CN101628127A

CN101628127A - 一种眼眶缘组织工程骨及其应用

Info

Publication number: CN101628127A
Application number: CN200810040539A
Authority: CN
Inventors: 范先群; 周慧芳
Original assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Ninth Peoples Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2008-07-14
Filing date: 2008-07-14
Publication date: 2010-01-20

Abstract

本发明涉及一种眼眶缘组织工程骨及其应用。一种眼眶缘组织工程骨由下列方法制得：(1)骨种子细胞培养及诱导；(2)制备个体化的骨修复支架；(3)骨种子细胞和骨修复支架体外复合并进行培养；其中所述的步骤(3)是将培养至第二代时的骨种子细胞和骨修复支架复合，形成骨种子细胞和骨修复支架复合物。在体外构建并培养的眶缘组织工程骨，与正常眼眶缘的组织结构和特性相似，在体内能够在支架材料降解的同时促进自体骨再生，并发生合理的骨改建，最终为自体骨组织所替代，达到形态与功能的双重修复。

Description

一种眼眶缘组织工程骨及其应用

技术领域

本发明涉及一种组织工程化骨，具体地说关于一种眼眶缘组织工程骨及其应用。

背景技术

眼眶缘呈不规则的类圆形开口状，其作为面部最中心的部位，不仅参与了面部轮廓的塑造，而且对保护眼球起着重要作用。先天性畸形、肿瘤手术、外伤及炎症均可能造成眶缘的骨缺损或发育不全，需要对骨折、缺损、畸形的眶缘进行修复重建。目前国内外使用的眼眶缘修复材料包括自体骨、异体骨及多种人工材料。

自体骨移植一直以来都是临床各种骨修复手术的金标准，但是自体骨的来源有限，而且供区存在出血、感染、慢性疼痛等并发症的风险。异体骨来源广泛，具有良好的骨传导性，但不具有骨诱导性，而且存在传播HIV和乙型肝炎等传染性疾病及引起免疫排斥反应的潜在危险。异种异体骨移植来源于动物，供应丰富，但是虽然经过各种方法加以处理，去处其内部的抗原性物质，但是仍不可完全避免发生免疫排斥反应的风险，此外异种骨移植存在传播动物源性疾病的危险，并存在伦理方面的问题。应用于眼眶缘修复的人工材料主要包括：高分子多孔聚乙烯、羟基磷灰石和钛金属，这些材料均不能降解或降解很慢，长期作为异物存在于机体内，故存在发生排异反应、感染、囊肿形成和植入物移位等并发症的危险。国内外学者尝试了多种可吸收材料进行眼眶缘缺损的修复，例如聚L-乳酸、聚L/DL-乳酸、聚乙醇酸等，但是这些材料降解速度不可控，在水解过程中会释放大量酸性物质，刺激组织产生炎症反应，而且材料内部没有细胞，成骨依赖于宿主骨的细胞参与，导致其植入体内后愈合速度缓慢，甚至无法愈合。因此，目前临床上尚缺乏理想的眼眶眶缘修复材料。

20世纪90年代以来，随着组织工程学的迅速发展和多学科如分子生物学、细胞生物学、生物材料学、眼眶外科学的共同发展和学科交叉、融合使得利用组织工程技术构建骨组织成为可能，并被认为是骨替代材料发展的方向。目前应用组织工程骨修复骨缺损的研究，主要集中在骨科和口腔科领域，已经在细胞的取材、体外培养、成骨诱导、细胞与支架材料的复合等方面取得了较大的进展。并有研究通过动物实验，验证了体外构建的组织工程骨能够修复下颌骨、四肢骨、颅骨等缺损。但是国内外尚未见应用组织工程技术修复眼眶缘缺损的相关研究。基于眶缘解剖结构的特殊性，应用组织工程技术修复缺损时与四肢骨、下颌骨等承重骨存在显著的不同：一是眶缘形态复杂，个体差异大，所以需对支架材料进行个体化预制，以保证对骨缺损部位的形态学修复。二是眶缘为非承重骨，所承受应力较低，而我们知道骨改建与应力有密切关系，骨组织会随着其所受的应力而发生相应的改建。所以，在低应力的环境下，植入的材料逐步降解之后，新生骨组织会发生怎样的改建，是否会形成我们所期待的眶缘形态及功能还有待研究。

