CN111094551A - 包含脂肪干细胞的生物材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物材料，其包含脂肪干细胞(ASC)、陶瓷材料和细胞外基质。特别地，根据本发明的生物材料分泌护骨因子(OPG)，并且包含胰岛素样生长因子(IGF1)和基质细胞衍生因子1‑α(SDF‑1α)。本发明还涉及用于产生生物材料的方法及其用途。

Description

包含脂肪干细胞的生物材料及其制备方法

发明领域

本发明涉及干细胞领域及其在多维生物材料生产中的用途。特别地，本发明涉及包含脂肪干细胞(ASC)的生物材料、制备和使用这种生物材料用于治疗的方法。

发明领域

骨缺损是在通常应有骨骼的身体区域缺乏骨组织。骨缺损可以通过各种手术方法治疗。但是，通常有一些因素会影响骨骼的愈合，例如糖尿病、免疫抑制疗法、运动状态不佳以及计划手术时必须考虑的其他因素。

骨缺损重建的外科方法尤其包括剥除、切除和固定、松质骨移植和Ilizarov横向骨搬移方法。但是，患者通常会出现长时间的行走障碍，并且功能和美学效果欠佳。

组织工程涉及通过使用活细胞来恢复组织结构或功能。一般过程包括细胞分离和增殖，然后进行使用支架材料的再植入程序。间充质干细胞(MSC)提供了成熟组织细胞的良好替代品，并具有许多优势，可作为骨骼和软骨组织再生的细胞来源。

根据定义，干细胞的特征在于其能够进行自我更新并且能够进行多向分化并形成终末分化细胞。理想情况下，用于再生医学应用的干细胞应符合以下标准：(i)应大量存在(数百万个至数十亿个细胞)；(ii)可以通过微创程序收集和收获；(iii)可沿着多个细胞谱系途径以可重复的方式进行分化；(iv)可以安全有效地移植到自体或同种异体宿主中。

研究表明，干细胞具有分化为中胚层、内胚层和外胚层来源的细胞的能力。MSC的可塑性通常是指干细胞内保留的跨越谱系屏障并获得其他组织所特有的细胞的表型、生化和功能特性的固有能力。例如，可以从骨髓和脂肪组织中分离成体间充质干细胞。

脂肪干细胞是多能的，并具有深度再生能力。以下术语已用于标识相同的脂肪组织细胞群：脂肪干细胞/基质细胞(ASC)；脂肪成体干细胞(ADAS)、脂肪成体基质细胞、脂肪衍生的基质细胞(ADSC)、脂肪基质细胞(ASC)、脂肪间充质干细胞(AdMSC)、成脂肪细胞、周细胞、前脂肪细胞、脂肪组织提取(PLA)细胞。使用这种多样化的命名法已导致文献上的重大混乱。为了解决这个问题，国际脂肪应用技术协会达成共识，采用术语“脂肪干细胞”(ASC)来标识分离的塑性黏附的多能细胞群。

当将成骨分化型ASC接种到各种支架上后，它们在各种临床前模型中显示出巨大的治愈潜力，这些支架例如是β-磷酸三钙(β-TCP)、羟基磷灰石(HA)、I型胶原、聚乳酸-co-乙醇酸(PLGA)和藻酸盐。国际专利申请WO2013/059089涉及一种骨糊剂，其包含干细胞以及磷酸钙黏固剂例如磷酸三钙和羟基磷灰石的混合物。US2011/104230公开了包括支架材料的骨贴剂，所述支架材料包含合成陶瓷材料、间充质干细胞和信号传导分子。

然而，尽管在小型动物模型中取得了令人鼓舞的结果，但使用加载在支架上的ASC进行临界尺寸骨重建仍然受到大尺寸骨缺损的限制，并因此受到工程植入物的大小限制。接种细胞的细胞移植也受到氧气和营养素扩散不良的限制。另外，细胞在支架内的位置是细胞在体外和体内存活的主要限制。采用支架的流动灌注的生物反应器旨在改善植入物内的细胞迁移，以实现更均匀的细胞分布，通过向植入物的核心输送氧气和营养素来改善细胞存活以及改善骨原细胞分化(通过流体剪切力)。尽管这些技术很有前途，但是在大型动物模型中相关的临床前和临床数据仍然有限。

因此，在本领域中仍然需要用于骨组织再生的组织工程材料，其是完全生物相容的并且为指定的应用提供适当的机械特征。因此，本发明涉及由分化成多维成骨结构的ASC和陶瓷材料制成的移植物。

发明内容

本发明涉及具有多维结构的生物材料，该生物材料包含成骨分化型脂肪干细胞(ASC)、陶瓷材料和细胞外基质，其中该生物材料分泌护骨因子(OPG)并包含胰岛素样生长因子(IGF1)和基质细胞衍生因子1-α(SDF-1α)。

在一个实施方案中，生物材料分泌至少约5ng OPG/g生物材料，优选至少约10ngOPG/g生物材料。

在一个实施方案中，生物材料包含至少约50ng IGF1/g生物材料，优选至少75ngIGF1/g生物材料。

在一个实施方案中，生物材料包含至多约100ng SDF-1α/g生物材料，优选至多75ng SDF-1α/g生物材料。

在一个实施方案中，陶瓷材料为颗粒形式。在一个实施方案中，陶瓷材料是磷酸钙颗粒。

在一个实施方案中，磷酸钙颗粒的平均尺寸为约50μm至约1500μm。在一个实施方案中，磷酸钙颗粒是羟基磷灰石(HA)颗粒和/或β-磷酸三钙(β-TCP)颗粒。

在一个实施方案中，磷酸钙颗粒是HA/β-TCP颗粒，其比例为约10/90至约90/10。在另一个实施方案中，HA/β-TCP颗粒的比例为约20/80至约80/20。在另一个实施方案中，HA/β-TCP颗粒的比例为约30/70至约70/30。在另一个实施方案中，HA/β-TCP颗粒的比例为约40/60至约60/40。在另一个实施方案中，HA/β-TCP颗粒的比例为约50/50。在另一个实施方案中，HA/β-TCP颗粒的比例为65/35。

在另一个实施方案中，生物材料包含至少约10ng VEGF/g生物材料。

在一个实施方案中，生物材料是三维的。

在一些实施方案中，生物材料是可模塑的或可成形的。

本发明还涉及包含本发明的多维生物材料的医疗装置或药物组合物。

本发明的另一个目的是一种用于产生本发明的多维生物材料的方法，其包括以下步骤：

-使脂肪干细胞(ASC)增殖，

-使第四代ASC发生成骨分化，和

-进行多维诱导，优选3D诱导。

本发明还涉及可通过本发明的方法获得的多维生物材料。

本发明的另一个目的是用于治疗骨缺损或软骨缺损的如本文所述的生物材料。

定义

在本发明中，以下术语具有以下含义：

-在值之前使用术语“约”表示为所述值的±10％以内。

-术语“脂肪组织”是指任何脂肪组织。脂肪组织可以是褐色或白色脂肪组织，其源自皮下、网膜/内脏、乳腺、性腺或其他脂肪组织部位。优选地，脂肪组织是皮下白色脂肪组织。这样的细胞可以包括原代细胞培养物或永生化细胞系。脂肪组织可以来自具有脂肪组织的任何活的或死的生物体。优选地，脂肪组织是动物的，更优选地是哺乳动物的，最优选地，脂肪组织是人的。脂肪组织的方便来源是吸脂手术，但是，脂肪组织的来源或分离脂肪组织的方法对本发明不是关键的。

-如本文所用，术语“脂肪干细胞”(也称为“脂肪组织干细胞”)是指脂肪组织的“非脂肪细胞”部分。细胞可以是新鲜的，也可以是培养的。“脂肪干细胞”(ASC)是指源自脂肪组织的基质细胞，其可以充当多种不同细胞类型的前体，例如但不限于脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞。

-如本文所用，术语“陶瓷材料”是指无机非金属固体材料。陶瓷材料可以是磷酸钙(CaP)、碳酸钙(CaCO₃)、硫酸钙、氢氧化钙(Ca[OH]₂)或其组合。陶瓷材料可以是颗粒形式。陶瓷材料可以是粉末、珠或颗粒的形式。陶瓷材料可以是多孔的。

-术语“再生”或“组织再生”包括但不限于由本公开的ASC生长出、产生或重建新细胞类型或组织。在一个实施方案中，这些细胞类型或组织包括但不限于骨原细胞(例如成骨细胞)、软骨细胞、内皮细胞、心肌细胞、造血细胞、肝细胞、脂肪细胞、神经元细胞和肌管。在一个特定的实施方案中，术语“再生”或“组织再生”是指由本公开的ASC产生或重建骨原细胞(例如成骨细胞)。

-如本文所用，术语“生长因子”是促进组织生长、细胞增殖、血管形成等的分子。在一个特定的实施方案中，术语“生长因子”包括促进骨组织形成的分子。

-如本文所用，术语“培养的”是指在体外、体内或离体环境中经历细胞分裂或未经历细胞分裂的一种或多于一种细胞。体外环境可以是本领域已知的适合于体外维持细胞的任何培养基，例如合适的液体培养基或琼脂。适用于细胞培养的体外环境的具体实例描述于Culture of Animal Cells:a manual of basic techniques(第三版),1994,R.I.Freshney(编),Wiley-Liss,Inc.；Cells:a laboratory manual(卷1),1998,D.L.Spector,R.D.Goldman,L.A.Leinwand(编),Cold Spring Harbor Laboratory Press；和Animal Cells:culture and media,1994,D.C.Darling,S.J.Morgan John Wiley andSons,Ltd.中。

-术语“汇合”是指细胞培养表面(例如培养皿或烧瓶)中贴壁细胞的数量，即，被细胞覆盖的表面的比例。100％汇合表示表面完全被细胞覆盖。在一个实施方案中，表述“细胞达到汇合”或“细胞汇合”是指细胞覆盖了表面的80％至100％。在一个实施方案中，表述“细胞亚汇合”是指细胞覆盖了表面的60％至80％。在一个实施方案中，表述“细胞过度汇合”是指细胞覆盖了至少100％的表面和/或100％汇合持续数小时或数天。

-术语“冷藏”或“制冷”是指以低于对象正常生理温度的温度进行的处理。例如，在约-196℃至约+32℃的范围内选择一个或多于一个温度，持续延长的时间段，例如至少约一个小时、至少约一天、至少约一周、至少约4周、至少约6个月等。在一个实施方案中，“制冷”或“冷藏”是指在低于0℃的温度下进行处理。制冷可以手动进行，或者优选地使用能够执行制冷程序的专门设备来进行。在一个实施方案中，术语“冷藏”包括本领域中已知的“冷冻”和“超低温保存”的方法。技术人员将理解，制冷方法可包括其他步骤，包括为此目的添加试剂。

-如本文所用，术语“非胚性细胞”是指不是从胚胎分离的细胞。非胚性细胞可以是分化的或不分化的。非胚性细胞可以指几乎任何体细胞，例如从动物子宫外分离的细胞。在一个实施方案中，非胚性细胞包括生殖细胞。这些实例并不意味着是限制性的。

-如本文所用，术语“分化的细胞”是指已从非特异性表型发展为特异性表型的前体细胞。例如，脂肪干细胞可以分化为骨原细胞。

-如本文所用，术语“分化培养基”是指在本发明的培养系统中用于产生分化细胞的化合物的集合之一。化合物的作用方式无限制。例如，该试剂可以通过诱导或协助表型的改变、促进具有特定表型的细胞的生长或阻止其他表型的生长来辅助分化过程。它也可以作为可能在培养基中或由细胞群合成的其他因子的抑制剂，否则其他因子将导致细胞群沿不期望的细胞类型分化途径分化。

-术语“处理”、“治疗”或“缓解”是指目的是预防或减慢(减轻)骨缺损的治疗性处理。需要治疗的对象包括已经患有疾病的对象以及易于患有疾病的对象或要预防骨缺损的对象。如果对象在接受治疗量的根据本发明方法的生物材料后，患者显示出可观察到的和/或可测量的以下一种或多于一种情况的减少或不存在，则成功地“治疗”了对象的骨缺损：骨缺损的减少和/或与骨缺损有关的一种或多于一种症状在某种程度上的缓解；发病率和死亡率降低，和生活质量问题改善。可以通过医师熟悉的常规程序容易地测量用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数。

