KR20210084859A

KR20210084859A - 오골계 유래 탈미네랄화된 골분을 이용한 골이식재 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20210084859A
Application number: KR1020190177320A
Authority: KR
Inventors: 강길선; 송정은; 송철의; 김필윤; 최정민
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2021-07-08

Abstract

본 발명은 오골계 유래 탈미네랄화된 골분(demineralized bone particles ; DBP)을 이용한 골이식재 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 오골계 유래의 DBP와 골유도물질을 함침시켜 제작한 골 재생에 매우 효과적인 골대체재용 지지체 조성물과 이를 이용하여 제작된 골이식재에 관한 것이다. 이러한 본 발명에 따른 골이식재는 다른 가금류인 닭, 오리 유래의 DBP를 이용하여 제작한 골이식재와 비교하여 골 재생 효과가 월등하게 우수하다.

Description

오골계 유래 탈미네랄화된 골분을 이용한 골이식재 및 이의 제조방법{Bone graft using Ogolyge derived demineralized bone particles and a fabrication method thereof}

본 발명은 오골계 유래 탈미네랄화된 골분 (demineralized bone particles ; DBP)을 이용한 골이식재 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 오골계 유래의 DBP와 골유도물질을 함침시켜 제작한 골 재생에 매우 효과적인 골대체재용 지지체 조성물과 이를 이용하여 제작된 골이식재에 관한 것이다.

고령화 및 기대수명의 증가에 따라 관절염 및 골다공증과 같은 골 질환의 발생률이 크게 증가하였다. 소규모의 골 손상시 골 내부에 자가치유가 일어나 원래 기능을 회복하는 재생반응이 일어나지만, 임계범위 이상의 골 결손부가 발생하면 자기재생을 할 수 없어 골이식 등과 같은 치료법이 필요하다.

골의 재생능력을 유도 촉진하여 골 기능을 회복시키는 골이식재로 자가골, 동종골, 이종골, 합성골을 골재료로 사용하고 있으나, 골 채취량 한계, 질환전염의 가능성, 면역 반응, 기증자 수 부족으로 인한 수급 한계, 개체 간 유전적인 이식 항원 문제 등으로 최근에는 조직공학적으로 천연 골 성분과 유사한 생체 모방 생체 재료인 골이식재의 연구가 되고 있다.

DBP는 콜라겐, 프로테오글리칸, 잔류 칼슘과 골형성 단백질 (bone morphogenetic protein; BMP) 등으로 이루어져 있으며, 잔류 칼슘 성분이 뼈의 석회화를 돕고 프로테오글리칸과 콜라겐 성분이 세포 부착을 도와 골전도도를 향상시켜주고 BMP 성분이 조골세포 분화를 유도하여 골 형성을 돕는다. 이러한 특성들로 인해 DBP는 골 재생을 위한 생체 재료로 사용된다(비특허문헌 01). 시중에서 가장 많이 유통되고 있는 DBP 제품은 소 및 돼지 유래 DBP로 이루어져 있으나, 인수공통 감염증으로 인해 안정성이 높은 새로운 소재의 골대체재가 필요한 실정이다.

종래 골이식재에 관한 발명으로서는 본 발명자에 의한 오리발 유래 골이식재(한국등록특허 제10-1902198호)가 제안되어 있고, 소수성 소재 간 상호 작용을 이용한 4-헥실레조르시놀의 이식재 내 투입 기술(한국등록특허 제10-1667245호)이 제안되어 있으며, 스폰지형 골 이식재의 제조기술(한국등록특허 제10-0978562호) 등이 제안되어 있다.

그러나 이러한 기존의 골이식재의 경우 오리 등 가금류를 이용하여 진일보한 경향을 보였으나, 충분한 이식재로서의 효과를 발휘하지 못하여 개선의 여지가 많았다.