中国专利文献CN1846793公开了“一种组织工程骨及其构建与应用”，所述的组织工程骨，包括载体支架和种子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有骨组织三维结构和生物活性的复合体，所述的载体支架为改性的具有大孔径和高孔隙率并经过去酸化处理的PLGA，其上负载有细胞因子骨形态发生蛋白，即BMP；种子细胞为骨髓基质干细胞。所述的组织工程骨可用于构建修复大段骨缺损的功能性组织工程化骨移植物。中国专利文献CN1973910公开了“组织工程骨及其制造方法”。中国专利文献CN101085374公开了“一种组织工程化骨复合体及应用”。但是，关于一种眼眶缘组织工程骨及其应用方面未见报道。

发明内容

本发明的目的在于：

(1)提供一种眼眶缘组织工程骨；

(2)提供一种眼眶缘组织工程骨的应用。

本发明的目的是通过以下技术方法来实现的：构建眼眶缘组织工程骨，其核心是建立骨种子细胞与支架材料的三维空间复合体。本发明以成骨诱导的自体骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)作为种子细胞，预制三维外形的β-磷酸三钙(β-Tricalcium Phosphate，β-TCP)作为支架材料，体外复合构建个体化的眼眶缘组织工程骨。

本发明的技术方案如下：

一种眼眶缘组织工程骨，它由下列方法制得：

(1)骨种子细胞培养及诱导；

(2)制备个体化的骨修复支架；

(3)骨种子细胞和骨修复支架体外复合并进行培养；

其中所述的步骤(3)是将培养至第二代时的骨种子细胞和骨修复支架复合，形成骨种子细胞和骨修复支架复合物。

所述的骨种子细胞和骨修复支架复合物在体外培养时间为5天。

所述的骨修复支架是根据立体光刻模型进行翻模制作得到的，立体光刻模型所需的数据是通过下列方法得到的：CT扫描、通过Medgraphics软件和Magic.RP软件进行三维建模处理、得到计算机三维模型数据。

所述的计算机三维模型中眼眶缘缺损部位的数据作为支架形状模型数据。

立体光刻模型是根据计算机三维模型数据的1.16倍制作。

支架材料选自珊瑚、羟基磷灰石或磷酸三钙中的一种。

磷酸三钙是β-磷酸三钙。

所述的骨种子细胞是骨髓基质干细胞。

所述的骨种子细胞体外培养时在α-MEM培养液中添加入50μM的抗坏血酸、10mM的β-磷酸甘油、10nM的地塞米松作为成骨诱导剂

组织工程化骨在眼眶缘缺损修复领域中应用。

本发明所公开一种眼眶缘组织工程骨及其应用，其优点表现在：(1)本发明制造的β-TCP支架具有良好的内部空间结构和生物相容性，适宜BMSCs的黏附、生长和增殖，达到眼眶缘骨修复的力学要求。(2)应用CAD/CAM技术对β-TCP三维支架进行预制，为眶缘的修复提供了一个良好的形态修复基础，并方便了手术操作。(3)应用成骨诱导的自体BMSCs作为种子细胞，创伤小、无免疫原性、在短期内能够获得大量有成骨能力的细胞。(4)在体外构建并培养的眶缘组织工程骨，与正常眼眶缘的组织结构和特性相似，在体内能够在支架材料降解的同时促进自体骨再生，并发生合理的骨改建，最终为自体骨组织所替代，达到形态与功能的双重修复。(5)本发明选用培养至第二代时的骨种子细胞和骨修复支架复合，形成的复合物在体外培养5天。优化了本发明，节省了实验时间和实验费用。