在所公开的生物材料的治疗用途的上下文中，对于“同种异体”疗法，供体和受体是同一物种的不同个体，而对于“自体”疗法，供体和受体是同一个体，对于“异种”疗法，供体来源于与受体不同物种的动物。

-术语“有效量”是指足以产生包括临床结果在内的有益或期望结果的量。可以一次或多于一次施用来施用有效量。

-术语“对象”是指哺乳动物，优选人。对象的实例包括人、非人灵长类、狗、猫、小鼠、大鼠、马、牛及其转基因物种。在一个实施方案中，对象可以是“患者”，即温血动物，更优选为人，其在等待或正在接受医疗护理、或曾经/现在/将要成为医疗程序的目标、或监测对象疾病的发展。在一个实施方案中，对象是成体(例如18岁以上的人类对象)。在另一个实施方案中，所述对象是幼体(例如18岁以下的人类对象)。在一个实施方案中，所述对象是雄性。在另一个实施方案中，所述对象是雌性。

-术语“生物相容的”是指与诸如细胞、细胞培养物、组织或生物体的生物系统相容的无毒材料。

-术语“多维”是指一个以上的维度，例如二维(2D)或三维(3D)。在一个实施方案中，具有多维结构的生物材料是指具有2D或3D结构的生物材料。

具体实施方式

本发明涉及具有多维结构的生物材料，其包含脂肪组织干细胞(ASC)、陶瓷材料和细胞外基质，分泌护骨因子(OPG)，并且包含胰岛素样生长因子(IGF1)和基质细胞衍生因子1-α(SDF-1α)。

如本文中所使用的，术语“具有多维结构的生物材料”可以在整个本发明中被术语“多维生物材料”代替。

在一个实施方案中，细胞是从脂肪组织中分离的，在下文中被称为脂肪干细胞(ASC)。

在一个实施方案中，ASC组织是动物来源的，优选哺乳动物来源的，更优选人类来源的。因此，在一个实施方案中，ASC为动物ASC，优选为哺乳动物ASC，更优选为人ASC。在一个优选的实施方案中，ASC是人ASC。

从脂肪组织中分离干细胞的方法在本领域中是已知的，并且例如在Zuk等人(Tissue Engineering.2001,7:211-228)中公开。在一个实施方案中，通过吸脂术从脂肪组织分离ASC。

作为说明，可以通过穿刺活检或吸脂术吸取来收集脂肪组织。可以首先通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)全面地洗涤组织样品，来从脂肪组织中分离ASC，磷酸盐缓冲盐水(PBS)任选包含抗生素，例如1％青霉素/链霉素(P/S)。然后将样品置于具有胶原酶的无菌组织培养板中以进行组织消化(例如，在含2％P/S的PBS中制备的I型胶原酶)，并在37℃、5％CO₂下孵育30分钟。胶原酶活性可以通过添加培养基(例如含有10％血清的DMEM)来中和。分解后，可以将样品转移到试管中。通过离心样品(例如，以2000rpm的速度离心5分钟)获得包含ASC的基质血管部分(SVF)。为完成基质细胞与原代脂肪细胞的分离，可大力振摇样品以彻底破坏团粒并混合细胞。可以重复离心步骤。旋转并吸出胶原酶溶液后，可将团粒重悬于裂解缓冲液中，在冰上孵育(例如10分钟)、洗涤(例如用PBS/2％P/S)并离心(例如以2000rpm离心5分钟)。然后可以吸出上清液，将细胞团粒重悬于培养基(例如基质培养基，即α-MEM，补充有20％FBS，1％L-谷氨酰胺和1％P/S)中，并过滤细胞悬浮液(例如，通过70μm细胞过滤器)。最终可以将含有细胞的样品涂布在培养板上，并在37℃、5％CO₂下进行孵育。

在一个实施方案中，本发明的ASC从脂肪组织的基质血管部分分离。在一个实施方案中，脂肪组织提取物可以在室温下保持数小时，或在使用前在+4℃下保持24小时，或在0℃以下如-18℃下长期保存。

在一个实施方案中，ASC可以是新鲜的ASC或冷藏的ASC。新鲜的ASC是未经冷藏处理的分离的ASC。冷藏的ASC是经过冷藏处理的分离的ASC。在一个实施方案中，冷藏处理是指低于0℃的任何处理。在一个实施方案中，可在约-18℃、-80℃或-180℃下进行冷藏处理。在一个具体的实施方案中，冷藏处理可以是超低温保存。

作为冷藏处理的一个实例，可以在80％至90％汇合时收获ASC。经过洗涤和从培养皿上分离的步骤后，可以在室温下用冷藏保存培养基沉淀细胞，然后放入小瓶中。在一个实施方案中，冷藏保存培养基包含80％的胎牛血清或人血清、10％的二甲基亚砜(DMSO)和10％的DMEM/Ham’s F-12。然后，将小瓶在-80℃下保存过夜。例如，可以将小瓶放置在酒精冷冻容器中，将小瓶以每分钟约1℃的速度缓慢冷却，直到达到-80℃。最后，可以将冷冻的小瓶转移到液氮容器中进行长期保存。

在一个实施方案中，ASC是分化的ASC。在一个优选的实施方案中，ASC是成骨分化的ACS。换句话说，在一个优选的实施方案中，ASC分化为骨原细胞。在一个特定的实施方案中，ASC分化为成骨细胞。

控制和评估成骨分化的方法是本领域已知的。例如，本发明的细胞或组织的骨分化的评估可以通过骨钙素和/或磷酸盐的染色(例如用冯库萨染色)；通过对磷酸钙进行染色(例如用茜素红)；通过磁共振成像(MRI)；通过测量矿化基质的形成；或通过测量碱性磷酸酶活性来进行。

在一个实施方案中，通过在成骨分化培养基(MD)中培养ASC来进行ASC的成骨分化。

在一个实施方案中，成骨分化培养基包含人血清。在一个特定的实施方案中，成骨分化培养基包含人血小板裂解物(hPL)。在一个实施方案中，成骨分化培养基不包含任何其他动物血清，优选除人血清之外不包含其他血清。

在一个实施方案中，成骨分化培养基包含或组成为补充有地塞米松、抗坏血酸和磷酸钠的增殖培养基。在一个实施方案中，成骨分化培养基还包含抗生素，例如青霉素、链霉素、庆大霉素和/或两性霉素B。在一个实施方案中，所有培养基均不含动物蛋白。

在一个实施方案中，增殖培养基可以是本领域普通技术人员已知的被设计为支持细胞生长的任何培养基。如本文所用，增殖培养基也称为“生长培养基”。生长培养基的实例包括但不限于MEM、DMEM、IMDM、RPMI1640、FGM或FGM-2、199/109培养基，HamF10/HamF12或McCoy’s 5A。在一个优选的实施方案中，增殖培养基是DMEM。

在一个实施方案中，成骨分化培养基包含或组成为补充有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Ala-Gln，也称为

或

)、hPL、地塞米松、抗坏血酸和磷酸钠的DMEM。在一个实施方案中，成骨分化培养基包含或组成为补充有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、hPL、地塞米松、抗坏血酸和磷酸钠的DMEM，以及抗生素，优选青霉素、链霉素、庆大霉素和/或两性霉素B。

在一个实施方案中，成骨分化培养基包含或组成为补充有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、hPL(约5％，体积/体积)、地塞米松(约1μM)、抗坏血酸(约0.25mM)和磷酸钠(约2.93mM)的DMEM。在一个实施方案中，成骨分化培养基包含或组成为补充有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、hPL(约5％，体积/体积)、地塞米松(约1μM)、抗坏血酸(约0.25mM)和磷酸钠(约2.93mM)的DMEM，青霉素(约100U/mL)和链霉素(约100μg/mL)。在一个实施方案中，成骨分化培养基还包含两性霉素B(约0.1％)。

在一个实施方案中，成骨分化培养基组成为补充有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、hPL(约5％，体积/体积)、地塞米松(约1μM)、抗坏血酸(约0.25mM)和磷酸钠(约2.93mM)的DMEM。在一个实施方案中，成骨分化培养基包含或组成为补充有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、hPL(约5％，体积/体积)、地塞米松(约1μM)、抗坏血酸(约0.25mM)和磷酸钠(约2.93mM)的DMEM，青霉素(约100U/mL)，链霉素(约100μg/mL)和两性霉素B(约0.1％)。

在一个实施方案中，ASC是传代后期的脂肪干细胞。如本文所用，术语“传代后期”是指至少在4代之后分化的脂肪干细胞。如本文所用，4代是指第四代，即第四次通过使细胞从培养容器的表面脱离，之后将细胞重悬于新鲜培养基中来分离细胞。在一个实施方案中，传代后期的脂肪干细胞在4代、5代、6代或多于6代之后分化。在一个优选的实施方案中，ASC在4代之后分化。

如本文所用，术语“容器”是指任何细胞培养表面，例如烧瓶或孔板。

原代细胞的初始代称为0代(P0)。根据本发明，P0代是指将来自沉淀的基质血管部分(SVF)的细胞悬浮液接种到培养容器上。因此，P4代是指将细胞从培养容器表面分离4次(在P1、P2、P3和P4)(例如，用胰蛋白酶消化)，然后重悬在新鲜培养基中。

在一个实施方案中，本发明的ASC在增殖培养基中培养直至第四代。在一个实施方案中，本发明的ASC在第四次传代后在分化培养基中培养。因此，在一个实施方案中，在P1代、P2代和P3代，将ASC从培养容器的表面分离，然后在增殖培养基中稀释至合适的细胞密度。仍然根据该实施方案，在P4代，将ASC从培养容器的表面分离，然后在分化培养基中稀释至合适的细胞密度。因此，根据该实施方案，在P4，在分化之前(即在分化培养基中培养之前)，直到本发明的ASC达到汇合，不对本发明的ASC在增殖培养基中进行重悬和培养，而是直接对其在分化培养基中进行重悬和培养。

在一个实施方案中，将细胞保持在成骨分化培养基中至少直至它们达到汇合，优选70％至100％汇合，更优选80％至95％汇合。在一个实施方案中，将细胞在成骨分化培养基中维持至少5天，优选至少10天，更优选至少15天。在一个实施方案中，将细胞在成骨分化培养基中维持5天至30天，优选10天至25天，更优选15天至20天。在一个实施方案中，每2天更换分化培养基。然而，如本领域中已知的，一个供体与另一个供体的细胞生长速率可能略有不同。因此，成骨分化的持续时间和更换培养基的次数可能因各个供体而异。

在一个实施方案中，将细胞保持在成骨分化培养基中至少持续到形成类骨质，即在骨组织成熟之前形成的骨基质的未矿化的有机部分。

在一个实施方案中，本发明的陶瓷材料为颗粒形式，在本文中称为陶瓷颗粒。在一个实施方案中，颗粒可以是珠、粉末、球体、微球等。

在一个实施方案中，本发明的陶瓷材料是磷酸钙(CaP)、碳酸钙(CaCO3)、硫酸钙或氢氧化钙(Ca[OH]2)或其组合的颗粒。

磷酸钙颗粒的实例包括但不限于羟基磷灰石(HA，Ca10(PO₄)₆(OH)₂)、磷酸三钙(TCP，Ca₃[PO₄]₂)、α-磷酸三钙(α-TCP，(α-Ca₃(PO4)₂)、β-磷酸三钙(β-TCP，β-Ca₃(PO4)₂)、磷酸四钙(TTCP，Ca₄(PO₄)₂O)、磷酸八钙(Ca₈H₂(PO₄)₆.5H₂O)、无定形磷酸钙(Ca₃(PO₄)₂)、羟基磷灰石/β-磷酸三钙(HA/β-TCP)、羟基磷灰石/磷酸四钙(HA/TTCP)等。

在一个实施方案中，本发明的陶瓷材料包含或组成为羟基磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)、羟基磷灰石/β-磷酸三钙(HA/β-TCP)、硫酸钙或其组合。在一个实施方案中，本发明的陶瓷材料包含或组成为羟基磷灰石(HA)、β-磷酸三钙(β-TCP)、羟基磷灰石/β-磷酸三钙(HA/β-TCP)、α-磷酸三钙(α-TCP)、硫酸钙或其组合。

