CN115089762A - 镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法，该制备方法包括：一、采用逆行髓内钉植入法，通过股骨髁间，将镁棒植入股骨髓腔内，2周后处死大鼠，取出股骨，在股骨干骺端钻取圆柱体形骨组织材料；二、将镁预刺激后的大鼠股骨脱细胞处理，得到脱细胞骨支架；三、将扩增的BMSCs接种到脱细胞骨支架。使用该制备方法，能解决现有骨组织工程支架制作程序复杂、造价昂贵、治疗效果不确切及周期过长、骨缺损修复效果欠佳的问题，其具有制作程序简单、造价低、促进成骨作用较好等优点。

Description

镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法
技术领域
本发明涉及骨组织支架技术领域，具体涉及一种镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法。
背景技术
骨缺损在临床中并不少见，造成骨缺损的原因有很多，包括运动或损伤、骨感染后的清创，以及放疗或骨肿瘤切除后骨不连或骨失去血供等，严重影响患者的生活和工作，给患者生理和心理造成了极大影响。
目前临床用于骨缺损修复的辅助治疗方法主要有三种：自体骨移植、异体骨移植和骨组织工程。自体骨因生物相容性好，成骨能力强，骨诱导、骨传导活性高，被认为是治疗骨缺损的金标准，然而，自体骨移植也伴随着许多相关并发症，如供区血肿、伤口裂开、供骨区疼痛、皮神经损伤、切口感染等。同种异体骨移植也是治疗骨缺损的一种方法，但同样会发生相关并发症，如免疫反应、感染、骨愈合延迟、骨吸收等。
随着组织工程技术的发展，脱细胞骨组织工程支架材料逐渐应用于临床修复骨缺损，一定程度上能够弥补自体骨和异体骨移植的不足，在骨科临床中有广泛的应用前景。然而，现有的骨组织工程支架材料仍有许多缺点需要克服：1.制作程序复杂，造价昂贵。2.促进骨形成、骨传导和骨诱导等效果不确切。3.治疗时间及周期较长。因此，设计一种能够辅助骨缺损修复的新型材料至关重要。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)作为种子细胞促进骨损伤修复方面的研究越来越受到人们的重视。MSCs为来源于中胚层、具有多向分化潜能及自我更新能力的成体干细胞，能向成骨细胞、成软骨细胞等方向分化，在组织损伤时可趋化至损伤组织处发挥促进组织修复、分泌细胞因子、发挥免疫调节功能、促进血管生成等作用。骨损伤部位MSCs募集、增殖及分化为成骨细胞在骨修复过程中发挥重要作用，损伤局部募集足够数量的MSCs是骨损伤修复的前提条件和细胞学基础。然而，单纯的种子细胞能力有限，已不足以满足临床需要，故对种子细胞进行处理及结合生物支架材料成为解决目前面临难题的重要手段。
目前，在骨科领域，有大量的动物实验和少量的前驱临床试验证实了镁金属植入物能促进周围新生骨的生成。同时，研究发现，一定浓度下的镁离子在早期可以促进细胞的增殖和黏附。近期，一篇发表于《Biomaterials》杂志的文章表明，在通过镁棒植入预处理后的骨组织中，降钙素基因相关肽(CGRP)和骨膜蛋白的表达能够明显增加。
发明内容
鉴于以上所述，本发明提供一种镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法，以解决现有骨组织工程支架制作程序复杂、造价昂贵、治疗效果不确切及周期过长、骨缺损修复效果欠佳的问题，其具有制作程序简单、造价低、促进成骨作用较好等优点。
本发明的技术方案：
本发明提供一种镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法，包括如下步骤：
一、采用逆行髓内钉植入法，通过股骨髁间，将镁棒植入股骨髓腔内，2周后处死大鼠，取出股骨，在股骨干骺端钻取圆柱体形骨组织材料；
二、将镁预刺激后的大鼠股骨脱细胞处理，得到脱细胞骨支架；
三、将扩增的BMSCs接种到脱细胞骨支架。
进一步地，步骤二包括如下步骤：