附图说明

图1：应用镜像技术，根据CT数据重建的犬头颅SLA三维模型，并标记了眼眶缘缺损的部位。

图2：应用CAD/CAM技术制作的眶缘缺损部位的SLA树脂模型。

图3：根据SLA模型预制的β-TCP支架材料。

图4：BMSCs与β-TCP支架在体外复合5天时，扫描电镜观察：材料表面已经完全被细胞所覆盖，细胞增殖旺盛、并分泌胶原纤维。

图5：BMSCs与β-TCP支架在体外复合5天时，扫描电镜观察：细胞在材料内部帖壁生长，并相互交联形成网状。

图6：组织工程骨植入犬皮下1月即见新生骨组织和血管形成(50X)。

图7：组织工程骨植入犬皮下3月时新生骨明显增多，并可见丰富的新生血管和骨髓脂肪组织(50X)。

图8：术中应用体外构建的眶缘组织工程骨修复犬眶下缘骨缺损，植入物与骨断端吻合良好。

图9：眶缘组织工程骨修复犬眶下缘缺损3月后，CT影像示修复后的眶下缘外形良好。

图10A：大体观察可见眶下缘缺损得到良好修复，具备正常生理形态，断端处为骨样连接，骨质较厚。

图10B：大体观察可见眶下缘缺损得到良好修复，具备正常生理形态，断端处为骨样连接，骨质较厚。(外侧面)

图10C：大体观察可见眶下缘缺损得到良好修复，具备正常生理形态，断端处为骨样连接，骨质较厚。(内侧面)

图11：眶缘组织工程骨修复犬眶下缘缺损3月后，Micro-CT显示植入物与骨断端已形成骨性连接，新生骨小梁逐步替代支架材料。

图12：眶缘组织工程骨修复犬眶下缘缺损3月后，硬组织切片荧光显微镜下观察：材料内部可见广泛分布的条带状荧光标记区域，相互交联呈网状(50×)。

图13A：眶缘组织工程骨修复犬眶下缘缺损3月后，硬组织切片VANGIESON-苦味酸品红染色观察：有较多深红色编织骨结构，可见成熟的板层骨，材料两端与正常骨之间为紧密的骨性连接。

图13B：眶缘组织工程骨修复犬眶下缘缺损3月后，硬组织切片VANGIESON-苦味酸品红染色观察：可见新生的成熟板层骨(50×)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

体外构建犬眼眶缘组织工程骨

一、BMSCs体外成骨诱导培养及检测

BMSCs在应用添加了β-磷酸甘油、地塞米松及抗坏血酸的α-MEM培养液进行体外成骨诱导培养，以未诱导BMSCs为对照，进行细胞形态学及成骨活性检测。结果显示：犬BMSCs经成骨诱导培养后细胞生长周期以及细胞增殖不受影响，可传至10代以上，细胞形态和增殖率仍与原代基本相似，足够数量作为种子细胞种植载体；ALP、钙结节染色呈强阳性；表达成骨标志性蛋白(OCN，OPN，BSP，Cbfa1、I型胶原等)及成骨相关基因(OCN，OPN，BSP)。而未诱导BMSCs的ALP染色呈弱阳性、钙结节染色阴性，成骨标志性蛋白及相关基因的表达量低于诱导组。

二、犬眼眶缘β-TCP三维支架材料的制造

建立犬眼眶缘缺损模型：眶下缘长25mm的截断性缺损。对实验动物犬头颅进行螺旋CT扫描，层厚为0.625mm，螺距为1.375mm，KV值为200mA；然后进行容积重建，重建厚度为1.25mm，间隔0.4mm。将CT资料以DICOM(Digital Imaging and Communications in Medicine)格式输出，通过Medgraphics软件和Magic.RP(Magic Rapid Prototyping)软件进行三维建模处理，得到犬头颅的三维模型。采用镜像技术对犬头颅三维模型进行处理，得到眼眶缘缺损区域的三维模型，然后通过立体光刻(Stereolithography，SLA)快速原型的制作，得到眶缘骨缺损的树脂模型。考虑到后续加工，需对材料进行抛光处理，会损失一部分体积，故本研究采用的SLA模型是根据真实犬头颅CT数据的1.16倍制作，已预留了体积作为后续加工所需要的损耗。使用该树脂模型进行硅橡胶取阴模，将β-TCP粉末搅拌成糊状后注入模具，放入干燥箱80℃中12小时，然后进行微波烧结一次成型。其中CT数据重建犬头颅三维模型(图1)，根据镜像技术得到眶缘缺损部位的三维模型，并制造SLA树脂模型(图2)，根据SLA模型对β-TCP支架进行个性化预制(图3)，并对材料进行内部结构及力学性能的检测。结果显示：制备的β-TCP支架为多孔、较为致密，5ml注射器针尖不能轻易刺入，材料亲水性良好。眶下缘支架材料与犬真实解剖结构符合，为不规则形，长约25mm，宽约10mm。内部呈均匀的多孔三维结构，平均孔径406.3μm，孔隙率约为84.63％，力学强度＞2Mpa，达到眼眶缘组织工程支架的要求。

