KR20100028594A - 천연의 성장인자가 보존되는 골 기질의 탈광물화 공정 - Google Patents

천연의 성장인자가 보존되는 골 기질의 탈광물화 공정 Download PDF

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낸시 제인 쉘비
스티븐 엠. 스코트
벤자민 피. 루치싱어
그레고리 에이. 주다
켈리 알. 커커
지저스 헤르난데즈
대럴 엘. 홀머스
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박테린 인터내셔날, 인크.
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Abstract

탈광물화 골 기질은 골체의 탈광물화를 위해 골체를 산을 포함하는 제1 공정 용액에 두는 방법에 의해 제조된다. 특정 시간 간격으로 제1 용액으로부터 주기적으로 제거하여 압축 시험과 같은 골체의 기계적 성질에 관한 하나 이상의 시험을 수행한다. 시험에서 원하는 결과가 얻어질 때, 골체를 제1 공정 용액보다 덜 산성인 제2 공정 용액에 노출시켜 탈광물화 공정의 가혹한 산성 조건에 골체가 노출되는 것을 최소한으로 한다.
탈광물화 골 기질, 압축 시험, 3-D 매트릭스, IGF-1, BMP.

Description

천연의 성장인자가 보존되는 골 기질의 탈광물화 공정 {PROCESS FOR DEMINERALIZATION OF BONE MATRIX WITH PRESERVATION OF NATURAL GROWTH FACTORS}
본 발명은 탈광물화 골 기질의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 독특한 취급 특성을 제공하면서 기질 내 존재하는 원래의/내인성 성장인자가 보존되는 것에 초점을 맞춘 탈광물화 골 기질의 제조방법에 관한 것이다. 탈광물화 골 기질은 골 및 연골의 치료와 골 및 연골의 성장 및 재생을 촉진하는 데 사용될 수 있다.
대략 백만건의 골 이식 시술이 전세계적으로 매년 실시되고 있다. 이들 시술중 약 500,000건은 미국에서 실시되고 있으며, 미국내 골 이식 시술 중 대략 250,000건은 척추를 수반한다. 이들 골 이식 및 골 치환 제품은 예를 들어, 퍼티(putty), "혈장" 보조물 및 다른 동종이식 골 물질을 포함하는 골 치환물, 골 다얼(bone dowel), 탈광물화 골 기질 제품을 들 수 있다.
무릎관절의 연골손상은 또한 미국내 백만명의 사람들이 겪는 일반적인 정형외과적 질병이다. 손상된 관절의 연골은 그 자체로 정상적으로 재생되지 않는다. 현재의 연골 손상에 대한 치료는 환자가 증상을 완화하기 위해 관절경 수술을 시행할 필요가 있다. 연골이 치료될 수 없어서, 제거되어야 하는 경우, 환자는 골관절 염으로 진전될 가능성이 있으며 몇몇 경우에 무릎 인공 관절 수술을 포함하는 추가의 수술을 필요로 할지도 모른다.
골절, 골손실, 감염, 종양 또는 다른 병인 질환 후 골의 치료를 촉진시키기 위해 골 물질을 사용하는 것이 당업자에게 잘 공지되어 있다. 전형적으로, 골 이식은 골 치료를 촉진시키기 위해 세 가지 양식 중 하나를 사용한다. 첫째, 자가 골 이식편이 사용될 수 있다. 자가 골 이식편은 수용자로부터 유래되고 자주 장골(iliac bone)로부터 얻어진다. 둘째, 통상 동일 종족 내의, 별개의 도너로부터 유래된 이식편을 지칭하는 골 동종이식편이 사용될 수 있다. 마지막으로, 자연적으로 유래되거나(예들 들어, 골 파편, 과립화된 골 파우더 등), 또는 다른 방법으로 담체를 포함하거나 포함하지 않는, 동종유래의 골 파편, 과립 또는 골 파우더로 제조된 일반적으로 결손 필러(defect filler)의 퍼티 및 겔 타입의 형태의 합성 또는 반합성 제품의 골 이식 치환물이 사용될 수 있다.
때때로 자가이식(즉, 환자 자신의 골)으로 지칭되는 자가 골 이식편이 결손을 치료하기 위해 필요되는 골을 공급하기 위해 채집될 수 있다. 당업자에게는 인식되는 것으로서, 골 결손 치료에서 자가 골을 사용하는 많은 이점이 있다. 예를 들어, 자가 골은 전형적으로 점탄성이고, 골전도성이고 골유도성이며 골형성성(즉, 기질 내에 골의 생성을 촉진하는 세포를 포함함)이다. 또한, 자가 골 이식편은 조직적합성이나 감염질병의 문제점을 회피한다. 그러나 자가 골은 공급이 제한되어 있으며, 일반적으로 채집 시 환자는 고통을 느끼고, 채집 위치의 발병율이 현저하게 높을 수 있다(즉, 환자는 추가의 외과수술이 필요하거나, 수술로 인한 합병증, 혈액 손실이 유발되거나, 환자에게 불편함을 추가로 유발시킬 수 있으며, 궁극적으로 환자의 회복시간이 길어지게 할 수 있다).
동종이식 골 이식편은 자가 골 이식편에 비해 보다 대량으로 입수가능한 점에서 장점을 가진다. 그러나, 동종이식 골 이식은 조직적합성 문제(예를 들어, 수용자의 면역계에 의한 거부반응), 감염성 작용제가 잠재적으로 존재할 수 있음에 관련된 단점을 보일 수 있고, 열악한 연성 또는 기계적 특성(예를 들어, 탄성, 압축성, 탄력성 등)을 가진 골을 또한 포함할 수 있다. 현재 입수가능한 당업자에 의해 개발된 골 이식 치환물은 통상 동종이식 골 이식편에 관해 상기에 개관된 것과 같은 많은 동일한 단점을 가진다. 골 동종이식편 또는 합성 이식 치환물 제품은 골 결손 사이의 죽은 공간에 삽입되도록 의도된, 퍼티 및 겔타입 필러로서 일반적으로 제조된다(즉, 결손 또는 빈 공간 필러). 전통적으로, 골 이식 치환물은 담체 조성물을 포함하거나 포함하지 않는 동종의 골 파편, 과립, 또는 골 파우더 또는 합성 재료로 제조될 수 있다. 또한, 소의 골로 제조된 사용가능한 이종유래의 골 이식편 제품도 몇몇 존재하고, 본 발명은 소의 재료 등의 출발재료의 다른 공급원을 사용하는데 적합화될 수 있다. 단점은 이종이식 골에 대한 잠재적인 면역반응, 프리온 등 감염성 작용제를 포함하여 동종이식에서 제시된 바와 유사하다.
현재 입수가능한 자가이식편, 동종이식편, 및 이전 기술의 골 치환 제품의 또 다른 현저한 단점은 이들이 일반적으로 골 치료로 수술에 사용하는 동안, 부하되는 힘에 견디거나 형태나 구조적인 완결성을 유지할 수 없다는 점이다. 현재까지, 어떠한 고체의, 미리 형태가 잡힌, 유연성 있는 탄성 제품(골 유래이거나 합 성)도 부하력을 견디고, 변형된 후 그의 형태나 구조적 완결성을 회복할 수 있는 제품으로서 수술용 용도로 입수가능하지 않다. 이들 특성은 골 결손의 없는 정상적인 골 조건에 매우 닮은 골 치료를 수행하는 데 필수적이다.
또한, 골 이식 물질 및 골 이식 치환물은, 이들의 수술중 배치를 방해하고 비교적 침습적인 수술적 시술을 필요로 하거나 골성장을 적합하지 않게 촉진하는, 구조적, 기계적 및 생물학적 특성(예를 들어, 압축성의 부족, 탄성의 부족 등)을 가지는 것이 공지되어 있다.
세라믹 및 동종이식 골물질을 포함하는 몇몇 골 동종이식 물질 또는 합성 복합체는 소정의 자가이식 특성을 따르도록 시도되었다. 예를 들어, 인산삼칼슘 화합물 등의 이전기술의 세라믹 골 이식편 치환물은 골전도 활성을 가지나(즉, 혈관형성을 촉진함으로써 골의 격자구조 생성을 촉진함), 골유도 활성(즉, 주위 조직으로부터 줄기세포를 적극적으로 유입하여 골형성을 촉진시키는 골형성 단백질을 가짐)은 가지지 않는다. 더욱이, 이전 기술의 세라믹 골 이식 치환물은 압축, 비틀림, 굽힘 및/또는 장력의 힘하에서 깨어지기 쉽거나 못쓰게 될 수 있다.
탈광물화된 피질성 골 파우더 및 재조합 사람 골형성 단백질(rhBMP)를 포함하는 이전 기술의 골 이식 치환물은 전형적으로 골유도성이다. 그러나, 이들 골 이식 치환물은 골전도성이 부족하고, 일반적으로 세포의 성장을 촉진하고 압축, 비틀림, 굽힘 및/또는 장력의 힘에 충분히 저항할 만한 어떠한 거시조직을 가지지 않는다. 보다 크기가 큰 전통적인 동종이식 골 제품이 골전도성이고 골의 기계적 강성의 일부를 가지지만, 이들은 이들의 광물 함량, 피질 구조 및 전체적인 밀도로 인하여 덜 골유도성이다. 현재까지, 예를 들어, 압축되거나, 비틀려지고/지거나 구부러지는 등 변형되고 원래의 형태, 구조, 및 크기로 회복될 수 있는 기계적 성질을 가진 이식편 물질은 존재하지 않는다.
