KR100978562B1 - 스폰지형 골 이식재 및 이를 제조하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 스폰지형 골 이식재 및 이를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 초음파의 공명현상을 이용하여 골 조직의 표면과 내부를 손상됨 없이 단시간 내에 탈지, 탈회, 세척 및 멸균 공정을 행함으로써, 보다 신속하고 효율적으로 동종 또는 이종의 골 이식재를 공급하도록 함과 동시에, 골 이식재 내부 및 외부의 Ca++ 농도를 효과적으로 제거하여 탄성 강도 등의 물성을 유지하고, 탈회골 내의 BMP단백질, 성장인자, 프로테오글리칸을 비롯한 골형성 유도 요소들을 보호하여 효과적으로 방출하도록 하며, 골 이식재가 쉽게 분해되거나 불활성화되는 것을 제어하는 보호제를 처리함으로써 높은 품질의 골 이식재 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 스폰지형 골 이식재를 제조하는 방법은, 채취한 동종 또는 이종의 골 조직을 블록형태로 절단하고 연조직을 제거하는 제 1단계와; 상기 골 조직을 에탄올 수용액으로 탈지, 탈수 및 살균하는 제 2단계와; 상기 탈지ㆍ탈수 및 살균된 골 조직에서 잔여조직을 제거하는 제 3단계와; 상기 골 조직을 과산화수소로 멸균ㆍ산화하는 제 4단계와; 상기 멸균ㆍ산화된 골 조직을 미세하게 절단하여 골 단편을 육면체로 가공하는 제 5단계와; 상기 육면체로 가공된 골 단편을 염산을 이용하여 탈회시키는 제 6단계와; 상기 탈회된 골 단편을 에탄올 수용액으로 세척하는 제 7단계와; 상기 세척된 골 단편을 인산염 완충용액으로 중화하는 제 8단계와; 상기 중화시킨 골 단편을 RSC 용액에 침지(浸漬, Steep)시키는 제 9단계와; 상기 RSC 용 액을 처리한 골 단편을 세척한 후 건조하는 제 10단계; 및 상기 건조된 골 단편을 진공동결건조하는 제 11단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스폰지형 골 이식재를 제조하는 방법을 제공한다.
스폰지형, 골 이식재, 초음파의 공명현상, RSC 용액, 탈회, 침지,

Description

스폰지형 골 이식재 및 이를 제조하는 방법{Cancellous bone graft substitute and its process}
본 발명은 스폰지형 골 이식재 및 이를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 초음파의 공명현상을 이용하여 골 조직의 표면과 내부를 손상됨 없이 단시간 내에 탈지, 탈회, 세척 및 멸균 공정을 행함으로써, 보다 신속하고 효율적으로 동종 또는 이종의 골 이식재를 공급하도록 함과 동시에, 골 이식재 내부 및 외부의 Ca++ 농도를 효과적으로 제거하여 탄성 강도 등의 물성을 유지하고, 탈회골 내의 BMP단백질, 성장인자, 프로테오글리칸을 비롯한 골형성 유도 요소들을 보호하여 효과적으로 방출하도록 하며, 골 이식재가 쉽게 분해되거나 불활성화되는 것을 제어하는 보호제를 처리함으로써 높은 품질의 골 이식재 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
골 이식은 골의 질병, 골 종양을 포함한 골 질환에 의해 손실된 뼈 조직내의 공간을 충진하거나, 골절, 골유합, 관절고정을 유도하는데에 적용되고 있으며, 최근에는 노인인구의 증가 및 삶의 질적 향상으로 인해 산업화와 의학의 발달 및 그 필요성이 점차 확대되고 있으며, 이와 같은 추세에 대응하여 보다 간편하고 효율적 인 치료용 골 이식재에 대한 연구도 더욱 활발해지고 있다.
이러한 골 이식에 있어서 가장 일반적인 방법으로는 이식자(graftee) 자신의 뼈 일부분을 채취하여 손상된 다른 부위에 이식하는 방법인 자가이식 방법이 사용되고 있다. 이처럼 자가해면골(Autogenous Cancellous Bone, ACB)을 이식하는 경우는, 뼈의 기질과 뼈 형성에 관련하는 살아있는 세포들이 이식 부위에 제공되므로 뼈의 생성이 다른 이식물에 비해 뛰어나고, 면역거부반응도 거의 없으며, 뼈 흡수가 거의 없어 골전도 및 골유도 능력이 매우 뛰어나다.