三、BMSCs与β-TCP支架复合体外构建眶缘组织工程骨

成骨诱导BMSCs细胞培养至第二代时，胰蛋白酶消化后计数离心，制备细胞悬液并调整密度为2×10⁷cells/ml。以单细胞悬液滴渗法接种到无菌培养皿中的预制β-TCP支架上，得到细胞/支架复合体。将该复合体在37℃培养箱(5％CO₂，95％O₂，100％饱和湿度)中静置4小时，以利于细胞贴壁。之后缓慢加入成骨诱导培养液，充分浸没材料，于上述条件继续培养，每天更换培养液。分别于复合4小时、1天、3天、5天和7天，分别取2个细胞材料复合体进行电镜观察。以锐利刀片将其中一个标本切为两个半圆部分，以了解细胞在支架内部的分布增殖情况。结果显示：β-TCP具有良好的多孔三维结构，与BMSCs在体外复合4小时就完成了黏附，较适宜的体外复合培养时间为5天(图4，图5)。

实施例2

体外构建的眼眶缘组织工程骨异位成骨能力的实验

按实施例1的方法体外复合自体诱导BMSCs和β-TCP支架材料构建组织工程骨。

每只犬背部皮下植入3块材料：自体诱导BMSCs复合TCP 1块，自体未诱导BMSCs复合TCP 1块，单纯TCP材料1块。手术方法：实验动物犬麻醉后，于其背部3个独立分开区域各切开1.5cm的小口，充分游离周围的皮下组织后将材料植入，用1号线间断缝合切口。

分别于材料植入后1月、2月、3月取出标本，每个时间点取3只犬的背部皮下标本9块(即自体诱导BMSCs复合TCP、自体无诱导BMSCs复合TCP、单纯TCP材料各3块)。标本经4％多聚甲醛固定后用10％EDTA溶液脱钙，行HE染色后于光学显微镜下观察新骨形成和血管化情况。

结果显示：自体诱导BMSCs复合TCP支架材料构建的组织工程骨植入犬皮下1月即见新生骨组织和血管形成，3月时新生骨明显增多，并可见丰富的新生血管和骨髓脂肪组织(图6，图7)。未诱导BMSCs/β-TCP复合物仅见少量成骨，而单纯β-TCP不具备异位成骨能力。

实施例3

眼眶缘组织工程骨原位修复犬眼眶缘骨缺损的实验

犬眶下缘骨缺损模型的建立：作下眼睑皮肤切口，顿性分离皮下组织及肌肉，充分暴露眼眶下缘及颧弓，切开骨膜并用剥离子进行剥离。根据计算机辅助设计的缺损的部位及大小，使用电锯自眶下缘内侧至颧弓，制造一长约25mm的节段性骨缺损，去除缺损处骨膜。植入自体诱导BMSCs和β-TCP构建的眶缘组织工程骨，在眶下缘及颧弓两断端用电钻各钻一小孔，用1号丝线穿过该孔及支架材料上预制的小孔，结扎固定材料(图8)。随后逐层关闭创口。以自体无诱导BMSCs/β-TCP复合物、单纯β-TCP材料作为对照。术后第一天起青霉素80万单位肌注(每天2次×3天)，预防感染。在处死动物取材前2天采用四环素静脉滴注，对新生骨进行荧光标记。

