g离心30min/次，真空冷冻干燥获得糖基化胶原；
3)将步骤2)中的糖基化胶原溶解于500mL0.01M的盐酸中，配制浓度为0.6g/L的糖基化胶原溶液；
4)在步骤3)所得糖基化胶原溶液中缓慢滴加0.1M的NaH2PO4溶液42mL，PO4 3-的加入量为0.014mol/克糖基化胶原；
5)持续搅拌步骤4)所得溶液，缓慢滴加0.1M的CaCl2溶液70mL，加入的Ca2+量与步骤4)中加入的PO4 3-的摩尔比为1.66：1；
6)持续搅拌步骤5)所得溶液，缓慢滴加浓度为0.1M的NaOH溶液调节pH，pH值为6.0左右时，溶液开始变浑浊，继续滴加NaOH溶液至pH为7.0，溶液表现为白色悬浊液；
7)将步骤6)所得悬浊液室温下静置24h，收集沉淀并用去离子水洗涤3次，每次洗涤后8000rpm离心，离心时间10min/次；冷冻干燥，研磨后获得糖基化矿化胶原粉末，用Col/HA/HAP表示，其中HAP为矿化形成的羟基磷灰石。
分别称取胶原蛋白128mg、透明质酸寡糖(oHAs)32mg、氰基硼氢化钠48mg，按照上述方法制备得到糖基化矿化胶原粉末，用Col/oHAs/HAP表示，其中HAP为矿化形成的羟基磷灰石。
实施例3
糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工程支架(Col/HA/HAP-HA/CTS-PLGA(5:1:4)，Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA(5:1:4))的制备，步骤如下：
1)将PLGA溶解于1,4-二氧六环中，得PLGA溶液，其质量浓度为8％；
2)将实施例1和实施例2中制得的糖基化壳聚糖(HA/CTS)和糖基化矿化胶原(Col/HA/HAP)加入到PLGA溶液中，或者，将实施例1和实施例2中制得的糖基化壳聚糖(oHAs/CTS)和糖基化矿化胶原(Col/oHAs/HAP)加入到PLGA溶液中，用磁力搅拌24h后，400W超声处理20min，继续磁力搅拌24h，得悬浊液，其中，Col/HA/HAP、HA/CTS与PLGA的质量比为5:1:4，Col/oHAs/HAP、oHAs/CTS与PLGA的质量比为5:1:4；
3)将步骤2)所得悬浊液注入到直径为1cm的圆柱形聚四氟乙烯模具中，聚四氟乙烯模具上固定了直径为14mm的盖玻片，便于支架脱模，经降温、成型后，于-20℃进行24h预冷冻，然后真空冷冻干燥获得仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工程支架，分别记为Col/HA/HAP-HA/CTS-PLGA或者Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA。
Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA的扫描电子显微镜(SEM)照片如图1所示，Col/HA/HAP-HA/CTS-PLGA的扫描电子显微镜(SEM)照片如图2所示，根据SEM照片观察到复合骨组织工程支架材料中单个孔的形状和孔壁形貌，孔为多边形，没有一定的规则，孔壁较平整，孔壁厚度比较均匀，为15-30μm，还可以看到互通的孔，孔的走向不是沿一个方向，而是纵向和横向都有，使得孔与孔之间形成相通的结构并仍有较高孔隙率及良好的孔连通性。
用切片机将Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA进行超薄切片，切片厚度约为50nm，其透射电子显微镜(TEM)照片如图3所示，可以看出复合骨组织工程支架材料的内部显微组织结构，有许多纤维束状的结构随机分布，各个方向均有，纤维束由一些平行的纤维排列而成，各纤维束的大小有不同，可以观察到有10多根胶原纤维并行排列形成纤维束，在纤维束中间是没有显相的聚乳酸的高分子。
将胶原溶解于盐酸中，按照实施例2中步骤3)～7)，制备得到矿化胶原，记为Col/HAP；以Col/HAP和PLGA为原料，两者质量比为1:1，按照实施例3的方法制备得到复合骨组织工程支架Col/HAP-PLGA；以Col/HAP、壳聚糖和PLGA为原料，Col/HAP、壳聚糖和PLGA的质量比为5:1:4，按照实施例3的方法制备得到复合骨组织工程支架Col/HAP-CTS-PLGA。
利用万能拉力机测试上述PLGA、Col/HAP-PLGA、Col/HAP-CTS-PLGA、Col/HA/HAP-HA/CTS-PLGA和Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA的抗压强度，检测结果如图4所示，结果显示，纯PLGA抗压强度最小，容易在外力作用下发生较大形变；随着材料中无机成分的添加，抗压强度不断增加，这与孔隙率不断降低的结果相对应，除了PLGA外的四种材料的力学性能指标均达到了骨的力学性能数据的下限，材料的韧性来自胶原基质，也与仿生的自组装分级结构有关。
实施例4
前体成骨细胞MC3T3-E1在各种复合骨组织工程支架材料上的增殖情况
材料的预处理：将实施例3中的PLGA，Col/HAP-PLGA，Col/HAP-CTS-PLGA，Col/HA/HAP-HA/CTS-PLGA，Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA五种复合骨组织工程支架材料放入48孔板中，每种材料设置3组平行，紫外杀菌1h后用体积分数为70％的乙醇溶液浸泡2h，加入无菌PBS缓冲液浸泡2h，乙醇溶液和PBS缓冲液重复浸泡4次，最后用未含血清的RPMI-1640培养基(购自Hyclone)浸泡在培养箱中浸泡过夜，具体操作在生物安全柜内完成；
