KR102100961B1 - 유공충 유래의 골 이식재 - Google Patents

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Abstract

유공충 유래의 골 이식재에 관한 것으로, 일 양상에 따른 유공충 유래의 골 이식재에 의하면, 현저한 세포 증식, 세포 부착 및 조골세포 분화능을 갖고, 새롭게 형성된 골을 지지할 수 있는 구조를 포함하고 있어, 골 이식재로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

유공충 유래의 골 이식재{Bone grafts derived from Foraminifera}
유공충 유래의 골 이식재에 관한 것이다.
일반적으로 외상, 기형 혹은 생리학적 현상 등에 의해 뼈조직이 손상된 경우, 그 부위에 골 이식재를 채우고, 차폐막을 덮어셔 연조직의 개입을 막고 신생골을 생성시키는 골유도재생술(guided bon regeneration, GBR)을 시술한다. 이러한 골 결손부의 회복을 위한 가장 보편적인 골유도재생술 방법은 다른 부위의 자신의 골을 일부 채취하여 이식하는 자가 이식방법(autograft), 다른 사람의 뼈를 화학 처리하여 이식하는 동종 이식방법(allograft), 동물의 뼈를 화학 처리하여 이식하는 이종 이식방법(xenograft) 등이 있다.
일반적으로 자신의 골을 일부 채취하여 이식하는 자가 이식방법에 사용되는 자가골 이식재의 경우에는 자가해면골(Autogenous Cancellous　Bone, ACB)을 이식하기 때문에 면역거부반응도 거의 없으며, 뼈 흡수가 거의 없어 골전도 및 골유도 능력이 좋다는 장점이 있고, 동종 이식방법 및 이종 이식방법에 사용되는 동종골 이식재와 이종골 이식재의 경우에는, 이식자 본인이 아닌 다른 사람의 뼈를 이용하는 동종이식(allograft)이나 다른 동물의 뼈를 이용하는 이종이식(xenograft)을 하기 때문에 자가골 이식재의 단점인 이식자(graftee) 본인의 뼈 손실 부위 이외의 부위에 이차적인 수술을 하지 않아도 된다는 장점이 있다.
동종골은, 사체나 생존해 있는 다른 공여자에게 얻는 것으로서 이식재를 동결시키거나 동결건조, 탈회동결건조, 그리고 방사선 조사를 가한 형태로 항원성을 제거하여 사용하게 되며, 골형성에 필요한 기간이 길고 새로 생성되는 골량도 적지만 필요한 양을 아무 때나 사용할 수 있고 부가적 수술부위를 만들지 않는다는 장점이 있다. 이러한 동종골의 종류로는 동결건조골 중 비탈회형태(Demineralized freeze dried　bone　allografts, DFDBA), 탈회형태(Freeze dried　boneallografts, FDBA) 그리고 방사선 조사 해면골 형태(Irradiated cancellous　bone, ICB)가 있다.
이종골은, 소나 돼지 등의 동물에서 골을 채취한 수 여러 과정을 거쳐 면역반응을 떨어뜨려 골전도 능력을 기대하는 이식재이며, 추가적인 수술부위를 만들지 않아도 되는 장점과 원하는 양만큼 충분히 사용할 수 있다는 장점이 있으나 흡수되고 치환되는데 오랜 시간이 걸리는 관계로 골유도 보다는 골전도의 기전으로 이해되는 것이 현재의 흐름이다. 이러한 이종골의 종류로는 Bio-Oss, ABM/P-15 및 BioCeraTM 등이 있다.
합성골은, 실제 뼈가 아니라 인공적으로 합성해서 만든 뼈이기 때문에 다른 뼈이식재에 비해서 가장 질이 떨어지고 골형성에 필요한 기간이 길지만 저렴하다는 장점이 있으며, non-porous hydroxyapatite(HAp), hydroxyapatite cement, porous hydroxyapatite, beta tricalcium phosphate, polymethlymethacrylate(PMMA)와 hydroxyet-hylmethacrylate(HEMA) polymer, 그리고 bioactive glass 등이 임상에서 사용되고 있다. HA 그리고 PMMA와 HEMA polymer는 비흡수성이며, tricalcium phosphate와 bioactive는 흡수성인데, 이러한 합성골의 종류는 제3 인산칼슘, 경조직 개체 중합체 및 생활성 유리질 세라믹 등이 있다. 한편, 하이드록시아파타이트(HAp)는 골 이식 및 치과 장치에서 골 대체물로 널리 사용되어왔다. HAp는 골전도 특성을 가진 생체 적합성 및 생체 활성 물질이며 화학적 조성은 천연 골 조직과 유사하다. HAp는 일종의 인산 칼슘 바이오 세라믹이며, 칼슘 이온과 인산 이온을 함유한 화학 물질을 원료로 사용하여 합성 할 수 있다. 수열 반응을 통한 해양 조류로부터 HAp 세라믹을 제조하는 것에 대한 몇 가지 보고가 있었다.
따라서, 골 이식재로서 사용하기 위해 더 높은 세포 증식, 및 부착능을 갖는 재료의 개발이 필요한 실정이다.
일 양상은 특유의 구조를 가져 현저한 세포 증식, 세포 부착 및 조골세포 분화능을 갖고, 새롭게 형성된 골을 지지할 수 있는 구조를 포함하는 골 이식재를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 골 이식재를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 하이드록시아파타이트를 포함하는 골 이식재로서, 상기 하이드록시아파타이트는 격벽으로 구분된 복수의 챔버를 포함하고, 상기 격벽은 다수의 포어를 포함하는 것인 골 이식재를 제공한다.