术后1周、4周、8周、12周分别进行螺旋CT检查和三维重建观察。术后12周取材，进行大体观察、骨密度检测、Micro-CT检查及组织学观察，对结果进行统计分析，评价修复效果。

结果显示：成骨诱导BMSCs/β-TCP复合物修复眶缘缺损。3月后，CT影像示眶下缘外形良好(图9)；大体观察可见眶下缘缺损得到良好修复，具备正常生理形态，断端处为骨样连接，骨质较厚(图10A，图10B，图10C)；骨密度为0.30±0.03g/cm²，与正常骨(0.36±0.04g/cm²)无显著区别(P＞0.05)；Micro-CT(图11)和组织学(图12，图13A，图13B)检查表明该复合物与骨断端已形成骨性连接，大部分材料已发生降解并被新生的骨组织所替代。未诱导BMSCs/β-TCP复合物植入后3月，失去正常形态，与骨断端只形成部分骨连接，甚至表现为骨不连，其骨密度(0.23±0.07g/cm²)显著低于正常组(P＜0.05)。单纯β-TCP材料组植入后3月形成骨不连。

实施例4

BMSCs与β-TCP支架的体外复合的合适时间实验

一、复合方法

BMSCs细胞培养至第二代时，胰蛋白酶消化后计数离心，制备细胞悬液并调整密度为2×10⁷cells/ml。以单细胞悬液滴渗法接种到无菌培养皿中的圆片状β-TCP支架上，细胞/支架复合体在37℃培养箱(5％CO₂，95％O₂，100％饱和湿度)中静置4小时，以利于细胞贴壁。之后将细胞/支架复合体转移至6孔板中，每孔缓慢加入成骨诱导培养液约4ml，充分浸没材料，于上述条件继续培养，隔天换液。

BMSCs与β-TCP体外复合后，分别于复合4小时、1天、3天、5天和7天，分别取2个细胞材料复合体进行电镜观察。以锐利刀片将其中一个标本切为两个半圆部分，以了解细胞在支架内部的分布增殖情况。

二、电镜观察细胞-材料复合体的体外培养情况

1.细胞在材料表面的生长情况

BMSCs接种于β-TCP上4小时后可见细胞单层复着于材料表面，分布均匀，大部分细胞向周围伸展而成多角形；小部分细胞呈圆形，尚未伸展。接种1天后细胞基本均已向外伸展呈多角形，细胞紧密贴附于材料表面，可见多个细胞相互形成网状或团块状，细胞进入孔与孔的孔内连接中。接种3天后，细胞增殖迅速、重叠生长，呈规则排列的长梭状，材料表面的孔隙基本被细胞覆盖填充。接种5天后，可见细胞继续快速增殖，呈多层重叠生长，材料的表面及孔隙已被完全覆盖，细胞之间可见分泌的胶原纤维。接种7天后，材料表面的细胞形态与接种5天时相似，也完全覆盖材料表面。

2.细胞在材料内部的生长情况

BMSCs接种于β-TCP上4小时后可见细胞单层复着于材料内部的孔隙表面，细胞呈圆形，尚未向周围伸展；靠近材料表面的孔隙内细胞较多，而越靠近材料中心部，细胞的数量越少。接种1天后细胞开始向外伸展呈多角形，细胞紧密贴附于材料表面，并开始增殖。接种3天后，细胞增殖迅速，可见多个细胞相互形成网状或团块状，细胞通过孔内连接相互沟通。接种5天后，可见细胞继续增殖，细胞形态和分布于第3天相似，更多的细胞间相互形成网状或团块状。接种7天后，材料表面的细胞形态出现老化，细胞数量较前反而减少，考虑为随着培养时间的增加，材料表面被增生的细胞所覆盖，影响了材料中间细胞与外界的气体和营养交换，所以细胞的生长受到影响。根据观察结果显示，BMSCs与β-TCP复合后体外培养的适宜时间为5天。

