JP2022545563A - 有孔虫由来の骨移植材 - Google Patents

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Abstract

有孔虫由来の骨移植材に係り、一態様による有孔虫由来の骨移植材によれば、顕著な細胞増殖能、細胞付着能及び造骨細胞分化能を有し、新たに形成された骨を支持することができる構造を含んでおり、骨移植材として有用に使用されうる効果がある。

Description

本発明は、有孔虫由来の骨移植材に関する。
一般的に、外傷、奇形または生理学的現象などにより、骨組織が損傷された場合、その部位に骨移植材を充填し、遮蔽膜を被せ、軟組織の介入を防ぎ、新生骨を生成させる骨誘導再生術（ＧＢＲ：guided bon regeneration）を施術する。そのような骨欠損部の回復のための最も普遍的な骨誘導再生術方法は、他の部位の自身の骨を一部採取して移植する自家移植方法（autograft）、他者の骨を化学処理して移植する同種移植方法（allograft）、動物の骨を化学処理して移植する異種移植方法（xenograft）などがある。
一般的に、自身の骨を一部採取して移植する自家移植方法に使用されるザが骨移植材の場合には、自家海綿骨（ＡＣＢ：autogenous cancellous bone）を移植するために、免疫拒否反応もほとんどなく、骨吸収もほとんどなく、骨伝導能及び骨誘導能が良好であるという長所があり、同種移植方法及び異種移植方法に使用される、同種骨移植材と異種骨移植材との場合には、移植者本人ではない他者の骨を利用する同種移植や、他動物の骨を利用する異種移植を行うために、自家骨移植材の短所である移植者（graftee）本人の骨損失部位以外の部位に二次的な手術をしなくてもよいという長所がある。
同種骨は、遺体や、生存している他の供与者から得るものであり、移植材を凍結させるか凍結乾燥させ、脱灰凍結乾燥させ、そして放射線照射を加えた形態で、抗原性を除去して使用することになり、骨形成に必要な期間が長く、新たに生成される骨量も少ないけれが、必要量をいつでも使用することができ、付加的手術部位を作らないという長所がある。そのような同種骨の種類としては、凍結乾燥骨のうち、非脱灰形態（ＤＦＤＢＡ：demineralized freeze dried bone allografts）、脱灰形態（ＦＤＢＡ：freeze dried bone allografts）、及び放射線照射海綿骨形態（ＩＣＢ：irradiated cancellous bone）がある。
異種骨は、牛や豚のような動物から骨を採取した後、さまざまな過程を経て、免疫反応を弱化させ、骨伝導能を期待する移植材であり、さらなる手術部位を作らなくてもよいという長所と、所望する量ほど十分に使用することができるという長所とがあるが、吸収されて置き換えられるのに長時間がかかるという関係で、骨誘導よりは骨伝導のメカニズムと理解されるところが現在の流れである。そのような異種骨の種類としては、Ｂｉｏ－Ｏｓｓ、ＡＢＭ／Ｐ－１５及びＢｉｏＣｅｒａＴＭなどがある。
合成骨は、実際の骨ではなく、人工的に合成して作った骨であるために、他の骨移植材に比べ、最も質に劣り、骨形成に必要な期間が長いが、低廉であるという長所があり、ＨＡｐ（non-porous hydroxyapatite）、ヒドロキシアパタイトセメント（hydroxyapatite cement）、多孔質ヒドロキシアパタイト（porous hydroxyapatite）、ベータ型リン酸三カルシウム（beta tricalcium phosphate）、ＰＭＭＡ（polymethlymethacrylate）、ＨＥＭＡ（hydroxyet-hylmethacrylate）ポリマー及び生体活性ガラス（bioactive glass）などが臨床で使用されている。ＨＡ、ＰＭＭＡ及びＨＥＭＡポリマーは、非吸水性であり、リン酸三カルシウムとbioactiveは、吸水性であるが、そのような合成骨の種類は、第３リン酸カルシウム、硬組織個体重合体及び生活性ガラス質セラミックスなどがある。なお、ヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）は、骨移植及び歯科装置において、骨代替物で広く使用されてきた。該ＨＡｐは、骨伝導特性を有した生体適合性、及び生体活性物質における化学的組成は、天然骨組織と類似している。該ＨＡｐは、一種のリン酸カルシウムバイオセラミックスであり、カルシウムイオンとリン酸イオンとを含む化学物質を原料として使用して合成することができる。水熱反応を介する海洋藻類からＨＡｐセラミックスを製造することに係わるいくつかの報告があった。
従って、骨移植材として使用するために、さらに高い細胞増殖及び付着能を有する材料の開発が必要となっている。
本発明が解決しようとする課題は、特有の構造を有し、顕著な細胞増殖能、細胞付着能及び造骨細胞分化能を有し、新たに形成された骨を支持することができる構造を含む骨移植材を提供することである。
本発明が解決しようとする課題は、また、前記骨移植材を製造する方法を提供することである。
一態様は、ヒドロキシアパタイトを含む骨移植材であり、前記ヒドロキシアパタイトは、隔壁によって区分された複数のチャンバを含み、前記隔壁は、多数のポアを含むものである骨移植材を提供する。
前記ヒドロキシアパタイトは、有孔虫（foraminifera）由来（例えば、有孔虫の外骨格由来）のものでもある。