상기 하이드록시아파타이트는 유공충(Foraminifera) 유래(예를 들면, 유공충의 외골격 유래)인 것일 수 있다.
상기 유공충은 껍데기가 있는 근족충류의 원생동물을 의미할 수 있다. 상기 유공충의 예는 글로비게리나(Globigerina) 속, 카메리나(Camerina) 속, 엘피디움(Elphidium) 속, 미오깁시나(Myogipsina) 속, 또는 바쿨로깁시나(Baculogypsina) 속을 포함할 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 바쿨로깁시나 속은 Baculogypsina sphaerulata, Baculogypsina bonarellii, Baculogypsina gallowayi, Baculogypsina lenticulate, Baculogypsina meneghinii, Baculogypsina saoneki, 또는 Baculogypsina sphaerica인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "골이식재 (bone graft)"는 골 결손의 보전, 골형성의 자극, 관절 유합, 관절의 제동 및 탈구 방지에 사용될 수 있는 재료로서, 골이식술 (bone grafting)에 사용될 수 있는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 있어서, 골 이식재는 골 결손 치료용인 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 골 이식재는 예를 들어, 사골 (ethmoid), 전두골 (frontal), 비골 (nasal), 후두골 (occipital), 두정골(parietal), 측두골 (temporal), 하악골 (mandible), 상악골 (maxilla), 관골 (zygomatic), 자궁경부의 척추골 (cervical vertebra), 흉부의 척추골 (thoracic vertebra), 요추 척추골 (lumbar vertebra), 천골 (sacrum), 늑골 (rib), 흉골 (sternum), 쇄골 (clavicle), 견갑골 (scapula), 상박골 (humerus), 요골 (radius), 척골 (ulna), 손목뼈 (carpal bones), 중수골 (metacarpal bones), 지골 (phalanges), 장골 (ilium), 좌골 (ischium), 치골 (pubis), 대퇴골 (femur), 경골 (tibia), 비골 (fibula), 슬개골 (patella), 종골 (calcaneus), 족근골 (tarsal) 및 척골 (metatarsal bones)에 적용할 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서, 골 이식재는 치과(치아 임플란트), 성형외과, 또는 정형외과 등에서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "골형성능"은 골아세포 (osteoblast)에 의한 골 기질 형성 및 골재생 (osteoanagensis)을 유도하거나 촉진하는 기능을 의미하며, 연골성 골형성, 결합 조직성 골형성 및 전조식 골형성을 모두 포함하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "골전도능"은 골아세포를 끌어당겨 골아세포의 골 기질 형성을 유도하거나 촉진하는 기능을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "골유도능"은 골 조직 재생에 유용한 세포 및 물질만을 결손부에 접근시켜 원하는 골 조직으로의 재생을 유도하는 기능을 의미한다.
용어, "투여하는," "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 골 이식재는 복수의 하이드록시아파타이트 입자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 입자의 사이즈는 50 내지 4,000 um, 50 내지 3,000 um, 50 내지 2,000 um, 80 내지 2,000 um, 100 내지 4,000 um, 100 내지 2,000 um, 100 내지 1,500 um, 100 내지 1,200 um, 100 내지 1,000 um, 100 내지 700 um 또는 120 내지 600 um인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 챔버의 직경은 5 내지 200 um, 5 내지 180 um, 5 내지 150 um, 5 내지 120 um, 10 내지 100 um, 10 내지 80 um, 10 내지 60 um, 또는 15 내지 60 um 일 수 있다. 상기 챔버의 단면적은 타원형일 수 있으며, 상기 직경은 타원의 짧은 직경 또는 긴 직경 둘 모두를 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 포어의 직경은 0.05 내지 5 um, 0.05 내지 4.5 um, 0.05 내지 4 um, 0.08 내지 3 um, 0.08 내지 2 um, 0.1 내지 3 um, 0.1 내지 2 um, 또는 0.2 내지 2 um일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 격벽의 두께는 1 내지 50 um, 1 내지 45 um, 1 내지 40 um, 2 내지 40 um, 4 내지 40 um, 4 내지 30 um, 5 내지 30 um, 5 내지 20 um, 또는 5 내지 15 um일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트 표면의 1 cm2 당 20,000 내지 100,000 개, 20,000 내지 80,000 개, 25,000 내지 80,000 개, 30,000 내지 80,000 개, 30,000 내지 750,000 개, 30,000 내지 70,000 개, 또는 40,000 내지 60,000 개의 균일한 챔버를 갖는 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트 입자는 마그네슘 이온을 0.5 내지 10 중량%(atomic%), 규소 이온을 0.2 내지 10 중량%(atomic%), 또는 스트론튬 이온을 0.1 내지 5 중량%(atomic%)로 함유하는 것일 수 있다. 본 명세서에서, 중량%는 중량백분율을 나타내고, 전형적으로 총 중량의 중량 백분율로 표현된다
일 구체예에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트는 유공충의 외골격을 수열 반응시켜 제조된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "수열 합성 (hydrothermal synthesis)"은 수열 반응이라고도 하며, 고온의 물 또는 고온, 고압의 물의 존재 하에서 이루어지는 물질의 합성 반응을 의미한다.
