CN104740686A - 一种分步式组织工程骨构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及骨组织工程技术领域，公开了一种分步式组织工程骨构建方法，包含下述步骤：(1)支架修复和预血管化：在骨缺损部位构建组织工程骨支架，并进行预血管化；(2)骨组织工程种子细胞后植:待炎症反应期过后，配合微血管长入时间，将成骨诱导后的种子细胞植入所述骨缺损部位的组织工程骨支架内；且所述步骤(2)骨组织工程种子细胞后植在所述步骤(1)支架修复和预血管化的7～14天后进行。本发明的方法先植入促血管生长的支架，后期再植入成骨的种子细胞，可快速构建大段组织工程骨、大大减少修复单位体积骨组织所需要的骨组织工程种子细胞的使用量，提高种子细胞利用率。

Description

一种分步式组织工程骨构建方法

技术领域

本发明涉及骨组织工程技术领域，特别涉及一种用于骨缺损修复的分步式组织工程骨构建方法。

背景技术

因创伤、肿瘤或老化等因素引起的全身各类型骨缺损是外科系统常见病。临床上常用治疗手段包括使用自体骨、异体骨及生物材料移植进行修复，但存在拆东墙补西墙、潜在疾病传播、修复效果有限等问题。近年来新兴的骨组织工程技术有望克服这些传统技术的缺陷。

传统骨组织工程技术是将种子细胞在体外进行大量扩增后，接种在具有诱导成骨活性的三维可降解生物支架上，通过一定时间体外诱导后植入缺损部位，促进体内自身血管长入吸收及原位骨断端残存骨细胞“爬行替代”成骨。当骨缺损体积较小时，凭借种子细胞或者成骨活性因子的刺激作用，通常可以达到完全修复效果。但针对大段骨缺损却难以达到稳定且长期的修复效果。究其原因，我们认为有以下五点：1)种子细胞植入后的迅速死亡：常见种子细胞之一骨髓间充质干细胞在移植入骨缺损部位的前2星期即已大量减少，到第4星期时已很难再检测到，其原因可能是缺乏营养交换，材料孔隙率低等引起。2)微血管长入的时间太慢：通常情况下，断端毛细血管发芽增生需要1～2星期，此时大段植入组织工程骨中心区域的外源性干细胞早已因缺乏充分氧气及养分交换大量发生凋亡，没有起到应有的介导“爬行替代”作用；而尺寸因素也决定微血管不可能迅速长满整段大块组织工程骨。3)自体成骨细胞“爬行替代”作用有限：受自身年龄、健康因素影响，个体的细胞生长能力相差显著，成骨细胞能够爬行替代的距离也不一，大段骨缺损仅仅依靠自身断端的成骨细胞爬行，难以完全修复。4)手术引起的炎症反应：根据部位不同，术后1星期内通常会有较强烈的免疫排斥反应，而修复部位体积越大、创伤越大、炎症反应则越强，为了抗感染而注射的高剂量抗生素或抗排斥药物也可能会影响大段骨缺损的修复。5)支架材料强度不足：常见的大段骨缺损通常有四肢骨、下颌骨，均为受力要求高、抗压能力强的支撑骨组织。常见组织工程骨材料普遍在1年内降解，而大段新生骨达到骨密度与正常骨一致的时间根据年龄不同，最长可需要2～3年，因此一种降解速度慢，抗压能力强的生物可降解材料亦迫切需求。

针对以上问题，国内外学者提出了各种方法试图解决问题：

1)使用缓释BMP-2等生长因子的生物材料代替细胞+材料。这样好处是可以保证成骨生长因子的不断释放，不受细胞凋亡影响。但BMP-2缓释时间仍然有限，无法完全满足修复大段骨需要，且剂量不好控制、存在一定的安全隐患，如2008年美敦力的BMP2产品就出现几例致死性的意外。

2)采用内皮细胞与BMSC共培养、VEGF基因转染BMSC、或者大血管预埋等方式促血管化。这些方式被证明可以促使微血管在体内较以往有较快生长，但血管生长速度仍然不够。