在一个实施方案中，本发明的陶瓷颗粒是羟基磷灰石(HA)的颗粒。在另一个实施方案中，本发明的陶瓷颗粒是β-磷酸三钙(β-TCP)的颗粒。在另一个实施方案中，本发明的陶瓷颗粒是羟基磷灰石/β-磷酸三钙(HA/β-TCP)的颗粒。换句话说，在一个实施方案中，本发明的陶瓷颗粒是羟基磷灰石和β-磷酸三钙颗粒的混合物(称为HA/β-TCP颗粒)。在一个实施方案中，本发明的陶瓷颗粒由羟基磷灰石颗粒和β-磷酸三钙颗粒组成(称为HA/β-TCP颗粒)。

在一个实施方案中，陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒为颗粒、粉末或珠形式。在一个实施方案中，陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒为多孔颗粒、粉末或珠形式。在一个实施方案中，陶瓷颗粒，优选HA，β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒为多孔陶瓷材料。在一个实施方案中，陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒为粉末颗粒。在一个特定的实施方案中，陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒为多孔颗粒形式。在另一个特定的实施方案中，陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒为粉末形式。在一个实施方案中，陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒未被构造以形成预定的3D形状或支架，例如立方体。在一个实施方案中，本发明的陶瓷材料不是3D支架。在一个实施方案中，陶瓷材料不具有预定的形状或支架。在一个实施方案中，本发明的陶瓷材料不具有立方体的形式。在一个实施方案中，本发明的生物材料是无支架的。

在一个实施方案中，本发明的陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒大于约50μm，优选大于约100μm。在一个实施方案中，本发明的陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒的平均直径大于约50μm，优选大于约100μm。

在一个实施方案中，本发明的陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒的平均直径为至少约50μm，优选为至少约100μm，更优选为至少约150μm。在另一个实施方案中，本发明的陶瓷颗粒，优选HA、TCP和/或HA/β-TCP颗粒的平均直径为至少约200μm，优选至少约250μm，更优选至少约300μm。

在另一个实施方案中，本发明的陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒的平均直径为至多约2500μm，优选为至多约2000μm，更优选为至多约1500μm。在一个实施方案中，本发明的陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒的平均直径为至多约1000μm、900μm、800μm、700μm或600μm。

在一个实施方案中，本发明的陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒的平均直径为约50μm至约1500μm，优选约50μm至约1250μm，更优选约100μm至约1000μm。在一个实施方案中，本发明的陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒的平均直径为约100μm至约800μm，优选约150μm至约700μm，更优选约200μm至约600μm。

在一个实施方案中，HA/β-TCP颗粒的平均直径为约50μm至约1500μm，优选约50μm至约1250μm，更优选约100μm至约1000μm。在一个实施方案中，HA和β-TCP颗粒的平均直径为约100μm至约800μm，优选约150μm至约700μm，更优选约200μm至约600μm。

在一个实施方案中，颗粒中HA与β-TCP的比例(HA/β-TCP比例)为约0/100至约100/0，优选为约10/90至约90/10，更优选为约20/80至约80/20。在一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为约30/70至约70/30、约35/65至约65/35或约40/60至约60/40。

在一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为0/100，即颗粒为β-磷酸三钙的颗粒。在另一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为100/0，即颗粒是羟基磷灰石的颗粒。在一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为约10/90。在另一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为约90/10。在一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为约20/80。在另一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为约80/20。在一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为约30/70。在另一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为约70/30。在另一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为约35/65。在另一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为约65/35。在一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为约40/60。在另一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为约60/40。在另一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为约50/50。

在一个实施方案中，颗粒中的HA/β-TCP比例为100比0、99比1、98比2、97比3、96比4、95比5、94比6、93比7、92比8、91比9、90比10、89比11、88比12、87比13、86比14、85比15、84比16、83比17、82比18、81比19、80比20、79比21、78比22、77比23、76比24、75比25、74比26、73比27、72比28、71比29、70比30、69比31、68比32、67比33、66比34、65比35、64比36、63比37、62比38、61比39、60比40、59比41、58比42、57比43、56比44、55比45、54比46、53比47、52比48、51比49、50比50、49比51、48比52、47比53、46比54、45比55、44比56、43比57、42比58、41比59、40比60、39比61、38比62、37比63、36比64、35比65、34比66、33比67、32比68、31比69、30比70、29比71、28比72、27比73、26比74、25比75、24比76、23比77、22比78、21比79、20比80、19比81、18比82、17比83、16比84、15比85、14比86、13比87、12比88、11比89、10比90、9比91、8比92、7比93、6比94、5比95、4比96、3比97、2比98、1比99、或0比100。

根据一个实施方案，陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP的量是对于向生物材料提供3D结构最佳的量。在一个实施方案中，对于150cm²的容器，以约0.1cm³至约5cm³，优选约0.5cm³至约5cm³，更优选约1cm³至约2cm³的浓度添加陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒。在一个优选的实施方案中，对于150cm²的容器，以约1.5cm³的浓度添加陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒。

在一个实施方案中，以每mL培养基约7.10^-3cm³至7.10^-2cm³的浓度添加陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒。在一个实施方案中，以每cm²容器约3.3.10^-3cm³至3.3.10^-2cm³的浓度添加陶瓷颗粒，优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒。

在一个实施方案中，在细胞分化后将本发明的陶瓷材料添加到培养基中。在一个实施方案中，当细胞亚汇合时加入本发明的陶瓷材料。在一个实施方案中，当细胞过度汇合时，加入本发明的陶瓷材料。在一个实施方案中，当细胞在分化后达到汇合时，加入本发明的陶瓷材料。换句话说，在一个实施方案中，当细胞在分化培养基中达到汇合时，添加本发明的陶瓷材料。在一个实施方案中，在P4之后至少5天，优选10天，更优选15天，添加本发明的陶瓷材料。在一个实施方案中，在P4之后5天至30天，优选10天至25天，更优选15天至20天，添加本发明的陶瓷材料。

在一个实施方案中，根据本发明的生物材料是二维的。在该实施方案中，本发明的生物材料可以形成小于1mm的薄膜。

在另一个实施方案中，根据本发明的生物材料是三维的。在该实施方案中，本发明的生物材料可以形成厚度为至少1mm的厚膜。生物材料的大小可以依用途调整。

在一个实施方案中，本发明的生物材料不包含支架。如本文所用，术语“支架”是指模拟包括人和动物组织在内的天然哺乳动物组织例如天然哺乳动物骨骼或细胞外基质的孔隙率、孔径和/或功能的结构。这种支架的实例包括但不限于人造骨、胶原海绵、水凝胶例如蛋白质水凝胶、肽水凝胶、聚合物水凝胶和木基纳米纤维素水凝胶等。在一个实施方案中，本发明的生物材料不包含人造骨。在一个实施方案中，本发明的陶瓷材料不是人造骨。

在一个实施方案中，本发明的多维生物材料不归因于模仿天然细胞外基质结构的支架。在一个实施方案中，本发明的生物材料不包含模拟天然细胞外基质结构的支架。

在一个实施方案中，本发明的多维生物材料归因于通过本发明的脂肪组织干细胞合成细胞外基质。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含细胞外基质。在一个实施方案中，本发明的细胞外基质衍生自ASC。在一个实施方案中，本发明的细胞外基质由ASC产生。

如本文所用，术语“细胞外基质”(ECM)是指非细胞三维大分子网络。ECM的基质组分彼此结合并与细胞黏附受体结合，从而在本发明的组织或生物材料中形成使细胞驻留于其中的复杂网络。

在一个实施方案中，本发明的细胞外基质包含胶原、蛋白聚糖/糖胺聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白、层黏连蛋白和/或其他糖蛋白。在一个特定的实施方案中，本发明的细胞外基质包含胶原。在另一个特定的实施方案中，本发明的细胞外基质包含蛋白聚糖。在另一个特定的实施方案中，本发明的细胞外基质包含胶原和蛋白聚糖。在一个实施方案中，本发明的细胞外基质包含生长因子、蛋白聚糖、分泌因子、细胞外基质调节剂和糖蛋白。

在一个实施方案中，本发明生物材料内的ASC形成组织，其在本文中称为ASC组织。在一个实施方案中，将本发明生物材料内的ASC和陶瓷材料，优选陶瓷颗粒，更优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒包埋在细胞外基质中。在一个实施方案中，ASC，优选分化为骨细胞的ASC与陶瓷材料，优选陶瓷颗粒，更优选HA、β-TCP和/或HA/β-TCP颗粒一起形成具有细胞外基质的3D结构。在一个实施方案中，ASC组织是血管化组织。在一个实施方案中，本发明的生物材料是血管化的。

在一个实施方案中，ASC组织是细胞化的互连组织。在一个实施方案中，陶瓷颗粒被整合在细胞化的互连组织中。在一个实施方案中，陶瓷颗粒分散在ASC组织内。

在一个实施方案中，本发明的生物材料的特征在于在陶瓷颗粒之间形成的互连组织。在一个实施方案中，本发明的生物材料的特征在于围绕陶瓷颗粒的矿化。在一个实施方案中，可以通过组织回缩的发生来确认形成的生物材料的组织性质。

在一个实施方案中，本发明的生物材料具有与具有骨钙素表达和矿化特性的真骨相同的特性。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含骨细胞。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含骨细胞和细胞外基质。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含骨细胞和胶原。在一个特定的实施方案中，胶原是钙化和矿化的胶原。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含骨基质。

在一个实施方案中，本发明的生物材料是生物材料中细胞的分化达到终点，并且当植入时生物材料的表型将保持不变的那些生物材料。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含生长因子。在一个实施方案中，在添加生物相容性材料后第4周、5周、6周、7周或8周评估本发明生物材料的生长因子含量或分泌。

护骨因子(OPG)，也称为破骨细胞生成抑制因子(OCIF)或肿瘤坏死因子受体超家族成员11B(TNFRSF11B)，是一种细胞因子受体。已经发现，OPG的过度表达或施用会抑制小鼠的破骨细胞生成。同样，已经确定，缺乏OPG的动物会加速破骨细胞生成并发展为严重的骨质疏松症。现在已知OPG是一种可溶性诱饵受体，可与RANK竞争RANKL(核因子κ-B配体的受体激活剂，也称为肿瘤坏死因子配体超家族成员11(TNFSF11)、TNF相关激活诱导的细胞因子(TRANCE)、护骨因子配体(OPGL)或破骨细胞分化因子(ODF))。已确定RANK/RANKL/OPG信号传导通路调节破骨细胞的分化和激活。因此，破骨细胞生成刺激因子RANKL和抑制剂OPG的表达之间的平衡决定了骨吸收的量。

在一个实施方案中，本发明生物材料的OPG含量和/或分泌可以通过本领域已知的任何方法来定量，例如通过ELISA，优选在添加生物相容性材料后第4周、5周、6周、7周或8周进行。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含OPG。在一个实施方案中，本发明的生物材料分泌OPG。在一个实施方案中，本发明生物材料的ASC分泌OPG。在一个实施方案中，本发明的细胞工程生物材料分泌OPG。

在一个实施方案中，本发明的生物材料分泌至少约1000pg OPG/10⁶个细胞、1250pg OPG/10⁶个细胞、1500pg OPG/10⁶个细胞、1750pg OPG/10⁶个细胞或2000pg OPG/10⁶个细胞。在一个实施方案中，本发明的生物材料分泌至少约2100pg OPG/10⁶个细胞、2200pgOPG/10⁶个细胞、2300pg OPG/10⁶个细胞、2400pg OPG/10⁶个细胞或2500pg OPG/10⁶个细胞。在另一个实施方案中，本发明的生物材料分泌至少约2550pg OPG/10⁶个细胞、2600pg OPG/10⁶个细胞、2650pg OPG/10⁶个细胞或2700pg OPG/10⁶个细胞。在另一个实施方案中，本发明的生物材料分泌至少约2750pg OPG/10⁶个细胞、2800pg OPG/10⁶个细胞、2850pg OPG/10⁶个细胞、2900pg OPG/10⁶个细胞或2950pg OPG/10⁶个细胞。

在一个实施方案中，本发明的生物材料分泌至少约2750pg OPG/10⁶个细胞。在另一个实施方案中，本发明的生物材料分泌约2500pg OPG/10⁶个细胞。在另一个实施方案中，本发明的生物材料分泌约3000pg OPG/10⁶个细胞。

