KR102542450B1 - 해면 골편을 유효성분으로 포함하는 골 이식재 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 해면동물로부터 얻은 바이오 실리카 골편을 활용하여 골 분화 촉진 활성이 우수한 골 이식재 조성물을 제공하는 바, 골 지지 뿐만 아니라 골 재생에도 우수한 효과가 있는 골 이식재를 제공할 수 있다.

Description

해면 골편을 유효성분으로 포함하는 골 이식재 조성물{Bone graft composition comprising cancellous bone grafts as an active ingredient}
본 발명은 해면동물의 골편을 유효성분으로 포함하는 골 이식재 조성물 등에 관한 것이다.
해면(海綿; Porifera)은 후생동물(後生動物) 중 가장 하등한 동물문에 속하며, 갯솜동물이라고도 하고, 원생동물에서 후생동물로 진화하는 과정 중 옆길로 발달한 동물이라고 생각하여 측생동물(側生動物)이라고도 한다. 이러한 해면은 수심 10 내지 9,000미터의 깊은 바다 속까지 분포해 있으며, 멍게류, 패류 등의 갑각 위에 붙어 있기도 하고 진흙바닥에 꼿꼿이 서 있는 종류도 있다. 또한 해면동물은 움직임 없이 바위나 바닥에 붙은 채로 생활하기 때문에 얼핏 보면 식물로 생각하기 쉽지만 소공과 대공을 통해 먹이를 섭취한다.
해면동물은 골편의 특징에 다라 석회해면강·육방해면강·보통해면강·동골해면강의 4강으로 나눈다. 석회해면류는 적회성 골편을 가지며, 얕은 바다에 산다. 전 세계에 약 500종 이상이 발견되었으며 한국에서는 현재 9종 정도가 밝혀져 있다. 싸리버섯해면·우테나팔해면·흰나팔해면·오목해면 등을 포함하고 있다. 보통해면류는 규질의 골편을 가지고 있으나 없는 종류도 있으며, 대부분 얕은 바다나 호수에서 산다. 해면동물 중 가장 많은 종을 포함하고 있는데, 한국에서는 약 114종 정도가 알려져 있다. 목욕해면·보라해면·민물해면·화산해면·꼭지해면·그물눈해면·해로동굴해면 등이 이에 속한다. 육방해면류는 골편은 규질이며 3축이 기본형이나, 1축에서 6축에 이르기까지 여러 종류가 있다. 특히 골편에는 육방성체나 양반체라는 작은 골편이 붙어 있어, 둘 중 어느 것이 있는가에 따라 다시 육방성 아강과 양반 아강으로 분류하고 있다. 모두 깊은 바다에 살고 있으며, 한국에는 2종만이 알려져 있다. 바다수세미·상모끝 등이 이에 속한다. 동골해면목은 2개의 과로 구성되어 있다. 골편의 크기는 10 μm내외로 현미경을 통하여 관찰될 수 있다. 해면동물의 섬유성 골격은 모세관 현상에 따른 흡수 능력을 가지고 있어 목욕용, 의료용, 미술용, 화장용, 석판 인쇄용, 기계청소용으로 사용되기도 한다. 다른 한편으로 몇몇 해면은 요오드, 브롬 및 알루미늄과 같은 원소와 신진대사를 촉진시킬 수 있는 인산염을 포함하고 있는 것으로 알려져 있다.
해면동물은 불순물이 제거되고 건조되어 분말 형태로 만들어지거나 또는 해면 골편에 유효성분을 흡수시키는 형태로 치료제의 제조를 위하여 사용될 수 있다. 해면동물 또는 해면 골편이 특정 질병의 치료 (피부)를 위하여 적용되는 기술은 개시되어 있지만, 국내에 해면동물의 실리카 골편을 함유한 골 재생 및 지지체로서의 치료 조성물 또는 이의 제조 기술은 아직 개시되어 있지 아니하다.