당업자에 의해 개발된 탈광물화 피질성 골 기질(DBM) 퍼티는 다양한 점성으로 활용가능한 퍼티 또는 겔을 생성하기 위해, 담체와 혼합된 피질성 동종이식 골(예를 들어, 탈광물질화, 비탈광물질화, 또는 둘 다)의 매우 작은(예를 들어, 마이크로미터 크기) 입자를 포함한다. 이전 기술의 골 치환 화합물(예를 들어, 퍼티, 겔, 용액 등)은 스파툴라, 시린지 또는 손으로 골 결손 부위로 도입될 수 있다. 이들 이전 기술의 골 치환 화합물은 연성이기 때문에, 이들은 일반적으로 불규칙한 공간에 맞도록 변형된다. 그러나, 활성 입자는 전형적으로 마이크로미터 크기이기 때문에, 골 치환 퍼티, 겔, 용액 등은 정상적인 골과는 거시적으로 닮지 않을 수 있고, 또한 정상적인 공극, 표면, 공간 및 골 골격을 포함하지 않을 수 있다. 또한, 이전 기술의 골 치환 화합물에서 사용되는 담체는 일반적으로 현탁액에서 또는 콜로이드에서 마이크로미터 크기의 입자를 가져서 시간이 지남에 따라 분해되어 정상적인 골의 거시구조를 가지지 않는 구조체를 남긴다. 예를 들어, 체내조건하, 생리식염수, 피 및/또는 혈청의 존재하 및 관주(irrigation) 도중, 이들 골 치환 화합물(예를 들어, 퍼티, 겔, 용액 등)의 다수가 수술시 또는 골 결손 부위로 도입된 후 몇분내 또는 몇시간내에 파괴되거나, 용해되거나 골의 빈 공간으로부터 새어나온다. 체내에서 용해되지 않는 이전 기술의 골 치환 화합물이더라도 거시구조에서는 정상적인 골을 닮지 않는다.
또한, 이전 기술의 골 치환 화합물은 정상적으로 골에 부여되어 있는 일반적인 기계적 성질(예를 들어, 탄성, 유연성, 압축, 장력, 비틀림, 굽힘 등에 대한 내성)을 유지하지 않을 수 있다. 끝으로, 입수가능한 어떠한 골 치환 화합물도 골의 빈 공간으로 또는 금속, 플라스틱 또는 복합체가 이식된 기질내로 압축되어가 그 공간에 맞게 늘여질 수 있고, 팽창 과정중 그 물리적 성질 또는 기억을 유지하여서 그 각각의 미시적 및 거시적 형태 및 크기로 회복할 수 있는 능력을 가진 것은 없다.
탈광물화 골 제품의 연구는 다양한 생분석, 예를 들어, ALP 분석, 추출 및 ELISA 분석에 의해 평가되는 천연의/내인성 BMP 레벨, 및 골 융합의 생체내 측정 등에 의해 측정된 골유도성 잠재성에서 큰 다양성을 보여주었다. 이러한 다양성에 공헌하는 요인들은 가공기술에서의 차이점을 포함할 수 있다. 골의 탈지질화, 탈광물화, 및 최종 멸균의 다양한 현재의 관행은 골 기질 내에 함유된 천연의 성장인자에 현저하게 나쁘게 영향을 미칠 가능성을 가진다. 높은 농도의 산이나 높은 수준의 감마선 조사에 장시간 노출되는 골 기질의 화학적 가공은 모두 처치된 골의 골유도성 활성을 감소시킨다. 현재의 관행은 산에 대한 노출 동안 용액의 pH 변화를 모니터하여 산에 대한 고정 농도 및 노출 시간을 사용하는 탈광물화 공정을 포함한다. 현재의 관행의 어느 것도 산에 대한 노출을 감소시킴으로써 골 기질과 관련된 천연의 성장인자를 보존하는 데 최적화되어 있지 않다. 또한, 체내에서 상이한 부위 및 도너 사이에서 발견되는 해면성 골 내에 구조적 다양성이 있다(즉, 다공성 및 밀도에서의 다양성). 이러한 다양성은 동일한 크기의 해면성 골 블록간에 도 탈지질화 및 탈광물화 공정의 결과에 현저한 영향을 끼친다. 현재, 대부분의 당업자는 해면성 골이 단지 골전도성이고 골유도성이 아니라고 믿고 있다[문헌(Schwarz 1991, Arch Orthop Trauma Surg .)(Finkemeier 2002, J. Bone Joint Surg .]. 이러한 인식은 골유도성 성장인자를 제거하거나 불활성화시키는 가공방법에 의해 유지된다. 본 발명은 현재의 기술적 가공보다 활성 성장인자를 높은 양으로 가지는 해면성 골 기질을 제조한다. 당업자는 천연의 성장인자 수준을 유지하도록 최적화된, 가공중 잠재적인 손상 원인제에 골 기질을 노출시키는 것을 최소한으로 하는 공정이 이 기술분야에서 상당한 진보일 것으로 인식할 것이다.
오존은 미생물에 대해 공지된 치사효과를 가진 가스로서, 그 결과의 멸균성이 물이나 식품산업에서 광범위하게 사용된다. 오존은 박테로이즈(Bacteroides), 캄필로박터(Campylobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리아(Corynebacteria), 에스케리치아(Escherichia), 크렙시엘라(Klebsiella), 리지오넬라(Legionella), 마이코박테리아(Mycobacteria), 프로프리오박테리아(Propriobacteria), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 스태필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 예시니아(Yersinia), 및 마이코박테리아(Mycobacteria) 등의 호기성 및 혐기성 박테리아를 포함하는 미생물을 죽이기에 단지 밀리리터 당 몇 마이크로그램을 요구되는 강한 살균제이다. 또한, 플라비비리대(Flaviviridae), 필로비리대(Filoviridae), 헤프나비리대(Hepnaviridae), 헤르페스비리대(Herpesviridae), 오르소믹소비리대(Orthomyxoviridae), 레트로비리대(Retroviridae). 코로나비리 대(Coronaviridae), 토가비리대(Togaviridae), 라브도비리대(Rhabdoviridae), 분야비리대(Bunyaviridae), 프라믹소비리대(Pramyxoviridae), 및 폭스비리대(Poxviridae) 등의 바이러스에도 효과적이다. 비-외막(envelop)의 감수성인 바이러스 패밀리는 이하를 포함한다: 아데노비리대(Adenoviridae), 피코르나비리대(Picornaviridae), 파필로마비리대(Papillomaviridae), 칼리시비리대(Caliciviridae), 아스트로비리대(Astroviridae), 및 레오비리대(Reoviridae). 오존은 한 스펙트럼의 기전을 통해 미생물을 중화시킨다. 가장 많이 연구된 것은 박테리아 세포막, 바이러스 외막 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 당단백질에서 발견되는 박테리아 지질 및 단백질의 오존 산화이다. 또한 오존은 완벽히 이해되지 않은 기전을 통하여 포유동물의 세포에도 독성이다. 오존을 탈광물화 골 기질의 제조방법에 응용하는 것은 생물학적으로 적은 부담, 멸균, 골의 백화, 탈지질화 및 기질내 성장인자를 보다 이용가능하게 만드는 점 등 현재 입수가능한 골 제품에 비해 몇가지 향상점을 가질 수 있다.
현재까지, 공지된 입수가능한 이전 기술의 골 치환 화합물과 관련된 상기한 단점을 극복하려는 당업자의 시도가 성공적이지 못했다. 특히, 당업자는 향상된 연성 또는 기계적 성질을 가짐으로써 소정의 정상 골 특성을 닮으려는 골 이식 재료를 찾아내고 제조하는 데 성공적이지 못했다. 이 점에서, (1) 혈관 및 세포의 이동을 위한 통로로서 기능하도록 정상 골 구조를 정확하게 닮는; (2) 연성이고 탄성인; 및 (3) 골절없이 압축, 신장, 튀틀림, 굽힘의 힘에 저항성이고, 변형되었을 때 원래의 형태, 구조 및 크기로 회복할 수 있는 능력을 가진, 골 대체물 및/또는 성장 증진 제품의 필요성이 당기술분야에 존재한다. 그러므로, 당업자에게 쉽게 인식될 수 있는 바와 같이, 공지 기술의 단점을 지적하는, 신규한 탈광물화 골 기질, 조성물 및 골 결손의 치료를 촉진하는 방법이 당기술분야에 현저한 진보일 것이다. 이들 기질은 골의 빈 공간의 치료 및 골 재생 뿐만 아니라, 연골 결손에 새로운 조직의 성장을 촉진하는 뼈대 및 성장인자를 제공함으로써 연골 재생에서도 임상적 응용을 가진다.
생리식염수나 체액의 존재하에서, 용해되거나 분해되지 않고, 몇일이나 몇주동안 거대-구조를 유지하는, 압축되어 빈 공간(골이나 연골에서)을 채울 수 있는 골 이식 화합물이 당기술에 현저한 진보일 수 있다. 더욱이, 골유도성, 골전도성, 생재흡수가능(bioresorbable), 생적합성이고, 골이나 연골의 구조에 실질적으로 유사하고, 사용하기 용이하여, 환자의 병적상태를 감소시키고 제조에 비용상 효율적인 탈광물화 해면성 골 기질이 당기술분야에 또한 현저한 진보일 수 있다.
또한, 부착, 분화, 증식되도록 하고 궁극적으로 이식되었을 때 새로운 조직을 재생할 수 있도록 하거나 연구 및 약물 스크리닝을 위한 3-D 세포배양 환경을 제공하는 기능을 할 수 있는, 다공성 구조로 주입하거나 침투가능한 전구세포와 관련하여 사용될 수 있는 탈광물화 골 기질의 필요성이 당기술분야에 존재한다.