S1：将取出的骨组织通过磷酸盐缓冲液冲洗，然后通过纱布包裹后进行多次冻融循环，样本取出后，置入加有双抗的磷酸盐缓冲液中，在4℃环境下振荡漂洗；
S2：配置0.1-0.3％TritonX-100溶液，加入双抗后将支架浸泡在内，置于4℃环境的摇床上漂洗；
S3：将支架置入加有双抗的磷酸盐缓冲液中，加入2％十二烷基硫酸钠，4℃环境的摇床上振荡；
S4：样本取出后，置入加有双抗的磷酸盐缓冲液中，在4℃环境下振荡漂洗；
S5：1mg/mL的核酸酶溶液中加入双抗，置入孵育3-4天，常温；
S6：4℃加入双抗的磷酸盐缓冲液中震荡漂洗。
进一步地，步骤S6后还包括步骤S7：取出样本，经过冻干后使用环氧乙烷消毒，密封保存。
进一步地，所述冻融循环为置入液氮10-15min，取出后放入37-40℃恒温水浴锅10-15min。
进一步地，步骤S2中，置于4℃环境的摇床上漂洗12-24小时。
进一步地，步骤S3中，4℃环境的摇床上振荡24小时。
进一步地，步骤S4中，在4℃环境下振荡漂洗3次，每次2-3小时。
进一步地，步骤S6中，震荡漂洗3次，每次2-3小时。
本发明的有益效果：
将镁棒植入实验动物体内后，以实验动物为生物反应器，通过镁棒释放的镁离子，刺激实验动物股骨内的BMSCs分泌CGRP、骨膜蛋白、生长因子、胶原蛋白-I等，能够增强股骨内的BMSCs的增殖、黏附、成骨分化等能力。
通过脱细胞技术处理后，消除了该支架的免疫原性，同时其能保留了天然复杂的结构和精细的微体系结构，以及在脱细胞后，生长因子和各种ECM成分，如纤维连接蛋白、硫酸肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和透明质酸仍保留有部分活性，能够在消除材料免疫原性的同时保留其促进成骨分化的功能。
镁离子预刺激的脱细胞骨支架能增强BMSCs的黏附、成骨等生物学行为。BMSCs负载的镁预刺激脱细胞骨支架可促进骨缺损的修复及缩短治疗时间，能够解决自体骨移植中出现的供区血肿、伤口裂开、供骨区疼痛、皮神经损伤、切口感染，同种异体骨移植中免疫反应、感染、骨愈合延迟、骨吸收等，以及现有骨组织工程支架材料制作程序复杂、造价昂贵、效果不确切及治疗周期长等缺点。
本发明的优选实施方案及其有益效果，将结合具体实施方式进一步详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例一
本发明提供一种镁预处理脱细胞组织工程骨支架，包括载体以及负载于所述载体上的成骨促进剂。优选地，载体采用大鼠股骨，具有成本低、易于置入操作的优点。以下仅以大鼠股骨为例进行说明。可以理解，载体并不局限于大鼠股骨，也可采用兔、犬、猪等的异种骨。成骨促进剂主要由镁离子、以及镁离子与镁棒植入共同刺激后生成的生长因子等蛋白成分及BMSCs形成。
本发明有必要提供一种镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法，包括如下步骤：
一、选用适龄SD大鼠，采用逆行髓内钉植入法，通过股骨髁间，将镁棒植入股骨髓腔内(镁棒长度约2.5cm)，2周后处死大鼠，取出股骨。根据临床及实验的需要，选择相应直径大小的牙科钻，在股骨干骺端钻取圆柱体形骨组织材料。
二、将镁预刺激后的大鼠股骨脱细胞处理，得到脱细胞骨支架。具体步骤如下：
(1)将取出的骨组织通过磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次10分钟。然后通过纱布包裹后进行五次冻融循环(置入液氮10min，取出后放入37℃恒温水浴锅10min，此为一个循环)。样本取出后，置入加有双抗的PBS溶液中，在4℃环境下振荡漂洗3次，每次2小时。
(2)配置0.1％TritonX-100溶液，加入双抗后将支架浸泡在内，置于4℃环境的摇床上漂洗12小时。
(3)将支架置入加有双抗的PBS溶液中，加入2％十二烷基硫酸钠(SDS)，4℃环境的摇床上振荡24小时。
(4)样本取出后，置入加有双抗的PBS溶液中，在4℃环境下振荡漂洗3次，每次2小时。
(5)1mg/mL的核酸酶溶液中加入双抗，置入孵育3天，常温。