三、讨论

组织工程的核心是构建细胞与生物支架复合物。在形成细胞-材料复合物的过程中，细胞与材料的粘附是基础，细胞必须与材料发生适当的粘附才能进行迁移、分化和增殖，而接种密度与细胞在材料上的粘附生长密切相关。Goshima等发现磷酸三钙和羟基磷灰石复合物BMSCs接种密度为5×10⁵/ml时，仅1/12标本有皮下成骨现象。Haynesworth等以磷酸三钙和羟基磷灰石复合物为支架进行研究，认为0.7-20×10⁶/ml是较佳的初始接种细胞浓度范围。Bruder认为过高的接种浓度(大于50×10⁶/ml)不利于骨髓基质干细胞粘附生长，并造成细胞营养供应不足。为此我们在本实验中选择20×10⁶/ml作为初始接种细胞密度。

体外构建组织工程骨的另外一个重要因素是复合时间。目前对于细胞和材料在体外需复合多少时间再回植尚无定论，不同的细胞和不同的材料所需的复合时间不尽相同。目前主要有两种观点，一种意见提倡较长的体外培养时间，其优点是：体外的恒定环境能为细胞在材料表面附着和生长提供一个稳定的营养环境并利于观察，尤其当利用生物反应器时，既能模拟体内的血液动力学、物理机械环境，又能保持稳定的适合细胞生长的环境。Mauney将BMSCs和支架材料在生物反应器中培养16天，并给予一定的机械刺激和一定浓度的地塞米松进行诱导，发现OPN及矿化基质都有较高的分泌表达。另一种观点是尽可能的缩短体外培养时间，尽早回植，其依据为：体内的各种营养、动力学和物理机械环境对细胞的生长非常重要，尤其是成骨细胞在骨形成的过程中需要一定的力学刺激，而体外无法完全模拟体内的复杂环境。本实验通过扫描电镜观察了细胞-材料体外复合后的在不同时间点，细胞的黏附、生长、增殖情况，以期为细胞-材料体外构建的培养时间选择提供参考。扫描电镜照片显示：BMSCs与β-TCP复合4小时时就完成了黏附，有部分细胞伸展为多角形，在材料表面和内部均有细胞分布；1天后，细胞与材料表面完全贴附、伸展，开始分化和增殖，材料内部的细胞也开始增殖；至第5天，细胞进一步分化和增殖，形成复合细胞层完全覆盖TCP材料的表面，材料内部的细胞也进一步连成网状或团块状，可见分泌细胞外基质及胶原纤维；但是第7天时，材料内部的细胞开始老化，形态发生改变，数量也较前减少。由于静态培养条件下支架表面的细胞优势生长，在培养5天后，细胞-支架复合体的表面均形成了复合细胞层，加剧了支架内部由弥散限制导致的营养供应不足。因此，在静态培养条件下BMSCs与β-TCP体外复合培养的时间不宜过长，根据本实验的结果，体外培养5天较为合适。

实施例5

BMSCs体外诱导培养代数实验

在α-MEM培养液中添加β-磷酸甘油、地塞米松及抗坏血酸作为成骨诱导剂，能够诱导体外培养的犬BMSCs向成骨细胞分化，并显示良好的成骨活性及增殖能力。犬BMSCs体外诱导培养至第二代即可表达成骨细胞表型(ALP，钙结节，OCN，OPN，BSP，Cbfal和I型胶原的表达等)，可作为理想的骨种子细胞。

一、BMSCs成骨功能的生化检测

1、碱性磷酸酶(ALP)染色

ALP定性染色结果表明，成骨诱导培养7天的第二代BMSCs AKP染色为强阳性，阳性反应细胞胞浆呈紫蓝色，局部细胞染色较深；而未诱导BMSCs则显色弱，提示AKP无明显表达。

2、茜素红(ARS)染色

第二代BMSCs成骨诱导培养28天，茜素红染色在大体及镜下观察均见红色的结节，而未诱导培养条件下BMSCs茜素红染色为阴性，说明BMSCs在成骨诱导条件下可形成矿化结节。