마지막으로, 탈광물화 골 기질은 또한 즉시 또는 시간이 지남에 따라 활성 생물학적 성장인자 또는 약물학적 작용제를 유리하도록 의도되어, 코팅, 주입 또는 함침의 방법으로 기질 표면에 부착된 생활성 작용제의 담체로서 사용할 수 있다.
요약
본 발명은 골유도성 및 골전도성 탈광물화 골 기질의 제조방법이다. 체내의 상이한 부위 및 개체 사이에서 발견되는 해면성 골의 구조적 다양성(즉, 다공성 및 밀도의 다양성)으로 인하여, 어떠한 이전에 기재된 공정도, 산 노출의 양을 제한함으로써 탈광물화 동안 성장인자의 손상을 최소한으로 하면서 원하는 물리적 성질을 일관되게 제조할 수 없었다. 본 발명은 골체(bone body)가 골체를 탈광물화하기 위하여 산을 포함하는 제1의 공정 용액에 두는 공정을 기재한다. 골체는 특정 시간 간격으로 제1의 용액으로부터 주기적으로 제거되어 압축시험 등의, 골체에 대한 기계적 성질에 관한 적어도 하나의 시험이 수행된다. 시험에서 원하는 결과가 얻어질 때, 골체는 제1의 것보다 덜 산성인 제2의 공정 용액에 노출되어 탈광물화 공정중 가혹한 산성 조건에 골 블록이 노출되는 것을 최소화한다.
도 1a 및 1b는 본 발명에 의해 제조된 탈광물화 해면성 골 기질의 예시적인 실시양태를 보여주는 사진이다. 도 1a는 압축상태의 탈광물화 골 기질을 나타내고, 도 1b는 압축되지 않은 상태의 탈광물화 골 기질을 나타낸다. 그 결과의 이식편의 압축성은 탈광물화 골 기질이 압축된 상태로 골의 결손 빈 공간으로 삽입되어 압축력이 제거되면 골의 결손 빈 공간의 윤곽을 최적으로 채우도록 팽창되도록 하는 것을 알 수 있다.
도 2는 동일한 도너로부터 해면성 골 기질의 세 개의 샘플을 상이한 탈광물화 프로토콜에 적용시킨 후 탈광물화 해면성 골 기질의 세 샘플에서 인슐린양 성장인자-1(IGF-1)의 수준을 나타내는 차트이다. 샘플 A 및 B는 본 발명의 공정, 방법 론 및 기술에 따라 제조된 탈광물화 해면성 골 기질을 나타낸다. 샘플 C는 문헌에서 발견되는 이전 기술에 따라 제조된 탈광물화 해면성 골 기질을 나타내는 데, IGF-1의 손상 또는 제거가 보여진다.
도 3a 내지 3c는 탈광물화 해면성 골의 천연의 성장인자의 수준에 있어서 산 노출에 의한 영향을 나타낸다. 도 3a는 BMP-2에 대한 산 노출의 효과를 나타낸다. 도 3b는 BMP-4에 대한 산 노출의 효과를 나타낸다. 도 3c는 BMP-7에 대한 산 노출의 효과를 나타낸다. 샘플 A는 본 발명의 바람직한 실시양태에 따라서 제조된 탈광물화 해면성 골 기질의 성장인자 함량을 나타내는데, 샘플 B 및 C에 비해 BMP가 높은 수준을 보인다. 샘플 B는 산업분야에서 현재 실시되고 있는 방법에 따라 제조된 탈광물화 해면성 골 기질의 성장인자 함량을 나타내는 데, 본 발명을 나타내는 샘플 A와 비교하여, BMP의 수준에서 감소하였음을 보여준다. 샘플 C는 24 시간 동안 산에 노출되어 공정된 탈광물화 해면성 골 기질에서의 성장인자 함량을 나타내는 데, BMP의 손상 또는 제거를 보여준다.
도 4a 내지 4b는 오존화되지 않은 것(대조군)과 비교하여 20분 또는 3시간 동안 오존화 용액에 탈광물화 해면성 골 기질을 노출시킨 후 탈광물화 해면성 골 기질에서 검출가능한 성장인자의 증가를 나타낸다. 도 4a는 BMP-2의 증가를 나타낸다. 도 4b는 BMP-4의 증가를 나타낸다. 도 4c는 BMP-7의 증가를 나타낸다. 이 결과는 ELISA에 의해 측정되는 것으로 기질로부터 얻어지는 추출된 BMP의 수준이 오존 노출에 의해 더 높은 것을 보여준다.
도 5a 내지 5c는 대조군과 비교하여, 15분 또는 1시간 동안 과산화수소수의 용액에 탈광물화 해면성 골 기질을 노출시킨 후 탈광물화 해면성 골 기질에서 검출가능한 성장인자의 감소를 나타낸다. 도 5a는 BMP-2의 감소를 나타낸다. 도 5b는 BMP-4의 감소를 나타낸다. 도 5c는 BMP-7의 감소를 나타낸다. 이 결과는 ELISA에 의해 측정되는 것으로서 기질에서 얻어지는 추출된 BMP의 수준이 과산화수소 노출에 의해 감소하였음을 나타낸다.
다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술적, 과학적, 의학적 용어는 당업자에 의해 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 그러나, 본 응용에 사용되는 다양한 용어를 위한 지지를 확립하는 목적으로, 이하의 기술적 코멘트, 정의, 및 리뷰가 참고로 제공된다.
본 발명에 사용되는 용어 "골전도성"은 놓여진 위치에서, 혈관, 혈관주위 조직 및 골전구 세포의 성장을 지지하는 미소환경을 제공함으로써 골의 자발적인 형성을 촉진하는 물질을 가리킨다.
용어 "골유도성"은 골의 형성을 적극적으로 추진하는 골 기질 내의 물질을 가리킨다. 골유도성 물질은 정규장소 이외의 또는 정규장소로부터 골전구세포의 유입을 촉진하고 이들의 성장 및 골 형성 세포, 즉, 조골세포로의 분화를 자극한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "골형성성"은 새로운 골의 형성을 적극적으로 촉진하는 기질내 살아있는 골전구세포를 포함하는 물질을 가리킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "기질"은 탈광물화 후 남아있는 해면성 골의 세포외기질을 가리킨다. 매우 다공성인 해면성 골 기질은 세포의 부착 및 조직 재생을 유도하는 뼈대를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "BMP"는 골형성성 세포에 분화, 증식 및 새로운 조직으로의 재생에 관한 시그날을 제공하는 기전을 통하여 골 및 연골의 성장과 연관된 골형성 단백질을 가리킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "성장인자"는 신생혈관형성과 새로운 조직의 성장을 촉진하는 공지된 단백질 및 호르몬을 가리킨다.
예시적인 실시양태에서, 탈광물화 해면성 골 기질은 골 치료, 관절고정, 새로운 골형성, 병인적 불융합(non-union)의 치료를 촉진한다. 바람직하게는, 탈광물화 해면성 골 기질은 2% 미만(<2%)의 잔여 광물 함량을 가지는 완전한 탈광물화 해면성 골의 하나 이상의 대형 구조물(예를 들어, 2 mm 내지 수 센티미터)로 이루어진다.
본 발명의 신규한 탈광물화 해면성 골 기질은 탈광물화 도중 원래의 성장인자에 대한 손상 (또는 성장인자의 제거)를 최소화하면서 독특하고 유용한 기계적 성질을 제공한다. 예시적인 실시양태에서, 특정 시간 간격으로 탈광물화 산 용액으로부터 각각의 해면성 골 조각을 제거하여 압축성을 측정함으로써, 골 조각이 이들의 원래 형태의 5 내지 60%로 압축될 수 있을 때까지 산 용액에서 가공되도록 하여 해면성 골에 내인적으로 존재하는 성장인자의 악화, 불활성화 또는 제거를 최소한으로 한다. 각 조각이 상기 퍼센트의 범위로 압축가능할 때, pH 4를 초과하는 용액에 둠으로써(또는 용액으로 세정함) 산 용액에 대한 추가의 노출을 방지한다.
또 하나의 예시적인 실시양태에서, 해면성 골내에 내인적으로 존재하는 성장인자의 악화, 불활성화 또는 제거를 최소한으로 하면서 해면성 골 조각은 2중량% 미만의 잔여 칼슘을 가지고 이들의 원래 형태의 5 내지 60%로 압축될 수 있을 때까지 산 용액에서 가공된다.
또 하나의 예시적인 실시양태에서, 해면성 골내에 내인적으로 존재하는 성장인자의 악화, 불활성화 또는 제거를 최소한으로 하면서, 해면성 골 조각은 10 내지 1000 grams-force/cm2를 사용하여 이들의 원래 형태의 60% 미만으로 압축될 수 있을 때까지 산 용액에서 가공된다. 각 해면성 골 조각은 압축성을 측정하기 위해 특정 시간 간격으로 탈광물화 산 용액으로부터 제거되어 각 조각이 상기 퍼센트 범위내로 압축가능할 때, pH 4를 초과하는 용액에 둠(또는 용액으로 세정)으로써 산 용액에 대한 추가의 노출을 방지한다.
또 다른 실시양태에서, 해면성 골 조각은 골체의 탈광물화를 위해 산 용액에서 가공된다. 주기적으로 골체는 압축력하에서 압축력 대 크기 감소 퍼센트를 측정하기 위해서 제거된다. 압축력 대 압축된 크기의 결과는 골 가공에서 그 다음 단계를 결정한다. 시험의 결과는 압축력과 압축크기가 다시 측정되기 전에 골체가 다음에 입수하게 될 산의 농도와 입수하게 될 시간 둘 다를 결정한다. 이 단계는 골체가 10 내지 1000 grams-force/cm2를 사용하여 그의 원래의 형태의 5 내지 60%로 압축될 수 있을 때까지 반복된다. 이 공정은 압축성을 측정하기 위해 특정 시간 간격으로 탈광물화 산 용액으로부터 각각의 해면성 골 조각을 제거함으로써, 해면성 골에 내인적으로 존재하는 성장인자의 악화, 불활성화 또는 제거를 최소화한다. 각 조각이 상기 퍼센트 범위내로 압축가능할 때, pH 4를 초과하는 용액에 둠(또는 용액으로 세정/분사/담금/입수)으로써 산 용액에 대한 추가의 노출을 방지한다.