在一个实施方案中，本发明的生物材料分泌约1000pg OPG/10⁶个细胞至约10000pg OPG/10⁶个细胞，优选约1250pg OPG/10⁶个细胞至约7500pg OPG/10⁶个细胞，更优选约1500pg OPG/10⁶个细胞至约5000pg OPG/10⁶个细胞。在一个实施方案中，本发明的生物材料分泌约1000pg OPG/10⁶个细胞至约5000pg OPG/10⁶个细胞，优选约1250pg OPG/10⁶个细胞至约4500pg OPG/10⁶个细胞，更优选约1500pg OPG/10⁶个细胞至约4000pg OPG/10⁶个细胞。在一个优选的实施方案中，本发明的生物材料以约2000pg/10⁶个细胞至约3500pg/10⁶个细胞的浓度分泌OPG。在一个特定的实施方案中，本发明的生物材料以约3000pg/10⁶个细胞或3500pg/10⁶个细胞的浓度分泌OPG。

在一个实施方案中，本发明的生物材料分泌至少约5ng OPG/g生物材料，优选至少约10ng OPG/g生物材料，更优选至少约15ng OPG/g生物材料。在另一个实施方案中，本发明的生物材料分泌至少约20ng OPG/g生物材料，优选至少约25ng OPG/g生物材料，更优选至少约30ng OPG/g生物材料。

在另一个实施方案中，本发明的生物材料分泌至少约50ng OPG/g生物材料，优选至少约60ng OPG/g生物材料，更优选至少约70ng OPG/g生物材料。在一个实施方案中，本发明的生物材料分泌至少约75ng OPG/g生物材料。在另一个实施方案中，本发明的生物材料分泌至少约80ng OPG/g生物材料。

在一个实施方案中，本发明的生物材料分泌约5ng OPG/g生物材料至约200ngOPG/g生物材料，优选约10ng OPG/g生物材料至约175ng OPG/g生物材料，更优选约15ngOPG/g生物材料至约150ng OPG/g生物材料。在另一个实施方案中，本发明的生物材料分泌约10ng OPG/g生物材料至约200ng OPG/g生物材料，优选约15ng OPG/g生物材料至约175ngOPG/g生物材料，更优选约20ng OPG/g生物材料至约150ng OPG/g生物材料，甚至更优选约25ng OPG/g生物材料至约125ng OPG/g生物材料。在一个实施方案中，本发明的生物材料分泌约20ng/g生物材料至约100ng/g生物材料。在另一个实施方案中，本发明的生物材料分泌约25ng/g生物材料至约100ng/g生物材料。在另一个实施方案中，本发明的生物材料分泌约30ng/g生物材料至约100ng/g生物材料、约30ng/g生物材料至约90ng/g生物材料或约30ng/g生物材料至约85ng/g生物材料。

在一个特定的实施方案中，本发明的生物材料以约30ng/g生物材料的浓度分泌OPG。在另一个特定的实施方案中，本发明的生物材料以约75ng/g生物材料的浓度分泌OPG。在另一个特定的实施方案中，本发明的生物材料以约85ng/g生物材料的浓度分泌OPG。

在一个实施方案中，在添加陶瓷材料后4周、5周、6周、7周或8周，本发明的生物材料以如上所述的浓度分泌OPG。换句话说，在一个实施方案中，在多维诱导开始后4周、5周、6周、7周或8周，本发明的生物材料以如上所述的浓度分泌OPG。

在一个实施方案中，本发明生物材料的RANKL含量和/或分泌可以通过本领域已知的任何方法例如通过ELISA来定量，优选在添加陶瓷材料后4周、5周、6周、7周或8周进行。

在一个实施方案中，本发明的生物材料或生物材料的上清液(当在培养基中时)中的RANKL水平是不可检测的。在一个实施方案中，RANKL的水平以pg/mL上清液表示。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含或生物材料的ASC分泌少于200pg/mL的RANKL，优选地少于156pg/mL，优选地少于100pg/mL，更优选地少于78pg/mL，甚至更优选小于50pg/mL，甚至更优选少于10pg/mL，甚至更优选少于7.8pg/mL的RANKL。

在一个实施方案中，本发明的生物材料基本上不包含RANKL。在一个实施方案中，本发明生物材料的ASC基本不分泌RANKL。

在一个实施方案中，在添加陶瓷材料后4周、5周、6周、7周或8周，本发明的生物材料以如上所述的浓度分泌RANKL。换句话说，在一个实施方案中，在多维诱导开始后4周、5周、6周、7周或8周，本发明的生物材料以如上所述的浓度分泌RANKL。

在一个实施方案中，本发明的生物材料分泌OPG并且不分泌RANKL，或者不分泌可检测水平的RANKL。

在一个实施方案中，本发明的生物材料分泌至少如上所述浓度的OPG，并分泌至多如上所述浓度的RANKL。

在一个实施方案中，本发明的生物材料显示出骨吸收抑制活性。在一个实施方案中，骨吸收抑制活性包括护骨因子(OPG)的分泌。在一个实施方案中，骨吸收抑制活性包括OPG的分泌和RANKL的低分泌或不分泌。

胰岛素样生长因子(IGF-1)与维持骨矿物质密度和获得更高的峰值骨量正相关，从而降低了随后的骨折风险。

在一个实施方案中，本发明生物材料的IGF-1含量可以通过本领域已知的任何方法来定量，例如通过ELISA，优选在添加陶瓷材料后4周、5周、6周、7周或8周进行。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含IGF-1。在一个特定的实施方案中，本发明的生物材料包含高水平的IGF-1。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为至少约50ng/g生物材料，优选至少约60ng/g生物材料，更优选至少约70ng/g生物材料，甚至更优选至少约80ng/g生物材料的IGF-1。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为至少约90ng/g生物材料、91ng/g生物材料、92ng/g生物材料、93ng/g生物材料、94ng/g生物材料、95ng/g生物材料、96ng/g生物材料、97ng/g生物材料、98ng/g生物材料、99ng/g生物材料或100ng/g生物材料的IGF-1。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约10ng/g生物材料至约500ng/g生物材料，优选为约20ng/g生物材料至约400ng/g生物材料，更优选为约30ng/g生物材料至约300ng/g生物材料，甚至更优选约40ng/g生物材料至约250ng/g生物材料的IGF-1。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约50ng/g生物材料至约200ng/g生物材料，优选为约60ng/g生物材料至约175ng/g生物材料，更优选为约70ng/g生物材料至约150ng/g生物材料的IGF-1。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约80ng/g生物材料至约150ng/g生物材料，优选为约85ng/g生物材料至约125ng/g生物材料，更优选为约90ng/g生物材料至约100ng/g生物材料的IGF-1。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约90ng/g生物材料至约500ng/g生物材料，约90ng/g生物材料至约400ng/g生物材料，约90ng/g生物材料至约300ng/g生物材料，约90ng/g生物材料至约200ng/g生物材料，约90ng/g生物材料至约150ng/g生物材料，约90ng/g生物材料至约125ng/g生物材料或约90ng/g生物材料至约100ng/g生物材料的IGF-1。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约90ng/g生物材料、91ng/g生物材料、92ng/g生物材料、93ng/g生物材料、94ng/g生物材料、95ng/g生物材料、96ng/g生物材料、97ng/g生物材料、98ng/g生物材料、99ng/g生物材料或100ng/g生物材料的IGF-1。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含约90ng/g生物材料的IGF-1。在另一个实施方案中，本发明的生物材料包含约95ng/g生物材料的IGF-1。在另一个实施方案中，本发明的生物材料包含约100ng/g生物材料的IGF-1。

在一个实施方案中，在添加陶瓷材料后的4周、5周、6周、7周或8周，本发明的生物材料包含如上所述浓度的IGF-1。换句话说，在一个实施方案中，在多维诱导开始后4周、5周、6周、7周或8周，本发明的生物材料包含如上所述浓度的IGF-1。

SDF-1α也称为基质细胞衍生因子1-α或CXCL12，在破骨细胞的分化和激活中起刺激作用。破骨细胞，尤其是破骨细胞前体，对SDF-1α的独特受体CXCR4为高度阳性。尽管SDF-1α直接诱导破骨细胞生成，但最近发现SDF-1α可通过上调RANKL表达间接影响破骨细胞生成。破骨细胞及其前体上存在RANK表明，存在于基质细胞上的破骨细胞分化因子可能是RANKL。

在一个实施方案中，本发明生物材料的SDF-1α含量可以通过本领域已知的任何方法例如通过ELISA来定量，优选在添加陶瓷材料后4周、5周、6周、7周或8周进行。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含SDF-1α。在一个特定的实施方案中，本发明的生物材料包含低水平的SDF-1α。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为至多约300ng/g生物材料，优选至多约250ng/g生物材料，更优选至多约200ng/g生物材料，甚至更优选为至多约150ng/g生物材料的SDF-1α。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为至多约100ng/g生物材料，优选至多约90ng/g生物材料，更优选至多约80ng/g生物材料的SDF-1α。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为至多约75ng/g生物材料、约70ng/g生物材料、约65ng/g生物材料、约60ng/g生物材料或约55ng/g生物材料的SDF-1α。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为至多约59ng/g生物材料、58ng/g生物材料、57ng/g生物材料、56ng/g生物材料、55ng/g生物材料、54ng/g生物材料、53ng/g生物材料、52ng/g生物材料或51ng/g生物材料的SDF-1α。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为至多约50ng/g生物材料的SDF-1α。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为至多约49ng/g生物材料、48ng/g生物材料、47ng/g生物材料、46ng/g生物材料、45ng/g生物材料、44ng/g生物材料、43ng/g生物材料、42ng/g生物材料或41ng/g生物材料的SDF-1α。在一个特定的实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为至多约40ng/g生物材料的SDF-1α。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为至多约39ng/g生物材料、38ng/g生物材料、37ng/g生物材料、36ng/g生物材料、35ng/g生物材料、34ng/g生物材料、33ng/g生物材料、32ng/g生物材料或31ng/g生物材料的SDF-1α。在一个特定的实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为至多约30ng/g生物材料的SDF-1α。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约5ng/g生物材料至约100ng/g生物材料，优选为约10ng/g生物材料至约90ng/g生物材料，更优选为约15ng/g生物材料至约90ng/g生物材料的SDF-1α。在另一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约20ng/g生物材料至约80ng/g生物材料，优选为约25ng/g生物材料至约70ng/g生物材料，更优选为约25ng/g生物材料至约60ng/g生物材料的SDF-1α。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约25ng/g生物材料至约55ng/g生物材料的SDF-1α。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约30ng/g生物材料至约100ng/g生物材料、约30ng/g生物材料至约90ng/g生物材料、约30ng/g生物材料至约80ng/g生物材料、约30ng/g生物材料至约70ng/g生物材料、约30ng/g生物材料至约60ng/g生物材料、约30ng/g生物材料至约55ng/g生物材料或约30ng/g生物材料至约50ng/g生物材料的SDF-1α。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含约30ng/g生物材料的SDF-1α。在另一个实施方案中，本发明的生物材料包含约40ng/g生物材料的SDF-1α。在另一个实施方案中，本发明的生物材料包含约50ng/g生物材料的SDF-1α。

在一个实施方案中，在添加陶瓷材料后的4周、5周、6周、7周或8周，本发明的生物材料包含如上所述浓度的SDF-1α。换句话说，在一个实施方案中，在多维诱导开始后4周、5周、6周、7周或8周，本发明的生物材料包含如上所述浓度的SDF-1α。

在一个实施方案中，本发明的生物材料分泌上述浓度的OPG，包含上述浓度的IGF1，并包含上述浓度的SDF-1α。

在一个特定的实施方案中，本发明的生物材料：

-分泌至少约5ng/g生物材料，优选至少约10ng/g生物材料，更优选至少约15ng/g生物材料的OPG，

-包含至少约10ng/g生物材料，优选至少约25ng/g生物材料，更优选至少约50ng/g生物材料的IGF1，和

-包含至多约200ng/g生物材料，优选至多约150ng/g生物材料，更优选至多约100ng/g生物材料的SDF-1α。

在另一个特定的实施方案中，本发明的生物材料：

-分泌至少约10ng/g生物材料，优选至少约20ng/g生物材料，更优选至少约30ng/g生物材料的OPG，

-包含至少约50ng/g生物材料，优选至少约75ng/g生物材料，更优选至少约90ng/g生物材料的IGF1，和

-包含至多约100ng/g生物材料，优选至多约75ng/g生物材料，更优选至多约50ng/g生物材料的SDF-1α。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含血管内皮生长因子(VEGF)。在一个特定的实施方案中，本发明的生物材料包含高水平的VEGF。