前記有孔虫は、殻がある根足虫類の原生動物を意味しうる。前記有孔虫の例は、グロビゲリナ（globigerina）属、カメリナ（camerina）属、エルフィジウム（elphidium）属、ミオジプシナ（miyogipsina）属またはバキュロジプシナ（baculogypsina）属を含んでもよい。さらに詳細には、前記バキュロジプシナ属は、Baculogypsina sphaerulata、Baculogypsina bonarellii、Baculogypsina gallowayi、Baculogypsina lenticulate、Baculogypsina meneghinii、Baculogypsina saonekiまたはBaculogypsina sphaericaでもある。
本明細書で使用される用語「骨移植材（bone graft）」は、骨欠損の保全、骨形成の刺激、関節癒合、関節の制動及び脱臼防止にも使用される材料であり、骨移植術（bone grafting）にも使用されるものを意味しうる。従って、本明細書において、該骨移植材は、骨欠損治療用のものでもある。
本明細書において、骨移植材は、例えば、篩骨（ethmoid）、前頭骨（frontal）、鼻骨（nasal）、後頭骨（occipital）、頭頂骨（parietal）、側頭骨（temporal）、下顎骨（mandible）、上顎骨（maxilla）、頬骨（zygomatic）、子宮頸部の脊椎骨（cervical vertebra）、胸部の脊椎骨（thoracic vertebra）、腰椎脊椎骨（lumbar vertebra）、仙骨（sacrum）、肋骨（ｒｉｂ）、胸骨（sternum）、鎖骨（clavicle）、肩甲骨（scapula）、上膊骨（humerus）、橈骨（radius）、尺骨（ulna）、手首骨（carpal bones）、中手骨（metacarpal bones）、指骨（phalanges）、腸骨（ilium）、座骨（ischium）、恥骨（pubis）、大腿骨（ｆｅｍｕｒ）、脛骨（tibia）、腓骨（fibula）、膝蓋骨（patella）、踵骨（calcaneus）、足根骨（tarsal）及び中足骨（metatarsal bones）に適用することができる。
また、本明細書において、骨移植材は、歯科（歯牙インプラント）、成形外科または整形外科などにおいても使用される。
本明細書で使用される用語「骨形成能」は、骨芽細胞（osteoblast）による骨基質形成及び骨再生（osteoanagensis）を誘導したり促進したりする機能を意味し、軟骨性骨形成、結合組織性骨形成及び転造式骨形成をいずれも含むものである。
本明細書で使用される用語「骨伝導能」は、骨芽細胞を引き寄せ、骨芽細胞の骨基質形成を誘導したり促進させたりする機能を意味する。
本発明で使用される用語「骨誘導能」は、骨組織再生に有用な細胞及び物質のみを欠損部に接近させ、所望する骨組織における再生を誘導する機能を意味する。
用語「投与する」、用語「導入する」及び用語「移植する」は、相互交換的に使用され、一具体例による組成物の所望する部位への、少なくとも部分的局所化をもたらす方法または経路による個体内への、一具体例による組成物の配置を意味しうる。一具体例による組成物の細胞または細胞成分の少なくとも一部を生存する個体内において、所望する位置に伝達する任意の適切な経路によっても投与される。
一具体例において、前記骨移植材は、複数のヒドロキシアパタイト粒子を含むものでもある。前記粒子のサイズは、５０ないし４，０００μｍ、５０ないし３，０００μｍ、５０ないし２，０００μｍ、８０ないし２，０００μｍ、１００ないし４，０００μｍ、１００ないし２，０００μｍ、１００ないし１、５００μｍ、１００ないし１、２００μｍ、１００ないし１，０００μｍ、１００ないし７００μｍ、または１２０ないし６００μｍのものでもある。
一具体例において、前記チャンバの直径は、５ないし２００μｍ、５ないし１８０μｍ、５ないし１５０μｍ、５ないし１２０μｍ、１０ないし１００μｍ、１０ないし８０μｍ、１０ないし６０μｍ、または１５ないし６０μｍでもある。前記チャンバの断面積は、楕円形でもあり、前記直径は、楕円の短い直径、または長い直径のいずれも意味しうる。
一具体例において、前記ポアの直径は、０．０５ないし５μｍ、０．０５ないし４．５μｍ、０．０５ないし４μｍ、０．０８ないし３μｍ、０．０８ないし２μｍ、０．１ないし３μｍ、０．１ないし２μｍ、または０．２ないし２μｍでもある。
他の具体例において、前記隔壁の厚みは、１ないし５０μｍ、１ないし４５μｍ、１ないし４０μｍ、２ないし４０μｍ、４ないし４０μｍ、４ないし３０μｍ、５ないし３０μｍ、５ないし２０μｍ、または５ないし１５μｍでもある。
他の具体例において、前記ヒドロキシアパタイト表面の１ｃｍ２当たり２０，０００ないし１００，０００個、２０，０００ないし８０，０００個、２５，０００ないし８０，０００個、３０，０００ないし８０，０００個、３０，０００ないし７５０，０００個、３０，０００ないし７０，０００個、または４０，０００ないし６０，０００個の均一なチャンバを有するものでもある。
他の具体例において、前記ヒドロキシアパタイト粒子は、マグネシウムイオンを０．５ないし１０重量％（atomic％）、ケイ素イオンを０．２ないし１０重量％（ａｔ％）、またはストロンチウムイオンを０．１ないし５重量％（ａｔ％）で含むものでもある。本明細書において、重量％は、重量百分率を示し、典型的には、総重量の重量百分率によって表現される