본 명세서에 따른 골 이식재에서 하이드록시아파타이트는 전처리된 유공충의 외골격을 적어도 30 ℃, 50 ℃, 80 ℃ 또는 100 ℃이상에서, 예를 들면, 30 내지 600 ℃, 80 내지 600 ℃, 100 내지 600 ℃, 100 내지 500 ℃, 100 내지 400 ℃ 또는 100 내지 300 ℃에서 2 내지 40 시간, 2 내지 30 시간, 10 내지 40 시간, 또는 12 내지 36 시간 동안 수열 반응 시켜 제조된 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 본 명세서에 따른 골 이식재에서 하이드록시아파타이트는 전처리된 유공충의 외골격에 마이크로웨이브를 처리하여 제조된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 골 이식재는 TCP(Tricalcium Phosphate)를 포함하거나, 포함하지 않을 수 있다.
상기 "포함하지 않는"이란, "실질적으로 포함하지 않는"의 의미이며, 여기에서 "실질적으로"란, 골 이식재의 활성에 영향을 미치지 않는 정도의 양으로 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
다른 구체예에 있어서, 상기 골 이식재는 세포 증식능, 세포부착능 또는 조골세포 분화능을 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 이식재는 세포, 예를 들면, 체세포 또는 줄기세포를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "줄기세포"는 다른 세포로의 분화능을 갖는 미분화 세포를 의미할 수 있다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포, 또는 중간엽줄기세포일 수 있다. 상기 중간엽줄기세포는 다양한 조직, 다양한 인종, 또는 다양한 나이의 인간으로부터 분리된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 중간엽줄기세포는 지방 조직 유래, 태반 유래, 제대혈 유래, 근육 조직 유래, 각막 조직 유래, 또는 골수 조직 유래의 중간엽줄기세포일 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 중간엽줄기세포는 지방줄기세포, 골수줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 태반줄기세포, 또는 제대혈줄기세포인 것일 수 있다.
본 명세서의 골 이식재는 결합제 (binding agent)를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서 결합제는 상기 하이드록시아파타이트를 물리적으로 고정, 결합 또는 응집시킴으로써, 골 이식재를 골 결손부에 적용시 골이식재가 골 결손부에서 곧바로 이탈하지 않게 할 수 있는 재료를 의미할 수 있다. 결합제의 예로는, 덴탈 레진 시멘트 (dental resin cement); 글라스 이오노머 시멘트(glass ionomer cement); 콜라겐 접착제 (collagen based glues); 인산 아연 (zinc phosphate), 인산 마그네슘 (magnesium phosphate)과 같은 인산 시멘트 (phosphate-based cements); 카르복실 아연 (zinc carboxylate); 피브린 글루 (fibrin glues), 접착 단백질 (mussel-derived adhesive proteins)과 같은 단백질 결합제 (protein-based binders);와 같은 공지된 생체 적합성 물질을 포함할 수 있다.
본 명세서의 골이식재는 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 골 결손부의 감염을 방지하거나, 골이식재의 골형성능, 골전도능 또는 골유도능을 보다 향상시키기 위해 첨가되는 의학적으로 허용되는 추가 성분일 수 있다. 첨가제의 예로는, 항바이러스제, 항균제, 항생제, 항암제, 혈관생성제(angiogenic drugs)와 같은 약물; 다당류 수용액; 아미노산; 펩타이드; 비타민; 단백질 합성에 대한 보조 인자; 소마토트로핀 (somatotropin)과 같은 성장 호르몬 호르몬; 내분비 조직 단편; 콜라게나제 (collagenase), 펩티다제 (peptidases), 옥시다제 (oxidases)와 같은 효소; 연골 단편 (cartilage fragments), 연골세포(chondrocytes), 골수 세포(bone marrow cells)와 같은 살아있는 세포; 면역억제제; 지방산 에스테르; 및 핵산;을 포함하지만, 이에 한정되지는 않으며, 당업자는 골 결손 부위 및 적용 대상의 상태에 따라 적합한 첨가제를 1종 이상 선택할 수 있다.
본 명세서의 골 이식재는 통상의 방법에 따라 산제, 현탁액, 에멀전, 연고제 또는 주사제의 형태로 제형화되어 골 결손 부위 또는 주변 부위에 적용될 수 있다. 본 명세서에 있어서 "투여량"은 이를 필요로 하는 대상 부위에 적용됨으로써 골 형성 또는 재생을 유도하거나, 촉진하기에 충분한 양을 의미한다. 본 발명에 따른 골 이식재의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태 및 골 결손 정도에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
또한, 본 명세서는 상기 골 이식재 제조용 조성물을 제공한다.
본 명세서에 따른 골 이식재 제조용 조성물은 물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 칼슘카보네이트, 덱스트린, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상을 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 상기 골 이식재를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법은, 유공충을 전처리 하는 단계; 상기 전처리된 외골격을 120 내지 400 ℃에서 2 내지 40 시간 동안 수열 반응시켜 하이드록시아파이트를 제조하는 단계/또는 상기 전처리된 외골격에 마이크로웨이브를 처리하여 하이드록시아파타이트를 제조하는 단계; 및/또는 상기 하이드록시아파타이트를 소결하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 전처리하는 단계는 유공충을 세척하는 단계; 및/또는 상기 세척된 유공충을 인산을 제공할 수 있는 화합물을 함유하는 수용액에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 인산을 제공할 수 있는 화합물의 예는 (NH4)H2PO4, H3PO4, Na3PO4, 또는 Na2HPO4 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 수열 반응시켜 하이드록시아파타이트를 제조하는 단계는 적어도 30 ℃, 50 ℃, 80 ℃ 또는 100 ℃이상에서, 예를 들면, 30 내지 600 ℃, 80 내지 600 ℃, 100 내지 600 ℃, 100 내지 500 ℃, 100 내지 400 ℃ 또는 100 내지 300 ℃에서 2 내지 40 시간, 2 내지 30 시간, 10 내지 40 시간, 또는 12 내지 36 시간 동안 수열 반응시키는 것을 포함할 수 있다.