细胞种植：将备好的前体成骨细胞MC3T3-E1细胞悬液于每孔中接种100μL，细胞种植密度为1.0×104个/cm2，37℃，5％CO2条件下培养4h后每孔补加200μL培养基，每隔1天给细胞更换培养基一次；
MTT增殖：选取培养3d，7d，10d的细胞，吸去旧培养基，用37℃预热的PBS缓冲液清洗3次；每孔加入37℃预热的RPMI-1640培养基(不含血清和双抗)400μL；然后再加入37℃预热的MTT(噻唑蓝，5mg/mL溶于PBS缓冲液中，pH 7.40)40μL，培养4h后在倒置相差显微镜下观察有紫色颗粒沉淀产生，吸出培养基及MTT，加入400μL的DMSO(二甲基亚砜)使沉淀溶解；取96孔板，每孔加入100μLDMSO溶解液在490nm处测定吸光度值，检测结果如图5。
由图5可以看出，细胞均表现为正常的增殖趋势，前体成骨细胞MC3T3-E1在PLGA材料上的增殖相对最快，经透明质酸寡糖修饰的复合骨组织工程支架Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA在细胞增殖培养3天之后的增殖速度开始加快，与未经糖基化修饰的复合骨组织工程支架Col/HAP-PLGA，Col/HAP-CTS-PLGA相比，前体成骨细胞MC3T3-E1在糖基化修饰的材料(Col/HA/HAP-HA/CTS-PLGA，Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA)上的增殖幅度相对较大。
实施例5
前体成骨细胞MC3T3-E1在各种复合骨组织工程支架材料上的碱性磷酸酶ALP表达情况
检测方法参考实施例4，不同在于前体成骨细胞MC3T3-E1的种植密度为2.19×104个/cm2，检测指标为细胞培养10d、20d、30d后在各种复合骨组织工程支架材料上表达碱性磷酸酶ALP的酶活，检测结果如图6所示。
由图6可以看出，所有材料都表现出碱性磷酸酶ALP酶活逐渐升高的趋势，其中，前体成骨细胞MC3T3-E1在PLGA材料上碱性磷酸酶ALP酶活增幅远远小于其他材料，在细胞培养过程中透明质酸寡糖修饰的复合骨组织工程支架Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA上细胞的碱性磷酸酶ALP酶活增幅较高，说明上述糖基化修饰的复合骨组织工程支架材料能促进MC3T3-E1逐渐分化为成熟的成骨细胞。
酶活力单位定义：在pH9.8的diethanolamine(DEA)缓冲液中，37℃条件下，每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位。
实施例6
大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)在各种复合骨组织工程支架材料上的增殖情况
检测方法参考实施例4，不同之处在于培养细胞为BMSC，细胞种植密度为8×103个/cm2，培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F-12(1:1)培养基，检测指标为细胞培养1d、4d、7d后在各种复合骨组织工程支架材料上的增殖情况，检测结果如图7所示。
由图7可以看出，细胞均表现为正常的增殖趋势，且在各种复合骨组织工程支架材料上细胞增殖幅度相差不大，其中，在透明质酸寡糖修饰的复合骨组织工程支架Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA上BMSC在第7天表现出较大增幅。
实施例7
大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)在各种复合骨组织工程支架材料上的碱性磷酸酶ALP的表达情况
检测方法参考实施例4，不同之处在于培养细胞为BMSC，细胞种植密度为1.7×104个/cm2，培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F-12(1:1)培养基，检测指标为细胞培养7d、14d、21d后在各种复合骨组织工程支架材料上表达碱性磷酸酶ALP的酶活，检测结果如图8所示。
由图8可以看出，所有材料都表现出碱性磷酸酶ALP活性逐渐升高的趋势，其中，BMSC在PLGA材料上碱性磷酸酶ALP的酶活增势较缓，这说明虽然前期细胞可以在PLGA材料上黏附和增殖并且表达碱性磷酸酶ALP，但是在第二周、第三周并没有良好的促进碱性磷酸酶ALP表达的效果；透明质酸修饰的复合骨组织工程支架(Col/HA/HAP-HA/CTS-PLGA，Col/oHAs/HAP-oHAs/CTS-PLGA)在细胞培养了14天和21天时碱性磷酸酶ALP的酶活升高明显，说明透明质酸能够促进BMSC逐渐分化为成熟的成骨细胞并进一步促进ALP的表达。
酶活力单位定义：在pH9.8的diethanolamine(DEA)缓冲液中，37℃条件下，每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位。

Claims (10)

1.一种仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)糖基化壳聚糖的制备：将透明质酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺加入反应体系中，36～38℃搅拌反应0.5～2h后加入壳聚糖，继续搅拌16～24h，离心获得上清液，调节pH至7.1，继续搅拌3～5h后调节pH至7.5，离心收集沉淀，将沉淀洗涤后，干燥获得糖基化壳聚糖；