综上所述，大段骨缺损由于其缺损体积大、缺损部位各异，因而采用传统的组织工程骨技术对其修复的效果参差不一，也始终无法解决大尺寸骨修复过程中的种子细胞凋亡问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分步式组织工程骨构建方法，该方法可快速构建大段组织工程骨、大大减少修复单位体积骨组织所需要的骨组织工程种子细胞的使用量，提高种子细胞利用率。

为解决上述技术问题，本发明的实施方式所提供的分步式组织工程骨构建方法，包含下述步骤：(1)支架修复和预血管化：在骨缺损部位构建组织工程骨支架，并进行预血管化；(2)骨组织工程种子细胞后植:将成骨诱导后的种子细胞植入所述骨缺损部位的组织工程骨支架内；且所述步骤(2)骨组织工程种子细胞后植在所述步骤(1)支架修复和预血管化的7～14天后进行。

本发明的实施方式所提供的分步式组织工程骨构建方法，按时间顺序划分为两个步骤进行：第一步在骨缺损部位构建组织工程骨支架并进行预血管化；第一步进行完7～14天之后，进行第二步，即对骨缺损部位注射成骨诱导后的种子细胞来进行成骨诱导。与现有技术相比，本发明的创新点在于：(1)改变了传统的组织工程骨技术中将种子细胞与支架材料一起植入体内骨缺损部位的思路，而是采用了先植入促血管生长的支架，后期再植入成骨的种子细胞。(2)对于“首次修复”(即植入促血管生长的支架)与“后植”(即植入成骨的种子细胞)这两个步骤之间的时间间隔，本发明提出了7～14天这个较为合理的时间间隔方案。根据文献报道结合前期实验经验，急性排斥反应在7天时结束，7～14天内血管发芽增生，因此本发明所提供的时间间隔确保了“后植”时间点是在炎症期过后、断端血管开始发芽长入支架材料时，这样能使得种子细胞避开炎症反应期间机体炎症因子的攻击排斥，存活率达到最大化。总的来说，骨缺损的修复过程是血管长入与成骨细胞爬行两个互相不断促进的过程，本发明让组织工程骨支架在体内预构好微血管后，再将种子细胞植入支架内，一方面可以避免手术初期的炎症反应杀死种子细胞，另一方面也可与预构的微血管互相促进，提高种子细胞生存率，不断成骨。此外，“后植成骨”亦可在原位骨断端爬行替代以及支架材料内部独立成骨。“后植”的种子细胞有可能既参与自体骨细胞的爬行替代作用，也可能在远离断端的组织工程骨中心骨化形成一个个独立的骨小岛(Bone formationislet)，不同骨小岛之间可以互相连接促进，这就保证了不受自体骨细胞爬行替代作用的限制，全尺寸骨缺损均可达到修复。

本发明的实施方式所提供的分步式组织工程骨构建方法中，步骤(1)的支架修复和预血管化的方法可以为以下两种方式之一：a)在骨缺损部位植入组织工程骨支架材料，然后植入未经诱导的间充质干细胞；或者b)将具有促血管活性的物质在体外与组织工程骨支架材料结合，然后植入骨缺损部位；上述的促血管活性的物质可以为未经诱导的间充质干细胞，或者也可以为促血管化生长因子如VEGF等，其可代替间充质干细胞促进血管生成。进一步地，将未经诱导的间充质干细胞在体外与组织工程骨支架材料结合的方法为：先将未经诱导的间充质干细胞与藻酸盐凝胶复合，然后与组织工程骨支架材料进行交联。具体来说，先将未经诱导的间充质干细胞与藻酸盐凝胶复合，然后与组织工程骨支架材料进行交联的方法为：在藻酸盐凝胶中加入双蒸水，配置成质量百分含量为1～3％的藻酸盐凝胶溶液；然后将藻酸盐凝胶溶液与未经诱导的间充质干细胞沉淀充分混匀，滴加在组织工程骨支架上进行混合，然后以50～200mM的氯化钙交联1～5分钟。藻酸盐作为一种天然材料，来源广泛，植入体内的安全性和作用的稳定性均较好，上述将未经诱导的间充质干细胞先与藻酸盐凝胶复合后再植入组织工程骨支架内的方法中，藻酸盐凝胶是作为“细胞支架材料”，起到包裹种子细胞的作用。