在一个实施方案中，本发明生物材料的VEGF含量可以通过本领域已知的任何方法例如通过ELISA来定量，优选在添加陶瓷材料后4周、5周、6周、7周或8周进行。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为至少约10ng/g生物材料，优选至少约20ng/g生物材料，更优选至少约30ng/g生物材料的VEGF。在另一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为至少约50ng/g生物材料、至少约60ng/g生物材料，至少约70ng/g生物材料或至少约75ng/g生物材料的VEGF。在另一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为至少约95ng/g生物材料或100ng/g生物材料的VEGF。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约10ng/g生物材料至约150ng/g生物材料，优选为约20ng/g生物材料至约125ng/g生物材料，更优选为约25ng/g生物材料至约100ng/g生物材料的VEGF。在另一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约20ng/g生物材料至约100ng/g生物材料的VEGF。在另一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约30ng/g生物材料至约100ng/g生物材料的VEGF。在另一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约35ng/g生物材料至约100ng/g生物材料的VEGF。在另一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约35ng/g生物材料至约95ng/g生物材料的VEGF。

在一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约35ng/g生物材料的VEGF。在另一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约75ng/g生物材料的VEGF。在另一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约95ng/g生物材料的VEGF。在另一个实施方案中，本发明的生物材料包含浓度为约100ng/g生物材料的VEGF。

在一个实施方案中，在添加陶瓷材料后的4周、5周、6周、7周或8周，本发明的生物材料包含如上所述浓度的VEGF。换句话说，在一个实施方案中，在多维诱导开始后4周、5周、6周、7周或8周，本发明的生物材料包含如上所述浓度的VEGF。

骨形态发生蛋白2或BMP2在刺激骨骼发育中起重要作用。例如，已证明其有效诱导成骨细胞分化。

骨形态发生蛋白7或BMP7在间充质细胞向骨骼的转化中起着关键作用，特别是通过诱导SMAD1和SMAD5的磷酸化，进而诱导众多成骨基因的转录来起作用。

在一个实施方案中，本发明生物材料的BMP2和BMP7含量可以通过本领域已知的任何方法例如通过ELISA来定量，优选在添加陶瓷材料后4周、5周、6周、7周或8周进行。

在一个实施方案中，本发明的生物材料或生物材料的上清液(当在培养基中时)中的BMP2水平是不可检测的。在一个实施方案中，本发明的生物材料基本上不包含BMP2。在一个实施方案中，本发明生物材料的ASC基本不分泌BMP2。

在一个实施方案中，BMP2的水平以pg/mL上清液表示。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含或生物材料的ASC分泌少于100pg/mL，优选少于85pg/mL，更优选少于75pg/mL，甚至更优选少于62.5pg/mL的BMP2。

在一个实施方案中，本发明的生物材料或生物材料的上清液(当在培养基中时)中的BMP7水平是不可检测的。在一个实施方案中，本发明的生物材料基本上不包含BMP7。在一个实施方案中，本发明生物材料的ASC基本不分泌BMP7。

在一个实施方案中，BMP7的水平以pg/mL上清液表示。在一个实施方案中，本发明的生物材料包含或生物材料的ASC分泌少于50pg/mL，优选少于40pg/mL，更优选少于35pg/mL，甚至更优选少于31.2pg/mL的BMP7。

在一个实施方案中，在添加陶瓷材料后的4周、5周、6周、7周或8周，本发明的生物材料包含如上所述浓度的BMP2和/或BMP7。换句话说，在一个实施方案中，在多维诱导开始后4周、5周、6周、7周或8周，本发明的生物材料包含如上所述浓度的BMP2和/或BMP7。

在一个实施方案中，根据本发明的生物材料是矿化的。如本文所用，术语“矿化”或“骨组织矿物质密度”是指每平方厘米的骨或由生物材料形成的“骨样”组织的矿物质的量，也以百分比表示。因此，如本文所用，术语“矿化”或“骨组织矿物质密度”是指每平方厘米生物材料中矿物质的量，也以百分比表示。

评估生物材料的矿化度的方法是本领域已知的。此类方法的实例包括但不限于微型计算机断层扫描(微型CT)分析、成像质谱、钙黄绿素蓝染色、骨矿物质密度分布(BMDD)分析等。

在一个实施方案中，本发明生物材料的矿化度不小于约1％。在一个实施方案中，本发明生物材料的矿化度大于约1％。

在另一个实施方案中，本发明生物材料的矿化度为至少约5％，优选至少约10％，更优选至少约15％。在另一个实施方案中，本发明生物材料的矿化度为至少约20％，优选至少约25％，更优选至少约30％，甚至更优选至少约35％。在一个实施方案中，本发明生物材料的矿化度为至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％或38％。

在一个实施方案中，本发明生物材料的矿化度为约5％至约50％，优选为约10％至约45％，更优选为约15％至约40％。在另一个实施方案中，本发明生物材料的矿化度为约20％至约50％，优选为约25％至约45％，更优选为约30％至约40％。在一个实施方案中，本发明生物材料的矿化度为约35％至约40％。在一个特定的实施方案中，本发明的生物材料的矿化度为约38％。

在一个实施方案中，本发明生物材料的矿化度与OPG的分泌成比例。在一个实施方案中，生物材料包含的OPG越多，生物材料矿化得越多。

本发明还涉及用于产生包含分化为成骨细胞的脂肪组织干细胞(ASC)、陶瓷材料和细胞外基质的多维生物材料的方法，其中所述生物材料包含护骨因子(OPG)。

在一个实施方案中，根据本发明的用于产生生物材料的方法包括以下步骤：

-使细胞增殖，

-使细胞分化，和

-进行多维诱导，例如3D诱导。

在一个实施方案中，根据本发明的用于产生生物材料的方法包括以下步骤：

-使ASC增殖，

-使ASC成骨分化，和

-进行多维诱导，优选3D诱导。

在一个实施方案中，根据本发明的用于产生生物材料的方法包括以下步骤：

-使细胞增殖，优选使ASC增殖，

-使增殖的细胞分化，优选使增殖的ASC分化，和

-在陶瓷材料的存在下培养分化的细胞，优选ASC。

在一个实施方案中，根据本发明的用于产生生物材料的方法包括以下步骤：

-从对象中分离细胞，优选ASC；

-使细胞，优选ASC增殖，

-使增殖的细胞，优选ASC分化，和

-在陶瓷材料的存在下培养分化的细胞，优选ASC。

在一个实施方案中，用于产生本发明生物材料的方法还包括在细胞增殖步骤之前进行的分离细胞的步骤，所述细胞优选为ASC，更优选为自体ACS。在一个实施方案中，用于产生本发明生物材料的方法还包括在细胞增殖步骤之前进行的分离细胞的步骤，所述细胞优选为ASC。

在一个实施方案中，增殖步骤在增殖培养基中进行。在一个特定的实施方案中，增殖培养基是DMEM。在一个实施方案中，增殖培养基补充有Ala-Gln和/或人血小板裂解物(hPL)。在一个实施方案中，增殖培养基还包含抗生素，例如青霉素和/或链霉素。

在一个实施方案中，增殖培养基包含或组成为补充有Ala-Gln和hPL(5％)的DMEM。在一个实施方案中，增殖培养基包含或组成为补充有Ala-Gln、hPL(5％，体积/体积)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的DMEM。

在一个实施方案中，增殖步骤如上所述进行。在一个实施方案中，增殖步骤进行至P8。在一个实施方案中，增殖步骤持续至P4、P5、P6、P7或P8。因此，在一个实施方案中，细胞增殖步骤包括至少3代。在一个实施方案中，细胞增殖步骤包括至多7代。在一个实施方案中，细胞增殖步骤包括3代至7代。在一个特定的实施方案中，增殖步骤进行至P4。因此，在一个实施方案中，细胞增殖步骤包括从培养容器的表面分离细胞，然后在P1、P2和P3代时将它们稀释在增殖培养基中。在增殖至P6的一个实施方案中，细胞增殖的步骤包括从培养容器的表面分离细胞，然后在P1、P2、P3、P4和P5代时将它们稀释在增殖培养基中。

在一个实施方案中，增殖步骤持续至足以使细胞传代3次、4次、5次、6次或7次的时间。在一个特定的实施方案中，增殖步骤持续至足以使细胞传代3次的时间。在一个实施方案中，增殖步骤持续到在最后一次传代后细胞达到汇合为止，优选为70％至100％的汇合，更优选为80％至95％的汇合。在一个实施方案中，增殖步骤持续到在第三次、第四次、第五次、第六次或第七次传代后细胞达到汇合为止。

在一个有利的实施方案中，在添加生物相容性颗粒之前在分化培养基中培养细胞，优选ASC是本发明方法的关键步骤。这样的步骤对于使ASC分化为成骨细胞是必需的。另外，该步骤对于获得多维结构是必需的。

在一个实施方案中，在P4、P5、P6、P7或P8之后进行分化步骤。在一个实施方案中，在细胞未汇合时进行分化步骤。在一个特定的实施方案中，在P4、P5、P6、P7或P8之后进行分化步骤，无需培养细胞至汇合。

在一个实施方案中，在P4、P5、P6、P7或P8时进行分化步骤。在一个实施方案中，在细胞未汇合时进行分化步骤。在一个特定的实施方案中，在P4、P5、P6、P7或P8时进行分化步骤，无需培养细胞至汇合。

在一个实施方案中，通过在分化培养基，优选成骨分化培养基中孵育细胞来进行分化步骤。在一个实施方案中，通过将从培养皿表面分离的细胞重悬于分化培养基，优选成骨分化培养基中来进行分化步骤。

在一个实施方案中，在成骨分化培养基中将ASC孵育至少5天，优选至少10天，更优选至少15天。在一个实施方案中，在成骨分化培养基中将ASC孵育5天至30天，优选10天至25天，更优选15天至20天。在一个实施方案中，每2天更换分化培养基。

在一个实施方案中，通过在分化培养基中添加如上文所限定的陶瓷材料来进行多维诱导，优选3D诱导的步骤。在一个实施方案中，在多维诱导，优选3D诱导步骤期间，将细胞保持在分化培养基中。

在一个实施方案中，当细胞在分化培养基中达到汇合，优选70％至100％的汇合，更优选80％至95％的汇合时，进行多维诱导，优选3D诱导的步骤。

在另一个实施方案中，当出现形态变化例如结节预先形成时，进行多维诱导，优选3D诱导的步骤。在一个实施方案中，当形成至少一个类骨质节结时，进行多维诱导，优选3D诱导的步骤。如本文所用，术语“类骨质”是指在骨组织成熟之前形成的骨基质的未矿化的有机部分。

在另一个实施方案中，当细胞达到汇合时，当出现形态学变化时以及当形成至少一个类骨质节结时，进行多维诱导，优选3D诱导的步骤。

在一个实施方案中，将本发明的细胞和陶瓷材料孵育至少5天，优选至少10天，更优选至少15天。在一个实施方案中，将本发明的细胞和陶瓷材料孵育10天至30天，优选15天至25天，更优选20天。在一个实施方案中，在多维诱导，优选3D诱导步骤期间，每2天更换一次培养基。

本发明还涉及可通过根据本发明的方法获得的多维生物材料。在一个实施方案中，多维生物材料是通过根据本发明的方法获得的。在一个实施方案中，多维生物材料是通过根据本发明的方法产生的。在一个实施方案中，通过本发明的方法能够获得的或获得的生物材料旨在植入人体或动物体内。在一个实施方案中，植入的生物材料可以是自体来源的或同种异体的。在一个实施方案中，本发明的生物材料可以被植入骨或软骨区域中。在一个实施方案中，该生物材料可以被植入人体或动物体的不规则区域中。

在一个实施方案中，本发明的生物材料是均匀的，这意味着在整个组织中该生物材料的结构和/或构造是相似的。在一个实施方案中，该生物材料具有植入天然疾病区域所需的期望的处理和机械特性。在一个实施方案中，通过本发明的方法能够获得的或获得的生物材料可以用外科器械保持而不被撕裂。