또한, 상기 마이크로웨이브를 처리하여 하이드록시아파타이트를 제조하는 단계는 300 MHz 내지 300 GHz 파장의 범위의 마이크로웨이브를 100 내지 1500 W의 양으로 0.5 분 내지 48시간 동안 처리하는 것을 포함할 수 있다.
또한, 상기 소결하는 단계는 제조된 하이드록시아파타이트를 200 내지 1500 ℃로 승온시키는 단계; 및/또는 냉각시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 승온은 적어도 복수 회 이상 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 승온시키는 단계는 1 내지 20 ℃/min의 속도로 400 내지 800 ℃까지 승온 후, 일정 시간(예를 들면, 1 시간 내지 8시간) 유지 후, 다시 1 내지 20 ℃/min의 속도로 600 내지 1500 ℃까지 승온시키는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 냉각은 적어도 상온까지 진행되는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 유공충 유래의 골 이식재에 의하면, 현저한 세포 증식, 세포 부착 및 조골세포 분화능을 갖고, 새롭게 형성된 골을 지지할 수 있는 구조를 포함하고 있어, 골 이식재로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트 입자의 구조를 나타낸 주사전자현미경 이미지이다; a: 1,000 X, 10,000 X, b: 100 X, 1,000 X, 3,000 X.
도 2는 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트 입자의 챔버 및 포어의 크기를 측정한 주사전자현미경 이미지이다.
도 3은 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트 입자의 XRD 회절 분석 결과를 대조군 HAp와 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트의 세포 독성 측정 결과를 나타낸 이미지이다.
도 5는 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트의 세포 증식 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트의 세포접착 및 침윤 결과를 나타낸 주사전자현미경 이미지이다.
도 7은 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트의 ALP 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트의 조골세포 마커 유전자 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 9는 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트의 생체 내 이식 8주째의 마이크로-CT 결과를 나타낸 도면 (a) 및 이를 정량화하여 나타낸 그래프(b)이다.
도 10은 일 구체예에 따른 하이드록사아파타이트의 생체 내 골 재생 효과를 나타낸 H&E 염색 결과이다.
도 11은 일 구체예에 따른 하이드록사아파타이트의 생체 내 골 재생 효과를 나타낸 Goldner's Masson trichrome 염색 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참조예 1. 세포배양
인간 중간엽줄기세포(hMSC)를 사용하여 유공충 유래-HAp의 생체적합성을 평가하였다. 구체적으로, 세포를 5% CO2 및 37 ℃ 조건하에서 10% 소 태아 혈청(FBS; Gibco-BRL)을 함유하는 α-MEM(Gibco-BRL, MD, Gaithersburg, MD)에서 배양하고, 4 ~ 6단계의 계대 배양한 hMSC를 사용하여 in vitro 실험을 수행하였다.
조골세포분화를 유도하기 위해, 골형성 자극제(0.1mM의 dexamethasone, 0.1M의 β-glycerophosphate 및 50μg/mL의 ascorbic acid)가 첨가된 배지에서 세포를 배양하였다. 골형성 자극제가 함유된 배지에 사용한 모든 화합물은 세포배양등급의 시약(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하였다. 정상 성장 배지 및 골형성 자극제 함유 배지는 실험 동안 2 일마다 교체하여 사용하였다.
세포배양 실험 전, HAp 입자를 먼저 70% 알코올로 30분동안 멸균하고, 인산완충용액(PBS)으로 10분간 3회 세척하였다. 멸균 후, 20 mg의 멸균된 순수한 HAp 및 유공충 유래-HAp 입자를 48-well 배양 플레이트에 넣었다. 세포(5 x 104 cell/well 농도)를 시딩(seeding)하고 2시간 동안 배양(incubation)하여 초기세포가 각 HAP 입자에 부착되게끔 하였다. 상기의 세포 부착된 HAp 입자를 새로운 배양 플레이트 well로 옮긴 후, in vitro 실험을 위해 배양하였다.
참조예 2. 세포증식
세포증식은 CellTiter96® Aqueous One solution (MTS assay, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용한 미토콘드리아 활성 기반 분석으로 평가하였다. 전술 한 바와 같이, hMSC를 1, 3, 6, 9 및 12일 동안 시딩(seeding)하고 배양하였다. 미리 결정된 시점에서, 50μL의 CellTiter96® 시약 용액을 250μL의 정상배지와 혼합한 후, 각 well에 첨가하였다. 세포배양 4 시간 후, 상청액을 수집하여 ELISA plate reader(SpectraMAX M3; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
참조예 3. 세포 생존력 및 세포 독성
세포 생존력 및 세포 독성은 Live/Dead® 및 Viability/Cytotoxicity 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용한 형광염색법에 의해 평가되었다. 제조 프로토콜에 따라, 세포 배양된 HAp입자를 PBS완충제로 30분동안 세척하였다. 이어서, 키트의 calcein acetoxymethyl ester(Calcein AM) 및 ethidium homodimer-1(EthD-1)을 사용하여 세포를 염색한 후, 역 형광현미경(DM IL LED Fluo; Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 관찰하였다.