그러나 이와 같은 자가이식 방법은 이식자 본인으로부터 이식물을 채취하기 때문에, 뼈의 손실 부위 이외에 이식물의 채취 부위의 외과적 수술이 반드시 동반되어야 할 뿐만 아니라, 이식자로부터 획득될 수 있는 이식물의 양이 매우 제한적이라는 가장 큰 문제점이 있다.
따라서, 자가이식 방법의 이와 같은 문제점들로 인하여 이식자 본인이 아닌 다른 사람의 뼈를 이용하는 동종이식(allograft)이나 다른 동물의 뼈를 이용하는 이종이식(xenograft)의 개발(Mulliken et al., Calcif. Tissue Int. 33:71, 1981; Neigel et al., Opthal. Plast. Teconstr. Surg. 12:108, 1996; Whiteman et al., J.Hand. Surg. 18B: 487, 1993; Xiaobo et al., Clin. Orthop. 293:360, 1993)이 진행되었으며, 이와 같은 개발에 수반되어 면역거부반응을 일으키는 이식물 내의 세포, 혈액, 지질층 등을 제거하고, 골유도에 관여하는 골유도 단백질(BMP)의 활성화를 유발할 수 있는 탈 무기질 처리된 동종 또는 이종의 탈회골(Demineralized Bone Matrix, DBM)이 개발되었다.
동종 또는 이종의 탈회골은 이식물 채취를 위한 이차적 수술이 불필요하고, 이식자의 특성에 맞는 탈회골의 맞춤화(가공의 용이성)가 가능하고, 이식물의 공급이 원활(공급의 용이성)하다는 장점을 갖으며, 이와 같은 탈회골은 동종 또는 이종의 골을 세척ㆍ탈지하고, 방부 처리 및/또는 멸균 처리 등으로 전염성 병원체를 제거하고, 기계적 절단 가공을 행한 후, 산 용액에 함침(soaking)시키는 방법으로 제조된다.
그러나, 공지되어 있는 기존의 동종 또는 이종의 탈회골을 제조하는 방법은 제조하는데에 상당히 오랜 시간이 소요될 뿐만 아니라, 이와 같은 제조 방법으로 제조되어 상품화되고 있는 골 이식재들은 이식된 이후 급속하게 분해되어 골생성 활성이 이식으로부터 24시간 이내에 현저하게 감소하고, 일부의 경우는 이식으로부터 6시간 이내에 불활성되어 골전도(Osteoconductive) 및 골유도(Osteoinductive) 능력이 사라지는 문제점들이 발견되고 있다.
이는 골 이식재를 적기에 공급할 수 있도록 통상적으로 수행되고 있는 진공동결건조(vaccum freeze drying)에 있어서, 냉동과 탈수의 반복 과정으로 골조직의 생체역학적 특성의 열화에 기인하여 골 이식재가 손상되거나 또는, 동결건조의 대안으로 감마 방사선을 조사하는 경우나 동결건조와 감마선 조사를 동시에 사용하는 경우에 의해 골 이식재의 손상이 증폭되기 때문이다.
따라서, 골 이식재의 사용량이 점차 증가 되는 추세에 따라 보다 간편하고 신속하게 높은 품질의 동종 또는 이종의 치료용 골 이식재를 공급할 수 있음과 동시에, 골 이식재의 제조 과정에서 초래되는 골 이식재의 손상을 효과적으로 보완하 는 방법의 개발이 요구된다.