더욱이, 본 발명의 탈광물화 골 기질의 물리적 및 화학적 특성 및 구조는 주위의 조직으로 유출되도록 의도된, 성장인자를 포함하는 생활성 작용제의 코팅 또는 함침을 허용한다. 예시적인 실시양태에서, 탈광물화 골 기질의 표면은 주위의 호스트 조직이나 유액과 직접 접촉할 수 있다. 탈광물화 골 기질은 정상적인 골 형태 및 구조를 유지하기 때문에, 골 결손, 빈 공간, 또는 상기 골 결손 또는 빈 공간으로 삽입될 수 있는 기계적 장치로부터 용해하거나 스며나오지 않을 것이다. 탈광물화 골 기질은 열린 다공성 구조를 가지기 때문에, 기질의 표면에 존재하는 활성 단백질이 퍼티 및 겔에 전형적으로 존재하는 담체에 의해 호스트 환경으로부터 숨겨지지 않는다. 담체에 의한 골의 희석이 없어서, 탈광물화 골 기질 이식편은 자주 총 골 함량이 30% 미만인 현재 입수가능한 퍼티 및 겔과 비교하여 골함량이 높을 것이다.
본 발명의 예시적인 실시양태는 척추의 케이지, 비구성 컵(acetabular cup), 튜브 및 실린더와 같은 관련 기계적 장치에 맞추기 위해 요구되는 특정 형태 및 윤곽에 맞도록 탈광물화 해면성 골 기질을 자르고, 형태를 만들고, 틀을 만드는 방법에 관할 수 있다. 또한, 본 발명은 압축, 장력, 굽힘, 뒤틀림의 부하 하에서 골절되거나 파괴되지 않고, 골 치료를 촉진하고, 공간을 채우고, 필수적인 구조를 유지하고, 별개의 골 표면을 연결시키는 그 생물학적 및 기계적 특성에 따라서, 뼈대로서 또는 골 빈 공간의 필러로서 단독으로 사용되거나 다른 기계적, 플라스틱 또는 복합체 장치와 함께 사용될 수 있는 탈광물화 해면성 골 기질에 관한 것이다.
상기에서 주목할 것으로서, 본 발명의 탈광물화 해면성 골 기질은 척추의 케이지와 같은 기계적 장치내에 맞도록 구성될 수 있다. 척추의 케이지 드라이 등의 기계적 장치로 채워 도입된다면, 탈광물화 해면성 골 기질은 수화될 때 상기 기계장치의 양쪽에서 호스트 골에 대해 꽉 맞물러 장치를 완전히 채울 수 있도록 장치에서 팽창될 것이다. 따라서, 탈광물화 해면성 골 기질은 낭포 변화(cystic change)로 인한 골 손실, 골의 퇴화, 골다공증, 또는 골과, 비구성 컵, 대퇴스템(femoral stem), 또는 다른 관절성형물 등의 인공 관절 이식편 간의 보정물 교정술로부터 자주 결과될 수 있는 불규칙성으로 맞추어 압축될 수 있다. 압축될 때, 탈광물화 해면성 골 기질은 탄성을 가지면서 주위의 윤곽에 맞추도록 가역적으로 변형될 것이고, 이는 골 결손 또는 빈 공간 밖으로 스며나오는 것 없이 인접한 빈 공간을 채우도록 팽창될 것이다.
탈광물화 골 기질의 특별한 물리적 성질은 예를 들어: (1) 수화로 부피 변화, 압축, 장력, 뒤틀림, 굽힘에 대한 탄성, 및 압축성 등; (2) 탈광물화 골 기질이 수화되었는지 수화되지 않았는지에 따라 상이한 물리적 특성; (3) 피, 골수 흡인물, 혈액 제품 등과 혼합가능함; (4) 수화로 팽창하여 인장성을 잃지 않고 빈 공간을 채움; (5) 퍼티, 장치 및 방법 등 이전의 다른 물질과 같이 관주나 시간이 지남에 따라 용해하지 않음; (6) 체액에 의해 침투될 때 인장성을 잃지 않음; (7) 골절되거나 기본적 생물학적 특성을 잃지 않고 불규칙한 형태로 맞출 수 있음; (8) 피와 체액을 흡수할 수 있고 수화로 팽창됨; 및 (9) 초기 피로 골절없이 장력, 압축, 굽힘 및 뒤틀림의 사이클성 부하를 견딜 수 있음을 포함할 수 있다.
본 발명은 골 재생과 성장을 촉진하는 향상된 생물학적 성질을 보여준다. 탈광물화 골 기질의 최적화된 가공은 천연의 성장인자의 보유를 허용할 것이고, 보다 높은 수준의 성장인자 및 증진된 골유도성을 가지는 기질을 제공할 것이다. 본 발명에 따르는 탈광물화 골 기질은 골유도성, 골전도성, 골형성성, 및 이의 조합일 수 있다. 탈광물화 해면성 골 기질의 매우 다공성인 성질은 조직 재생을 유도하는 세포 부착 및 다른 세포 활동을 위한 천연의 뼈대를 결과한다. 골전구세포를 포함하는 환자로부터의 세포는 탈광물화 해면성 골 기질에 쉽게 부착하고 새로운 조직으로 성장한다. 더욱이, 탈광물화 골 기질은, 예를 드나 이에 한정되지 않는, 정형외과 수술, 신경 수술, 성형 수술, 치과 수술, 피부과 수술 등의 수많은 골 이식편 시술에 널리 응용될 수 있다.
본 발명의 디자인 및 기능에 있어서 추가의 향상은, 탈광물화 후 콜라겐 기질과 관련된 BMP 등의 성장인자의 증진된 이용가능성, 증진된 탈지질화, 가공 도중 기질의 백화 및 기질의 탈오염 및 멸균 등의 몇가지 목적을 위해 가공 프로토콜에서 오존을 사용하는 것이다.
또한, 본 발명의 탈광물화 해면성 골 기질은, 예를 드나 이에 한정되지 않는, 척추 골절, 디스크 퇴화, 골다공성 또는 골 결핍성, 정형외과적 골절 및 관절 퇴화, 연골 치료, 치과 시술 등의 수많은 질병 상태에 응용될 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시양태는 본 발명의 공정, 방법론, 기술에 따라 제조된 탈광물화 해면성 골 기질이 골형성성 전구세포, 전구-조골세포, 골 형성 세포, 연골 형성 세포, 줄기 세포 및 다른 전구 세포 타입을 포함하는 세포의 3-D 배양을 위한 재료로서 사용될 수 있음을 포함한다. 이들 세포는 자가유래, 동종유래, 또는 이종유래일 수 있다. 이 세포는 젤라틴, 피브린, 셀룰로스, 합성 세포외기질, 폴리머 및 다른 생적합성 담체로 제조되는 담체를 통해 기질에 전달될 수 있다. 이 세포는 수화된 기질로 주입된 후 배양 배지에 배치될 수 있다. 이들 세포가 시드(seed)된 구축물은 조직의 재생을 위해 환자에게 이식되거나, 또는 연구 또는 약물 스크리닝의 목적으로 3-D 세포 배양 모델로서 사용될 수 있다.
본 발명의 탈광물화 골 기질은 탈광물화 동안 천연의 성장인자에 대한 손상(또는 성장인자의 제거)을 최소화하면서 스폰지같은 기질과 관련한 향상된 적합성의 방법으로 이전 기술 및 재료에 비해 실질적인 응용가능성 및 사용성을 가진다. 추가의 실시양태는 향상된 골 이식 성공 또는 연골 치료 성공을 위해 독특한 형태 및 크기로 골 또는 연골의 결손 부위로 이식되는 것이다. 추가로, 스폰지같은 탈광물화 골 이식 기질의 향상된 적합성은 골 이식 시술의 다양한 케이지 및 다른 장치로 용이하게 삽입된다.
정형외과 의사의 미국 아카데미(American Academy of Orthopedic Surgeons) 및 조직은행의 미국 연합(American Association of Tissue Banks)는 이상적인 골 이식 치환물(BGS)의 특성의 리스트를 제안하였는데, 이들 그룹은 또한 이상은 아직 달성되지 않았다고 언급하였다. 이들 언급된 성질은, 예를 드나 한정되지 않는: (1) 생적합성; (2) 생재흡수성; (3) 골형성성 (즉, 이식된 이식편이 생존하여 직접 새로운 골을 형성하는 세포 성분의 능력); (4) 골전도성; (5) 골유도성; (6) 골에 구조적으로 유사함; (7) 사용하기 용이함; (8) 연성; 및 (9) 변형성을 포함한다. 본 발명의 탈광물화 해면성 골 기질은 골형성성을 가지지 않는 것을 제외하고 그 자체로 이들 모든 기준을 만족시킨다. 그러나, 탈광물화 해면성 골 기질이 골수 흡입물로 침투되거나, 줄기 세포로 코팅되거나 침투된다면, 탈광물화 해면성 골 기질은 정형외과 의사의 미국 아카데미 및 조직은행의 미국연합에 의한 이상적인 이식편의 열거된 기준 모두를 충족시킬 수 있다.