KR 10-1762594
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 해면 골편을 이용하여 골 재생 및 지지를 위한 골 이식재를 제공하고, 골 이식재 제조를 위한 해면 골편 수득방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 해면 골편을 유효성분으로 포함하는 골 이식재 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 인산 칼슘 화합물을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 인산 칼슘 화합물은 하이드록시 아파타이트, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 모노칼슘 포스페 이트, 테트라칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트 또는 이의 조합일 수 있고, 바람직하게는 트리 칼슘 포스페이트일 수 있고, 더욱 바람직하게는 베타 트리 칼슘 포스페이트일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 콜라겐을 추가로 포함하여 해면 골편과 인산 칼슘 화합물의 균질한 혼합을 유도할 수 있으며 골 분화를 보다 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 해면은 아젤라스 종(Agelas sp.), 얼키니아 종(Ircinia sp.), 및 스틸리사 종(Stylissa sp.)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 해면 골편 1 중량부 기준으로 인산 칼슘 화합물을 1. 3 내지 7 중량부 포함하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 해면 골편 1 중량부를 기준으로 인산 칼슘 화합물 7 중량부를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 해면 골편을 10 중량%, 인산 칼슘 화합물을 70 중량%, 및 콜라겐을 20 중량% 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 골 이식재 제조방법을 제공한다:
해면동물을 메탄올(Methanol) 및 디클로로메탄(Dichloromethane) 용액에 침지시켜 유기물 및 불순물을 제거하는 단계;
상기 해면동물을 5~10 시간 동안 600~800?로 가열하여 정제된 해면 골편을 수득하는 단계;
상기 수득된 해면 골편을 증류수로 세척하고 동결 건조하는 단계;
상기 건조된 해면 골편을 메쉬망에 1~3회 통과시켜 골편의 크기를 조절하는 단계;
상기 해면 골편을 콜라겐 및 0.2M 아세트산과 혼합하여 혼합물 1을 제조하는 단계;
상기 혼합물 1에 트리칼슘 포스페이트(TCP)을 혼합하여 혼합물 2를 제조하는 단계; 및
상기 혼합물 2를 몰드에 부어 성형하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 골 이식재는 골 재생 및 지지용일 수 있으며, 상기 트리칼슘 포스페이트는 해면 골편 1 중량부 기준으로 7중량부 혼합하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 골 이식재를 제공한다.
본 발명은 해면동물로부터 얻은 바이오 실리카 골편을 활용하여 골 분화 촉진 활성이 우수한 골 이식재 조성물을 제공하는 바, 골 지지 뿐만 아니라 골 재생에도 우수한 효과가 있는 골 이식재를 제공할 수 있다.
도 1은 유기물이 제거된 후 건조된 4종의 해면 파편 이미지, 이들의 소결 후 이미지, 및 주사 전자 현미경(SEM)으로 관찰한 이미지이다.
도 2는 성분과 그 성분비율을 달리한 골 이식재의 표면을 주사 전자 현미경으로관찰한 이미지이다. 각 이식재의 성분과 그 비율은 아래와 같다:
A: β-TCP 50mg 과 collagen 50 mg으로 제조한 골이식재,
B: 해면 001 50mg과 collagen 50mg으로 제조한 골이식재,
C: 해면 003 80mg과 collagen 20mg으로 제조한 골이식재
도 3A는 각 제조 골이식재에 세포를 접종하여 7일 후 세포 생존력을 MTS 분석으로 분석한 결과이며, 도 3B는 7일 후 alkaline phosphatase 활성 분석 결과이다.
도 4는 각 제조 골이식재에 골분화 촉진 정도를 확인할 수 있는 골분화 인자인 alkaline phosphatase (ALP), Type I collagenase (Col1), bone sialoprotein (BSP), osteocalcin (OCN)의 발현을 비교 분석한 결과이다.
본 발명자들은 골 지지체로 이식되어 우수한 세포 부착능과 골세포 분화를 촉진시키는 재료에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 해면은 해면동물문의 무척추동물 종에서 유래한 것으로, 해면동물이라고도 한다. 약 5,000종의 생존하고 있는 해면종이 해면동물문으로 분류되며, 이것은 3개의 상이한 군, 즉, 육방해면강(Hexactinellida)(유리 해면), 보통해면강(Demospongia) 및 석회해면강(Calcarea)(석회질 해면)으로 구성된다. 해면은 골편으로 알려진 침상 구조체로 구성되는 경질의 골격에 의해 지지되는 젤리형의 단백질 매트릭스에 현탁된 연질의 조직으로 구성되며, 탄산칼슘, 또는 실리카 및 콜라겐을 주요 성분으로 포함한다.
본 발명에서 해면 골편은 하기의 단계 수행하여 수득될 수 있다:
(1) 해면동물을 메탄올(Methanol) 및 디클로로메탄(Dichloromethane) 용액에 침지시켜 유기물 및 불순물을 제거하는 단계;
(2) 상기 해면동물을 5~10 시간 동안 600~800℃로 가열하여 정제된 해면 골편을 수득하는 단계;
(3) 상기 수득된 해면 골편을 증류수로 세척하고 동결 건조하는 단계; 및
(4) 상기 건조된 해면 골편을 메쉬망에 1~3회 통과시켜 골편의 크기를 조절하는 단계.