한국등록특허 제10-1902198호 한국등록특허 제10-1667245호 한국등록특허 제10-0978562호

HS Sandhu, SN Khan, DY Suh, et al., Demineralized bone matrix, bone morphogenetic proteins, and animal models of spine fusion: an overview, Eur. Spine. J., 10, S122 (2001)

상기와 같이 종래 기술에서 해결하지 못한 문제를 개선하기 위해, 본 발명에서는 새로운 골대체재 소재로 가금류 유래 DBP를 함유하는 지지체 조성물을 제조하고 이로부터 효과가 우수한 골이식재를 개발하는 것을 해결과제로 한다.

따라서 본 발명의 목적은 기존에 골대체재로 적용된 바 없는 오골계 유래 탈미네랄화된 골분(demineralized bone particles ; DBP)을 함유하는 골대체재용 지지체 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 오골계 유래 지지체에 골수간엽줄기세포를 파종하여 제조한 골대체재 조성물로 이루어진 골이식재를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같은 골대체재로서의 골이식재의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오골계 유래 탈미네랄화된 골분(demineralized bone particles ; DBP) 함유하는 골대체재용 지지체 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 탈미네랄화된 골분은 평균입자 크기가 10~100㎛인 것을 함유하는 지지체 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 탈미네랄화된 골분은 전체 지지체 조성물 구성의 0.1-5중량%, 더욱 바람직하게는 1~2%중량으로 함유될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 골대체재용 지지체 조성물에 골유도물질로서 생리활성물질, 골형성 단백질, 세라믹성분 중에 하나 이상, 바람직하게는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite; HAp), 멜라닌 중에서 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 지지체 조성물로 이루어진 골이식재를 포함한다. 이러한 골이식재는 다공질 성형체 형태로서, 예컨대 스폰지형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 골이식재는 골수유래줄기세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 지지체 조성물이나 골이식재는 골 손상 치료용으로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 오골계 유래 탈미네랄화된 골분(DBP)을 제조하는 단계;

(b) 탈미네랄화된 골분을 이용하여 다공성 성형체로 지지체를 제조하는 단계; 및

(c) 상기 지지체에 골유도물질로서 생리활성물질, 골형성 단백질, 세라믹성분 중에 하나이상의 골유도물질을 적용하는 단계

를 포함하는 골이식재의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, (a) 오골계 유래 탈미네랄화된 골분을 제조하는 단계는 오골계의 대퇴부 및 경골을 채취하여 세척하고, 분쇄된 뼈를 decalcifier 용액에 넣어 탈미네랄화 과정을 거쳐, 세척 후 동결건조하고 동결분쇄기로 분쇄하여 평균입자 크기가 10-100 ㎛인 오골계 유래 탈미네랄화 분말을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 지지체를 제조하는 단계와 골유도물질을 적용하는 단계는 예컨대 상기 오골계 유래 탈미네랄화 분말을 펩신이 들어있는 아세트산 용액에 넣고 동결건조하여 다공성 성형체, 바람직하게는 스펀지형 지지체를 구성한 다음, 이를 생체유사용액 (stimulated body fluid; SBF)에 담지시켜 HAp가 코팅된 지지체로 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, (c) 상기 골유도물질을 적용하는 단계에서는 추가로 줄기세포, 바람직하게는 골수유래줄기세포를 함유시킬 수 있다.

본 발명은 새로운 골대체재인 오골계 유래 DBP를 이용하여 제작한 다공성 성형체 형태의 지지체 조성물, 바람직하게는 스펀지형의 지지체를 포함하는 골이식재로서 구성하여 사용하는 경우 골 결손부위에 이식시 골 손상 치료에 탁월한 효과가 있다.

본 발명에 따른 오골계 유래 DBP는 기존의 Urist 제조방법보다 그 제조공정이 간단하며 손쉽게 탈회를 할 수 있다.

여기서, 기존 urist 방법은 탈미네랄화 과정에 0.5M HCl을 사용하여, 뼈 부피의 10배를 사용하고, 5일동안 교체해주면서 계속 교반해서 탈미네랄화시켜 사용하였다(M. R. Urist, Science, 150, 893 (1965)).