이하의 실시에는 본 발명의 실시를 보다 상세하게 예시할 것이다. 본 명세서의 실시예에서 일반적으로 기재되고 예시되는 것으로서 본 발명의 이하의 방법, 조제물, 및 신규한 화합물의 조성물은 본 발명의 원리의 예시로서 보아야 할 것이며 이들 원리를 수행하는 특정 구조 또는 과정에 제한되지 않는 것으로 당업자에게 쉽게 이해될 것이다. 따라서, 실시예 1 내지 6은 청구된 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않고, 본 발명의 예시적인 실시양태의 단순한 대표이다.
실시예 1
본 발명에 기재된 탈광물화 해면성 골 조각의 제조방법은, (1) 적당한 반응 용기에서 해면성 골 기질 1 내지 300 g을 0.3 내지 2.0 M 염산(HCl) 10 내지 4500 mL에 첨가하는 단계; (2) 용기 내용물을 약 4 내지 10 시간 교반하는 단계; (3) "사용한" 산 용액을 비이커로 매 1 내지 4 시간마다 대체하는 단계; (4) 매 5 내지 90분마다 해면성 골 기질의 각 조각을 제거하고 상기 블록이 완전히 압축가능한 지 를 결정하는 시험을 수행하는 단계; 및 (5) 완전히 압축가능한 해면성 골 기질의 조각을 pH 4를 초과하는 중화 용액에 옮기고, 완전히 압축가능하지 않는 해면성 골 기질의 조각은 산을 함유하는 반응용기에 되돌려 추가의 탈광물화를 계속하여 상기의 압축시험을 반복하는 단계를 포함할 수 있다.
실시예 2
(탈광물화 해면성 골 기질의 향상된 기능에 대한 오존의 용도)
조직의 가공 도중 상기의 골을 오존으로 처리함으로써 탈광물화 해면성 골 기질의 향상된 기능을 위한 방법은, (1) 탈광물화 해면성 골 기질을 미세버블을 함유하는 오존이 가득한 용액에 두는 단계; (2) 0.1 내지 400 ppm의 오존 농도를 함유하는 용액을 계속적으로 대체하는 단계; (3) -20 내지 50℃의 오존용액의 온도 범위에서 0.1 내지 7 시간 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 골의 오존 용액 처리는 또한 상기에서 논의된 동일한 파라메타를 사용하여 탈광물화 전에 일어날 수 있다.
실시예 3
(탈광물화 해면성 골 기질의 임상 응용)
이하는 신규한 탈광물화 해면성 골 기질의 임상 응용 및 용도의 예이다.
척추 이식에의 용도: 이 실시예는 융합을 만들고 인접 척추체의 표면간의 치료를 촉진하기 위해 기계적 장치와 관련하여 사용될 때, 본 발명에 따라 제조된 탈광물화 해면성 골 기질 및 탈광물화 해면성 골 기질 화합물의 몇몇 생물학적 및 기계적 성질을 나타낸다.
본 발명의 신규한 탈광물화 해면성 골 기질은 전면 척추 이식(예를 들어, 척추 케이지, 또는 금속, 골, 플라스틱 또는 다른 복합체 물질로 이루어지는 다른 장치)에 의해 제공되는 공간 또는 빈 공간에 배치될 수 있다. 탈광물화 골 이식편 기질은 압축되어 탈광물화 해면성 골 기질이 골절되지 않고 다양한 형태의 공간으로 맞춰질 수 있도록 한 후 팽창하여 장치 내의 빈 공간을 채울 수 있다. 장치로부터 스며나오지 않고, 생리식염수, 관주액 또는 체액의 존재하에 용해하지 않으면서, 탈광물화 해면성 골 기질이 수화되면 탈광물화 골 기질은 팽창하여 인접한 골 표면에 단단히 접촉하여, 단독으로 사용되거나, 다른 골 퍼티 또는 겔, 활성 생물학적 또는 약물학적 코팅, 피 또는 골수 흡입물과 함께 사용될 수 있는, 골형성성, 골유도성, 및 골 전도성 브릿지를 만든다.
다른 방법으로, 다양한 구성체(예를 들어, 골수 흡입물 또는 혈소판 겔을 가지거나 가지지 않음)와 함께 다양한 조각의 탈광물화 해면성 골 기질로 구성된 탈광물화 해면성 골 기질 화합물은 전면의 척추 이식(척추 케이지 또는 금속, 골, 플라스틱 또는 다른 복합체 물질로 이루어지는 다른 장치)에 의해 제공되는 공간 또는 빈 공간에 놓여질 수 있다. 탈광물화 해면성 골 기질 화합물은 압축되어 골절되지 않고 다양한 형태의 공간에 맞아질 수 있도록 한 후 팽창하여, 장치로부터 스며나오거나 생리식염수, 관주액 또는 체액의 존재하에 용해하지 않으면서 장치내의 빈 공간을 채울 수 있고, 탈광물화 해면성 골 기질 화합물은 팽창하여 인접한 골 표면에 단단히 접촉하여, 단독으로 사용되거나, 다른 골 퍼티 또는 겔, 활성 생물학적 또는 약물학적 코팅, 피 또는 골수 흡입물과 함께 사용될 수 있는, 골형성성, 골유도성, 및 골 전도성 브릿지를 만든다.
구조적 척추 피질성 / 해면성 동종이식편에의 용도 이 실시예는 본 발명에 따라 제조된 탈광물화 해면성 골 기질 또는 탈광물화 해면성 골 기질 화합물은 구조적 척추 피질성 또는 피질성/해면성 동종이식편과 관련하여 사용될 수 있음을 보여준다. 경골, 대퇴골, 상완골, 비골, 족근골 또는 다른 골로부터 잘려진 다얼 또는 엄밀히 파쇄된 척추 동종이식편은 척추 이식편과 같이 두 개의 인접한 척추체간의 구조적 지지를 제공한다. 다얼이 움푹파여졌을 때, 탈광물화 해면성 골 기질은 다얼의 중앙에 배치되어서 융합을 형성하고 인접한 척추체의 표면 간의 치료를 촉진한다. 탈광물화 해면성 골 기질은 링 구조나 다른 다양한 형태로 잘라질 수 있고 피질성 동종이식편 바깥 주위로 맞아지도록 디자인되어 융합을 형성하거나 골 치료를 촉진할 수 있다.
골의 지연 융합 또는 불융합에의 용도: 이 실시예는 본 발명의 공정, 방법론, 및 기술에 따라 제조된 탈광물화 해면성 골 기질의 독특한 기계적 및 생물학적 성질의 사용하여 탈광물화 해면성 골 기질을 병인성 공간에 배치함으로써 골의 지연 융합 또는 불융합을 통하는 치료적 브릿지를 형성하는 것의 예시적인 실시예를 보여준다.
관이 하나의 건강한 골의 말단으로부터 치료되지 않은 공간을 통과하여 두번째 건강한 골로 지나도록 뚫어질 수 있다. 사이즈 줄(size rasp), 풀런저를 가진 인서터로 구성된 새로운 장치를 사용하여, 활성 생물학적 또는 약물학적 코팅을 가지거나 가지지 않은 원통형이나 다얼로서 형성된 탈광물화 해면성 골 기질은 관에 배치될 수 있고 하나의 건강한 골과 다른 것을 연결할 수 있다. 탈광물화 해면성 골 기질의 신규한 특성은 인서터 내로 압축될 수 있도록 하여, 관내에서 생리식염수, 피, 골수 흡수물, 또는 다른 유체 성분으로 수화될 때, 탈광물화 해면성 골 기질이 팽창하여 공간을 꽉 채울 수 있도록 한다. 탈광물화 해면성 골 기질이 탄성이고 압축, 장력, 뒤틀림, 굽힘의 힘에 의해 변형될 것이기 때문에, 불융합 부위에서 몇몇 움직임으로 브릿지 이식편이 피로하게 되거나 골절되지 않을 것이다. 본 명세서에서 고려되는 것으로서, 본 발명의 탈광물화 해면성 골 기질은, 이의 구조적인 특성으로 인하여, 플레이트 및 스크류, 골내(intramedullary) 고정, 핀 또는 와이어, 외부 고정 장치, 캐스트, 스플린트(splint), 또는 브레이스(brace) 등의 정형외과적 고정의 모든 수단과 함께 사용될 수 있다.
골신장술(distraction osteogenesis)에의 용도: 이 실시예는 골신장술(골 길이신장 또는 운송)에서 골 치료를 촉진시키고 재촉하는 본 발명을 사용하는 예시적인 실시양태를 보여준다. 탈광물화 해면성 골 기질 브릿지는 골 결손이 수술로 형성되거나 이후 일정시간 후에, 피질절단 또는 골절단 부위에 배치될 수 있다. 탈광물화 해면성 골 기질은 삽입 장치나 이의 변형 장치를 사용하거나 사용하지 않고, 관 내 또는 신연 가골(distraction callous) 내에 배치될 수 있다.
탈광물화 해면성 골 기질 브릿지는 플레이트 및 스크류, 골내 고정, 핀 또는 와이어, 외부 고정 장치, 캐스트, 스플린트 또는 브레이스 등의 정형외과적 고정의 모든 수단과 함께 골신장술에 사용될 수 있다.
골절 치료에의 용도: 이 실시예는 급성 골절 부위에서 골절치료를 촉진하기 위해 본 발명을 사용하는 예시적인 실시양태를 나타낸다.