상기 (2) 단계는 전기로에서 수행되는 것일 수 있으며, 전기로에서 수분율 10% 미만, 바람직하게는 8% 미만의 해면동물을 가열하여 유기물을 제거하는 것일 수 있다. 가열 이후의 (3) 단계 수득된 해면 골편은 고순도의 실리카 함량이 높은 실리카로 이루어진 것일 수 있다.
발명에서 사용되는 용어 "골 이식재 조성물"은 골 결손부에 이식되어 이를 충진하는 재료, 즉 골 결손부 보충재로서 사용되는 조성물을 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서, 골 이식재 조성물은 인산 칼슘 화합물을 기초로 한 합성 골 이식재(Alloplastic, Synthetic bone graft materials) 조성물을 의미한다.
본 발명의 골 이식재 조성물은 해면 골편을 유효성분으로 포함하며, 인산 칼슘 화합물 및/또는 골분화 유도(또는 촉진) 인자를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 해면 골편은 아젤라스 종(Agelas sp.), 얼키니아 종(Ircinia sp.), 및 스틸리사 종(Stylissa sp.)으로부터 획득되는 것일 수 있으나, 상기 해면동물에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 인산 칼슘 화합물은 인산과 칼슘을 포함하는 천연 골 유사 성분으로 골이 전도되어 자랄 수 있도록 유도한다. 본 발명의 구체적인 실험에서는 인산 칼슘은 β-트리칼슘 포스페이트(β-TCP, Ca3(PO4)2)를 이용하였으나, 이에 제한되지 아니하고, 파타이트, 트리칼슘 포스페이트(TCP), 모노칼슘 포스페이트, 테트라칼슘 포스페이트, 디칼슘 포스페이트 등이 이용될 수 있다.
한편, 본 발명은 구체적인 실험을 통해 해면 골편과 β-TCP의 혼합비를 달리하여 골 이식재를 제조하고 골 세포의 부착능 및 분화 정도를 확인한 결과, 골 이식재 조성물에 포함된 해면 골편의 함량과 β-TCP의 혼합비가 중요함을 확인하였다.
본 발명의 골 이식재 조성물은 해면 골편 1 중량부 기준으로 인산 칼슘 화합물1.3 내지 7 중량부 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인산칼슘 화합물 7 중량부 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 골 이식재 제조방법을 제공하며, 그 방법은 하기의 단계를 포함한다:
해면동물을 메탄올(Methanol) 및 디클로로메탄(Dichloromethane) 용액에 침지시켜 유기물 및 불순물을 제거하는 단계;
상기 해면동물을 5~10 시간 동안 600~800℃로 가열하여 정제된 해면 골편을 수득하는 단계;
상기 수득된 해면 골편을 증류수로 세척하고 동결 건조하는 단계;
상기 건조된 해면 골편을 메쉬망에 1~3회 통과시켜 골편의 크기를 조절하는 단계;
상기 해면 골편을 콜라겐 및 0.2M 아세트산과 혼합하여 혼합물 1을 제조하는 단계;
상기 혼합물 1에 트리칼슘 포스페이트(TCP)을 혼합하여 혼합물 2를 제조하는 단계; 및
상기 혼합물 2를 몰드에 부어 성형하는 단계.
본 발명의 방법에 의해 제공되는 골 이식재는 세포 부착 및 골 분화 유도 활성이 뛰어난 바, 골 재생 및 지지용 이식재로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 해면골편 및 인산 칼슘 화합물을 포함하는 골 이식재 제조 키트를 제공하며, 상기 키트는 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1. 해면동물로부터 실리카 골편 준비
아젤라스 종(Agelas sp.), 얼키니아 종(Ircinia sp.), 및 스틸리사 종(Stylissa sp.)의 해면동물을 준비하고, 상기 각각의 해면동물을 메탄올(Methanol) 용액과 디클로로메탄(Dichloromethane) 용액에 침지시켜 유기물 및 불순물을 제거하여 해면 골편을 수득하였다. 이어서, 수득한 해면 골편을 700?의 전기로에서 6시간 동안 가열하여, 정제된 순수한 실리카 골편을 수득하였다. 이후 수득한 실리카 골편을 증류수로 세척한 후 동결 건조하고, 메쉬 체거름망을 이용하여 일정한 크기를 가지는 실리카 골편을 얻었다. 각 해면동물에서 정제된 실리카 골편 4종의 성분은 하기 표 1과 같다.