본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 스폰지형 골 이식재를 제조하는데에 있어서 초음파의 공명현상을 이용하는 에탄올 처리공정, 과산화수소 처리공정 및 탈회 처리공정을 행함으로써, 골조직의 표면 및 내부를 손상하는 일 없이 단시간 내에 품질 좋은 스폰지형 골 이식재를 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 골 이식재를 제조하는데에 있어서 동종 또는 이종의 골단편을 탈회 처리한 후 보호제를 처리함으로써, 생체 내에 이식된 후에 쉽게 불활성화 되지 않는 고품질의 스폰지형 골 이식재를 제공하는 데에 또 다른 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 기술적 사상으로서의 본 발명은, 채취한 동종 또는 이종의 골 조직을 블록형태로 절단하고 연조직을 제거하는 제 1단계와; 상기 골 조직을 에탄올 수용액으로 탈지, 탈수 및 살균하는 제 2단계와; 상기 탈지ㆍ탈수 및 살균된 골 조직에서 잔여조직을 제거하는 제 3단계와; 상기 골 조직을 과산화수소로 멸균ㆍ산화하는 제 4단계와; 상기 멸균ㆍ산화된 골 조직을 미세하게 절단하여 골 단편을 육면체로 가공하는 제 5단계와; 상기 육면체로 가공된 골 단편을 염산을 이용하여 탈회시키는 제 6단계와; 상기 탈회된 골 단편을 에탄올 수용액으로 세척하는 제 7단계와; 상기 세척된 골 단편을 인산염 완충용액으로 중화하는 제 8단계와; 상기 중화시킨 골 단편을 RSC 용액에 침지(浸漬, Steep)시키는 제 9단계 와; 상기 RSC 용액을 처리한 골 단편을 세척한 후 건조하는 제 10단계; 및 상기 건조된 골 단편을 진공동결건조하는 제 11단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스폰지형 골 이식재를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 스폰지형 골 이식재 및 이를 제조하는 방법은 초음파의 공명현상을 공정에 이용함으로써 증가되고 있는 골 이식재의 요구량에 대응하여 고품질의 골 이식재를 필요한 대상자들에게 신속하게 제공할 수 있는 효과가 있다.
또한, 단순하게 동결ㆍ건조시킨 골 이식재가 아닌 보호제를 처리하여 동결ㆍ건조시킴으로써, 동종 또는 이종의 골 이식재가 이식자에게 이식된 후에도 쉽게 분해되거나 불활성화되지 않고 골 형성을 효과적으로 유도할 수 있도록 하는 효과도 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부 도면에 의거하여 상세하게 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 스폰지형 골 이식재를 제조하는 과정을 보여주는 순서도이며, 도 2는 본 발명에 따른 스폰지형 골 이식재를 제조하는 방법에 있어서, 일반 공정과 초음파 공정에 의하여 탈회 처리된 골 조직을 촬영한 도면이다.
먼저, 본 발명의 골이식재의 원료로서 -70℃ 이하의 냉동고에서 냉동보관되는 조직을 해동시킨다. 상기 조직은 사체로부터 채취된 동종골(allogenic bone)이 거나 소, 염소, 말 등의 다른 동물로부터 채취된 이종골(xenogenic bone)일 수 있다.
해동시킨 골 조직은 절단기를 이용하여 블록 형태로 절단한 다음 골 조직의 표면에 존재하는 근막, 연결조직, 힘줄, 인대 등을 포함한 연조직을 1차적으로 제거한다.
이어서, 연조직을 제거한 골 조직을 에탄올 수용액에서 약 30분 동안 처리하여 탈지(defatting), 탈수(dehydration) 및 살균(disinfecting) 하는데, 효과적으로 지질을 제거하고 살균하기 위한 최적의 에탄올 수용액의 농도로는 83%가 바람직하다(S110).
이와 같은 과정에 있어, 종래의 일반 공정은 세척된 골을 적어도 3시간 동안 에탄올의 교환(적어도 1시간마다 총 3회의 에탄올 교환)을 통해 얻어지고 있는 반면, 본 발명에서는 초음파의 공동현상(Cabitation)을 이용하여 약 30분의 최단시간 내에 최적으로 지질제거, 수분제거 및 살균을 수행한다.
상기의 초음파의 공동현상(Cabitation)은 20KHz이상의 주파수를 가진 초음파가 액체 중에 발사되는 경우, 초음파의 진로상의 매질이 부분적으로 가열되어 액체 내에 수천만 개의 미세 기공(microscopic bubble)이 발생되고, 압축에 의해 기공이 터지는 것을 말하며, 이와 같이 기공이 일정크기 이상이 되어 터질 때의 에너지 및 기공 내의 방전으로 인해 골 조직이 세척ㆍ살균되고, 골 조직 표면의 지질이 제거될 수 있다.
에탄올 처리된 골 조직으로부터 잔여 조직을 2차적으로 완벽하게 제거한 후, 에탄올 처리과정과 동일한 방법인 초음파의 공동현상(Cabitation)을 이용하여 3% 과산화수소에서 약 90분 동안 골 조직을 멸균ㆍ산화한다(S120).