관이 하나의 골의 말단으로부터 골절 공간을 통과하여 두번째 골로 지나도록 뚫어질 수 있다. 본 발명에 따르는 골 이식편 응용 키트는 사이즈 줄, 풀런저를 가진 인서터, 활성 생물학적 또는 약물학적 코팅을 가지거나 가지지 않은 탈광물화 해면성 골 기질 원통형이나 다얼을 포함할 수 있고, 이는 관에 배치되어 하나의 건강한 골과 또 다른 골을 연결할 수 있다. 탈광물화 해면성 골 기질의 신규한 특성은 인서터 내로 압축될 수 있도록 하여, 관내에서 생리식염수, 피, 골수 흡수물, 또는 다른 유체 성분으로 수화될 때, 탈광물화 해면성 골 기질은 팽창하여 공간을 꽉 채울 것이다. 탈광물화 해면성 골 기질이 탄성이고 압축, 장력, 뒤틀림, 굽힘의 힘에 의해 변형될 것이기 때문에, 불융합 부위에서 몇몇 움직임으로 브릿지 이식편이 피로하게 되거나 골절되지 않을 것이다.
탈광물화 해면성 골 기질은 인서터를 사용하거나 또는 손조작으로 수술 치료시 골절부위에서 골내에 배치될 수 있다. 의도에 따라, 원통형이거나 다얼의 형태로, 또는 조각편으로 배치될 수 있다. 본 발명에 따르는 탈광물화 해면성 골 기질 브릿지는 플레이트 및 스크류, 골내 고정, 핀 또는 와이어, 외부 고정 장치, 캐스트, 스플린트 또는 브레이스 등의 정형외과적 고정의 모든 수단과 함께 사용될 수 있다.
관절고정술 치료에의 용도: 이 실시예는 두 뼈 사이의 관절이 제거되어 남아있는 골 사이에 골 융합이나 관절고정을 이루기 위해 시도될 때 관절고정 부위에서 성공적인 치료를 증진시키고 촉진하기 위한 본 발명의 용도의 예시적인 실시양 태를 나타내는 데, 전형적으로 융합되는 관절이나 관절 고정은 손가락, 발가락, 손목, 발 및 발목의 골이다. 발목 골은 특히 융합이 실패할 위험성이 높다. 다른 일반적으로 융합되는 관절은 어깨, 팔꿈치, 엉덩이 및 무릎 관절 등을 들 수 있다. 본 발명의 탈광물화 해면성 골 기질은 경추부 후방관절(facet joint) 등의 전면 및 후면 척추 분절, 천장관절(sacro-iliac joint), 치골, 및 견쇄 관절(acromio-clavicular joint), 및 흉쇄 관절(stemo-clavicular joint) 등의 임의의 움직일 수 있거나 움질일 수 없는 관절과 함께 사용될 수 있다.
관이 하나의 건강한 골 말단으로부터 관절고정 부위를 통과하여 두번째 건강한 골로 지나도록 뚫어질 수 있다. 사이즈 줄, 풀런저를 가진 인서터, 활성 생물학적 또는 약물학적 코팅을 가지거나 가지지 않은 원통형이나 다얼로서 형성된 탈광물화 해면성 골 기질로 구성된 새로운 장치를 사용하여, 탈광물화 해면성 골 기질이 관에 배치될 수 있어서 하나의 건강한 골과 다른 것을 연결할 수 있다. 탈광물화 해면성 골 기질의 신규한 특성은 인서터 내로 압축될 수 있도록 하여, 관내에서 생리식염수, 피, 골수 흡수물, 또는 다른 유체 성분으로 수화될 때, 탈광물화 해면성 골 기질은 팽창하여 공간을 꽉 채울 수 있다. 탈광물화 해면성 골 기질이 탄성이고 압축, 장력, 뒤틀림, 굽힘의 힘에 의해 변형될 것이기 때문에, 불융합 부위에서 몇몇 움직임으로 브릿지 이식편이 피로하게 되거나 골절되지 않을 것이다. 사용되는 드릴은 표준의 내부 고정 장치에서 사용되는 드릴과 동일한 직경일 수도 아닐 수도 있고, 카눌라(cannula)화된 드릴을 사용할 수도 사용하지 않을 수도 있다.
관절성형술에서 고정을 향상시키는 용도: 본 발명에 따른 새로운 장치는 골 내의 결손을 채우기 위해 사용할 수 있고, 골 치료를 재촉 및/또는 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 공정, 방법론, 및 기술에 따라 제조된 탈광물화 해면성 골 기질은 외상, 낭포, 종양, 이전의 수술, 또는 감염으로 인한 골 내의 결손 내에 배치될 수 있다. 탈광물화 해면성 골 기질은 2 mm 내지 수 센티미터의 크기의 범위일 수 있는 단일의 블록이나 복수의 조각으로 결손 부위에 채워질 수 있다. 탈광물화 해면성 골 기질 및 골 기질의 보다 작은 조각(예를 들어, 화합물)은 치골 내의 비구 컵에 인접한 부위, 대퇴골 스템 주위, 원위 대퇴골, 근위 경골의 무릅 구성요소에 인접한 부위, 손, 팔목, 팔꿈치, 어깨, 발, 발목 또는 다른 관절 표면의 관절을 재구성하는 구성요소에 인접한 부위 등의 고정을 향상시키고 결손을 채우기 위해 관절성형술과 관련하여 사용될 수 있다.
본 발명의 탈광물화 해면성 골 기질의 독특한 구조적 및 기능적 특성은 압축에 의해 골절없이 다양한 형태를 가지는 공간이나 구멍으로 배치되는 것을 촉진시킨다. 탈광물화 해면성 골 기질은 장치로부터 스며나오거나 생리식염수, 관주액 또는 체액의 존재하에 용해하지 않고 수화하면 팽창하여 장치내 빈 공간을 채우고; 탈광물화 해면성 골 기질은 인접한 골 표면 주위로 빈틈없이 팽창하여 골형성성, 골유도성, 골전도성 브릿지를 만드는데, 상기 브릿지는 단독으로 사용되거나, 다른 골 퍼티 또는 겔, 활성 생물학 또는 약물학 코팅, 피 또는 골수 흡입물과 함께 사용될 수 있다.
연골 치료 및 재생에의 용도: 이 실시예는 연골 재생을 촉진하기 위해 연골 의 손상부위에 기질을 배치시킴으로써 연골치료에 본 발명을 사용하는 예시적인 실시양태를 보여준다. 본 발명은 압축이 다양한 연골 결손 또는 연골 내 및 연골과 관련된 구멍내에의 배치를 촉진시키도록 한다. 수화된 탈광물화 해면성 골 기질은 팽창하여 연골내의 빈 공간을 채우고, 피 또는 골수를 흡수할 수 있다. 탈광물화 해면성 골 기질은 성장인자 또는 줄기세포와 함께 코팅되거나 주입될 수 있어 연골의 치료 및 재생을 추가로 증진시킬 수 있다.
경구 수술에의 용도: 이 실시예는 재구축성 경구 수술에 있어서 하악골 및 상악골을 재구축하는 데 본 발명을 사용하는 예시적인 실시양태를 보여준다. 본 발명의 탈광물화 해면성 골 기질은 잃어버린 골을 다시 만들기 위해 이식편으로서 턱 및 상악골의 구멍이나 공간에 배치될 수 있다. 탈광물화 해면성 골 기질은 담체 또는 활성 생물학적 또는 약물학적 작용제와 함께 또는 이들 없이 탈광물화 피질성 골 파우더와 함께 또는 이것 없이 사용될 수 있다. 본 발명의 적어도 두 개의 현재 바람직한 용도는 경구 수술에 사용되는 것으로 상정되고 이 실시예에서 제공된다. 본 발명에 따라서 미리 선택되고/되거나 적절한 크기를 갖는 탈광물화 골 이식 물질은 발치 소켓(tooth extraction socket)에 삽입될 수 있다. 적절하다면, 골성 치조 결손이 본 발명에 따르는 골 이식 물질을 사용하여 동일한 방법으로 또한 치료될 수 있다. 선택되는 멤브레인은 본 발명에 따르는 탈광물화 골 이식 물질 상에 배치될 수도 있고 치주 수준에서 봉합될 수 있다.
본 발명의 공정, 방법론, 및 기술에 따라 가공된 적절한 크기의 수화된 탈광물화 해면성 골 기질은 부비강 통로를 통해 삽입될 수도 있고 외과적으로 만들어진 부비강 구멍으로 배치될 수도 있다. 본 발명의 이 예시적인 실시예는 이전 공지 기술에 비해 이하의 하나 이상의 장점을 가질 수 있다. 첫째, 응용 용이성- 본 발명의 물질을 포함하는 탈광물화 해면성 골 기질 또는 화합물은 이전 기술의 이식 물질 및 방법에 비해 이식 부위로 보다 용이하게 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 주의할 것으로서, 탈광물화 해면성 골 기질은 균일하게 입자상이나 퍼티일 수 있어서, 이식 부위로 배치되기가 보다 어려울 수 있는 전통적인(즉, 이전 기술)의 이식 물질에 비하여 압축가능한 물질의 단일 조각으로서 조제될 수 있다. 둘째, 본 발명의 탈광물화 해면성 골 기질은 원하는 이식 부위로 배치되기 전에 압축되어 배치후 팽창될 수 있다. 반대로, 이전 기술의 골 이식 물질은 이식 부위에 채워질 필요가 있다. 셋째, 골 이식 기질 또는 유도 화합물은 움직이지 않아서 커버리지를 위한 멤브레인을 사용할 필요성이 없다. 마지막으로, 본 발명의 탈광물화 해면성 골 기질은 더 빠른 골 형성을 가져와서 치과 이식물의 빠른 배치를 가능하게 한다.