一具体例において、前記ヒドロキシアパタイトは、有孔虫の外骨格を水熱反応させて製造されたものでもある。
本明細書で使用される用語「水熱合成（hydrothermal synthesis）」は、水熱反応とも言い、高温の水、または高温、高圧の水の存在下でなされる物質の合成反応を意味する。
本明細書による骨移植材において、ヒドロキシアパタイトは、前処理された有孔虫の外骨格を、少なくとも３０℃、５０℃、８０℃または１００℃以上で、例えば、３０ないし６００℃、８０ないし６００℃、１００ないし６００℃、１００ないし５００℃、１００ないし４００℃、または１００ないし３００℃で、２ないし４０時間、２ないし３０時間、１０ないし４０時間、または１２ないし３６時間水熱反応させて製造されたものでもある。
他の具体例において、本明細書による骨移植材において、ヒドロキシアパタイトは、前処理された有孔虫の外骨格にマイクロウェーブを処理して製造されたものでもある。
一具体例において、前記骨移植材は、ＴＣＰ（tricalcium phosphate）を含んでもよく、含まなくともよい。
前述の「含まない」というのは、「実質的に含まない」という意味であり、ここにおいて、「実質的に」とは、骨移植材の活性に影響を及ぼさないほどの量で含むものであるということを意味する。
他の具体例において、前記骨移植材は、細胞増殖能、細胞付着能または造骨細胞分化能を有するものでもある。
一具体例において、前記移植材は、細胞、例えば、体細胞または幹細胞をさらに含んでもよい。
本明細書において用語「幹細胞」は、他の細胞への分化能を有する未分化細胞を意味しうる。前記幹細胞は、胚芽幹細胞、成体幹細胞、誘導万能幹細胞または間葉系幹細胞でもある。前記間葉系幹細胞は、多様な組織、多様な人種、または多様な年齢の人々から分離されたものでもある。例えば、前記間葉系幹細胞は、脂肪組織由来、胎盤由来、臍帯血由来、筋肉組織由来、角膜組織由来または骨髄組織由来の間葉系幹細胞でもある。また、例えば、前記間葉系幹細胞は、脂肪幹細胞、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞、神経幹細胞、胎盤幹細胞または臍帯血幹細胞でもある。
本明細書の骨移植材は、結合剤（binding agent）をさらに含んでもよい。本発明において結合剤は、前記ヒドロキシアパタイトを物理的に固定、結合または凝集させることにより、骨移植材を骨欠損部に適用するとき、骨移植材が骨欠損部からすぐに離脱させない材料を意味しうる。該結合剤の例としては、歯科用レジンセメント（dental resin cement）；ガラスアイオノマーセメント（glass ionomer cement）；コラーゲン接着剤（collagen based glues）；リン酸亜鉛（zinc phosphate）、リン酸マグネシウム（magnesium phosphate）のようなリン酸セメント（phosphate-based cements）；カルボキシル亜鉛（zinc carboxylate）；フィブリングルー（fibrin glues）、接着蛋白質（mussel-derived adhesive proteins）のような蛋白質結合剤（protein-based binders）；のような公知の生体適合性物質を含んでもよい。
本明細書の骨移植材は、添加剤をさらに含んでもよい。前記添加剤は、骨欠損部の感染を防止するか、あるいは骨移植材の骨形成能、骨伝導能または骨誘導能をさらに向上させるために添加される医学的に許容される追加成分でもある。該添加剤の例としては、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗生物質、抗癌剤、血管生成剤（angiogenic drugs）のような薬物；多糖類水溶液；アミノ酸；ペプチド；ビタミン；蛋白質合成に係わる補助因子；ソマトトロピン（somatotropin）のような成長ホルモン；内分泌組織断片；コラゲナーゼ（collagenase）、ペプチダーゼ（peptidases）、オキシダーゼ（oxidases）のような酵素；軟骨断片（cartilage fragments）、軟骨細胞（chondrocytes）、骨髄細胞（bone marrow cells）のような生きている細胞；免疫抑制剤；脂肪酸エステル；及び核酸；を含むが、それらに限定されるものではなく、当業者であるならば、骨欠損部位、及び適用対象の状態により、適する添加剤を１種以上選択することができる。
本明細書の骨移植材は、通常の方法により、散剤、懸濁液、エマルジョン、軟膏剤または注射剤の形態に剤形化され、骨欠損部位または周辺部位にも適用される。本明細書において「投与量」は、それを必要とする対象部位に適用されることにより、骨の形成または再生を誘導するか、あるいは促進するのに十分な量を意味する。本発明による骨移植材の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態及び骨欠損程度によっても異なり、当業者により、適切に選択されうる。
また、本明細書は、前記骨移植材製造用組成物を提供する。
本明細書による骨移植材製造用組成物は、水、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソーム、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油、カルシウムカーボネート、デキストリン、プロピレングリコール及びリキッドパラフィンからなる群のうちから選択される１種以上をさらに含んでもよい。