초음파를 이용한 과산화수소 처리공정의 경우에도 종래의 일반 공정에서 약 12시간 동안 과산화수소의 교환(적어도 3시간마다 총 4회의 과산화수소 교환)을 행하는 것에 비하여, 약 90분의 최단시간 내에 최적의 멸균 및 산화가 가능하다.
에탄올 수용액 처리공정을 통한 살균과 과산화수소 처리공정을 통한 멸균 및 산화를 통해 골 조직 표면의 항원을 파괴하고, 세균 및 바이러스를 사멸시킴으로써, 동종 또는 이종의 골 이식재가 생체 내에 이식되는 때의 이식거부 등과 같은 면역성을 감소시킬 수 있다.
과산화수소 처리된 골 조직을 정제수로 세척하고 수분을 제거한 후, 미세절단 가공이 가능한 장비를 이용하여 골 단편으로 가공하고, 가공된 골을 사이즈별로 분류한다(S130). 가공되는 골 단편은 육면체(Hexahedron)인 것이 특징이고, 특히, 가로(L), 세로(W), 높이(H)의 길이가 8, 10, 12, 14 또는 16mm인 정육면체(Cubic type)가 바람직하다.
이후, 육면체의 골 단편은 초음파의 공동현상(Cabitation)을 이용하여 0.5N 염산(15ml/g 비율)에서 약 30 내지 90분 동안 탈회시킴으로써, 무기질의 미네랄 성분을 제거한다(S140). 0.5N 염산에 골 분말 또는 골 단편을 침지(浸漬, Steep)하여 약 3시간 동안 탈회하는 종래의 일반 공정에 비하여 단시간 내에 효율적으로 탈회시킬 수 있다.
도 2에서와 같이, 종래의 일반 공정(A, C, E)과 본 발명의 초음파 공동현 상(Cabitation)을 이용한 탈회공정(B, D, F)을 시간 경과에 따른 탈회 정도를 비교해 보면, (A)와 (B)는 골 단편에 염산처리를 시작하고 약 30분이 경과한 사진으로, (A)의 골 표면에 비하여 (B)의 골 표면이 탈회 정도가 큰 것을 확인할 수 있으며, (C)와 (D)는 골 단편에 염산처리를 시작하고 약 60분이 경과한 사진이고, (E)와 (F)는 약 90분이 경과한 사진으로, (C)와 (E)의 경우는 (A)와 비교하여 정도의 차이가 크게 없음에 반하여, (D)와 (F)의 경우는 (B)와 비교하여 30분 내지 60분이라는 단시간 내에 탈회된 정도의 차이가 큰 것을 확인할 수 있다.
또한, 골 단편을 탈회하는 때는 염산의 세기, 분쇄된 골 입자의 형상, 탈회 처리방법 및 탈회 처리시간에 따라 탈회의 정도가 결정될 수 있으며, 예를 들어, 치유속도가 느린 골간부 손실의 재구성, 고정물과 함께 사용하여 관절 및 경추의 고정, 대퇴골 등의 질병 및 노령으로 인한 무유합 골절의 치료 등 탈회골이 사용될 부위 및 분야에 따라 탈회의 정도(표면 탈회, 부분 탈회, 완전 탈회)를 조절할 수 있다.
산 처리후, 탈회 골 단편을 초음파의 공동현상(Cabitation)을 이용하여 83% 에탄올 수용액에서 약 30분 동안 세척한다(S150). 약 1시간 내지 2시간 동안 에탄올 수용액에 침지(浸漬, Steep)하여 세척하던 종래의 일반 공정에 비하여 신속한 세척이 가능하다.
하기의 표 1은 본 발명에 따른 S110, S120, S140 및 S150 단계를 일반공정과 비교한 것이다.
[표 1]

일반 공정
초음파 공동현상을 이용한 공정


83% 에탄올(S110)
약 3시간
(1시간마다 총 3회 용액 교체)
약 30분
(용액의 교체 없음)

3% 과산화수소
(S120)
약 12시간
(3시간마다 총 4회 용액 교체)
약 90분
(용액의 교체 없음)


0.5N 염산(S140)
약 3시간
(1회 용액 교체)
약 30분 내지 90분
(용액의 교체 없음)


83% 에탄올(S150)
약 1시간 내지 2시간
(1회 내지 2회 용액 교체)
약 30분
(용액의 교체 없음)
세척된 탈회 골 단편으로부터 산의 잔여분을 제거하고, 인산염 완충용액(Phosphate buffered saline, pH 7.0)으로 중화하여 pH를 높인다(S160).