그러나 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 Urist 제조방법과 달리 탈회용액을 사용하면 약 2배의 용액만을 사용하여도 탈미네랄화가 이루어지기 때문에 유리하고, 또 용액 교체 주기도 기존에 6번 이상을 사용하였다면 본 발명에서는 3번 정도만 사용하여도 된다. 그뿐만 아니라, 본 발명에서는 탈미네랄화 공정에서 교반을 실시하지 않아도 목적 달성이 가능하므로 이러한 점에서 여러 공정상의 장점이 있다.

또한, 본 발명의 오골계 유래 DBP가 포함된 지지체는 다른 가금류인 오리나 닭 유래 DBP 분말을 함유하는 지지체(예; 스펀지)와 비교하였을 때 세포 증식 및 ALP 활성이 현저하게 증가하는 효과를 보이므로, 월등하게 우수한 골 재생 효과가 있어서 골이식재로 매우 유용한 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에 따라 3종의 가금류(오골계, 오리, 닭) 유래 탈미네랄화된 뼈를 분쇄하여 제조한 각각의 분말 사진이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2의 제조방법에 따라 3종의 가금류 유래 DBP 기반의 스펀지와 HAp가 코팅된 DBP 스펀지를 제작한 사진이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 3종의 가금류 유래 골분의 XRD 결과로 탈회 여부를 확인한 비교 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 3종의 가금류 유래 DBP 및 지지체(스펀지)의 FT-IR 결과로 구성 성분을 확인할 수 있는 비교 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 3종의 가금류 유래 DBP 기반의 지지체(스펀지)의 다공크기와 형태를 확인하기 위해 촬영한 사진과 토끼 골수유래 간엽줄기세포(Bone marrow derived mesenchymal stem cells; rBMSCs)를 파종 후 각각 7, 14, 21일 뒤에 세포 증식을 SEM을 통해 확인한 사진이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 가금류 유래 DBP 기반의 지지체(스펀지)에 파종된 rBMSC를 파종후 각각 7, 14, 21일 뒤에 공초점 레이저 주사 현미경을 통해 확인한 사진이다.
도 7은 본 발명에 따라 제조된 가금류 유래 DBP 기반의 지지체(스펀지)에 파종된 rBMSC의 증식률을 MTT를 이용해 확인한 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 가금류 유래 DBP 기반의 지지체(스펀지)에 파종된 rBMSC의 골분화를 확인하기 위해 ALP 활성 평가를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 구체적으로 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 오골계 유래 탈미네랄화 분말을 함유하는 골대체재로서의 지지체 조성물과, 지지체 및 이를 이용한 골이식재에 관한 것이다.

본 발명에서는 오골계를 이용하므로 이와 유사한 가금류로서 닭과 오리 등을 비교대상으로 제조하고 실험하여 그 결과로 오골계가 현저하게 우수한 효과가 있음을 발명하였다. 그러므로 본 발명에서는 비교를 위하여 가금류 또는 닭과 오리 등에 대한 실험결과를 포함하여 설명한다.

본 발명에서 오골계는 영문으로는 Ogolyge로 표시할 수 있으나, 이는 일반적인 오골계를 포함하는 것으로서, Yeonsan Ogolyge로 통칭하는 Gallus gallus var, domesticus와 silky fowl, silky fowl, 그리고 그 외의 일반적인 오골계뿐만 아니라 오계 등을 모두 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에서는 가금류(닭, 오골계, 오리) 유래 DBP 골분을 이용하여 골대체재를 개발하기 위하여, 가금류 (닭, 오리, 오골계) 유래 DBP와 HAp가 포함되어 있는 것을 제조하여 효과를 비교하였다.

본 발명에서는 물성 비교를 위해, 닭 골분 (Chicken particles, CP), 오리 골분 (Duck particles, DP), 오골계 골분 (Gallus gallus var. domesticus particles, GP)을 탈미네랄화하여 사용하였다. 닭, 오리, 오골계의 탈미네랄화된 골분은 각각 CD-P, DD-P, GD-P로 표시하였다. 이를 이용하여 제조한 닭, 오리, 오골계 유래 스펀지(지지체)는 각각 CD, DD, GD로 표현하였으며, 이들 스펀지의 골전도성과 골부착성을 증가시키기 위해 HAp를 코팅하여, 각각 CD-H, DD-H, GD-H로 표현하였다.