참조예 4. 세포부착 및 세포침윤의 in vitro 평가
표면상의 세포부착 및 각각의 HAP입자로의 세포침윤을 관찰하기 위해, 세포를 5일간 배양하였다. 샘플을 PBS완충액으로 세척하고, 2.5% glutaraldehyde 용액에 4℃에서 2시간 고정시킨 후, 0.1% osmium tetroxide 용액으로 후-고정(post-fixed)시켰다. 이어서, 샘플을 graded ethanol series(30, 50, 75, 85, 95, 100%, 각 10 분)에서 탈수(dehydration)시켰다. 이어서, 금으로 스퍼터- 코팅(sputter-coated)한 후, EM(EM-30)으로 관찰하였다. 세포침윤을 관찰하기 위해, HAp 입자를 날카로운 랜싯(lancet)으로 슬라이스하여 단면을 노출시킨 후 SEM 분석을 수행하였다.
참조예 5. ALP(Alkaline Phosphatase) 활성 측정
조골세포분화는 ALP(alkaline phosphatase) 활성 분석으로 평가하였다. ALP 활성 분석은 p-nitrophenylphosphate(p-NPP)를 기질로 사용하여 수행하였다. 상세하게는, hMSC를 입자상에 시딩(seeding)한 후 골형성 자극제 함유 배지에서 배양하였다. 세포배양 5일 후, 접착성 세포를 아이스박스 조건에서 10분간 1% Triton X-100/PBS 용액에 초음파 처리(sonication)하여 용해시켰다. 입자 및 잔해물을 제거하기 위해, 샘플을 4℃에서 12,000 rpm으로 원심분리 하였다. 상청액을 ALP 활성 분석 및 단백질 농도 분석에 사용하였다. 본 연구에서 ALP 활성은 총 단백질 함량으로 정규화(normalized)되었다.
참조예 6. 실시간 중합효소 연쇄반응
HAp 입자상에서 배양된 hMSC의 조골세포분화를 측정하기 위해, ALP, collagen type Iα1(Col1αI), osteocalcin(OCN) 및 bone sialoprotein(BSP)과 같은 몇몇 골형성 마커 유전자를 정량적 실시간중합효소연쇄반응(RPCR)을 사용하여 측정하였다. 골형성 자극제 함유 배지에서 7일간 배양 후 총 mRNA를 세포에서 단리하고, cDNA를 역전사효소(Invitrogen) 및 올리고(dT)프라이머로 전사하였다. cDNA는 TaqMan Universal PCR Master mix(Applied Biosystem)와 ALP(Hs01029144_m1), Col1αI(Hs00164004_m1), OCN(Hs01587814_g1), BSP(Hs00173720_m1), 18S(Hsscience)에 대한 primers and TaqMan probe sets으로 증폭시켰다. 모든 TaqMan PCR은 StepOne Plus RPCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 통해 수행하였고, 18S rRNA 유전자를 내부표준으로서 공동 증폭시켰다.
참조예 7. 동물 모델
근육 내 용량의 ketamine(35 mg/kg; 유한양행, 서울) 및 xylazine(5 mg/kg; 바이엘 코리아, 서울)을 사용하여 성인수컷(연령> 3 개월 이상) 뉴질랜드 흰 토끼(2.5-3.0 kg) 4 마리를 마취시켰다. 그리고 2% lidocaine 용액을 사용하여 국소마취를 시행하였다. 조직 절제 후, 외경이 6mm 인 트레핀(trephine)을 사용하여 분리된 3개의 원형의 두개골 결함을 만들었다. 하나의 결함은 대조군으로 사용되었고, 또 하나의 결함은 순수한 HAp 입자로 채웠고, 세번째 결함은 유공충 유래-HAp 입자로 채웠다. 이식 후 8주에 치유과정을 관찰하였고, 결함을 주변의 골과 함께 숙주의 골로부터 절개하였다. 그리고 추가분석하기 전, 표본(specimens)을 제거하고 4℃에서 7일간 고정액(phosphate buffered 4% paraformaldehyde solution, pH 7.2)에 두었다.
참조예 8. Micro-CT 골 분석
새로 형성된 골은 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(Micro-CT)(Sky-Scan 1172TM, Skyscan, Kontich, Belgium)에 의해 병리학적으로 평가되었다. 이식 후 8주째에, 샘플을 0.5-mm 알루미늄 필터를 사용하여 60kV의 전압 및 167μA의 전류조건으로 셋팅된 X-선을 이용하여 분석하였다. Micro-CT 결과를 바탕으로, 3D 소프트웨어(CTVol, Skyscan) 기반의 3D 재구성 이미지로 결함의 정성적 이미지를 관찰하고, 이미지 분석 소프트웨어(CT-analyzer TM, Skyscan)를 사용하여 골 부피의 비율(bone volume, BV)을 다음과 같이 계산하였다.