他の態様は、前記骨移植材を製造する方法を提供する。
前記方法は、有孔虫を前処理する段階；前記前処理された外骨格を、１２０ないし４００℃で２ないし４０時間水熱反応させ、ヒドロキシアパイトを製造する段階／または前記前処理された外骨格にマイクロウェーブを処理し、ヒドロキシアパタイトを製造する段階；及び／または前記ヒドロキシアパタイトを焼結する段階を含んでもよい。
前記前処理する段階は、有孔虫を洗浄する段階；及び／または前記洗浄された有孔虫を、リン酸を提供することができる化合物を含む水溶液に添加する段階を含んでもよい。
前記リン酸を提供することができる化合物の例は、（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、Ｈ３ＰＯ４、Ｎａ３ＰＯ４またはＮａ２ＨＰＯ４などを含んでもよい。
また、前記水熱反応させ、ヒドロキシアパタイトを製造する段階は、少なくとも、３０℃、５０℃、８０℃または１００℃以上において、例えば、３０ないし６００℃、８０ないし６００℃、１００ないし６００℃、１００ないし５００℃、１００ないし４００℃、または１００ないし３００℃において、２ないし４０時間、２ないし３０時間、１０ないし４０時間、または１２ないし３６時間水熱反応させることを含んでもよい。
また、前記マイクロウェーブを処理し、ヒドロキシアパタイトを製造する段階は、３００ＭＨｚないし３００ＧＨｚ波長の範囲のマイクロウェーブを、１００ないし１，５００Ｗの量で、０．５分ないし４８時間処理することを含んでもよい。
また、前記焼結する段階は、製造されたヒドロキシアパタイトを、２００ないし１，５００℃に昇温させる段階；及び／または冷却させる段階を含んでもよい。前記昇温は、少なくとも複数回以上行われるものでもある。例えば、前記昇温させる段階は、１ないし２０℃／ｍｉｎの速度で、４００ないし８００℃まで昇温させた後、一定時間（例えば、１時間ないし８時間）維持後、さらに１ないし２０℃／ｍｉｎの速度で、６００ないし１，５００℃まで昇温させる段階を含んでもよい。また、前記冷却は、少なくとも常温まで進められるものでもある。
一態様による有孔虫由来の骨移植材によれば、顕著な細胞増殖能、細胞付着能及び造骨細胞分化能を有し、新たに形成された骨を支持することができる構造を含んでおり、骨移植材として有用に使用されうる効果がある。
一具体例によるヒドロキシアパタイト粒子の構造を示した走査電子顕微鏡イメージである：１，０００Ｘ、１０，０００Ｘ。 一具体例によるヒドロキシアパタイト粒子の構造を示した走査電子顕微鏡イメージである１００Ｘ、１，０００Ｘ、３，０００Ｘ。 一具体例によるヒドロキシアパタイト粒子のチャンバ及びポアの大きさを測定した走査電子顕微鏡イメージである。 一具体例によるヒドロキシアパタイト粒子のＸＲＤ回折分析結果を、対照群ＨＡｐと比較した結果を示した図面である。 一具体例によるヒドロキシアパタイトの細胞毒性測定結果を示したイメージである。 一具体例によるヒドロキシアパタイトの細胞増殖測定結果を示したグラフである。 一具体例によるヒドロキシアパタイトの細胞接着及び細胞浸潤の結果を示した走査電子顕微鏡イメージである。 一具体例によるヒドロキシアパタイトのＡＬＰ活性分析結果を示したグラフである。 一具体例によるヒドロキシアパタイトの造骨細胞マーカー遺伝子発現レベルを示したグラフである。 一具体例によるヒドロキシアパタイトの生体内移植８週目のマイクロＣＴ結果を示した図面である。 一具体例によるヒドロキシアパタイトの生体内移植８週目のマイクロＣＴ結果を定量化して示したグラフである。 一具体例によるヒドロキシアパタイトの生体内骨再生効果を示したＨ＆Ｅ染色結果である。 一具体例によるヒドロキシアパタイトの生体内骨再生効果を示したGoldner’s Masson trichrome染色結果である。
以下、本発明について、実施例を介し、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
参照例１．細胞培養
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を使用し、有孔虫由来ＨＡｐの生体適合性を評価した。具体的には、細胞を、５％ ＣＯ２及び３７℃の条件下で、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、Gibco－ＢＲＬ）を含むα－ＭＥＭ（Gibco－ＢＲＬ、ＭＤ；Gaithersburg、ＭＤ）で培養し、４～６段階の継代培養したｈＭＳＣを使用し、in vitro実験を行った。
造骨細胞分化を誘導するために、骨形成刺激剤（０．１ｍＭのデキサメタゾン、０．１Ｍのβ－グリセロリン酸（glycerophosphate）、及び５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸）が添加された培地で細胞を培養した。骨形成刺激剤が含有された培地に使用した全ての化合物は、細胞培養等級の試薬（Sigma Aldrich、セントルイス、ＭＯ、米国）を使用した。正常成長培地及び骨形成刺激剤含有培地は、実験の間、２日ごとに交換して使用した。