本发明的实施方式所提供的分步式组织工程骨构建方法中，步骤(1)中所用到的组织工程骨支架材料可以为任何具有成骨能力的组织工程骨支架材料，例如优选为聚己内酯、脱钙骨基质、羟基磷灰石或BETA-磷酸三钙等。进一步地，当选用聚己内酯作为本发明的组织工程骨支架材料时，所述聚己内酯支架材料可采用3D打印方法制备，该材料呈蜂窝状立体结构且内部形成直径为0.1～0.5mm的孔隙。常见的大段骨缺损通常发生在四肢骨或下颌骨等部位，这些部位的骨组织均为受力要求高、抗压能力强的支撑骨组织，而且大段新生骨通常达到骨密度与正常骨一致的时间根据年龄不同，最长可需要2～3年。上述3D打印技术制备而成的蜂窝状立体结构的聚己内酯，是一种降解速度较慢的生物可降解材料，而且抗压能力强、具有较好的力学强度，尤其适合于作为组织工程骨支架材料应用于本发明中。

优选地，本发明的实施方式所提供的分步式组织工程骨构建方法中，步骤(2)中将成骨诱导后的种子细胞植入骨缺损部位的组织工程骨支架内的方法为：在X光引导下，在骨缺损部位的前、中、后三处分别注射成骨诱导后的种子细胞。在骨缺损部位周围的多处进行成骨诱导后的种子细胞的注射，可确保种子细胞在骨缺损部位的组织工程骨支架内部呈均匀、全面地分布；尤其针对于大段骨缺损的情况，可确保快速地实现修复作用、并提高种子细胞的利用率。

优选地，本发明的实施方式所提供的分步式组织工程骨构建方法中，所述的种子细胞为间充质干细胞，例如可以为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或成骨细胞等。在各类种子细胞中优选为同种异体骨髓间充质干细胞，该种细胞已经被证实是骨来源的，具有相对最佳的成骨能力的间充质干细胞，可以做为原位骨缺损修复的组织工程骨种子细胞来源，结合已有的骨髓种子细胞库，采用同一批次的种子细胞更能保证日后运用临床修复时的疗效问题以及来源问题，且不用受患者年龄，健康因素影响，符合伦理学的需要。

最后，本发明的实施方式所提供的分步式组织工程骨构建方法中，在进行步骤(1)支架修复与预血管化之前，先对骨缺损部位包裹聚己内酯复合膜。优选地，该种用于包裹骨缺损部位的聚己内酯复合膜的厚度为0.5～2毫米，呈平面网状结构，且所述平面网状结构的网孔孔径为100～300微米。进一步地，本发明的实施方式还提供该种聚己内酯膜复合膜的制备方法：将聚己内酯与复合添加材料按照质量百分含量分别为80～100％和0～20％的配比混合，然后采用3D打印方法制备得到聚己内酯复合膜。上述制备方法中的复合添加材料可以为BETA-磷酸三钙、羟基磷灰石或珊瑚。使用聚己内酯复合膜对骨缺损部位进行包裹的效果是：一方面，该聚己内酯复合膜可起到包围骨缺损部位的作用，成骨诱导后的种子细胞再植入骨缺损部位后，减少因为注入载体的流动而导致干细胞的流失，提高了种子细胞的利用率；另一方面，该种聚己内酯复合膜有较好的强度，能阻止周围纤维组织的长入，减少因为纤维组织占位而引起的骨不连可能性，达到引导骨再生的作用；再一方面，聚己内酯复合膜属于惰性材料，与骨缺损部位接触后不会引起炎症反应，此外其在X光照射下不显影，不会影响对实验效果的观察比较；同时膜片的包裹起到类似于骨板的内固定作用，对于非承重骨可以较好地保持解剖复位。