本发明的另一个目的是一种医疗器械，其包括根据本发明的生物材料。

另一个目的是药物组合物，其包含根据本发明的生物材料和至少一种药学上可接受的载体。

本发明还涉及根据本发明的生物材料或药物组合物，其用作药物。

本发明涉及本发明生物材料作为医疗装置或包括在医疗装置中或在药物组合物中的任何用途。在一些实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物是油灰状材料，其可以在使用前被操作和成型。

本发明还涉及一种在有需要的对象中治疗骨缺损或软骨缺损的方法，该方法包括向对象施用治疗有效量的根据本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物。

如本文所用，术语“骨缺损”是指在其中通常应有骨或治疗上期望形成骨组织的身体区域中缺乏骨组织。

如本文所用，术语“软骨缺损”是指在其中通常应有软骨或治疗上期望形成软骨组织的身体区域中缺乏软骨组织。

本发明的另一个目的是根据本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物，其用于在有需要的对象中治疗骨缺损或软骨缺损。本发明的另一个目的是根据本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物在治疗有需要的对象中的骨缺损中的用途。

骨缺损的实例包括但不限于骨折、骨脆弱、骨矿物质密度降低、关节炎、假关节例如先天性假关节、骨质疏松症、脊椎滑脱、脊椎前移、骨软化症、骨质减少、骨癌、佩吉特病、硬化性病变、骨的浸润性疾病、松质和皮质骨坏死、脊柱裂、延迟愈合、成骨不全、颅骨缺损(例如肿瘤切除或出血后的颅骨缺损)、骨坏死和代谢性骨质丢失。

软骨缺陷的实例包括但不限于软骨受损或身体区域缺乏软骨。软骨缺损的原因可能是由于外伤、骨坏死、骨软骨炎和其他病症。软骨缺损最常见于膝关节，通常由外伤引起，并与韧带损伤如前十字韧带(ACL)撕裂相关。

在一个实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物用于治疗骨缺损或用于治疗骨缺损的用途，所述骨缺损选自骨折、骨脆弱、骨矿物质密度降低、关节炎、假关节例如先天性假关节、骨质疏松症、脊椎滑脱、脊椎前移、骨软化症、骨质减少、骨癌、佩吉特病、硬化性病变、骨的浸润性疾病、松质和皮质骨坏死、脊柱裂、延迟愈合、成骨不全、颅骨缺损(例如肿瘤切除或出血后的颅骨缺损)、骨坏死和代谢性骨质丢失。

在一个实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物用于治疗骨缺损或用于治疗骨缺损的用途，所述骨缺损选自骨折、关节炎、先天性假关节、骨质疏松症、脊椎滑脱、脊椎前移、骨癌、佩吉特病、硬化性病变、松质和皮质骨坏死以及代谢性骨质丢失。

在一个实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物用于治疗脊椎滑脱和/或脊椎前移，或用于治疗脊椎滑脱和/或脊椎前移的用途。脊椎滑脱是椎弓峡部(parsinterarticularis)的缺损或应力性骨折。脊椎前移或滑脱是一个椎骨相对于相邻椎骨的平移移位或非解剖排列，发生在约30％的脊椎滑脱患者中。

在一个实施方案中，脊椎前移是发育不良、峡部裂性、退行性、创伤性、病理性和/或手术后/医源性的脊椎前移。在一个实施方案中，脊椎前移是来自第五腰椎的上骶关节面或下关节面的先天性异常的发育不良的脊椎前移(也称为1型)。在另一个实施方案中，脊椎前移是峡部裂性的脊椎前移(也称为2型)，由峡部的缺损引起，但是也可以出现在细长的峡部中。在另一个实施方案中，脊椎前移是退行性脊椎前移(也称为3型)，由关节面关节炎和关节重塑引起。在另一个实施方案中，脊椎前移是创伤性脊椎前移(也称为4型)，由除了峡部以外的神经弓的急性骨折引起。在另一个实施方案中，脊椎前移是病理性脊椎前移(也称为5型)，由感染或恶性肿瘤引起的。在另一个实施方案中，脊椎前移是手术后/医源性脊椎前移(也称为6型)，由手术后的并发症引起。

在一个实施方案中，根据Myerding分类，脊椎前移分为I级、II级、III级、IV级或V级。在一个实施方案中，脊椎前移为I级，其对应于以椎体宽度的百分比测量的0％到25％的滑脱度。在另一个实施方案中，脊椎前移为II级，其对应于25％至50％的滑脱度。在另一个实施方案中，脊椎前移为III级，其对应于50％至75％的滑脱度。在另一个实施方案中，脊椎前移为IV级，其对应于75％至100％的滑脱度。在另一个实施方案中，脊椎前移为V级，其对应于大于100％的滑脱度。

在一个实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物用于填充有需要的对象中待植入的椎间体间隙和/或椎间融合器(fusion cage)。

在一个实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物用于治疗先天性假关节，或用于治疗先天性假关节的用途。在一个特定的实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物用于治疗先天性胫骨假关节(CPT)，或用于治疗先天性胫骨假关节的用途。CPT是指自然发生或在轻微创伤后发生的胫骨骨折的不愈合：胫骨显示节段性发育不良的区域，从而导致骨骼的前外侧弯曲。CPT通常与神经纤维瘤病相关，并且仍然是小儿矫形外科手术面临的最具挑战性和最可怕的病症之一。通常，这种疾病在小于一岁的儿童中就明显存在，但是可能直到12岁仍未被发现。

在一个实施方案中，根据克劳福德分类，CPT分为I型、II型、III型或IV型。在一个实施方案中，CPT为I型，其对应于前弓弯曲(anterior bowing)、皮质密度增加且髓质狭窄。在另一个实施方案中，CPT为II型，其对应于前弓弯曲且硬化性髓质狭窄。在另一个实施方案中，CPT为III型，其对应于与囊肿或预裂征兆相关的前弓弯曲。在另一个实施方案中，CPT为IV型，其对应于前弓弯曲和通常与胫骨和腓骨相关的假关节的明显骨折。

在一个实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物用于治疗儿童患者先天性胫骨假关节，或用于治疗儿童患者先天性胫骨假关节的用途。在一个实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物用于治疗儿童先天性胫骨假关节，或用于治疗儿童先天性胫骨假关节的用途。

本发明还涉及本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物在整形外科特别是颌面外科或整形外科中的用途。本发明的生物材料也可以用于风湿病学中。

本发明还涉及使用本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物来治疗、矫正或减轻手术、外伤或其他先天性或获得性异常后的先天性或获得性关节异常、颅颌面部上颌骨异常、正畸紊乱、骨骼或关节骨病症(例如需要更换)，并用于支持其他肌肉骨骼植入物，尤其是人工和合成植入物的方法。

在另一个方面，本发明涉及本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物，其用于骨重建。在一个实施方案中，本发明的生物材料用于填充人体或动物体内的骨腔。

在另一个方面，本发明涉及本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物，其用于重建手术或美容手术。

在一个实施方案中，本发明涉及用于重建手术的本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及用于美容手术的本发明的生物材料。

在一个实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物可以用作同种异体植入物或自体植入物。在一个实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物可以用作异种植入物。在一个实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物可以用于组织移植中。

本发明的生物材料对于刺激血管生成也是有利的。实际上，生物材料的ASC释放出刺激新血管生长的血管内皮生长因子(VEGF)。

在一个实施方案中，对象是人类对象。在另一个实施方案中，对象是动物对象，例如宠物、家畜或生产动物。在一个实施方案中，对象是哺乳动物对象。

在一个实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物可以用于人和/或动物。在一个实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物可以用于人类和兽医学。

在一个实施方案中，对象患有骨缺陷和/或软骨缺陷。

在一个特定的实施方案中，对象患有脊椎滑脱和/或脊椎前移。在另一个特定的实施方案中，对象患有先天性胫骨假关节(CPT)。在一个特定的实施方案中，对象患有小儿先天性胫骨假关节(CPT)。

在一个实施方案中，对象已进行过骨缺损和/或软骨缺损的治疗。

在一个特定的实施方案中，对象已进行过脊椎滑脱和/或脊椎前移的治疗。脊椎滑脱和/或脊椎前移的其他治疗方法的实例包括但不限于保守治疗，例如支撑、活动限制、伸展运动、俯屈运动和腹部深部锻炼；以及诸如脊柱融合术和椎板切除术的手术。

在另一个特定的实施方案中，对象已经已进行过CPT治疗。用于CPT的其他治疗方法的实例包括但不限于支撑和手术，例如与骨移植物相关的髓内钉、血管化骨转移、Ilizarov技术、诱导膜和海绵状自体移植物。

在一个实施方案中，对象对骨缺损和/或软骨缺损的至少一种其他治疗方法无响应。

在一个实施方案中，对象是婴儿或儿童。因此，在一个实施方案中，对象是小儿对象。在一个实施方案中，对象为18岁以下，优选为15岁、12岁或10岁。

在另一个实施方案中，对象是成人。因此，在一个实施方案中，对象超过18岁。

在一个实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物在骨缺损和/或软骨缺损手术例如脊柱融合手术期间施用于有需要的对象。

在一个实施方案中，本发明的生物材料、医疗装置或药物组合物与清创术、一个或两个椎间体融合器的放置以及双侧椎弓根螺钉的固定和/或康复结合使用。

本发明还涉及一种试剂盒，其包括根据本发明的生物材料、药物组合物或医疗装置以及合适的固定装置。合适的固定装置的实例包括但不限于外科胶，组织胶或任何外科用的具有生物相容性、无毒的且可生物吸收的黏合剂组合物。

附图简要说明

图1是显示与未经处理的细胞相比，以三种不同浓度(1.5cm³、2.85cm³和5.91cm³)间接接触HA/β-TCP的hASC的细胞活力的直方图，以百分比表示。

图2是显示所形成的具有HA/β-TCP(A)、HA(B)或β-TCP(C)的生物材料的宏观视图的一组照片。

图3是显示所形成的具有HA/β-TCP的生物材料的显微图的一组照片。

图4是显示所形成的具有HA/β-TCP的生物材料的苏木精-伊红染色(A)，Masson三色染色(B)和骨钙素染色(C)的一组照片。

图5是显示在三种不同比例(A、B和C)下所形成的具有HA/β-TCP的生物材料的微型CT分析的一组照片。

图6是显示所形成的具有HA/β-TCP的生物材料的IGF1(深灰色)、VEGF(浅灰色)和SDF-1(中灰色)含量的直方图。

图7是显示在MP培养基和MD培养基中以及所形成的具有HA/β-TCP的生物材料的培养基中的2D培养中，以pg/10⁶个细胞计的ASC的OPC分泌的直方图。

图8是显示在MD培养基的2D培养中以及所形成的具有HA/β-TCP、HA和β-TCP的生物材料的培养中，以ng/g材料计的ASC的OPC分泌的直方图。

图9是显示与在MP(MP)和MD(MD)中的ASC相比，所形成的具有HA/β-TCP(生物材料)的本发明生物材料中基因FGFR1(A)、IGFR1(B)、RUNX2(C)、TWIST1(D)、TGFBR1(E)、SMAD2(F)、SMAD4(G)、SMAD5(H)表达的一组图。*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001。

图10是显示与MP(MP)和MD(MD)中的ASC相比，所形成的具有HA/β-TCP(生物材料)的本发明生物材料中基因ANG(A)、EFNA1(B)、EFNB2(C)、VEGFA(D)、FGF1(E)、LEP(F)表达的一组图。*：p<0.05，**：p<0.01。

图11是显示与MP(MP)和MD(MD)中的ASC相比，所形成的具有HA/β-TCP(生物材料)的本发明生物材料在低氧(1％)或常氧(21％)下的VEGF(A)和SDF-1α(B)分泌的一组直方图。

图12是显示对来自本发明生物材料的外植体进行血管性假血友病因子免疫染色的照片。HA/β-TCP颗粒用符号*表示，容器用黑色箭头表示。

图13是显示本发明生物材料中的血管面积百分比(A)和血管数/mm²(B)的一组直方图。

图14是显示在大鼠中植入后第28天在本发明的生物材料中通过过氧化物酶显色(在此由黑色箭头表示)通过HLA/人白细胞抗原免疫染色所显示的褐色人细胞的存在的照片。HA/β-TCP颗粒用符号*表示。