3、Von Kossa染色

第二代BMSCs成骨诱导培养28天，形成的白色结节经Von Kossa染色呈棕褐色至棕黑色，未诱导的细胞因成骨分化较弱显淡褐色。

二、免疫细胞化学检测BMSCs成骨相关蛋白的表达情况

诱导培养的BMSCs能表达OCN、OPN、BSP、I型胶原和Cbfa1：免疫细胞化学染色可见大部分细胞胞浆中有棕色颗粒，免疫荧光观察大部分细胞胞浆见绿色荧光。未诱导培养BMSCs可表达OCN、BSP，OPN和I型胶原：染色见部分细胞胞浆内有棕色颗粒，免疫荧光见部分细胞胞浆呈绿色荧光，但表达较诱导培养的BMSCs弱，且未见有Cbfal的阳性表达。人成纤维细胞的染色除I型胶原阳性外其余均为阴性，空白对照均为阴性。

三、Western-blot检测BMSCs细胞OCN、OPN蛋白表达情况

检测结果显示诱导培养的BMSCs和未诱导培养的BMSCs组在15K D和36K D处均有条带形成，说明两组细胞中均有OCN、OPN蛋白的分泌表达。但是诱导培养的BMSCs的OCN和OPN蛋白条带比未诱导组深，提示BMSCs经诱导后的骨基质蛋白的分泌增加。

四、RT-PCR检测细胞中OCN、OPN和BSP的mRNA表达情况

检测结果显示诱导培养的第二代BMSCs和未诱导培养的第二代BMSCs组均有OCN、OPN和BSP的mRNA表达。提示BMSCs中存在确定性骨祖细胞(不需要任何诱导因子的参与就可以适应机体生长发育和再生修复的需要，并能自动分化为成骨细胞)。

五、荧光定量PCR检测细胞中OCN、OPN和BSP的mRNA表达差异

由SYBR Green法进行的Real-time PCR结果表明：在进行成骨诱导培养后的BMSCs的OCN表达量为未诱导时的3.32倍，OPN的表达为未诱导时的2.68倍，而BSP的基因表达为未诱导的0.77。

无需进一步详细阐述，相信阅读了本发明上述公开的内容后，本领域技术人员可最大限度地应用本发明，可作各种改动或修改，因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

Claims

1、一种眼眶缘组织工程骨，它由下列方法制得：

(1)骨种子细胞培养及诱导；

(2)制备个体化的骨修复支架；

(3)骨种子细胞和骨修复支架体外复合并进行培养；

其特征在于：所述的步骤(3)是将培养至第二代时的骨种子细胞和骨修复支架复合，形成骨种子细胞和骨修复支架复合物。

2、根据权利要求1所述的组织工程化骨，其特征在于：所述的骨种子细胞和骨修复支架复合物在体外培养时间为5天。

3、根据权利要求1所述的组织工程化骨，其特征在于：所述的骨修复支架是根据立体光刻模型进行翻模制作得到的，立体光刻模型所需的数据是通过下列方法得到的：CT扫描、通过Medgraphics软件和Magic.RP软件进行三维建模处理、得到计算机三维模型数据。

4、根据权利要求3所述的组织工程化骨，其特征在于：所述的计算机三维模型中眼眶缘缺损部位的数据作为支架形状模型数据。

5、根据权利要求3所述的组织工程化骨，其特征在于：立体光刻模型是根据计算机三维模型数据的1.16倍制作。

6、根据权利要求1所述的组织工程化骨，其特征在于：支架材料选自珊瑚、羟基磷灰石或磷酸三钙中的一种。

7、根据权利要求6所述的组织工程化骨，其特征在于：所述的磷酸三钙是β-磷酸三钙。

8、根据权利要求1所述的组织工程化骨，其特征在于：所述的骨种子细胞是骨髓基质干细胞。

9、根据权利要求1所述的组织工程化骨，其特征在于：骨种子细胞体外培养时在α-MEM培养液中添加入50μM的抗坏血酸、10mM的β-磷酸甘油、10nM的地塞米松作为成骨诱导剂。

10、权利要求1-9任一所述的组织工程化骨在眼眶缘缺损修复领域中应用。