細胞培養実験前、ＨＡｐ粒子を、まず、７０％アルコールで３０分間滅菌し、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で１０分間３回洗浄した。滅菌後、２０ｍｇの滅菌された純粋ＨＡｐ及び有孔虫由来ＨＡｐ粒子を、４８ウェル培養プレートに入れた。細胞（５ｘ１０４細胞／ウェル濃度）をシーディング（seeding）し、２時間培養（incubation）し、初期細胞を各ＨＡｐ粒子に付着させた。前述の細胞が付着されたＨＡｐ粒子を、新たな培養プレートウェルに移した後、in vitro実験のために培養した。
参照例２．細胞増殖
細胞増殖は、CellTiter96(登録商標) Aqueous One solution（ＭＴＳ assay、Invitrogen、Carlsbad、ＣＡ、米国）を利用したミトコンドリア活性基盤分析で評価した。前述のように、ｈＭＳＣを、１日、３日間、６日間、９日間及び１２日間シーディングして培養した。事前に決定された時点において、５０μＬのCellTiter96(R)試薬溶液を、２５０μＬの正常培地と混合した後、各ウェルに添加した。細胞培養４時間後、上澄み液を収集し、ＥＬＩＳＡ plate reader（SpectraＭＡＸ Ｍ３、Molecular Devices、Sunnyvale、ＣＡ）を使用し、４９０ｎｍで吸光度を測定した。
参照例３．細胞生存力及び細胞毒性
細胞生存力及び細胞毒性は、Live/Dead(登録商標)及びViability/Cytotoxicityキット（Invitrogen、Carlsbad、ＣＡ、米国）を利用した蛍光染色法によって評価された。製造プロトコルにより、細胞培養されたＨＡｐ粒子を、ＰＢＳ緩衝剤で３０分間洗浄した。次に、キットのカルセインＡＭ（calcein acetoxymethyl ester及びＥｔｈＤ－１（ethidium homodimer－１）を使用して細胞を染色した後、逆蛍光顕微鏡（ＤＭ ＩＬ ＬＥＤ Ｆｌｕｏ、Leica Microsystems、Wetzlar、ドイツ）で観察した。
参照例４．細胞付着及び細胞浸潤のin vitro評価
表面上の細胞付着、及びそれぞれのＨＡｐ粒子への細胞浸潤を観察するために、細胞を５日間培養した。サンプルをＰＢＳ緩衝液で洗浄し、２．５％グルタルアルデヒド溶液に、４℃で２時間固定させた後、０．１％四酸化オスミウム溶液で後固定（post-fixed）させた。次に、サンプルをgraded ethanol series（３０％、５０％、７５％、８５％、９５％、１００％、それぞれ１０分）で脱水（dehydration）させた。次に、金でスパッタコーティング（sputter-coated）した後、ＥＭ（ＥＭ－３０）で観察した。細胞浸潤を観察するために、ＨＡｐ粒子を鋭いランセット（lancet）でスライスし、断面を露出させた後、ＳＥＭ分析を行った。
参照例５．ＡＬＰ（alkaline phosphatase）活性測定
造骨細胞分化は、ＡＬＰ（alkaline phosphatase）活性分析で評価した。ＡＬＰ活性分析は、ｐ－ＮＰＰ（ｐ－nitrophenylphosphate）を基質として使用して行った。詳細には、ｈＭＳＣを粒子上にシーディングした後、骨形成刺激剤含有培地で培養した。細胞培養５日後、接着性細胞を、アイスボックス条件で、１０分間１％ Triton Ｘ－１００／ＰＢＳ溶液に、超音波処理（sonication）して溶解させた。粒子及び残骸物を除去するために、サンプルを、４℃で１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み液を、ＡＬＰ活性分析及び蛋白質濃度分析に使用した。本研究において、ＡＬＰ活性は、総蛋白質含量で正規化（normalized）された。
参照例６．リアルタイム重合酵素連鎖反応
ＨＡｐ粒子上で培養されたｈＭＳＣの造骨細胞分化を測定するために、ＡＬＰ、Ｃｏｌ１αＩ（collagen type Ｉα１）、ＯＣＮ（osteocalcin）及びＢＳＰ（bone sialoprotein）のようないくつかの骨形成マーカー遺伝子を、定量的リアルタイム重合酵素連鎖反応（ＲＰＣＲ）を使用して測定した。骨形成刺激剤含有培地で７日間培養した後、総ｍＲＮＡを細胞から単離し、ｃＤＮＡを、逆転写酵素（Invitrogen）及びオリゴ（ｄＴ）プライマーに転写した。ｃＤＮＡは、ＴａｑＭａｎUniversal ＰＣＲ Master ｍｉｘ（Applied Biosystem）、及びＡＬＰ（Ｈｓ０１０２９１４４＿ｍ１）、Ｃｏｌ１αＩ（Ｈｓ００１６４００４＿ｍ１）、ＯＣＮ（Ｈｓ０１５８７８１４＿ｇ１）、ＢＳＰ（Ｈｓ００１７３７２０＿ｍ１）、１８Ｓ（Ｈｓｓｃｉｅｎｃｅ）に係わるプライマー＆ＴａｑＭａｎプローブセットで増幅させた。全てのＴａｑＭａｎ ＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ ＲＰＣＲシステム（Applied Biosystems、Foster City、ＣＡ、米国）を介して行い、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を内部標準として共同増幅させた。
参照例７．動物モデル