본 발명에서 골대체재용 지지체는 본질적으로는 다공질 성형체로서, 가장 전형적으로는 원통형이나 원형 등의 스펀지 형태의 지지체를 의미하며, 분말형, 입자형, 알갱이형, 그래뉼형을 모두 포함한다. 여기서는 경우에 따라서는 편의상 스펀지로 표기하기도 한다. 여기서 성형체는 반드시 몰드를 이용한 것뿐만이 아니라 분말화나 입자화 과정에서 자연적으로 형성된 것도 포함한다.

본 발명에서 지지체 조성물은 지지체를 이루기 전단계의 조성물을 포함함은 물론 지지체를 이룬 후의 후처리된 형태의 성형체를 이룬 조성물도 포함하며, 그 크기가 작은 분말상, 입상, 그래뉼, 알갱이 형태, 스펀지 형태 및 이를 제조하기 위한 전 단계의 형태 등을 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 지지체 조성물은 다양한 형태의 지지체 자체, 그 지지체를 골유도물질이나 줄기세포 등의 성분으로 후처리한 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에서 오골계는 특히, 바람직하기는 한국 재래 오골계인 연산 오골계가 사용될 수 있으며, 이러한 오골계는 골수에서 적혈구 형성을 효과적으로 촉진하며 항산화와 항염증 역할을 할 뿐만 아니라, 알칼리성 인산분해효소 (Alkalin phoshatase, ALP) 활성 및 뼈 무기질화를 촉진하고 뼈 재흡수를 억제하는 특징을 가지고 있다.

본 발명은 오골계 유래 탈미네랄화된 골분(demineralized bone particles ; DBP) 함유하는 골대체재용 지지체 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 오골계 유래 골대체재용 지지체 조성물은 다공성 성형체로 제공되어 골 손상 및 재생 치료에 효과적이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 탈미네랄화된 골분은 평균입자 크기가 10~100㎛인 것을 함유하는 지지체 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에 따르면, 골대체재용 지지체 조성물에 이러한 탈미네랄화된 골분의 평균입자 크기를 함유하는 경우 골 형성 인자의 방출을 높여, 골 재생 등의 치료효과를 높일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 탈미네랄화된 골분은 전체 지지체 조성물 구성의 0.1-5중량%로 함유될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 전체 조성물에서 DBP의 중량비가 1~2 중량%일 때 가장 이상적이다. 만일, 그 중량비가 0.1% 이하인 경우는 지지체 형상이 이루어지기 힘들고 특히 스펀지의 모양을 유지하기 어려우며, 설령 지지체 형상을 구성하더라도 기계적 강도가 낮아진다. 또한, 5 중량%를 초과하는 경우에는 지지체 제조시에 기공 크기가 작아져, 세포 부착 및 증식이 어려워지는 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 오골계 유래 지지체 조성물은 항산화, 항균작용 등과 같은 생리 활성 물질, 골아세포 분화를 촉진시키고 증식시키는 골형성 단백질 및 골 성분과 유사한 세라믹 재료인 HAp 등과 같은 골유도물질 중에서 하나이상을 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 추가적으로 줄기세포도 적용할 수 있다. 이러한 골유도물질로서 바람직하게는 HAp, 멜라닌 중에서 하나 이상을 바람직하게 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 생리활성물질로서는 예컨대, 폴리페놀 플라보노이드계 실리마린(silymarin), 쿼세틴(quercetin), 헤스페딘(hesperidin), 레스베라트롤(resveratrol), 홍화씨 등 중에서 하나이상이 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 골유도성 성장인자로서는 예컨대, 뼈형성단백질(bone morphogenetic proteins; BMPs), 상피세포증식인자(epidermal growth factor ; EGF), 인슐린 유사성장인자 (insulin-like growth factor; IGF), 섬유아세포성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 혈소판유래 성장인자 (platelet-derived growth factor; FDGF), 전환성장인자(transforming growth factor; TGF) 등의 성분 중에서 하나 이상이 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 세라믹 성분으로서는 예컨대, 하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite; HAp), 인산삼칼슘(tricalciumphosphate; TCP) 등을 포함하는 인산 칼슘(calcium hosphate), 인산 칼슘 또는 이들의 혼합물로 구성될 수 있다.