감염된 골의 치료에의 용도: 이 실시예는 감염된 골의 불융합을 치료할 목적으로, 주로 또는 관절치환술이 실패한 후 감염된 관절을 융합시킬 목적으로, 급성 또는 오래된 골절을 내부적으로 또는 외부적으로 고칠 목적으로, 주로 또는 이전의 척추 융합 실패후 감염된 척추 분절을 융합시킬 목적으로, 이전에 감염된 골 분절에서 골을 신장하거나 운송할 목적으로, 감염 또는 오염된 골 및 연조직의 존재하에서 치료를 증진하거나 촉진시키는 데 본 발명이 사용됨을 보여준다. 탈광물화 골 이식 물질은 실버 설파디아진, 클로로헥시딘, 겐타마이신, 토브라마이신, 반코마이신 등의 항생물질이나 항-감염 작용제를 유리하도록 의도된 용출성 코팅으로 처리되었다. 탈광물화 골 이식 물질은 실버 설파디아진, 클로로헥시딘, 겐타마이신, 토브라마이신, 반코마이신 등의 항생물질 또는 활성 작용제를 함유하는 항-감염 작용제 용액에 적셔졌다. 탈광물화 골 이식 물질은 블록으로서, 작은 조각으로서 작용될 부위에 채워지고 또는 원통으로서 도입될 수 있다.
척추성형술 용도: 골다공증은 수 천만명의 미국인의 골을 얇게 만든다. 매년 대략 700,000명의 환자가 그 결과로서 척추골절을 겪는다. 이들은 앉는 것 또는 서는 것이 절단된 척추를 압박하기 때문에 괴로워한다. 환자의 약 3분의 2가 침대에서 몇달간 휴식을 취한 후는 고통이 없어지지만, 나머지는 만성통증을 가진다. 척추 골절은 축척되어 키를 낮게 하고 소화 및 호흡 곤란을 가져온다. 현재 이용가능한 척추 성형술 접근법을 사용하여, 생분해가능한 접착제로 삽입된 스폰지 같은 골 물질이 으스러진 척추내로 주입되고, 이는 팽창하여 즉시 통증을 경감시키고 척추의 구조를 지지하고, 골의 재생을 촉진할 작용제를 제공할 것이다. 현재 척추성형술 기술은 골을 안정화시키고 추가의 붕괴를 예방 또는 지연시키기 위해 시멘트(예를 들어, 메틸메타크릴레이트 접착제)를 사용한다. 75 내지 90% 정도의 환자가 통증경감을 얻는다고 제시한 작은 연구들과 함께, 이러한 기술에 의한 환자의 통증경감의 증거가 있다.
후만성형술(kyphoplasty)이라는 보다 새로운 기술은 더 복잡하다. 먼저 풍선을 가지는 카테더를 갈라진 척추내로 끼울 수 있다. 특별한 액체로 풍선을 팽만시키면 붕괴된 골을 들어올려 시멘트가 이어서 주입되면서 높이를 복귀시킨다. 본 발명의 장점은 현재 이용가능한 시술에 사용되고 있는 시멘트가 골 성장을 증진시 키지 않는다는 것이다. 통증경감은 통상 단지 일시적이고, 몇달 내로 환자는 다시 문제를 안는다. 골 성장을 촉진하는 본 발명의 골 적합성 물질 및 재료를 사용하면 골다공증성 골의 구조 및 기능의 보다 영구적인 회복 가능성을 증가시킬 것이다. 생분해성 접착제와 결합된, 스폰지같은 골 물질의 팽창가능한 성질은 환자에서 바로 높이를 회복시키고 척추안정성을 제공하는 데 사용될 수 있다.
실시예 4
(생활성제의 상처부위로의 송달)
담체로서 탈광물성 해면성 골 기질을 사용한 생활성제의 송달 방법은, (1) 무수화되거나 수화된 탈광물성 해면성 골 기질을 생활성제를 포함하는 용액에 두어 기질이 용액을 흡수하도록 하여 기질를 생활성제로 함침한 후 공기건조 또는 동결건조; (2) 탈광물화 해면성 골 기질을 생활성제를 함유하는 히드로겔, 폴리머 또는 다른 물질로 코팅; (3) 생활성제를 함유하는 용액을 기질에 주입을 포함한다.
이들 다른 활성 단백질은 탈광물화 해물성 골 기질에 침투, 함침 또는 주입되거나 탈광물화 표면에 코팅될 수 있다. 단백질은 또 다른 담체에 의해 탈광물화 해면성 골 기질에 인접하게 배치될 수 있고 이는 즉시 수술 베드에 주어질 수 있다. 탈광물화 기질은 이의 기재된 기계적 성질, 탄성, 유동성, 골유도성, 골전도성, 흡수성, 및 수화될 때 유체상에 유지되는 능력으로 인하여 이들 단백질의 이상적인 담체이다.
본 발명의 공정, 방법론, 기술에 따라 제조된 탈광물화 해면성 골 기질 화합물은 이들 및 다른 단백질과 결합될 수 있고, 탈광물화 해면성 골 기질 화합물로 혼합되거나 탈광물화 입자 표면상으로 또는 골 화합물과 함께 사용되는 또 다른 물질의 표면상으로 코팅될 수 있다. 단백질은 다른 담체를 사용하여 탈광물화 해면성 골 기질에 인접하게 배치되어 즉시 수술 베드에 주어질 수 있다. 탈광물화 해면성 골 기질은 이의 기재된 기계적 성질, 탄성, 유동성, 골유도성, 골전도성, 흡수성, 및 수화될 때 유체상에 유지되는 능력으로 인하여 이들 단백질의 이상적인 담체이다.
실시예 5
('불활성' 골 기질의 제조)
탈광물화 골 기질은 공지된 해로운 처리를 사용하여 기질 내 성장인자의 이용가능성을 의도적으로 감소시키는 방식으로 가공될 수 있다. 이는 시그날 분자를 현저하게 포함하지 않은 대부분이 세포외 성분, 주로 콜라겐으로 구성된 '불활성' 기질을 제공할 것이다. 이러한 기질은 몇몇 임상적 및 연구 세팅에서 바람직할 수 있다. 또한 과산화수소 노출에 의한 탈광물화 골의 공정은 이러한 목적을 성취하기 위한 하나의 방법이다.
실시예 6
(3D-뼈대로서 탈광물화 해면성 골 기질의 용도)
본 발명의 공정, 방법론, 및 기술에 따라 제조된 탈광물화 해면성 골 기질의 세포의 3차원(3-D) 배양을 위한 물질로서 용도의 방법은, (1) 젤라틴, 피브린, 셀룰로스, 합성 세포외기질, 폴리머, 및 다른 생적합성 담체로 제조된 담체를 통해 세포는 기질로 송달된다 (2) 또는 세포는 직접 기질 위에 배양으로 배치된다; (3) 또는 세포는 수화된 기질로 주입된 후 배양 배지에 배치된다; (4) 완전한 영양 배지가 탈광물화 해면성 골 기질과 세포를 포함하는 배지에 사용된다; (5) 세포 분화 요소 등의 첨가제가 배지 성분에 추가된다; (6) 3-D 매트릭스 시험관내 세포 배양이 성숙한 조직이 형성될 때까지 유지된 후 이식된다; (7) 또는 반대로, 세포가 기질과 회합된 직후 이식되어져서 조직 재생이 생체내에서 일어나도록 할 수 있다; (8) 탈광물화 해면성 골 기질 세포 배양 구축물은 시험관내 세포가 시드된 구축물을 소정의 화학물질에 노출시킨 후 세포 생존률 또는 기능을 평가함으로써 영양 작용제(trophic agent) 또는 독성 작용제를 평가하기 위한 약물 또는 화학물질 스크리닝을 수행하는 데 사용될 수 있다; (9) 키트는 소정의 특정 분야에 적절한 시약 또는 세포와 함께 또는 이들 없이, 제조된 탈광물화 해면성 골 기질의 샘플로 구성될 수 있다.
이러한 탈광물화 해면성 골 기질에서 세포의 배양은 사람 또는 동물에서 골 또는 연골 결손 또는 다른 조직 또는 기관 결손을 치료하기 위해 이식용의 골 또는 연골을 성장시키는데 사용될 수 있다. 세포가 시드된 뼈대(scaffold)는 성숙한 조직 형성이 일어날 때까지 시험관내에서 배양된 후, 이식될 수 있고, 또는 반대로, 세포가 기질과 회합된 직후에 이식되어져 조직 재생이 생체내에서 일어나도록 할 수 있다. 예를 들어, 연골세포는 탈광물화 해면성 골 기질 상에서 시험관내에서 성장되어 연골 조직을 형성하고 이후 조직의 치료 및 재생을 위해 손상된 연골 부위에 이식될 수 있다.
탈광물화 해면성 골 기질 세포 배양 구축물은 또한 3-D 배양 세팅에서 영양 성장 증진제 또는 줄기세포 분화제 또는 가능한 독성제를 평가하기 위하여 약물 또는 화학물질 스크리닝을 수행하는 연구 모델로서 사용될 수 있다. 현재의 시험은, 자주 2-D 세포 배양을 사용하여 수행되고 2-D에서 배양된 세포의 결과는 자주 모든 타입의 세포에게 보다 자연적인 환경인 3-D 매트릭스에서 배양된 세포의 것과 상이함이 당업자에게 공지되어 있다. 키트는 소정의 특정 분야의 적절한 시약 또는 세포와 함께 또는 이들 없이 제조된 탈광물화 해면성 골 기질의 샘플을 제공할 수 있다.
탈광물화 해면성 골 기질은 콜라겐 섬유내의 착색제 및 염료는 물론 많은 종류의 생활성제를 용이하게 흡수하고 그리하여 상기 골 기질의 용도를, 생활성제, 착색제 및 염료가 기질 표면으로부터 유출되는 세포의 부착/접착 및 성장 연구로 범위를 넓힌다. 탈광물화 해면성 골 기질은 세포의 활성 및 세포외기질의 리모델링의 보다 나은 관찰을 위해 얇은 시트로 잘게 썰어질 수 있다. 이종이식 물질이 용이하게 입수가능하고, 따라서 연구 응용에 특히 매력적이다.