筋肉内用量のケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ、柳韓洋行、ソウル）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ、バイエルコリア、ソウル）を使用し、成体雄（年齢＞３ヵ月以上）ニュージーランド白兎（２．５～３．０ｋｇ）４匹に麻酔を施した。そして、２％リドカイン溶液を使用し、局所麻酔を施した。組織切除後、外径が６ｍｍであるトレフィン（trephine）を使用し、分離された３個の円形頭蓋骨欠陥を作った。１つの欠陥は、対照群として使用され、他の１つの欠陥は、純粋ＨＡｐ粒子で充填し、３番目欠陥は、有孔虫由来ＨＡｐ粒子で充填した。移植後８週において、治癒過程を観察し、欠陥を周辺の骨と共に、宿主の骨から切開した。そして、追加分析前、標本（specimens）を除去し、４℃で７日間固定液（phosphate buffered ４％パラホルムアルデヒド溶液（paraformaldehydesolution）、ｐＨ７．２）に置いた。
参照例８．マイクロＣＴ骨分析
新たに形成された骨は、マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）（Ｓｋｙ－Ｓｃａｎ １１７２ＴＭ、Skyscan、Kontich、ベルギー）によって病理学的に評価された。移植後８週目、サンプルを、０．５ｍｍアルミニウムフィルタを使用し、６０ｋＶの電圧及び１６７μＡの電流の条件でセッティングされたＸ線を利用して分析した。マイクロＣＴ結果を基に、３Ｄソフトウェア（ＣＴＶｏｌ、Skyscan）基盤の３Ｄ再構成イメージで、欠陥の定性的イメージを観察し、イメージ分析ソフトウェア（ＣＴ－analyzerＴＭ、Skyscan）を使用し、骨体積の比率（ＢＶ：bone volume）を次のように計算した。
ＢＶ（％）＝（新生骨体積）－（残余移植材の体積）／総欠陥体積
参照例９．組織学的分析
移植後８週目、組織学的分析を行った。鼠（rat）頭蓋骨の固定された試片に対し、８％ギ酸／８％ ＨＣｌで石灰質を除去した後、graded alcohol series（７０～１００％）で脱水させた。最後に、試片をパラフィンに入れた。ロータリミクロトーム（rotary microtome）（ＨＭ ３２５ＴＭ、Microm、Walldorf、ドイツ）を使用し、５μｍ区画で切断した。各サンプルの中央部分から５個の区画を、ＨＥ（hematoxylin－eosin）及びGoldner’s ＭＴ（masson trichrom）で染色した。そして、サンプルをランダム選択し、顕微鏡で新たな骨形成を観察した（ＤＭＲ、Leica、Nussloch、ドイツ）。
参照例１０．統計分析
数値は、平均±標準偏差（ＳＤ）で表され、統計的分析は、一元分散分析（ＡＮＯＶＡ：one-way analysis of variance）で行った後、ＧｒａｐｈＰａｄPrism version ５．３（GraphPad Software、サンディエゴ、ＣＡ、米国）を使用したDunnett’s post-hoc testを利用して行った；Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると見なされた。
実施例 ヒドロキシアパタイト粒子の製造及び分析
１．有孔虫を利用したヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）粒子製造
有孔虫を利用したヒドロキシアパタイトは、下記のように製造した。
まず、有孔虫（Baculogypsina sphaerulata、沖縄）は、市場で購入した。残留汚染物質及び有機成分を除去するために、サンプルを、４％過塩素酸ナトリウム（ＮａＣｌＯ４）で煮た後、蒸溜水で洗浄した。詳細には、サンプルを、第１リン酸アンモニウム（（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４）水溶液に添加した後、Ｃａ：Ｐのモル比が１０：６になるようにした。
次に、サンプルをテフロン（登録商標）ラインド（Teflon-lined）ステンレス圧力容器に入れ、２００℃で２４時間加熱した。変換されたサンプルを沸騰水で洗浄し、６０℃で乾燥させた。次に、ＨＡｐ粒子をランセット（lancet）で細切りにした後、ステンレスシーブを使用し、２００～５００μｍ範囲の粒子を分離した。その後、前記粒子につき、焼結（sintering）工程を遂行し、結晶化を進めた。該焼結は、電気炉（Muffle furnace、ＳＨ－ＦＵ－４ＭＨ）内で行い、５℃／ｍｉｎの昇温速度で６００℃まで昇温させた後、６００℃で２時間維持した。その後、さらに５℃／ｍｉｎの昇温速度で８００℃まで昇温させた後、８００℃で４時間維持した。その後、常温まで温度を低くし、焼結過程を進めた。
対照群としては、化学量論的に合成したＨＡｐ粒子（純粋ＨＡｐ、２００～５００μｍ範囲の粒子サイズ）を、Dio Implant Ｉｎｃ．（釜山、韓国）から入手して使用した。
２．化学的及び形態学的な特性
前述の実施例１．で製造された有孔虫由来ＨＡｐ組成を分析するために、ＣｕＫα放射線を利用したＸ線回折分析（ＸＲＤ、Ｄ８、Bruker ＡＸＳ、Karlsruhe、ドイツ）を行い、スキャン速度０．０２°／分、５０ｋＶ、１０～８０°範囲の３０ｍÅの条件で分析した。サンプルのイオン組成は、Ｘ線蛍光分光法（ＸＲＦ、Bruker）で評価した。有孔虫由来ＨＡｐ粒子のマイクロ構造及び表面形態は、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＥＭ－３０、ＣＯＸＥＭ、大田、韓国）を使用し、真空下で観察された。
前記走査電子顕微鏡イメージは、図１及び図２に示され、前記ＸＲＤ回折分析結果は、図３に示され、サンプルのイオン組成は、下記表１に示されている。