附图说明

图1是本发明的分步式组织工程骨构建方法的流程图；

其中：1代表对骨缺损部位植入组织工程骨支架并进行预血管化；2代表骨缺损部位处于炎症反应期；3代表向骨缺损部位植入成骨诱导后的种子细胞；4代表骨缺损部位已有明显成骨；

图2是实施例1中的骨缺损部位植入成骨诱导后的种子细胞时的影像学检查图；

图3是实施例1中的骨缺损部位植入成骨诱导后的种子细胞1个月后的影像学检查图；

图4是实施例1中的骨缺损部位植入成骨诱导后的种子细胞3个月后的影像学检查图；

图5是实施例2中的各实验组的骨缺损部位的影像学检查结果对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。

实施例1

一.建立动物模型

由于兔桡骨模型作为原位骨缺损模型已在各类文献报道较多，据报道1.5cm缺损为临界缺损，且动物成本较经济。因此选取成年雄性大白兔，5月龄，桡骨1.5cm缺损做为本实验动物模型。

二.实验分组

后植组：具体实验步骤见下文；

空白对照组：初期未作任何处理，仅在第14天时，注射0.3mlPBS(未植入预血管化种子细胞，也未植入成骨种子细胞)；

对照组1：传统组织工程方式，即初期就植入6million成骨诱导后的骨髓间充质干细胞；

对照组2：初期未植入预血管化种子细胞，仅在第14天时植入6million的成骨诱导后的骨髓间充质干细胞。

(上述空白对照组、对照组1、对照组2的具体实验步骤略)

三.后植组具体实验步骤：

1、首先制备PCL聚己内酯支架材料：

(1)取聚己内酯原料15克，作为3D打印原材料。

(2)先通过计算机建模软件建立几何模型：设计为内部呈蜂窝状立体结构，且内部形成直径为0.5mm的孔隙，最后生成STL格式文件。

(3)打印实体模型：将上述得到的STL格式文件输入到3D打印机中，对打印参数根据需要进行设置，包括喷头行走路径、熔融温度和挤压速度等，然后打印出三维模型，即得到呈蜂窝状立体结构且内部形成直径为0.5mm的孔隙的聚己内酯支架材料。

2、支架修复和预血管化：

将3million未诱导的骨髓间充质干细胞(BMSC)与0.5毫升质量浓度为1.5％的藻酸钠溶液(Alginate)混合以后，滴加在1.5cm*0.3cm*0.5m的上一步中制备得到的蜂窝状立体结构PCL聚己内酯支架材料上，再以100mM氯化钙水溶液浸泡使其交联2分钟成胶，然后植入骨缺损部位。

3、骨组织工程种子细胞后植：

14天后待炎症反应消退，血管长入时，在截断缺损前中后，分三次，在骨缺损部位的前、中、后分别注射经过7～14天成骨诱导后的BMSC+pbs水溶液。

4、实验结果：

附图2、3、4分别显示了后植组在成骨诱导后的种子细胞植入支架时、以及植入后1个月、3个月时的影像学检查结果。

后植组在成骨诱导后的种子细胞植入支架的1个月后就出现成骨影像，且沿回植材料分布，成骨均匀，而对照组则并无成骨征象。后植组在成骨诱导后的种子细胞植入3个月后已经有比较明显成骨，在注射部位沿材料形成了外形均一的骨组织，骨组织已长入材料，并从断端以及注射部位全面爬行替代。

实施例2

1、制备PCL聚己内酯复合膜：

(1)取聚己内酯原料15克作为3D打印材料。

(2)先通过计算机建模软件建立几何模型：设计为具有孔洞的平面网状结构，孔径直径为200微米，厚度为2毫米，最后生成STL格式文件。

(3)打印实体模型：将上述得到的STL格式文件输入到3D打印机中，对打印参数根据需要进行设置，包括喷头距板高度、喷头挤压速度和喷头行走路径等，然后打印出三维模型，即得到厚度为2毫米，孔径直径为200微米的聚己内酯复合膜。