BV (%) = (신생 골 부피)-(잔여 이식재의 부피) / 총 결함 부피
참조예 9. 조직학적 분석
이식 후 8 주째에 조직학적 분석을 수행하였다. 쥐(rat) 두개골의 고정된 시편을 8% formic acid/8% HCl로 석회질을 제거한 후, graded alcohol series (70-100 %)로 탈수시켰다. 마지막으로 시편을 파라핀에 넣었다. rotary microtone (HM 325?; Microm, Walldorf, Germany)을 사용하여 5μm 구획으로 절단하였다. 각 샘플의 중앙부분으로부터 5개의 구획을 hematoxylin-eosin(HE) 및 Goldner's masson trichromand(MT)로 염색하였다. 그리고 샘플을 무작위 선택하여 현미경으로 새로운 골 형성을 관찰하였다(DMR, Leica, Nussloch, Germany).
참조예 10. 통계 분석
수치는 평균 ± 표준편차(SD)로 표현되고, 통계적 분석은 일원분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA)으로 수행한 후 GraphPad Prism version 5.3(GraphPad Software, SanDiego, CA, USA)을 사용한 Dunnett's post-hoc test를 이용하여 수행하였다; P <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
실시예. 하이드록시아파타이트 입자의 제조 및 분석
1. 유공충을 이용한 하이드록시아파타이트(HAp) 입자 제조
유공충을 이용한 하이드록시아파타이트는 하기와 같이 제조하였다.
먼저, 유공충(Baculogypsina sphaerulata, Okinawa, Japan)은 시장에서 구입하였다. 잔류 오염 물질 및 유기 성분을 제거하기 위해, 샘플을 4 % 과염소산나트륨(NaClO4)으로 끓인 후 증류수로 세척하였다. 상세하게는, 샘플을 제1인산암모늄((NH4)H2PO4)수용액에 첨가한 후, Ca:P의 몰비가 10:6이 되도록 하였다.
이어서 샘플을 테플론-라인드(Teflon-lined) 스테인레스 압력 용기에 넣고, 200℃에서 24시간 동안 가열하였다. 변환된 샘플을 끓인 물로 세척하고 60℃에서 건조시켰다. 이어서 HAp 입자를 랜싯(lancet)으로 잘게 자른 후, 스테인레스 체를 사용하여 ~ 200-500μm 범위의 입자를 분리하였다. 이후에 상기 입자에 대해 소결 공정을 수행하여 결정화를 진행하였다. 소결(sintering)은 전기로(Muffle Furnace, SH-FU-4MH) 내에서 수행하였고, 5 ℃/min의 승온 속도로 600 ℃까지 올린 후, 600 ℃에서 2시간 동안 유지하였다. 이후에, 다시 5 ℃/min의 승온 속도로 800 ℃까지 올린 후, 800 ℃에서 4시간 동안 유지하였다. 이후에, 상온까지 온도를 낮추어 소결 과정을 진행하였다.
대조군으로는 화학양론적으로 합성한 HAp 입자(순수한 HAp, 200-500μm 범위의 입자크기)을 디오임플란트사(Dio Implant Inc. 부산, 한국)로부터 입수하여 사용하였다.
2. 화학적 및 형태학적 특성
상기 실시예 1.에서 제조된 유공충 유래-HAp 조성을 분석하기 위해, CuKα 방사선을 이용한 X-선 회절 분석(XRD; D8, Bruker AXS, Karlsruhe, Germany)을 수행하였고, 스캔속도 0.02°/분 (2
Figure 112019089726017-pat00001
), 50 kV, 10-80°범위의 30mÅ의 조건으로 분석하였다. 샘플의 이온 조성은 X-선 형광분광법(XRF, Bruker)으로 평가하였다. 유공충 유래-HAp 입자의 마이크로 구조 및 표면형태는 주사전자현미경(SEM; EM-30, COXEM, 대전, 한국)을 사용하여 진공하에서 관찰되었다.
상기 주사전자현미경 이미지는 도 1 및 도 2에 나타내었고, 상기 XRD 회절분석 결과는 도 3에 나타내었고, 샘플의 이온 조성은 하기 표 1에 나타내었다.
원소 함량(%)
Mg 2.98 %
Si 1.53~2.5 %
Sr 0.52~1.11 %
도 1은 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트 입자의 구조를 나타낸 주사전자현미경 이미지이다.
도 2는 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트 입자의 챔버 및 포어의 크기를 측정한 주사전자현미경 이미지이다.
도 3은 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트 입자의 XRD 회절 분석 결과를 대조군 HAp와 비교한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 순수한 HAp 입자의 SEM 이미지는 빽빽하게 압축된 HAp 블록과 비-마이크론 크기의 다공성이 대부분인 표면형태를 보여주었다. 반면에, 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트는 포어를 갖는 격벽으로 구분된 복수의 챔버를 갖고 있으며, 내부가 상호 연결된 다수의 챔버로 나뉘어진 매크로(macro) 크기의 포어 구조를 갖는다. 또한, 입자의 표면에 포어가 균일하게 분포되어 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 유의한 형태학적 변화는 없었으며, 이러한 형태학적 특성은 HAp로의 전환이 이루어질 동안 유지되었다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 1cm2 당 약 53,300 개 정도의 균일한 챔버Ch 수를 가지며, 그 크기는 약 50 um * 25 um이었다. 또한, 격벽의 포어의 크기는 ~ 2 um 이었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 수열 반응 후의 피크 패턴이 일 구체예에 다른 하이드록시아파타이트와 상업적으로 구매가능한 순수한 HAp가 일치함을 알 수 있었다. 이는 유공충이 수열 반응에 의해 HAp로 성공적으로 변형되었음을 의미한다.