Figure 2022545563000002
図１は、一具体例によるヒドロキシアパタイト粒子の構造を示した走査電子顕微鏡イメージである。図２は、一具体例によるヒドロキシアパタイト粒子のチャンバ及びポアの大きさを測定した走査電子顕微鏡イメージである。
図３は、一具体例によるヒドロキシアパタイト粒子のＸＲＤ回折分析結果を、対照群ＨＡｐと比較した結果を示した図面である。
図１及び図２から分かるように、純粋ＨＡｐ粒子のＳＥＭイメージは、きつく圧縮されたＨＡｐブロックと、非ミクロンサイズの多孔性がほとんどである表面形態を示している。一方、一具体例によるヒドロキシアパタイトは、ポアを有する隔壁によって区分された複数のチャンバを有しており、内部が相互連結された多数のチャンバに分けられたマクロ（macro）サイズのポア構造を有する。また、粒子表面に、ポアが均一に分布されていることが分かった。また、有意な形態学的変化は、見られず、そのような形態学的特性は、ＨＡｐへの転換がなされる間維持された。
また、図２から分かるように、１ｃｍ２当たり約５３，３００個ほどの均一なチャンバ数を有し、その大きさは、約５０μｍ＊２５μｍであった。また、隔壁のポアサイズは、～２μｍであった。
図３から分かるように、水熱反応後のピークパターンが、一具体例によるヒドロキシアパタイトと、商業的に購入可能な純粋ＨＡｐとが一致することが分かった。それは、有孔虫が水熱反応により、ＨＡｐに首尾よく変形されたことを意味する。
実験例１．細胞毒性測定
有孔虫由来ＨＡｐ粒子の細胞毒性を評価するために、前記参照例に記載されているように、live／dead染色分析を施し、その結果を図４に示した。
図４は、一具体例によるヒドロキシアパタイトの細胞毒性測定結果を示したイメージである。
図４から分かるように、生存したｈＭＳＣは、緑色に染色されているが、粒子上に存在するほとんどの細胞が緑色に染色されており、赤色に染色された死滅細胞は、観察されていない。そのような結果は、有孔虫由来ＨＡｐ粒子が細胞毒性を示さないということを意味する。
実験例２．細胞増殖評価
前述の参照例に記載されているように、ＭＴＳミトコンドリア活性基盤分析（mitochondrial activity based assay）を使用し、有孔虫由来ＨＡｐにおけるｈＭＳＣの細胞増殖を測定した。前記結果は、図５に示されている。
図５は、一具体例によるヒドロキシアパタイトの細胞増殖測定結果を示したグラフである。
図５から分かるように、ｈＭＳＣｓ細胞が、純粋ＨＡｐ及び有孔虫由来ＨＡｐのいずれにおいても、経時的に良好に育つところを示している。特に、培養１日後、有孔虫由来ＨＡｐで培養された細胞光学密度数値（０．２５±０．１０）は、純粋ＨＡｐにおける光学密度数値（０．０７±０．０１）より顕著に高かった。そのような結果は、有孔虫由来ＨＡｐが、純粋ＨＡｐより、初期細胞接着にさらに有利でもあるということを意味する。また、有孔虫由来ＨＡｐ粒子に係わるｈＭＳＣの光学密度は、全ての実験時点において、純粋ＨＡｐの光学密度より顕著に高かった。
実験例３．細胞接着及び細胞浸潤の観察
前述の参照例に記載された方法を使用し、純粋ＨＡｐ粒子及び有孔虫由来ＨＡｐ粒子に係わるｈＭＳＣの細胞付着及び細胞浸潤は、細胞培養５日目にＳＥＭで観察し、その結果を図６に示した。
図６は、一具体例によるヒドロキシアパタイトの細胞接着及び細胞浸潤の結果を示した走査電子顕微鏡イメージである。
図６に示されているように、ｈＭＳＣが、純粋ＨＡｐの表面でのみ、まれに付着されて成長するところを示している。それに反し、有孔虫由来ＨＡｐの表面には、純粋ＨＡｐより多数の細胞が付着されている。また、浸潤及び付着されたｈＭＳＣが、有孔虫由来ＨＡｐのチャンバ内においても観察された。そのような結果は、一具体例によるヒドロキシアパタイトの粒子構造が、細胞の接着に有利な環境を提供するということを意味する。
実験例４．造骨細胞分化能分析
造骨細胞分化能を分析するために、前述の参照例に記載されているように、ＡＬＰ活性及びｑＲＴ－ＰＣＲを遂行し、ＡＬＰ、ＣｏｌＩａ１、ＯＣＮ及びＢＳＰのような造骨細胞マーカー遺伝子を検出した。前記結果は、図７及び図８に示されている。
図７は、一具体例によるヒドロキシアパタイトのＡＬＰ活性分析結果を示したグラフである。
図８は一具体例によるヒドロキシアパタイトの造骨細胞マーカー遺伝子発現レベルを示したグラフである。
図７から分かるように、骨形成刺激剤含有培地で細胞が培養されるとき、ＡＬＰ活性は、有孔虫由来ＨＡｐ粒子上において、１９．５９±３．０６ｎｍｏｌ／ｍｇの蛋白質として測定され、それは、純粋ＨＡｐ上で培養された細胞（５．６９±０．６８ｎｍｏｌ／ｍｇの蛋白質）より、およそ３．４倍さらに高い数値であることが分かった。
また、図８から分かるように、有孔虫由来ＨＡｐ粒子上のＡＬＰ、ＣｏｌＩａ１、ＯＣＮ及びＢＳＰのｍＲＮＡ発現レベルは、純粋ＨＡｐ粒子対比で、それぞれ、約６．６倍、約１０．５倍、約２．６倍、約１６．５倍さらに高かった。
そのような結果は、一具体例によるヒドロキシアパタイトが、純粋ヒドロキシアパタイトに比べ、顕著な造骨細胞分化能を有するということを意味する。
実験例５．生体内骨再生能分析
前述の実施例で製造した有孔虫由来ＨＡｐの生体内骨再生能を分析するために、マイクロＣＴ評価及び組織学的評価を行った。