암세포는 또한 화학요법제의 평가를 위해 이 기질 상에서 성장시킬 수 있다. 자가유래의 암세포가 사용될 수 있고, 화학요법제는 주어진 환자에서 가장 효과적인 종양 억제 또는 제거 효과를 위한 특정 항암제 조합을 맞추기 위해 스크리닝될 수 있다.
이해될 것으로서, 본 발명은 본 발명의 정신 또는 필수 특성에서 벗어나지 않는 다른 특정형태로 구체화될 수 있다. 기재된 실시양태는 모든 면에서 단지 예시적으로서 고려되어야 하고 이에 제한되는 것으로 생각되지 않는다.
본 발명은 바람직한 실시양태를 참고로 하여 기재되었으나, 당업자는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않는 형태 및 상세에서 변화가 만들어질 수 있음을 인식할 것이다.

Claims (80)

  1. 골체의 탈광물화를 위해 골체를 산을 포함하는 제1 공정 용액에 두는 단계;
    특정 시간 간격으로 제1 공정 용액으로부터 골체를 주기적으로 제거하여 골체의 기계적 성질에 관한 하나 이상의 시험을 수행하는 단계; 및
    상기 시험에서 원하는 결과가 얻어질 때 골체를 제2 공정 용액에 노출시키는 단계
    를 포함하는 탈광물화 골 기질의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 골체의 부피가 약 4 세제곱 밀리미터를 초과하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 골체가 파편화된 방법.
  4. 제1항에 있어서, 제2 공정 용액의 pH가 약 4를 초과하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 제2 공정 용액의 pH가 약 7 내지 약 14의 범위인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 제2 공정 용액이 완충제를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 제2 공정 용액이 수성계인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 제2 공정 용액이 유기성이고 골체 내 및 골체 상에서 산을 중화시킬 수 있는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 탈광물화 골 기질 내의 내인성 성장인자의 악화, 불활성화, 또는 제거가 최소화되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 내인성 성장인자가 IGF-1인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 탈광물화 골 기질 내의 내인성 성장인자가 최대한 보존되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 내인성 성장인자가 IGF-1인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 탈광물화 골 기질 내의 내인성 골형성 단백질의 악화, 불활성화 및 제거가 최소화되는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 탈광물화 골 기질 내의 내인성 골형성 단백질이 최대한으로 보존되는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 골체가 자가유래 골, 동종유래 골, 이종유래 골 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 탈광물화 골 기질이 광물을 약 2 중량% 미만으로 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 광물이 칼슘, 마그네슘 및 인산염으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 생활성 작용제 및 성장인자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 약물 용출성 화합물로 탈광물화 골 기질을 코팅하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 생활성 작용제 및 성장인자로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 약물 용출성 화합물을 탈광물화 골 기질에 함침시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 폴리히드록시 화합물, 천연 폴리머, 합성 폴리머, 천연 폴리사카라이드, 반-합성 폴리사카라이드, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 주입가능 담체 물질과 탈광물화 골 기질을 혼합하는 단계를 추가로 포함 하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 탈광물화 골 기질을 동결건조시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 감마선 조사로 탈광물화 골 기질을 최종적으로 멸균시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 탈광물화 골 기질 내의 성장인자의 수를 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 탈광물화 골 기질을 과산화수소로 처리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 탈광물화 골 기질을 오존을 함유하는 제3 공정 용액에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 제3 공정 용액이 멸균수, 생리식염 용액, 완충용액, 유기 용매용액, 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 성분을 포함하는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 제3 공정 용액이 등장성(isotonic)인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 제3 공정 용액이 저장성(hypotonic)인 방법.
  29. 제25항에 있어서, 제3 공정 용액이 고장성(hypertonic)인 방법.
  30. 제25항에 있어서, 제3 공정 용액의 오존 농도가 약 0.1 내지 약 400 ppm의 범위인 방법.
  31. 제25항에 있어서, 제3 공정 용액이 오존 포화 용액을 포함하는 것인 방법.
  32. 제25항에 있어서, 제3 공정 용액이 오존과 불활성 담체 가스의 혼합물을 포함하는 것인 방법.
  33. 제25항에 있어서, 오존의 가스 버블의 흐름을 제3 공정 용액을 통하여 적용시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  34. 제25항에 있어서, 약 0.1 시간 내지 약 7 시간의 범위의 소정의 시간 동안 제3 공정 용액에 탈광물화 골 기질을 노출시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  35. 내용 없음.
  36. 내용 없음.
  37. 내용 없음.
  38. 내용 없음.
  39. 제25항에 있어서, 제3 공정 용액의 온도가 약 -20 내지 약 80℃의 범위인 방법.
  40. 제1항에 있어서, 골체가 해면성 골로 이루어지는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 골체가 블록을 포함하는 방법.
  42. 제40항에 있어서, 특정 시간 간격이 약 5 분 내지 약 4시간의 범위인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 시험이 압축시험인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 골체에 압축력을 적용시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 압축력이 제곱센티미터 당 약 10 내지 약 1000 그램의 힘의 범위인 방법.
  46. 제 45항에 있어서, 원하는 결과는 골체가 그 원래 크기의 약 5 내지 약 60%의 범위로 균일하게 압축될 때 얻어지는 것인 방법.
  47. 제40항에 있어서, 탈광물화 피질성 골 파우더, 히드록시아파타이트, 인산칼슘, 칼슘염, 생활성 작용제, 담체 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 성분과 함께 탈광물성 골 기질을 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  48. 제1항에 있어서, 골체가 피질성 골로 이루어지는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 특정 시간 간격이 약 5분 내지 약 4시간의 범위인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 골체가 스트립을 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 골체의 길이가 약 5 밀리미터 내지 약 500 밀리미터의 범위인 방법.
  52. 제50항에서, 시험이 굽힘시험인 방법.
  53. 제51항에 있어서, 굽힘력을 골체에 적용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 굽힘력이 제곱센티미터 당 1 내지 약 4000 그램 힘의 범위인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 원하는 결과는 골체가 아크(arc) 주위로 약 140 내지 약 180도의 범위의 각도로 굽혀질 때 얻어지는 것인 방법.
  56. 제50항에 있어서, 시험이 롤링시험인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 골체에 롤링력을 적용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 원하는 결과는 골체의 안쪽 모서리가 적어도 한번 균일하게 겹쳐지는 때 얻어지는 것인 방법.
  59. 제48항에 있어서, 골체가 블록을 포함하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 시험이 압축시험인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 골체에 압축력을 적용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 압축력이 제곱센티미터당 약 50 내지 약 4000 그램의 힘의 범위인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 원하는 결과는 골체가 그의 원래 크기의 약 40 내지 약 98%의 범위로 균일하게 압축될 때 얻어지는 것인 방법.
  64. 제1항에 있어서, 골체가 피질해면성(corticocancellous) 골로 이루어지는 것인 방법.
  65. 제1항에 있어서, 탈광물화 골 기질에 전구세포를 시드하여 3-D 매트릭스를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 3-D 매트릭스를 세포의 분화 및 증식을 위한 환경으로서 이용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  67. 제66항에 있어서, 새로운 조직의 성장, 세포 분화, 증식 및 기능을 연구하는 데 상기 환경을 이용하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  68. 제65항에 있어서, 전구세포가, 골전구세포, 골격근 줄기세포, 연골 전구세포, 분화된 조골세포, 파골세포, 연골세포, 지방 줄기세포, 골수 줄기세포, 간엽계 줄기세포, 성인 줄기세포, 배아줄기세포, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  69. 제65항에 있어서, 전구세포가, 자가유래 세포, 동종유래 세포, 이종유래 세포, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  70. 제65항에 있어서, 피브린, 젤라틴, 셀룰로스, 합성 세포외기질, 합성 폴리머, 천연 폴리머, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 생적합성 담체에서 전구세포를 혼합하여 세포를 포함하는 담체를 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 세포를 포함하는 담체를 3-D 매트릭스에 주입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  72. 제65항에 있어서, 세포부착을 확립시키기 위해 소정의 기간 동안 전구세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 세포부착이 일어날 때 3-D 매트릭스를 상처부위로 즉시 이식하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  74. 제65항에 있어서, 스크리닝 공정을 수행하기 위해, 3-D 매트릭스를 연구 모델로서 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 스크리닝 공정을 영양 성장 증진제를 평가하기 위해 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  76. 제74항에 있어서, 상기 스크리닝 공정을 줄기세포 분화제를 평가하기 위해 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  77. 제74항에 있어서, 상기 스크리닝 공정을 독성제를 평가하기 위해 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  78. 제74항에 있어서, 상기 스크리닝 공정을 화학요법약물을 평가하기 위해 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  79. 골체의 탈광물화를 위해 골체를 산을 포함하는 제1 공정 용액에 두는 단계;
    특정 시간 간격으로 제1 공정 용액으로부터 골체를 주기적으로 제거하여 골체의 기계적 성질에 관한 하나 이상의 시험을 수행하는 단계;
    상기 시험에서 제1의 원하는 결과가 얻어질 때 골체의 탈광물화를 위해 산을 포함하는 제2 공정 용액에 골체를 두는 단계;
    특정 시간 간격으로 제2 공정 용액으로부터 골체를 주기적으로 제거하여 골체의 기계적 성질에 관한 하나 이상의 시험을 수행하는 단계; 및
    상기 시험에서 제2의 원하는 결과가 얻어질 때 골체를 제3 공정 용액에 노출시키는 단계
    를 포함하는 탈광물화 골 기질의 제조방법.
  80. 제79항에 있어서, 제1 공정 용액의 pH가 제2 공정 용액의 pH보다 낮은 방법.
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