2、使用上述步骤中制备的聚己内酯复合膜包裹骨缺损部位，然后以实施例1中的实验设计步骤进行分布式组织工程骨构造，各个实验组1个月、3个月时分别进行影像学检查，进行效果对比，如附图5所示。其中0+0代表空白对照组；3+3代表本发明的后植组；6+0代表对照组1，即传统组织工程方式；0+6代表对照组2。从附图5可见，3+3组(即本发明的后植组)成骨最为均匀，相对效果最好。且经过PCL复合膜包裹后的实验组兔桡骨均保持解剖结构稳定，极少出现骨折，成骨成功率比不包裹PCL复合膜有明显提高。

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (14)

1.一种分步式组织工程骨构建方法，其特征在于，包含下述步骤：

(1)支架修复和预血管化：在骨缺损部位构建组织工程骨支架，并进行预血管化；

(2)骨组织工程种子细胞后植:将成骨诱导后的种子细胞植入所述骨缺损部位的组织工程骨支架内；

且所述步骤(2)骨组织工程种子细胞后植在所述步骤(1)支架修复和预血管化的7～14天后进行。

2.根据权利要求1所述的分步式组织工程骨构建方法，其特征在于，所述步骤(1)支架修复和预血管化的方法为：

a)在骨缺损部位植入组织工程骨支架材料，然后植入未经诱导的间充质干细胞；或者

b)将具有促血管活性的物质在体外与组织工程骨支架材料结合，然后植入骨缺损部位。

3.根据权利要求2所述的分步式组织工程骨构建方法，其特征在于，所述促血管活性的物质为未经诱导的间充质干细胞或促血管化生长因子。

4.根据权利要求3所述的分步式组织工程骨构建方法，其特征在于，所述将未经诱导的间充质干细胞在体外与组织工程骨支架材料结合的方法为：先将未经诱导的间充质干细胞与藻酸盐凝胶复合，然后与组织工程骨支架材料进行交联。

5.根据权利要求4所述的分步式组织工程骨构建方法，其特征在于，所述先将未经诱导的间充质干细胞与藻酸盐凝胶复合，然后与组织工程骨支架材料进行交联的方法为：在藻酸盐粉末中加入双蒸水，配置成质量百分含量为1～3％的藻酸盐凝胶溶液；然后将所述藻酸盐凝胶溶液与未经诱导的间充质干细胞沉淀混匀，滴加在组织工程骨支架上进行混合，最后以50～200mM的氯化钙交联1～5分钟。

6.根据权利要求1所述的分步式组织工程骨构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中的组织工程骨支架材料为聚己内酯、脱钙骨基质、羟基磷灰石或BETA-磷酸三钙。

7.根据权利要求6所述的分步式组织工程骨构建方法，其特征在于，所述聚己内酯支架材料采用3D打印方法制备，呈蜂窝状立体结构且内部形成直径为0.1～0.5mm的孔隙。

8.根据权利要求1所述的分步式组织工程骨构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中将成骨诱导后的种子细胞植入骨缺损部位的组织工程骨支架内的方法为：在X光引导下，在骨缺损部位的前、中、后三处分别注射成骨诱导后的种子细胞。

9.根据权利要求1至8中的任一项所述的分步式组织工程骨构建方法，其特征在于，所述种子细胞为间充质干细胞。

10.根据权利要求9所述的分步式组织工程骨构建方法，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或成骨细胞。

11.根据权利要求10所述的分步式组织工程骨构建方法，其特征在于，在进行所述步骤(1)之前，对骨缺损部位包裹聚己内酯复合膜。

12.根据权利要求11所述的分步式组织工程骨构建方法，其特征在于，所述聚己内酯复合膜的厚度为0.5～2毫米，所述聚己内酯复合膜呈平面网状结构，且所述平面网状结构的网孔孔径为100～300微米。

13.根据权利要求11所述的分步式组织工程骨构建方法，其特征在于，所述聚己内酯膜复合膜的制备方法为：将聚己内酯与复合添加材料按照质量百分含量分别为80～100％和0～20％的配比混合，然后采用3D打印方法制备得到聚己内酯复合膜。

14.根据权利要求13所述的分步式组织工程骨构建方法，其特征在于，所述复合添加材料为BETA-磷酸三钙、羟基磷灰石或珊瑚。