图15是显示在大鼠中植入本发明生物材料(左上和左下)和单独的HA/β-TCP颗粒(右上和右下)后1个月，股骨的微型CT扫描的一组照片。下部照片是上部照片的放大。虚线矩形代表植入部位。

图16是显示植入HA/β-TCP颗粒后1个月骨缺损的组织学的一组照片：苏木精-伊红染色，原始放大倍数x5(A)；Masson三色染色，原始放大倍数x20(B)。白色箭头表示产品未整合和重要的纤维化。黑色箭头表示在天然骨与HA/β-TCP植入物之间的界面处的缺损中没有软骨内成骨。

图17是显示植入本发明生物材料后1个月骨缺损的组织学的一组照片：苏木精-伊红染色，原始放大倍数x5(A)；Masson三色染色，原始放大倍数x20(B)；HLA-1免疫染色，原始放大倍数x10(C)。白色箭头表示产品整合和骨融合。黑色箭头表示在天然骨骼与生物材料之间直接接触的软骨内成骨，从而揭示了骨结合过程。

实施例

通过以下实施例进一步说明本发明。

实施例1：本发明生物材料的制备

分离hASC

在知情同意和血清学筛查后，根据科尔曼技术，通过吸脂术在腹部区域收集人皮下脂肪组织。

从刚获得的脂肪组织中立即分离出人脂肪干细胞(hASC)。脂肪吸取物可以在+4℃下保存24小时、或在-80℃下保存长于24小时。

首先，为了质量控制目的，分离出一部分脂肪吸取物，并测量脂肪吸取物的剩余体积。然后，通过在HBSS中制备的胶原酶溶液(NB 1，Serva Electrophoresis GmbH，海德堡，德国)消化脂肪吸取物(终浓度为约8U/mL)。用于消化的酶溶液的体积是脂肪组织体积的两倍。消化在37℃±1℃下进行50分钟至70分钟。在15分钟至25分钟后进行第一次间歇摇动，在35分钟至45分钟后进行第二次摇动。通过添加MP培养基(增殖培养基或生长培养基)来停止消化。MP培养基包含DMEM培养基(4.5g/L葡萄糖和4mM的Ala-Gln；Sartorius StedimBiotech，哥廷根，德国)，并补充有5％人血小板裂解物(hPL)(体积/体积)。DMEM是一种标准的培养基，其包含盐、氨基酸、维生素、丙酮酸和葡萄糖，经碳酸盐缓冲液缓冲，并且具有生理pH(7.2至7.4)。使用的DMEM包含Ala-Gln。人血小板裂解物(hPL)是用于刺激间充质干细胞(例如hASC)体外生长的生长因子丰富来源。

将消化的脂肪组织离心(500g，10min，室温)，并除去上清液。将沉淀的基质血管部分(SVF)重悬于MP培养基中，并通过200μm至500μm的滤网。将过滤的细胞悬液第二次离心(500g，10min，20℃)。将含有hASC的沉淀重悬于MP培养基中。可以保留一小部分细胞悬液用于细胞计数，并将全部剩余的细胞悬液用于接种一个75cm²的T-培养瓶(称为P0代)。进行细胞计数(仅供参考)，以估计接种细胞的数量。

分离步骤的次日(第1天)，将生长培养基从75cm²的T-培养瓶中取出。用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次，然后将新鲜制备的MP培养基加入培养瓶中。

人脂肪干细胞的生长和扩增

在增殖阶段，将hASC传代4次(P1、P2、P3和P4)，以便为该过程的后续步骤获得足够量的细胞。

在P0和第四代(P4)之间，将细胞培养在T-培养瓶上，并用新鲜的MP培养基饲养。当汇合度≥70％且≤100％(目标汇合度：80％至90％)时，将细胞传代。将来自1批的所有细胞培养受体同时进行传代。在每次传代中，用重组的不含动物细胞的解离酶TrypLE(选择1X；对于75cm²培养瓶使用9mL，对于150cm²培养瓶使用12mL)，将细胞从培养容器中分离出来。在37℃±2℃下进行TrypLe消化5分钟至15分钟，并通过添加MP培养基终止。

然后将细胞离心(500g，5min，室温)，然后重悬于MP培养基中。收集收获的细胞以保证得到均质细胞悬液。重悬后，计数细胞。

然后在第P1、P2和P3代中，将剩余的细胞悬液在MP培养基中稀释至合适的细胞密度，并接种在较大的组织培养表面上。在这些步骤中，75cm²的培养瓶接种15mL体积的细胞悬液，而150cm²的培养瓶接种30mL体积的细胞悬液。在每次传代中，接种0.5x10⁴个细胞/cm²至.8x10⁴个细胞/cm²的细胞。在不同的代之间，每3天至4天更换一次培养基。从一个供体到另一个供体的细胞行为和生长速率可能略有不同。因此，两次传代之间的持续时间以及代之间的培养基更换次数可能会因各个供体而异。

成骨分化

在P4代(即第四代)，将细胞第二次离心，并重悬于MD培养基(分化培养基)中。重悬后，第二次计数细胞，然后在MD培养基中稀释至合适的细胞密度，然后将70mL体积的细胞悬液接种在150cm²培养瓶中，并注入成骨MD培养基。根据该方法，第四次传代后将细胞直接培养在成骨MD培养基中。因此，当细胞尚未达到汇合时，加入成骨MD培养基。

成骨MD培养基由补充有地塞米松(1μM)、抗坏血酸(0.25mM)和磷酸钠(2.93mM)的增殖培养基(DMEM，Ala-Gln，5％的hPL)构成。

一个供体与另一个供体的细胞行为和生长速率可能略有不同。因此，成骨分化步骤的持续时间和代之间的培养基更换次数可能因各个供体而异。

多维诱导细胞

当细胞达到汇合时，如果出现形态学改变，并且如果在培养瓶中观察到至少一个类骨质结节(即在骨组织成熟之前形成的未矿化的骨基质有机部分)，则开始对ASC进行多维诱导。

暴露于成骨MD培养基后，将含有贴壁骨原细胞汇合单层的培养皿缓慢均匀地撒上各种陶瓷材料：

-HA/β-TCP颗粒：比例为65/35，对于150cm²培养瓶(Teknimed，法国)为1.5cm³，

-HA颗粒：150cm²培养瓶(法国Biocetis)为1.5cm³，或

-β-TCP颗粒：150cm²培养瓶(法国Biocetis)为1.5cm³。

将细胞保持在MD培养基中。在多维诱导过程中，每3天至4天进行常规培养基更换。通过小心地防止除去陶瓷材料颗粒和发展中的结构来进行那些培养基更换。

实施例2：生物材料的表征

材料和方法

细胞毒性

该方法的目的是评估间接的细胞-材料接触(可浸出的化学物质在培养基中的扩散)的毒性。用这种方法，将hASC以8000个细胞/cm²(每孔15200个细胞)接种，并在37℃下在两个24孔板中孵育72小时。然后，当细胞汇合时，除去培养基，并将陶瓷材料加入包含底部微孔膜的transwell插入物中：

-HA/β-TCP的三种不同量：150cm²的容器为1.5cm³、2.85cm³和5.91cm³，

-150cm²容器中HA颗粒为1.5cm³，或

-150cm²容器中β-TCP颗粒为1.5cm³，

然后放入每个孔中，并在37℃/5％CO₂下孵育24小时。

孵育后，根据供应商的说明，使用“CCK-8试剂盒”评估细胞活力，以定量增殖和细胞毒性试验(Sigma)中的活细胞数。简而言之，除去培养基并将100μL体积的CCK-8溶液添加到板的每个孔中。将混合物在37℃/5％CO₂下孵育2小时至4小时。稳定的四唑氮盐通过复杂的细胞机制裂解为可溶性甲臜染料。这种生物还原很大程度上取决于活细胞中糖酵解产生的NAD(P)H。因此，形成的甲臜染料的量与培养物中代谢活性细胞的数量直接相关。通过使用分光光度计读板器在450nm处测量光密度(OD)来评估甲臜染料的量。

相对细胞活力(％)表示为相对于未处理的对照细胞的百分比。其如下确定：

(OD-空白)_未经处理:阴性对照(未经处理的细胞)的(OD-空白)的平均值。

未撒上陶瓷材料的细胞用作阴性对照(未经处理的细胞)。用1％Triton溶液处理的细胞用作阳性对照。

组织学分析

在添加陶瓷颗粒后第4周和第8周对MD培养基中形成的结构进行活检。

结构/细胞性/细胞外基质的存在

用苏木精-伊红和Masson三色染色评估组织的结构、细胞性和细胞外基质的存在。

骨分化和矿化

分别用骨钙素和微型CT评估组织的骨分化和矿化。

使用Skyscan 1172G(Bruker)(Erwan Plougonven,ULg,Liège)进行采集。在Bruker微型CT软件NRecon v.1.6.10.1上进行了重建。调整后，重建约1700x1700x700体素(3D像素)的3D图像。对于上述分辨率，体素的体积为985μm³。衰减区域的平均体积和厚度测量值以总体积的％表示。衰减区域被同化为矿化区域。

生长因子含量

为了评估形成的组织的生物活性，在添加陶瓷颗粒后第4周和第8周进行活检，以进行蛋白质提取和定量。通过比色法(BCA蛋白质测定试剂盒，ThermoFisher Scientific)和ELISA(人Quantikine ELISA试剂盒，RD Systems)对BMP2、BMP7、VEGF、SDF1α、IGF1进行定量。

破骨活性

在无hPL条件下培养72小时后，收获来自2D培养(在MD培养基或MP培养基中)的ASC上清液和来自通过在约8周期间添加HA/βTCP所诱导的多维培养的ASC上清液，并直接储存于-20℃用于进一步定量。还单独提取陶瓷颗粒的蛋白质以定量OPG和RANKL水平。

根据供应商的说明，使用ELISA试剂盒(人TNFSF11/RANKL/TRANCE ELISA试剂盒；人护骨因子ELISA试剂盒；LS Bio)对OPG和RANKL进行定量。

结果

细胞毒性

在低浓度(10mg/cm²)下，hASC与HA/β-TCP颗粒的间接接触可改善细胞活力(与单独的细胞相比，细胞活力为111.1％)。相较而言，浓度为19mg/cm²和39.4mg/cm²时，细胞活力分别降低了10％和52.3％(图1)。

组织学分析

与生物相容性颗粒一起孵育4周或8周后，在结构之间未发现显著差异。

结构/细胞性/细胞外基质的存在

加入陶瓷材料几天后，骨原细胞和分散的陶瓷材料颗粒逐渐包埋在矿化的细胞外基质中。

此后，骨原细胞和陶瓷材料颗粒开始形成部分矿化的棕黄色可塑团块的大3维片(或少量较小的片)，从每个培养容器中脱落。约15天后，形成多维生物材料，并且可以从培养瓶中分离出来。

hASC与任何不同的颗粒(HA/β-TCP、HA和β-TCP)在成骨分化培养基中的共培养显示出多维结构的形成。这种结构可以用镊子抓住，抵抗机械强度(图2)。图3显示了所形成的具有HA/β-TCP的生物材料的显微图。

所形成的具有HA/β-TCP(n＝7)的生物材料的细胞数为262±205个细胞/mm²。

通过苏木精-伊红和Masson三色染色的组织学分析显示，细胞和颗粒之间存在相互连接的组织，并且颗粒整合在细胞化的相互连接的组织中(图4A-B)。

骨分化/矿化

骨钙素染色在细胞外基质中呈阳性(图4C)，这表明ASC正确分化为骨原细胞。

微型-CT分析显示，所形成的具有HA/β-TCP的生物材料的矿化度为1.9％(图5)。

生长因子含量

与生物相容性颗粒一起孵育4周或8周后，在结构之间未发现显著差异。

结果显示在下表1和图6中。

表1：本发明生物材料的生长因子含量(以ng/g生物材料计)

	VEGF	IGF1	SDF-1α
				HA/β-TCP	34±57	94±57	31±24
HA	96.88	99.58	40.63
				β-TCP	75.28	89.78	51.70

所形成的具有本发明的陶瓷颗粒的所有生物材料均包含VEGF、IGF1和SDF-1α。SDF-1α的含量低于VEGF和IGF1的含量。在所有组织中均未检测到BMP2或BMP7。