그러나 이러한 골유도물질은 이에 한정되는 것은 아니며, 이와 유사한 성질을 가지는 것이라면 적용 가능하다.

본 발명의 지지체 조성물은 추가적으로 골수유래줄기세포를 바람직하게 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 지지체 조성물로 이루어진 골이식재를 포함한다. 이러한 골이식재는 다공성 성형체로 이루어진 소재로서, 분말형, 입자형, 그래뉼형, 알갱이 모양, 원통형이나 구형, 타원구형, 다각기둥형 또는 패치형 등으로 이루어지는 스폰지형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기와 같은 지지체 조성물로 지지체를 제조할 수 있다.

이러한 지지체로서는 전형적으로 스폰지형 지지체가 제조될 수 있으며, 이러한 지지체는 골이식재로 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 골이식재는 지지체에 골수유래줄기세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 지지체 조성물이나 지지체 또는 골이식재는 골 손상 치료용으로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기와 같은 골이식재의 제조방법에 대하여 일예를 들어서 설명하면 다음과 같다.

골이식재의 제조를 위하여, 오골계를 준비하고 (a) 오골계 유래 탈미네랄화된 골분(DBP)을 제조하는 단계를 거친다.

이 단계에서는 예컨대, 오골계의 대퇴부 및 경골을 채취하여 세척하고, 분쇄된 뼈를 decalcifier 용액에 넣어 탈미네랄화 과정을 거쳐, 세척 후 동결건조하고 동결분쇄기로 분쇄하여 평균입자 크기가 10-100 ㎛ 인 오골계 유래 탈미네랄화 분말을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 탈미네랄화 과정을 거친 다음에는 예컨대 PBS에 세척하여(pH 7.4), 약 -60℃ 내지 -90℃, 더 좋기로는 -75℃ 내지 85℃에서 동결건조하는 것이 바람직하다.

다음으로, (b) 탈미네랄화된 골분을 이용하여 스펀지형으로 지지체를 제조하는 단계를 거치고, (c) 상기 지지체에 골유도물질로서 생리활성물질, 골형성 단백질, 세라믹성분 중에 하나 이상의 골유도물질을 적용하는 단계를 거친다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 지지체를 제조하고 골유도물질을 적용하는 단계에서는 예컨대 상기 오골계 유래 탈미네랄화 분말의 단백질을 분해하고 분산시키기 위해 펩신이 들어있는 아세트산 용액에 넣고 동결건조하여 스펀지형 지지체를 제조하고, 골과 유사한 조성으로 제조하기 위하여 지지체(스펀지)를 SBF용액에 담지시켜 골유도물질의 적용 환경을 만든 다음, 여기에 세라믹 물질로서 예컨대, HAp가 코팅된 골대체제용 지지체로 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 이와 유사한 방법으로 여기에 생리활성물질이나 골형성단백질, 다른 형태의 세라믹 물질 등을 하나 이상 적용할 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, (c) 상기 골유도물질을 적용하는 단계에서는 추가적으로 줄기세포, 바람직하게는 골수유래줄기세포를 함유시킬 수 있다.

이와 같이 제조된 골대체재용 지지체나 골이식재는 골 손상 치료용으로 바람직하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 가금류의 DBP 제조

가금류로서는 골 형성 효과의 비교를 위해 오골계 이외에도 닭과 오리를 사용하여 각각 3종의 가금류에 대해 하기의 동일한 방법으로 DBP를 제조하였다.