No. 종 Si Atomic % Si Atomic % (Calcinated) Ca Atomic % (Calcinated) P Atomic % (Calcinated)
01 Agelas sp. 0.58 4.69 6.65 2.47
02 Ircinia sp. 0.26 1.24 5.37 9.06
03 Stylissa sp. 1.08 28.77 0.77 0.34
04 Stylissa sp. 0.69 12.99 7.54 3.38
실시예 2. 골 이식재 제조
상기 실시예 1에서 준비한 실리카 골편을 콜라겐(Collagen)과 혼합하여 골 지지체를 제조하였다. 비교를 위해 해면 골편 대신에 베타-트리칼슘 포스페이트(beta-tricalcium phosphate: bTCP)과 콜라겐을 혼합한 matrix로 골 지지체를 제조하였다. 골 지지체 제조를 위한 각 matrix의 성분과 혼합비는 하기 표 2에 나타내었다.
Material Matrix A
(bTCP)		 matrix B
(해면 01)		 matrix C
(해면 03)
Spicule - 50mg 80mg
β-TCP 50mg - -
Collagen 50mg 50mg 20mg
Total 100mg
보다 구체적으로, 먼저 정제 소결된 해면 골편, 콜라겐, 및 0.2 M 아세트산 (Acetric aicd)를 혼합하여 빠른 속도로 진탕하였다. 상기 혼합물에 베타-트리칼슘 포스페이트를 섞어 몰드 (5mm x 2 mm)에 담아 24시간동안 자연 건조하였다. Matrix A는 beta TCP를 몰드에 넣어 24시간 동안 자연 건조하였다.
제조한 골 이식재의 SEM 이미지는 도 2에 나타내었다. (도 2A ~ 2C).
실시예 3. 골이식재에 골세포의 부착 및 분화 확인
상기 실시예 2에서 제작된 골 이식재를 배양배지에 하루 동안 담그고, 새 96 well plate에 옮긴 후 각 well 당 preosteoblast인 MC3T3 E1 세포를 1 ㅧ 105 cells을 접종하였다. 3일 동안 배양배지에서 배양 후 4일 째에 분화배지로 교체하여 4일동안 골 분화를 유도하였다. 배양 배지는 10% Fetal bovine serum (FBS) 과 1% 항생제가 포함된 alpha-MEM 배지이고, 분화배지는 상기 배양배지에 10mM beta-glycerophosphate와 50 M ascorbic acid을 추가로 포함된 alpha-MEM 배지이다. 7일간 배양 후 MTS 분석으로 세포증식를 확인하고 골분화마커인 alkaline phosphatase (ALP) 활성을 측정하였다. 1주일 배양 후 Matrix C로 제작한 골이식재에서 세포 생존력과 ALP 활성이 가장 높게 나타났다 (도 3).
실시예 4. 해면 04 골편과 베타-트리칼슘 포스페이트 비율에 따른 골분화 인자 발현
해면 골편과 bTCP의 혼합 및 그 혼합비에 따른 골 이식재의 골분화 촉진 정도를 확인하고자 하였다. 골 이식재 제조를 위한 구체적인 성분과 그 혼합비는 하기 표 3에 나타내었다.
Material S4:T4 S3:T5 S2:T6 S1:T7 S0:T8
Spicule 40 mg 30 mg 20 mg 10 mg -
β-TCP 40 mg 50 mg 60 mg 70 mg 80 mg
Collagen 20mg
Total 100mg
먼저 정제 소결된 해면 골편, 콜라겐, 및 0.2 M 아세트산 (Acetric aicd)를 혼합하여 빠른 속도로 진탕하였다. 이어서, 상기 혼합물에 bTCP를 혼합한 기질을 몰드 (5mm x 2 mm)에 담아 24시간동안 자연 건조하여 골 이식재를 제조하였다. 제작된 골이식재를 배양배지에 하루 동안 담그고, 새 96 well plate에 옮긴 후 각 well 당 preosteoblast인 MC3T3 E1 세포 1 ㅧ 105 cells을 접종하였다. 3일 동안 배양배지에서 배양 후 4일 째에 분화배지로 교체하여 4일동안 골 분화를 유도하였다. 배양 배지는 10% Fetal bovine serum (FBS) 과 1% 항생제가 포함된 alpha-MEM 배지이고, 분화배지는 상기 배양배지에 10mM beta-glycerophosphate와 50 M ascorbic acid을 추가로 포함된 alpha-MEM 배지이다.