이후에, 중화된 탈회 골 단편을 RSC 용액(3ml/g)에 침지(浸漬, Steep)하여 40℃의 항온수조(Water bath)에서 5시간 처리 후, 4℃ 냉장고에서 20시간 처리하여, 탈회골의 골전도성 및 골유도능을 비롯한 골 이식재의 물성ㆍ활성을 유지시키고, 탈회골 내의 BMP단백질, 성장인자, 프로테오글리칸 등의 골형성 유도인자들을 보호하며, 생체 내에 이식된 후 쉽게 분해되거나 불활성화되는 것을 방지할 수 있도록 한다(S170).
상기 RSC 용액은 15 내지 20%의 프로필렌 글리콜(Propylene Glycol), 20 내지 25%의 디메틸 설폭사이드(DMSO, Dimethyl Sulfoxide), 1 내지 5%의 마니톨(Manitol), 1 내지 5%의 테트라할로오스(Tetrahalose) 및 40 내지 60%의 증류수 로 제조될 수 있고, 또는, 15 내지 20%의 글라이신(Glycine), 20 내지 25%의 스타키오스(Stachyose), 1 내지 5%의 마니톨(Manitol), 1 내지 5%의 덱스트란(Dextran) 및 40 내지 60%의 증류수로 제조될 수 있다.
RSC 용액을 처리한 탈회 골 단편은 정제수로 세척하고 수분을 제거한 후, 이후의 공정처리를 위해 진공의 조건에서 동결건조시킨 후 멸균된 바이알에 진공 포장(S180)하고, 알미늄으로 캡핑한 후, 플라스틱 및 박스 포장을 행함이 바람직하다.
도 3은 본 발명의 스폰지형 골 이식재(A)와 일반 골 이식재(B)를 각각 세포배양 한지 2주 후의 골 이식재의 표면을 SEM(Scaning Electron Microscope, ×3,000)으로 촬영한 도면으로서, (B)의 일반 골 이식재를 세포배양 한 경우보다 상대적으로 (A)의 화살표가 지시하고 있는 부분과 같이, 본 발명의 스폰지형 골 이식재를 세포배양 한 경우에는 다양한 단백질과 다당류로 구성되는 고분자 및 무기질의 세포외기질(Extra Cellular Matrix, ECM)이 다수 형성되어 있는 것을 확인할 수 있어, 본 발명의 스폰지형 골 이식재가 일반 골 이식재에 비하여 골전도 및 골유도 능력이 뛰어난 것으로 판단되었다.
도 4는 본 발명의 스폰지형 골 이식재(a)와 일반 골 이식재(b)의 골형성 유전 표지의 mRNA 발현(Expression)을 나타내는 그래프로, 외부로부터 이식된 골 이식재에 의하여 자극을 받아 조골세포의 골화 유도가 일어나게 될 때, DNA 수준에서 골유도 전사인자들(Dlx-5, ALP, Runx-2, Osteocalcin)이 발현되게 되는데, 이와 같은 초기 골유도 전사인자들이 발현되는 정도를 통해 골 이식재의 골전도 및 골유도 능력을 판단할 수 있다.
(A) 내지 (D) 그래프의 가로축은 배양 시간을 의미하며, 세로축은 대조군에 대한 발현배수를 의미하며, 본 발명의 스폰지형 골 이식재(a)의 경우가, Dlx-5와 ALP 골유도 전사인자에 있어서는 약 1.5배, Runx-2와 Osteocalcin 골유도 전사인자에 있어서는 약 2배 정도 일반 골 이식재(b)보다 발현이 잘 일어나는 것을 확인할 수 있어, 단백질 수준의 골화 유도에 있어서도 성장인자들의 발현이 활발한 것으로 확인되었다.
도 5는 가공된 스폰지형 골 이식재의 전자현미경(Electron Microscope,×30)적 구조를 나타내는 도면으로, 상기 도면에서 보여지는 스폰지형 골 이식재의 다공성 내부구조에 의하여 본 발명이 적용되는 신체 부위 구조에 적합한 형태로의 변형이 용이하다는 점 등의 우수한 신축성 및 탄력성을 갖는다.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백하다 할 것이다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 스폰지형 골 이식재를 제조하는 과정을 보여주는 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따른 스폰지형 골 이식재를 제조하는 방법에 있어서, 일반 공정과 초음파 공정에 의하여 탈회 처리된 골 조직을 촬영한 도면이다.