실험예 1. 세포 독성 측정
유공충 유래-HAp 입자의 세포독성을 평가하기 위해, 상기 참조예에 기재된 바와 같이, live/dead 염색 분석을 시행하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트의 세포 독성 측정 결과를 나타낸 이미지이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 생존한 hMSC는 녹색으로 염색되었는데, 입자 상에 존재하는 대부분의 세포가 녹색으로 염색되었으며, 적색으로 염색된 사멸세포는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 유공충 유래-HAp 입자가 세포독성을 나타내지 않음을 의미한다.
실험예 2. 세포증식 평가
상기 참조예에 기재된 바와 같이, MTS 미토콘드리아 활성기반 분석(mitochondrial activity based assay)을 사용하여 유공충 유래-HAp에서의 hMSC의 세포증식을 측정하였다. 상기 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5는 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트의 세포 증식 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, hMSCs 세포가 순수한 HAp 및 유공충 유래-HAp의 양쪽 모두에서 시간이 지남에 따라 잘 자라는 것을 보여 주었다. 특히 배양 1일 후, 유공충 유래-HAp에서 배양된 세포광학밀도 수치(0.25 ±0.10)는 순수한 HAp에서의 광학밀도 수치(0.07 ± 0.01)보다 현저하게 높았다. 이러한 결과는 유공충 유래-HAp가 순수한 HAp보다 초기 세포 접착에 더 유리할 수 있음을 의미한다. 또한, 유공충 유래-HAp 입자에 대한 hMSC의 광학 밀도는 모든 실험 시점에서 순수한 HAp의 광학 밀도보다 현저하게 높았다.
실험예 3. 세포접착 및 세포침윤 관찰
상기 참조예에 기재된 방법을 사용하여 순수한 HAp 입자 및 유공충 유래-HAp 입자에 대한 hMSC의 세포 부착 및 침윤은 세포배양 5일째에 SEM으로 관찰하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트의 세포접착 및 침윤 결과를 나타낸 주사전자현미경 이미지이다.
도 6에 나타내 바와 같이, hMSC가 순수한 HAp의 표면에서만 드물게 부착되고 성장함을 보여준다. 이에 반해, 유공충 유래-HAp의 표면에는 순수한 HAp보다 다수의 세포가 부착되었다. 또한, 침윤 및 부착된 hMSC가 유공충 유래-HAp의 챔버 내에서도 관찰되었다. 이러한 결과는 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트의 입자 구조가 세포의 접착에 유리한 환경을 제공함을 의미한다.
실험예 4. 조골세포분화능 분석
조골세포분화능을 분석하기 위해 상기 참조예에 기재된 바와 같이 ALP 활성 및 qRT-PCR을 수행하여 ALP, ColIa1, OCN 및 BSP와 같은 조골세포 마커 유전자를 검출하였다. 상기 결과는 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 7은 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트의 ALP 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트의 조골세포 마커 유전자 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 골 형성 자극제 함유 배지에서 세포가 배양될 때, ALP 활성은 유공충 유래-HAp 입자상에서 19.59 ± 3.06 nmol/mg의 단백질로 측정되었고, 이는 순수한 HAp상에서 배양된 세포(5.69 ± 0.68 nmol/mg의 단백질) 보다 대략 3.4 배 더 높은 수치임을 알 수 있었다.
또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 유공충 유래-HAp 입자상의 ALP, ColIa1, OCN 및 BSP의 mRNA 발현 수준은 순수한 HAp 입자 대비 각각 약 6.6배, 10.5배, 2.6배, 16.5배 더 높았다.
이러한 결과는 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트가 순수한 하이드록시아파타이트에 비해 현저한 조골세포 분화능을 가짐을 의미한다.
실험예 5. 생체 내 골 재생능 분석
상기 실시예에서 제조한 유공충 유래-HAp의 생체 내 골 재생능을 분석하기 위해 Micro-CT 평가, 및 조직학적 평가를 수행하였다.
구체적으로, 상기 참조예에 기재된 바와 같이, 이식 후 8주째에 3차원 Micro-CT 이미지를 획득하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었고, 이식 후 8주째에 골 결손 부위에 대해 H&E 염색 및 Goldner's Masson trichrome 염색을 수행하여, 그 결과를 각각 도 10 및 11에 나타내었다.
도 9는 일 구체예에 따른 하이드록시아파타이트의 생체 내 이식 8주째의 마이크로-CT 결과를 나타낸 도면 (a) 및 이를 정량화하여 나타낸 그래프(b)이다.
도 10은 일 구체예에 따른 하이드록사아파타이트의 생체 내 골 재생 효과를 나타낸 H&E 염색 결과이다.
도 11은 일 구체예에 따른 하이드록사아파타이트의 생체 내 골 재생 효과를 나타낸 Goldner's Masson trichrome 염색 결과이다.
도 9a에 나타낸 바와 같이, 대조군 그룹(empty group, 이식하지 않은)에서 결손 부위 가장자리에 새로운 골이 재생함을 보여주었다. 그러나, 순수한 HAp 및 유공충 유래-HAp를 이식한 그룹에서의 새로운 골 재생은, 결함의 가장자리 부위뿐 아니라 이식된 HAp의 입자내부에서도 관찰되었다. 특히, 유공충 유래-HAp 이식 군에서 새로 형성된 골은 유공충 결함 부위의 표면을 덮었다. 또한, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 유공충 유래-HAp (31.54 ± 3.61 %)의 골 부피 백분율은 대조군 그룹(empty group)(8.43 ± 0.52 %) 및 순수한 HAp (21.18 ± 2.61 %)의 골 부피 보다 현저하게 높았다.