7일간 배양 후 각 샘플에서 세포의 골분화 정도를 확인하기 위하여 골분화 마커의 발현 정도를 RT-qPCR을 수행하여 확인하였다. RNA 추출은 ReliaPrep RNA Cell Miniprep 시스템 (Promega)을 이용하였으며, cDNA 합성은 ReverTra Ace RT Master Mix (Toyobo, Japan)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행되었다. qPCR은 StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems)에서 Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (ThermoFisher Scientific Korea, 서울)를 사용하여 수행하였다.
골분화 촉진 정도를 확인하기 확인한 골분화 마커는 alkaline phosphatase (ALP), Type I collagenase (Col1), bone` sialoprotein (BSP), 및 osteocalcin (OCN) 이고, Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)는 골분화 마커 유전자 발현의 정상화 (normalization)를 위하여 사용되었다. qPCR에 사용되는 프라이머 서열은 하기 표 4와 같고, 각 샘플에서 골분화 마커 유전자의 발현량은 7일째에 해면 골편이 포함되지 않은 골지지체상의 세포 발현 수준에 대한 평균 배수로 표현하여 도 4에 나타내었다.
Name primer 5’ to 3’
ALP Forward ACCGCTGCCCGAATCC
Reverse TCTCCTCGCCCGTGTTGT
BSP Forward CCAAGAAGGCTGGAGATGCA
Reverse TCCTCGTCGCTTTCCTTCAC
COL1 Forward CTTCACCTACAGCACCCTTGTG
Reverse TGACTGTCTTGCCCCAAGTTC
OCN Forwa`rd GTGAGCTTAACCCTGCTTGTGA
Reverse TGCGTTTGTAGGCGGTCTTC
GAPDH Forward CCTGGCCAAGGTCATCCATG
Reverse GCAGGAGACAACCTGGTCCT
해면 04와 β-TCP를 1:7 비율로 섞은 경우 β-TCP 단독보다 2배 이상의 골분화 인자들의 발현이 증가하였다. 해면 골편과 β-TCP의 비율이 1:7에서 3:5 사이의 혼합의 경우 전반적으로 TCP 단독보다 증가된 골분화 인자의 발현을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 해면 골편이 포함된 기질로 제조된 골 이식재는 β-TCP 만이 포함된 골 이식재보다 골 세포의 부착 및 분화가 활발하고, 골 분화에는 골 이식재에 포함된 해면 골편의 함량이 중요함을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. β-트리칼슘 포스페이트(β-TCP) 및 해면 골편을 유효성분으로 포함하며,
    상기 β-트리칼슘 포스페이트(β-TCP) 및 해면 골편의 중량비는 1:7에서 3:5 사이인 것을 특징으로 하는, 골 이식재 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 콜라겐을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 골 이식재 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 해면은 아젤라스 종(Agelas sp.), 얼키니아 종(Ircinia sp.), 및 스틸리사 종(Stylissa sp.)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 골 이식재 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 해면동물을 메탄올(Methanol) 및 디클로로메탄(Dichloromethane) 용액에 침지시켜 유기물 및 불순물을 제거하는 단계;
    상기 해면동물을 5~10 시간 동안 600~800℃로 가열하여 정제된 해면 골편을 수득하는 단계;
    상기 수득된 해면 골편을 증류수로 세척하고 동결 건조하는 단계;
    상기 건조된 해면 골편을 메쉬망에 1~3회 통과시켜 골편의 크기를 조절하는 단계;
    상기 해면 골편을 콜라겐 및 0.2M 아세트산과 혼합하여 혼합물 1을 제조하는 단계;
    상기 혼합물 1에 트리칼슘 포스페이트(TCP)을 혼합하여 혼합물 2를 제조하는 단계; 및
    상기 혼합물 2를 몰드에 부어 성형하는 단계;를 포함하는 골 재생 및 지지용 이식재 제조방법으로,
    상기 트리칼슘 포스페이트는 β-트리칼슘 포스페이트(β-TCP)이며,
    상기 β-트리칼슘 포스페이트(β-TCP) 및 해면 골편의 중량비는 1:7에서 3:5 사이인 것을 특징으로 하는, 골 이식재 조성물 제조방법.
  10. 삭제
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