가금류 유래 DBP를 제조하기 위해서, 가금류의 대퇴부 및 경골을 채취하여 원위골단부, 근위골다부, 골막과 골수 및 연조직을 깨끗이 제거한 후, 에탄올로 세척하여 잘게 분쇄하였다. 분쇄된 뼈는 decalcifier solution을 사용하여 탈미네랄화 과정을 거친 후, 인산완충용액 (PBS pH 7.3-7.4, Sigma)으로 세척하여 pH 7.4로 조절하였으며, -80℃에서 동결건조시켰다.

상기 동결건조된 가금류 유래 DBP는 액체질소 내에서 동결분쇄기(6700 SPEX Inc, USA)를 이하여 100 ㎛ 이하의 고운 분말을 얻었다.

그렇게 제조된 3종의 가금류 유래 분말(DBP)은 각각 도 1에 사진으로 예시한 바와 같다.

실시예 2: 가금류 유래 DBP 스펀지의 제조

100ml의 3% 아세트산 수용액에 0.2% (0.2g) 펩신을 녹인 후, 2% DBP를 넣어 DBP 수용액을 제조한 후 48웰 플레이트에 1ml씩 분주 후 48시간 동안 동결건조하여 스펀지 형태의 지지체를 만들었다. 이들 지지체를 2.5% 글루타알데하이드 수용액에 넣어 가교한 다음 동결건조 후 각각 CD, DD, GD스펀지를 제조하였다. 이들 스펀지는 24시간 동안 생체유사용액 (stimulated body fluid ; SBF)에 넣어 HAp로 코팅시킨 후, 동결건조하여 CD-H, DD-H, GD-H 스펀지(지지체)를 제작하였다.

도 2는 실시예 2의 제조방법에 따라 제조한 가금류 각각의 DBP 기반 지지체 사진이다,

실시예 3: rBMSCs의 채취 및 배양

rBMSCs는 흰색 뉴질랜드 토끼 (6 주령, 암컷)의 대퇴부에서 분리하여 사용하였다.

토끼 다리부분의 뼈를 채취한 후, 절단하여 실린지 (18 게이지)를 사용해 골수를 채취하였다. 채취한 골수는 층분리 배양법을 사용하여 배양기에 1×10^-5 cell/mL의 농도로 인큐베이터 (5% CO₂, 37℃)에서 배양 하였으며 20% 우태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS, Gibco, USA) 및 1% 항생제 ( 100 unit/mL 페니실린/스트렙토마이신)이 포함된 α-MEM (alpha modification of eagle’s minimum essential medium, Lonza, USA)를 기본 배양액을 사용하여 배양하였다. 세포들이 배양 플라스크에 부착되면 배양액을 교환한 후, 2일 마다 배양액을 교환하였으며, 80~90% 정도 배양기의 바닥을 채우면 0.25% trypsin/1 mM EDTA를 이용하여 세포를 채취한 후, 지지체에 파종하여 사용하였다.

실험예 1 : 가금류 유래 DBP의 XRD 분석

상기 3종의 가금류 유래 DBP의 탈미네랄화 정도를 측정하기 위해 XRD 분석을 시행하였다.

도 3은 실시예에 따라 제조된 3종의 가금류 유래 DBP의 XRD 분석을 비교하여 나타낸 그래프이다.

실험예 2 : 가금류 유래 골분 및 지지체의 FT-IR 분석

본 평가를 통해 제조 과정시 각 스펀지 물성의 변성여부를 분석하기 위하여 FT-IR 분석을 시행하였다. FT-IR측정 결과 모든 지지체에서 유사한 피크을 보이는 것을 확인하였다. amideⅠ은 1630cm^-1, amideⅡ는 1540cm^-1, NO₃ ^2-는 1450cm^-1, 흡착수분은 3200cm^- ¹부근에서 나타났다. 또한, 지지체의 FT-IR 측정결과, 골분과 유사한 피크을 볼 수 있었으며, HAp가 코팅된 군에서는 P-O에 관계된 인산그룹이 1055m^-1부근에서 나타났다.

도 4는 실시예에서 제조된 3종류의 가금류 골분, 지지체, HAp가 코팅된 지지체의 FT-IR 분석을 비교하여 나타낸 그래프이다.