具体的には、前述の参照例に記載されているように、移植後８週目、三次元マイクロＣＴイメージを獲得し、その結果を図９に示し、移植後８週目、骨欠損部位につき、Ｈ＆Ｅ染色及びGoldner’s Masson trichrome染色を行い、その結果を、それぞれ図１０及び図１１に示した。
図９は、一具体例によるヒドロキシアパタイトの生体内移植８週目のマイクロＣＴ結果を示した図面（図９Ａ）、及びそれを定量化して示したグラフ（図９Ｂ）である。
図１０は、一具体例によるヒドロキシアパタイトの生体内骨再生効果を示したＨ＆Ｅ染色結果である。
図１１は、一具体例によるヒドロキシアパタイトの生体内骨再生効果を示したGoldner’s Masson trichrome染色結果である。
図９Ａから分かるように、対照群グループ（empty group；移植せず）において、欠損部位縁に、新たな骨が再生するところを示している。しかし、純粋ＨＡｐ及び有孔虫由来ＨＡｐを移植したグループにおける新たな骨再生は、欠陥の縁部位だけではなく、移植されたＨＡｐの粒子内部においても観察された。特に、有孔虫由来ＨＡｐ移植群において、新たに形成された骨は、有孔虫欠陥部位の表面を覆った。また、図９Ｂから分かるように、有孔虫由来ＨＡｐ（３１．５４±３．６１％）の骨体積百分率は、対照群グループ（empty group）（８．４３±０．５２％）及び純粋ＨＡｐ（２１．１８±２．６１％）の骨体積より顕著に高かった。
また、図１０から分かるように、対照群（empty；移植せず）グループ、純粋ＨＡｐ移植したグループ、有孔虫由来ＨＡｐ移植したグループのいずれにおいても、欠陥部位の縁において、新たな骨の形成が観察され、移植された全てのグループにおいて、新たに形成された骨と欠陥とが合わされる傾向を示した。特に、純粋ＨＡｐ及び有孔虫由来ＨＡｐが移植されたグループにおいて、新たな骨は、縁欠陥部位において形成されるところが観察され、またＨＡｐ粒子の外表面上に、新たな骨が発生しながら、骨髄の空洞と類似した形態（bone marrow cavity-like morphology）に観察された。成熟された新たな骨は、有孔虫移植グループにおいて、はるかに厚いということが分かった。
また、図１１から分かるように、純粋ＨＡｐ及び有孔虫由来ＨＡｐが移植されたグループにおいては、周辺部位だけではなく、中央領域においても、新たに形成された骨が観察された。一方、対照群グループ（empty group；移植せず）の中央領域においては、緩い結合組織のみが示された。また、他のグループと比較したとき、有孔虫由来ＨＡｐ移植グループにおいて、成熟した骨が多量に有意に形成されていることが分かった。また、有孔虫由来ＨＡｐを移植したグループにおいてのみ、多孔性チャンバ内に内増殖（ingrowth）する組織と類似するように、新たな骨が形成されるということが分かった。そのような結果は、有孔虫由来ＨＡｐ粒子が、新たな骨の形成を刺激するだけではなく、それらチャンバ構造内において、新たに形成された骨の浸潤を支持（support）するということを示している。

Claims (10)

  1. ヒドロキシアパタイトを含む骨移植材であり、前記ヒドロキシアパタイトは、隔壁によって区分された複数のチャンバを含み、前記隔壁は、多数のポアを含む、骨移植材。
  2. 前記ヒドロキシアパタイトは、有孔虫に由来するものである、請求項１に記載の骨移植材。
  3. 前記有孔虫は、Baculogypsina sphaerulata、Baculogypsina bonarellii、Baculogypsina gallowayi、Baculogypsina lenticulate、Baculogypsina meneghinii、Baculogypsina saonekiまたはBaculogypsina sphaericaである、請求項２に記載の骨移植材。
  4. 複数のヒドロキシアパタイトは、粒子を含み、前記粒子のサイズは、１００ないし４，０００μｍである、請求項１に記載の骨移植材。
  5. 前記チャンバの直径は、１０ないし８０μｍであるか、前記隔壁の厚みは、５ないし１５μｍであるか、前記ポアは、０．１ないし３μｍである、請求項１に記載の骨移植材。
  6. ヒドロキシアパタイト表面の１ｃｍ２当たり２０，０００ないし１００，０００個の均一なチャンバを有するものである、請求項１に記載の骨移植材。
  7. 前記ヒドロキシアパタイト粒子は、マグネシウムイオンを０．５ないし１０重量％、ケイ素イオンを０．２ないし１０重量％、またはストロンチウムイオンを０．１ないし５重量％で含む、請求項１に記載の骨移植材。
  8. 前記ヒドロキシアパタイトは、前処理された有孔虫の外骨格を、３０ないし６００℃で２ないし４０時間水熱反応させて製造されたものであるか、３００ＭＨｚないし３００ＧＨｚ波長の範囲のマイクロウェーブを１００ないし１，５００Ｗの量で０．５分ないし４８時間処理して製造されたものである、請求項１に記載の骨移植材。
  9. 骨欠損治療のためのものである、請求項１に記載の骨移植材。
  10. 有孔虫を前処理する段階と、
    前記前処理された外骨格を、３０ないし６００℃で２ないし４０時間水熱反応させるか、あるいは３００ＭＨｚないし３００ＧＨｚ波長の範囲のマイクロウェーブを、１００ないし１，５００Ｗの量で０．５分ないし４８時間処理し、ヒドロキシアパイトを製造する段階と、
    前記ヒドロキシアパタイトを焼結する段階と、を含む請求項１に記載の骨移植材を製造する方法。
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