도 3은 본 발명의 스폰지형 골 이식재와 일반 골 이식재를 SEM(Scaning Electron Microscope, ×3,000)으로 촬영한 도면이다.
도 4는 골형성 유전 표지의 mRNA 발현(Expression)을 나타내는 그래프이다.
도 5는 가공된 스폰지형 골 이식재의 전자현미경(Electron Microscope,×30)적 구조를 나타내는 도면이다.

Claims (9)

  1. 채취한 동종 또는 이종의 골 조직을 블록형태로 절단하고 연조직을 제거하는 제 1단계와;
    상기 골 조직을 에탄올 수용액으로 탈지, 탈수 및 살균하는 제 2단계와;
    상기 탈지ㆍ탈수 및 살균된 골 조직에서 잔여조직을 제거하는 제 3단계와;
    상기 골 조직을 과산화수소로 멸균ㆍ산화하는 제 4단계와;
    상기 멸균ㆍ산화된 골 조직을 미세하게 절단하여 골 단편을 육면체로 가공하는 제 5단계와;
    상기 육면체로 가공된 골 단편을 염산을 이용하여 탈회시키는 제 6단계와;
    상기 탈회된 골 단편을 에탄올 수용액으로 세척하는 제 7단계와;
    상기 세척된 골 단편을 인산염 완충용액으로 중화하는 제 8단계와;
    상기 중화시킨 골 단편을 RSC 용액에 침지(浸漬, Steep)시키는 제 9단계와;
    상기 RSC 용액을 처리한 골 단편을 세척한 후 건조하는 제 10단계; 및
    상기 건조된 골 단편을 진공동결건조하는 제 11단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 스폰지형 골 이식재를 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 골 조직을 에탄올 수용액으로 탈지ㆍ탈수ㆍ살균하는 제 2단계 및 상기 탈회된 골 단편을 에탄올 수용액으로 세척하는 제 7단계는,
    83% 에탄올에서 30분 동안 초음파의 공동현상(Cabitation)을 통하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 스폰지형 골이식재를 제조하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 골 조직을 과산화수소로 멸균ㆍ산화하는 제 4단계는,
    3% 과산화수소에서 90분 동안 초음파의 공동현상(Cabitation)을 통하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 스폰지형 골이식재를 제조하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 육면체로 가공된 골 단편을 염산을 이용하여 탈회하는 제 6단계는,
    0.5N 염산에서 30분 내지 90분 동안 초음파의 공동현상(Cabitation)을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 스폰지형 골이식재를 제조하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 중화시킨 골 조직을 RSC 용액에 침지(浸漬, Steep)시키는 제 9단계에서,
    상기 RSC 용액의 조성은, 15 내지 20%의 프로필렌 글리콜(Propylene Glycol), 20 내지 25%의 디메틸 설폭사이드(DMSO, Dimethyl Sulfoxide), 1 내지 5%의 마니톨(Manitol), 1 내지 5%의 테트라할로오스(Tetrahalose) 및 40 내지 60%의 증류수이고,
    골 단편을 상기 조성의 RSC 용액에 침지하여 40℃의 항온수조에서 5시간 처리한 후, 4℃ 냉장고에서 20시간 처리하는 것을 특징으로 하는 스폰지형 골이식재를 제조하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 중화시킨 골 조직을 RSC 용액에 침지(浸漬, Steep)시키는 제 9단계에서,
    상기 RSC 용액의 조성은, 15 내지 20%의 글라이신(Glycine), 20 내지 25%의 스타키오스(Stachyose), 1 내지 5%의 마니톨(Manitol), 1 내지 5%의 덱스트란(Dextran) 및 40 내지 60%의 증류수이고,
    골 단편을 상기 조성의 RSC 용액에 침지하여 40℃의 항온수조에서 5시간 처리한 후, 4℃ 냉장고에서 20시간 처리하는 것을 특징으로 하는 스폰지형 골이식재를 제조하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    멸균된 바이알에 진공동결건조된 스폰지형 골 이식재를 진공 포장하고, 알미늄으로 캡핑한 후, 플라스틱 및 박스 포장하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 스폰지형 골이식재를 제조하는 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
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