실험예 3 : 가금류 유래 지지체의 모폴로지 확인

상기 실시예에서 제작된 CD, DD, GD, CD-H, DD-H, 및 GD-H 지지체의 다공 및 다공크기를 확인하기 위해 SEM 관찰을 실시하였다. 각 샘플들은 카본데이프를 이하여 금속판에 고정시키고 아르곤 가스 하에서 2분 동안 프라즈마 스퍼터 (Model SC 500K, Emscope, UK)로 200 두께의 백금 코팅하였다. 이를 주사전자현미경 (Hitachi Co, Model S-2250N, Japan)을 이용하여 측정하였다. 그 결과 각 다공질 지지체의 기공 크기는 30~100μm로 3종의 가금류가 거의 유사한 크기를 보였다.

실험예 4 : 세포의 모폴로지 확인

제작된 스펀지 지지체에 7, 14, 21일간 rBMSC세포를 파종하여 배양하고 2.5% 글루타알데하이드로 세포를 고정한 후, rBMSC의 모폴로지를 확인하였다.

본 평가를 통하여, rBMSC 세포 부착정도와 형태를 관찰한 결과 시간이 증가할수록 모든군에서 세포가 잘 증식한 것을 보였으며, 21일째 다른군에 비해 GD와 GD-H군에서 세포가 방추 형태로 뻗어가 있으며, 많은 세포외기질 (Extracellular matrix, ECM)이 분비되어있는 것을 확인하였다. 특히, GD-H 지지체에서 세포의 부착과 증식이 가장 활발하게 나타내었다. 오골계의 멜라닌 성분은 골아세포 분화를 촉진하여 골세포의 증식 및 분화에 도움된다고 알려져 있으며, 골성분인 HAp 역시 같은 효과를 나타낸다. 따라서 멜라닌 성분과 HAp의 시너지 작용으로 GD-H 지지체가 다른 군에 비해 세포의 부착과 증식이 증가한 것으로 보인다.

도 5는 실시예에 따라 제조된 3종의 가금류 유래 지지체의 기공크기와 모폴로지 및 지지체내에서 세포들의 부착과 증식을 나타내는 SEM 관찰 사진을 비교하여 나타내었다.

실험예 5 : 세포의 생존능력 평가

제작된 지지체에 파종한 세포의 생존능력을 평가하기 위해 Live and dead cell assay를 실시하였다. 골수유래 간엽줄기세포를 7, 14, 21일간 파종한 지지체를 Live and dead cell assay kit로 염색한 후 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 관찰한 결과 GD-H 지지체에서 살아있는 세포의 수가 다른 군에 비해 현저히 많은 것으로 보아 세포의 생존 능력이 가장 우수한 것을 알 수 있었다.

도 6은 실시예에 따라 제조된 가금류 DBP 지지체 내에서 세포들의 생존능력을 나타내는 Confocal 이미지를 비교하여 나타내었다.

실험예 6 : 세포의 증식률 평가

rBMSCs가 파종된 CD, DD, GD, CD-H, DD-H, 및 GD-H 지지체에서 세포증식능력을 분석하기 위해 MTT 분석법을 통하여 관찰하였다. 각 지지체당 1×10⁵ 세포/스펀지의 농도로 rBMSCs를 파종한 후, 1, 7, 14, 21일째 샘플을 획득하여 50mg/mL의 농도의 MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyltetrazoliumbromide) 액을 100 ㎕ 첨가하고, 3시간 동안 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 보라색 결정이 생성되면 디메틸설폭사이드 (DMSO) 용액을 1 mL씩 넣어 결정이 녹을 때까지 피펫팅을 하였다. 용해된 용액을 96 well 플레이트에 200 μL씩 분주하고, 마이크로 플레이트 리더 (Biotek instruments, Inc, USA)를 통하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

본 평가를 통해서, 배양기간이 지남에 따라서 가금류 유래 지지체에서 세포가 점차 증식하였으며, 그 중에서도 GD-H 지지체에서 가장 높은 세포 증식을 나타내었다.

도 7은 실시예에 따라 제조된 3종의 가금류 유래 지지체의 세포증식능력 평가를 비교하여 나타낸 결과이다.