所述反应体系为吗啉乙磺酸缓冲液，浓度为0.01～0.05M；所述透明质酸在反应体系中的浓度为1～5mg/mL，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在反应体系中的浓度为4～8mg/mL，所述N-羟基琥珀酰亚胺在反应体系中的浓度为6～7mg/mL，所述壳聚糖在反应体系中的浓度为4～8mg/mL；
(2)糖基化矿化胶原的制备：透明质酸与胶原在氰基硼氢化钠的作用下发生交联反应，35～40℃避光条件下磁力搅拌24h～36h，将交联溶液用醋酸稀释6～8倍，超滤除去未交联分子，冷冻干燥获得糖基化胶原；将糖基化胶原溶解于盐酸中得糖基化胶原溶液，向糖基化胶原溶液中缓慢滴加含有PO4 3-的水溶液，然后逐滴加入含有Ca2+的水溶液，调节pH至7.0，室温下静置24～48h，收集沉淀，沉淀洗涤后，干燥获得糖基化矿化胶原；
所述交联反应的反应体系为六氟异丙醇和碳酸氢钠水溶液按体积比3:(1～2)的混合溶液，碳酸氢钠水溶液的摩尔浓度为0.1～0.2M；所述透明质酸在反应体系中的浓度为4～6mg/mL，所述胶原在反应体系中的浓度为14～18mg/mL，所述氰基硼氢化钠在反应体系中的浓度为4～6mg/mL；
所述糖基化胶原溶液的浓度为0.5～0.8g/L；所述含有PO4 3-的水溶液为NaH2PO4溶液，加入PO4 3-的量为0.010～0.060mol/克糖基化胶原；含有Ca2+的水溶液为CaCl2溶液，加入Ca2+的量与PO4 3-的量的摩尔比为(1.6～1.8)：1；
(3)糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工程支架的制备：以溶剂溶解PLGA，得质量浓度为8％～10％的PLGA溶液，将步骤(1)和步骤(2)制得的糖基化壳聚糖和糖基化矿化胶原加入到PLGA溶液中，分散均匀后，将所得悬浊液注入到直径为1cm的圆柱形聚四氟乙烯模具中降温、成型、干燥后获得仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工程支架。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述透明质酸的重均分子量为700～5000Da；所述壳聚糖的重均分子量为50KDa，脱乙酰度为90％。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为0.05M；所述透明质酸在反应体系中的浓度为3mg/mL，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在反应体系中的浓度为6mg/mL，所述N-羟基琥珀酰亚胺在反应体系中的浓度为6.5mg/mL，所述壳聚糖在反应体系中的浓度为6mg/mL。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)满足以下条件中的一项或多项：
i.所述搅拌反应的条件为：37℃搅拌反应0.5h后加入壳聚糖，继续搅拌20h；
ii.所述离心的条件为：8000rpm离心10min；
iii.所述调节pH采用浓度为0.10M的氢氧化钠溶液；
iv.所述沉淀洗涤的过程为去离子水反复洗涤沉淀3次，每次洗涤后8000rpm离心，离心时间10min/次。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述透明质酸的重均分子量为700～5000Da；所述胶原为I型胶原。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述交联反应的反应体系为六氟异丙醇和碳酸氢钠水溶液按体积比3:1的混合溶液，碳酸氢钠水溶液的摩尔浓度为0.1M；所述透明质酸在反应体系中的浓度为4mg/mL，所述胶原在反应体系中的浓度为16mg/mL，所述氰基硼氢化钠在反应体系中的浓度为6mg/mL。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)满足以下条件中的一项或多项：
i.所述交联反应的条件为：37℃避光条件下磁力搅拌24h；
ii.所述交联溶液用醋酸稀释6倍，其中醋酸的质量浓度为5％；所述超滤采用截留分子量为30KDa的超滤管，超滤过程中4000g条件下离心4次，离心时间30min/次；
iii.所述盐酸的浓度为0.01M；所述糖基化胶原溶液的浓度为0.8g/L；
iv.所述调节pH采用浓度为0.05～0.50M氢氧化钠溶液；
v.所述沉淀洗涤的过程为去离子水反复洗涤沉淀3次，每次洗涤后8000rpm离心，离心时间10min/次。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PLGA的重均分子量为300-400KDa，PLGA的类型为75/25。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)满足以下条件中的一项或多项：
i.所述溶剂为氯仿或1,4-二氧六环；所述PLGA溶液的质量浓度为8％；
ii.所述糖基化矿化胶原、糖基化壳聚糖和PLGA的质量比为5:1:4；
iii.所述分散为采用磁力搅拌24h后，400～500W超声处理20-60min，继续磁力搅拌24h；
iv.所述聚四氟乙烯模具上固定了直径为14mm的盖玻片；
v.所述干燥为在-20℃预冷冻24h后真空冷冻干燥。
10.一种按照权利要求1～9任一项所述的制备方法制备的仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/PLGA复合骨组织工程支架。
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