(6)4℃加入双抗的PBS液中震荡漂洗，重复3次，每次2小时。
(7)取出样本，经过冻干后使用环氧乙烷消毒，密封保存。
三、将扩增的小鼠BMSCs接种到脱细胞骨支架。构建小鼠骨缺损模型，将负载BMSCs的脱细胞骨支架植入骨缺损部位，术后2周及4周进行影像学及组织学分析。
实施例二
本发明提供一种镁预处理脱细胞组织工程骨支架，包括载体以及负载于所述载体上的成骨促进剂。优选地，载体采用大鼠股骨，具有成本低、易于置入操作的优点。以下仅以大鼠股骨为例进行说明。可以理解，载体并不局限于大鼠股骨，也可采用兔、犬、猪等的异种骨。成骨促进剂主要由镁离子、以及镁离子与镁棒植入共同刺激后生成的生长因子等蛋白成分及BMSCs形成。
本发明有必要提供一种镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法，包括如下步骤：
一、选用适龄SD大鼠，采用逆行髓内钉植入法，通过股骨髁间，将镁棒植入股骨髓腔内(镁棒长度约2.5cm)，2周后处死大鼠，取出股骨。根据临床及实验的需要，选择相应直径大小的牙科钻，在股骨干骺端钻取圆柱体形骨组织材料。
二、将镁预刺激后的大鼠股骨脱细胞处理，得到脱细胞骨支架。具体步骤如下：
(1)将取出的骨组织通过磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次15分钟。然后通过纱布包裹后进行五次冻融循环(置入液氮12min，取出后放入37℃恒温水浴锅13min，此为一个循环)。样本取出后，置入加有双抗的PBS溶液中，在4℃环境下振荡漂洗3次，每次2.5小时。
(2)配置0.2％TritonX-100溶液，加入双抗后将支架浸泡在内，置于4℃环境的摇床上漂洗18小时。
(3)将支架置入加有双抗的PBS溶液中，加入2％十二烷基硫酸钠(SDS)，4℃环境的摇床上振荡24小时。
(4)样本取出后，置入加有双抗的PBS溶液中，在4℃环境下振荡漂洗3次，每次2.5小时。
(5)1mg/mL的核酸酶溶液中加入双抗，置入孵育4天，常温。
(6)4℃加入双抗的PBS液中震荡漂洗，重复3次，每次2.5小时。
(7)取出样本，经过冻干后使用环氧乙烷消毒，密封保存。
三、将扩增的小鼠BMSCs接种到脱细胞骨支架。构建小鼠骨缺损模型，将负载BMSCs的脱细胞骨支架植入骨缺损部位，术后2周及4周进行影像学及组织学分析。
实施例三
本发明提供一种镁预处理脱细胞组织工程骨支架，包括载体以及负载于所述载体上的成骨促进剂。优选地，载体采用大鼠股骨，具有成本低、易于置入操作的优点。以下仅以大鼠股骨为例进行说明。可以理解，载体并不局限于大鼠股骨，也可采用兔、犬、猪等的异种骨。成骨促进剂主要由镁离子、以及镁离子与镁棒植入共同刺激后生成的生长因子等蛋白成分及BMSCs形成。
本发明有必要提供一种镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法，包括如下步骤：
一、选用适龄SD大鼠，采用逆行髓内钉植入法，通过股骨髁间，将镁棒植入股骨髓腔内(镁棒长度约2.5cm)，2周后处死大鼠，取出股骨。根据临床及实验的需要，选择相应直径大小的牙科钻，在股骨干骺端钻取圆柱体形骨组织材料。
二、将镁预刺激后的大鼠股骨脱细胞处理，得到脱细胞骨支架。具体步骤如下：
(1)将取出的骨组织通过磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每次20分钟。然后通过纱布包裹后进行五次冻融循环(置入液氮15min，取出后放入37℃恒温水浴锅15min，此为一个循环)。样本取出后，置入加有双抗的PBS溶液中，在4℃环境下振荡漂洗3次，每次3小时。
(2)配置0.3％TritonX-100溶液，加入双抗后将支架浸泡在内，置于4℃环境的摇床上漂洗24小时。
(3)将支架置入加有双抗的PBS溶液中，加入2％十二烷基硫酸钠(SDS)，4℃环境的摇床上振荡24小时。
(4)样本取出后，置入加有双抗的PBS溶液中，在4℃环境下振荡漂洗3次，每次3小时。
(5)1mg/mL的核酸酶溶液中加入双抗，置入孵育4天，常温。