실험예 7 : ALP 활성 평가

실시예에서 제조된 지지체에 rBMSC를 파종한 후 골 분화를 확인하기 위하여 ALP를 측정하였다. ALP분석은 ALP activity Kit (Takara)를 사용하여, 1, 7, 14, 21일째에 시행하였다. 지지체에서 배양액 제거 후, PBS로 1회 세척한 뒤, 5% Extraction solution으로 지지체에서 세포를 추출해 냈다. 이 추출액에 50μL의 nNPP 용액을 넣은 뒤, 37℃에서 1시간 반응시키고, 0.9N NaOH 수용액 50μL를 주입 후, 405nm의 흡광도에서 ALP의 활성 정도를 분석하였다.

본 평가를 통하여, 배양기간에 따라서 점차 ALP의 활성이 증가하였고, 그 중에서 GD-H 지지체에서 ALP 활성이 가장 높게 증가하였다. 이를 통하여, GD-H 지지체에서 rBMSC의 골분화가 가장 활발히 진행됨을 알 수 있었다.

도 8은 실시예에 따라 제조된 3종의 가금류 유래 지지체에 파종된 rBMSC의 ALP 활성 평가를 비교하여 나타낸 결과이다.

상기 실험예들의 결과로부터, 3종의 가금류 중에서도 오골계(GD)의 경우 다른 가금류(닭, 오리)에 비해 월등하게 우수한 골 생성 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

Claims

오골계 유래 탈미네랄화된 골분(demineralized bone particles ; DBP)을 함유하는 골대체재용 지지체 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 탈미네랄화된 골분은 평균입자 크기가 10~100㎛인 것을 함유하는 골대체재용 지지체 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 탈미네랄화된 골분은 전체 지지체 조성물 구성의 0.1-5중량%로 함유하는 골대체재용 지지체 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 골대체재용 지지체 조성물에 골유도물질로서 생리활성물질, 골형성 단백질, 세라믹성분 중에 하나이상을 포함하는 골대체재용 지지체 조성물.
오골계 유래 탈미네랄화된 골분(demineralized bone particles ; DBP)을 함유하는 골대체재용 지지체 조성물로 이루어지되 청구항 2 내지 청구항 4 중에서 어느 하나의 항에 따른 골대체재용 지지체 조성물로 이루어진 골이식재.
청구항 5에 있어서, 다공성 성형체 형태로 이루어진 골이식재.
청구항 5에 있어서, 골수유래줄기세포를 포함하는 골이식재.
(a) 오골계 유래 탈미네랄화된 골분(DBP)을 제조하는 단계;
(b) 탈미네랄화된 골분을 이용하여 다공성 성형체로 지지체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 지지체에 골유도물질로서 생리활성물질, 골형성 단백질, 세라믹성분 중에 하나이상의 골유도물질을 적용하는 단계
를 포함하는 골이식재의 제조방법.
청구항 8에 있어서, (a) 오골계 유래 탈미네랄화된 골분을 제조하는 단계는 오골계의 대퇴부 및 경골을 채취하여 세척하고, 분쇄된 뼈를 decalcifier 용액에 넣어 탈미네랄화 과정을 거쳐, 세척 후 동결건조하고 동결분쇄기로 분쇄하여 평균입자 크기가 10-100 ㎛인 오골계 유래 탈미네랄화 분말을 제조하는 단계를 포함하는 골이식재의 제조방법.
청구항 8에 있어서, (a) 지지체를 제조하는 단계와 (b) 골유도물질을 적용하는 단계는 상기 오골계 유래 탈미네랄화 분말을 펩신이 들어있는 아세트산 용액에 넣고 동결건조하여 스펀지형 지지체를 제조하고, 생체유사용액 (stimulated body fluid; SBF)에 담지시켜 HAp가 코팅된 지지체로 제조하는 단계를 포함하고, (c) 상기 골유도물질을 적용하는 단계에서는 생리활성물질로 골수유래줄기세포를 함유시키는 단계를 포함하는 골이식재의 제조방법.