또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군(empty, 이식하지 않은) 그룹, 순수한 HAp 이식한 그룹, 유공충 유래-HAp 이식한 그룹 모두에 결함 부위의 가장자리에서 새로운 골의 형성이 관찰되었으며, 이식된 모든 그룹에서 새로이 형성된 골과 결함이 합쳐지는 경향을 나타내었다. 특히, 순수한 HAp 및 유공충 유래-HAp가 이식된 그룹에서, 새로운 골은 가장자리 결함 부위에서 형성됨이 관찰되었고, 또한 HAp 입자의 바깥 표면 위로 새로운 골이 발생하면서 골수의 공동과 유사한 형태(bone marrow cavity-like morphology)로 관찰되었다. 성숙된 새로운 골은 유공충 이식 그룹에서 상당히 두꺼움을 알 수 있었다.
또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 순수한 HAp 및 유공충 유래-HAp가 이식된 그룹에서는 주변 부위뿐만 아니라 중앙영역에서도 새로 형성된 골이 관찰되었다. 반면에, 대조군 그룹(empty group, 이식하지 않은)의 중앙영역에서는 느슨한 결합조직만이 나타났다. 또한 다른 그룹과 비교하였을 때, 유공충 유래-HAp 이식그룹에서 성숙한 골이 다량으로 유의하게 형성되었음을 알 수 있었다. 또한, 유공충 유래-HAp를 이식한 그룹에서만 다공성 챔버 내에 내증식(ingrowth)하는 조직과 유사하게 새로운 골이 형성됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 유공충 유래-HAp 입자가 새로운 골의 형성을 자극할 뿐만 아니라 그들의 챔버 구조 내에서 새롭게 형성된 골의 침윤을 지지(support)함을 나타낸다.

Claims (10)

  1. 하이드록시아파타이트를 포함하는 골 이식재로서, 상기 하이드록시아파타이트는 격벽으로 구분된 복수의 챔버를 포함하고, 상기 격벽은 다수의 포어를 포함하며,
    상기 하이드록시아파타이트는 복수의 입자를 포함하고, 상기 입자의 사이즈는 200 내지 500um이며,
    상기 하이드록시아파타이트 입자는 마그네슘 이온을 0.5 내지 10 중량%, 규소 이온을 0.2 내지 10 중량%, 또는 스트론튬 이온을 0.1 내지 5 중량%로 함유하고,
    하이드록시아파타이트 표면의 1 cm2 당 40,000 내지 60,000 개의 균일한 챔버를 갖는 것인 골 이식재.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트는 유공충(Foraminifera) 유래인 것인 골 이식재.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 유공충은 Baculogypsina sphaerulata, Baculogypsina bonarellii, Baculogypsina gallowayi, Baculogypsina lenticulate, Baculogypsina meneghinii, Baculogypsina saoneki, 또는 Baculogypsina sphaerica인 것인 골 이식재.
  4. 삭제
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 챔버의 직경은 10 내지 80 um인 것이 거나, 상기 격벽의 두께는 5 내지 15 um인 것이 거나, 상기 포어는 0.1 내지 3 um인 것인 골 이식재.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트는 전처리된 유공충의 외골격을 30 내지 600 ℃에서 2 내지 40 시간 동안 수열 반응 시켜 제조된 것이 거나, 300 MHz 내지 300 GHz 파장의 범위의 마이크로웨이브를 100 내지 1500 W의 양으로 0.5 분 내지 48시간 동안 처리하여 제조하는 공정; 및 소결 공정을 거쳐 제조된 것이며,
    상기 소결 공정은 상기 하이드록시아파타이트를 1 내지 20 ℃/min의 속도로 400 내지 800 ℃까지 승온 후, 1 시간 내지 8시간 유지 후, 다시 1 내지 20 ℃/min의 속도로 600 내지 1500 ℃까지 승온시키는 단계; 및 상온으로 냉각시키는 단계를 1회 이상 반복하는 것인 골 이식재.
  9. 청구항 1에 있어서, 골 결손 치료를 위한 것인 골 이식재.
  10. 유공충을 전처리 하는 단계;
    상기 전처리된 외골격을 30 내지 600 ℃에서 2 내지 40 시간 동안 수열 반응시키거나, 300 MHz 내지 300 GHz 파장의 범위의 마이크로웨이브를 100 내지 1500 W의 양으로 0.5 분 내지 48시간 동안 처리하여 하이드록시아파이트를 제조하는 단계; 및
    상기 하이드록시아파타이트를 소결하는 단계를 포함하며,
    상기 소결하는 단계는 상기 하이드록시아파타이트를 1 내지 20 ℃/min의 속도로 400 내지 800 ℃까지 승온 후, 1 시간 내지 8시간 유지 후, 다시 1 내지 20 ℃/min의 속도로 600 내지 1500 ℃까지 승온시키는 단계; 및 상온으로 냉각시키는 단계를 1회 이상 반복하는 것인 청구항 1의 골 이식재를 제조하는 방법.
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