(6)4℃加入双抗的PBS液中震荡漂洗，重复3次，每次3小时。
(7)取出样本，经过冻干后使用环氧乙烷消毒，密封保存。
三、将扩增的小鼠BMSCs接种到脱细胞骨支架。构建小鼠骨缺损模型，将负载BMSCs的脱细胞骨支架植入骨缺损部位，术后2周及4周进行影像学及组织学分析。
通过以上三个实施例的实验结果可以得出，本发明技术方案具有如下有益效果：
将镁棒植入实验动物体内后，以实验动物为生物反应器，通过镁棒释放的镁离子，刺激实验动物股骨内的BMSCs分泌CGRP、骨膜蛋白、生长因子、胶原蛋白-I等，能够增强股骨内的BMSCs的增殖、黏附、成骨分化等能力。
通过脱细胞技术处理后，消除了该支架的免疫原性，同时其能保留了天然复杂的结构和精细的微体系结构，以及在脱细胞后，生长因子和各种ECM成分，如纤维连接蛋白、硫酸肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和透明质酸仍保留有部分活性，能够在消除材料免疫原性的同时保留其促进成骨分化的功能。
镁离子预刺激的脱细胞骨支架能增强BMSCs的黏附、成骨等生物学行为。BMSCs负载的镁预刺激脱细胞骨支架可促进骨缺损的修复及缩短治疗时间，能够解决自体骨移植中出现的供区血肿、伤口裂开、供骨区疼痛、皮神经损伤、切口感染，同种异体骨移植中免疫反应、感染、骨愈合延迟、骨吸收等，以及现有骨组织工程支架材料制作程序复杂、造价昂贵、效果不确切及治疗周期长等缺点。
以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
一、采用逆行髓内钉植入法，通过股骨髁间，将镁棒植入股骨髓腔内，2周后处死大鼠，取出股骨，在股骨干骺端钻取圆柱体形骨组织材料；
二、将镁预刺激后的大鼠股骨脱细胞处理，得到脱细胞骨支架；
三、将扩增的BMSCs接种到脱细胞骨支架。
2.根据权利要求1所述的镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，步骤二包括如下步骤：
S1：将取出的骨组织通过磷酸盐缓冲液冲洗，然后通过纱布包裹后进行多次冻融循环，样本取出后，置入加有双抗的磷酸盐缓冲液中，在4℃环境下振荡漂洗；
S2：配置0.1-0.3％TritonX-100溶液，加入双抗后将支架浸泡在内，置于4℃环境的摇床上漂洗；
S3：将支架置入加有双抗的磷酸盐缓冲液中，加入2％十二烷基硫酸钠，4℃环境的摇床上振荡；
S4：样本取出后，置入加有双抗的磷酸盐缓冲液中，在4℃环境下振荡漂洗；
S5：1mg/mL的核酸酶溶液中加入双抗，置入孵育3-4天，常温；
S6：4℃加入双抗的磷酸盐缓冲液中震荡漂洗。
3.根据权利要求2所述的镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，步骤S6后还包括步骤S7：取出样本，经过冻干后使用环氧乙烷消毒，密封保存。
4.根据权利要求2所述的镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，所述冻融循环为置入液氮10-15min，取出后放入37-40℃恒温水浴锅10-15min。
5.根据权利要求2所述的镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，步骤S2中，置于4℃环境的摇床上漂洗12-24小时。
6.根据权利要求2所述的镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，步骤S3中，4℃环境的摇床上振荡24小时。
7.根据权利要求2所述的镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，步骤S4中，在4℃环境下振荡漂洗3次，每次2-3小时。
8.根据权利要求2所述的镁预处理脱细胞组织工程骨支架的制备方法，其特征在于，步骤S6中，震荡漂洗3次，每次2-3小时。
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