破骨活性

在MP/MD培养基中的hASC上清液中，定量所形成的具有HA/β-TCP的生物材料，所形成的具有HA的生物材料和所形成的具有β-TCP的生物材料的OPG/RANKL分泌。

未检测到RANKL。在MP或MD培养基的细胞上清液中未发现OPG。

相比之下，所形成的具有HA/β-TCP的生物材料分泌约3010pg/10⁶个细胞(图7)。就每克组织的浓度而言，所形成的具有HA/β-TCP的生物材料为约30ng/g，所形成的具有HA的生物材料为约76ng/g，所形成的具有β-TCP的生物材料为约84ng/g(图8)。

还评估了仅由HA/β-TCP引起的OPG分泌，发现其水平几乎无法检测到(图8)。

实施例3：成骨和血管生成的潜力

材料和方法

使用Qiazol裂解试剂(Qiagen，Hilden，德国)和Precellys匀浆器(Bertin仪器，法国Montigny-le-Bretonneux)，从增殖培养基(MP)中的ASC(n＝4，来自4个不同的人类脂肪组织供体)、分化培养基(MD，在没有颗粒的经典成骨培养基中培养细胞)中的ASC(n＝4，来自4个不同的人类脂肪组织供体)和所形成的具有1.5cm³HA/β-TCP的生物材料(n＝4，来自4个不同的人类脂肪组织供体)中提取总RNA。根据制造商的说明，使用Rneasy mini试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化RNA，并另外进行柱上DNA酶消化。使用分光光度计(Spectramax190，Molecular Devices，加利福尼亚，美国)确定RNA的质量和含量。通过RT² RNA第一链试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)由0.5μg总RNA合成cDNA，以通过商用PCR阵列(人RT² Profiler分析-血管生成；人RT²Profiler分析-成骨，Qiagen)进行成骨和血管生成基因表达谱分析。使用ABI Quantstudio 5系统(Applied Biosystems)和SYBR Green ROX Mastermix(Qiagen，Hilden，德国)检测扩增产物。根据ΔΔCT方法进行定量。将每个样品的最终结果相对于三个管家基因(ACTB、B2M和GAPDH)的平均表达水平进行归一化。

使用实时RT-PCR(人RT2 Profiler Array，Qiagen)在mRNA水平分析成骨和血管生成基因表达。

结果

在测试的84个成骨基因中，与MP中的ASC或MD中的ASC相比，在本发明的生物材料中发现11种参与骨骼发育的基因(ACVR1、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、CSF1、EGFR、FGFR1、IGFR1、RUNX2、TGFBR1、TWIST1)、3种转录因子(SMAD2、SMAD4、SMAD5)、2种生长因子(VEGFA、VEGFB)和3种细胞黏附分子(ITGA1、ITGB1、ICAM1)被调节(图9)。

矮小相关转录因子2(Runx2)是一种重要的成骨特异性转录因子，其促进成骨相关基因的表达、调节细胞周期进程、改善骨微环境并影响软骨细胞和破骨细胞的功能(Bruderer M等人,Eur Cell Mater,2014；Xu J等人,Am J Trans Res,2015)，与MP或MD中的ASC相比，其在本发明生物材料中的表达明显更高(图9C)。

TWIST相关蛋白1(TWIST1)在骨骼间充质中表达，并在骨骼发育过程中在控制间质细胞谱系分配中发挥关键作用(Johnson D等人Mech Dev.2000；Rice DP等人MechDev.2000)，与在MD中的ASC相比，其在本发明的生物材料中的表达也明显更高(p＝0.09)(图9D)。

成骨的重要途径是转化生长因子-β/骨形态发生蛋白(TGF-b/BMP)途径。TGF-b(通过TGFBR1激活)激活细胞内信号传导蛋白，例如SMAD。这些因子调节TGF-β调节的基因的转录，从而激活成骨基因的转录，促进成骨细胞的分化(Song B,Cytokine Growth FactorRev.Author,2010)。有趣的是，与MD中的ASC相比，在本发明的生物材料中发现了TGFBR1和SMAD2/5mRNA的更高表达(图9E-H)。

在MP、MD和本发明的生物材料中针对ASC测试的84个血管生成基因中，6个与生长因子相关的基因(ANG、EFNA1、EFNB2、VEGFA、FGF1、TGFB1)，2个ECM分子(LEP、TIMP1)和2个细胞相关黏附分子(ENG、THBS1)被调节(图10)。

与MP中的ASC相比，在本发明的生物材料中发现血管生成素(ANG)mRNA的显著更高的表达(图10A)。血管生成素信号传导促进血管生成，通过该过程从先前存在的血管形成新的动脉和静脉(Fagiani E等人,Cancer Lett,2013)。

此外，发现在胚胎发育和成体组织中调节血管生成的肝配蛋白A1(EFNA)mRNA(asquale等人Nat Rev Mol Cell Biol 2005,6(6):462-475)与MP和MD中的ASC相比，在本发明的生物材料中高度表达(图10B和图10C)。

与MP或MD中的ASC相比，本发明生物材料中ASC中的血管内皮生长因子A mRNA(VEGFA)的表达也显著提高(图10D)。VEGF是调节血管发育和血管生成的最重要的生长因子之一。由于骨骼是高度血管化的器官(血管生成是成骨过程中的重要调节剂)，因此VEGF也会对骨骼发育和产后骨骼修复产生积极影响(Hu K等人,Bone 2016)。

成纤维细胞生长因子1(FGF1)mRNA(一种有效的促血管生成因子，Murakami M等人,Curr Opin Hematol 2009)和瘦素(LEP)mRNA的表达(一种重要的血管生成增强剂和VEGF表达诱导剂；Bouloumie A等人,Circ.Res.1998；Sierra-Honigmann MR等人,Science(New York,N.Y.)1998)与MP中的ASC相比，在本发明的生物材料中也过表达(分别为图10E和图10F)。

总之，通过所存在的细胞在分子水平上表达骨分化能力以及促进移植后细胞移植物的血管生成能力(在3D结构中)，本发明的生物材料可以定义为成骨的。

实施例4：移植后在纤维化环境中促进血管生成和成骨

4.1.体外

组织损伤的最常见因素之一是缺氧。间质性损伤通常与凝血级联反应的激活有关，从而导致出现缺氧区域。在这种情况下，我们评估了本发明生物材料分泌VEGF的能力，VEGF是移植后血管化的关键生长因子(Madrigal M等人,J Transl Med.2014Oct 11；12:260)。已知各种组织中氧张力的降低会导致缺氧诱导因子(HIF-1α)的激活，从而诱导血管生成基因例如血管内皮生长因子(VEGF)(Ahluwalia A等人,Curr Med Chem.2012；19(1):90–97；Hawkins KE等人,Regen Med.2013；8(6):771–782)以及MSC化学引诱物基质细胞衍生因子1(SDF-1α)(Youn SW等人,Blood.2011；117:4376–4386.Ceradini DJ等人,NatMed.2004；10(8):858–864)的转录。

材料和方法

为了评估低氧浓度对生物材料促血管生成特性的影响，将由来自3个供体的ASC和1.5cm³HA/β-TCP形成的生物材料用PBS洗涤两次，并一式两份在6孔板中的10mL不含hPL的成骨分化培养基(MD)中孵育(以避免培养基中的外源性生长因子)。将板置于缺氧(1％O₂)或常氧(21％O₂)、5％CO₂、37℃下72小时。然后收获上清液以通过ELISA对VEGF和SDF-1α进行定量。

此外，将一式两份在6孔板中的来自3个供体的第4代汇合的ASC，用PBS洗涤两次，并置于5mL或10mL的无hPL的增殖培养基(MP)或成骨分化培养基(MD)中，在缺氧(1％O₂)或常氧(21％O₂)、5％CO₂、37℃下培养72小时。然后收获上清液以通过ELISA的VEGF以及SDF-1α定量。

结果

在低氧张力下，2D细胞(MP和MD)中的VEGF分泌增加(在1％和21％的O₂下分别为MP中242±51pg/10⁵个细胞和29±27pg/10⁵个细胞，MD中565±507pg/10⁵个细胞和182±216pg/10⁵个细胞(p<0.05))，对于本发明的生物材料而言，发现低氧对VEGF分泌没有影响(在1％和21％的O₂下分别为760±594pg/10⁵个细胞和806±530pg/10⁵个细胞)(图11A)。因此，低氧张力不是使用本发明生物材料的限制因素。

另外，与在1％和21％O₂条件下的MP和MD中的ASC相比，在本发明的生物材料中发现了更高的VEGF分泌(图11A)。

虽然在低氧激发后观察到刺激MD中ASC的SDF-1α分泌(p＝0.009)，但是与21％O₂下MP和MD中的ASC相比，本发明的生物材料释放出显著更高量的SDF-1α(分别为p＝0.013和0.025)(图11B)。

另外，证明了，在1％O₂下，与ASC MP和本发明的生物材料(分别为p＝0.009和0.013)相比，ASC MD的分泌较低(图11B)。

将本发明的生物材料暴露于低氧张力(如在纤维化组织中存在的1％的氧)显示出ASC能够分泌血管生成的关键效应因子。与二维培养的增殖/成骨培养基中的ASC相比，具有细胞外基质的3维的ASC，即本发明生物材料中的ASC的这些分泌更有优势(在低氧和常氧时)。

4.2.体内

为了确定本发明生物材料在低氧条件下的生物活性，进行了肌肉坏死的临床前模型。由Schubert等人(Biomaterials,2011；32(34):8880-91)阐述的异位模型是研究生物材料生物活性的金标准模型，其在于将测试物品(生物材料)植入腰部区域中由烧烙过的椎旁肌构成的袋中。

材料和方法

在裸大鼠上进行了两次实验，以植入本发明的生物材料(人类来源)，避免任何移植排斥。

设计第一个实验以评估本发明的生物材料在植入后1个月时对组织重塑的作用。设计第二个实验以在分子水平上评估组织重塑(植入后第29天)。

在这两个实验中，将生物材料植入10只裸大鼠的两侧。植入的体积为约0.3cm³(相当于500mg或4.7*10⁶个细胞)的生物材料。

在第一个实验中，在植入后第28天，对血管性假血友病因子进行免疫染色后，通过组织形态计量术对血管生成进行了定量，并通过针对HLA的免疫组织化学评估了人细胞的存在。

在第二个实验中，在植入后第29天，通过针对HLA的免疫组织化学方法评估了人细胞的存在，并在进行了Masson三色染色后通过组织形态分析法评估了植入物的血管再生。

此外，使用Qiazol裂解试剂(Qiagen，Hilden，德国)和Precellys匀浆器(BertinInstruments，Montigny-le-Bretonneux，法国)从外植体中提取总RNA。根据制造商的说明，使用Rneasy mini试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化RNA，并另外进行柱上DNA酶消化。使用分光光度计(Spectramax 190，Molecular Devices，加利福尼亚，美国)确定RNA的质量和含量。通过RT² RNA第一链试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)从0.5μg总RNA合成cDNA，以通过商用PCR阵列(人RT²Profiler分析-血管生成；人RT²Profiler分析-成骨，Qiagen)进行成骨和血管生成基因表达谱分析。使用ABI Quantstudio 5系统(Applied Biosystems)和SYBRGreen ROX Mastermix(Qiagen，Hilden，德国)检测扩增产物。根据ΔΔCT方法进行定量。将每个样品的最终结果相对于三个管家基因(ACTB、B2M和GAPDH)的平均表达水平进行归一化。

在植入后第29天，比较从本发明的生物材料获得的外植体之间的成骨基因表达。然后测试外植体的八十四种成骨基因。

结果

第一个实验

植入后1个月，在生物材料内部证实了血管向内生长(图12)。

血管表面积和血管数/mm²的结果如图13所示。

本发明生物材料中人细胞的存在证明了本发明生物材料中人ASC在坏死宿主组织(随后是对肌肉区域/植入部位进行烧烙)中的存活能力(图14)。

第二个实验

植入后第29天，证实了在本发明的生物材料中人细胞的存在(数据未显示)。

如先前在第一个生物活性实验中所述，在植入后第29天确认了植入物的血管再生(数据未显示)。

体内实验揭示了本发明生物材料诱导在产品内部的血管生成的能力。

实施例5：骨缺损的治疗

为了研究本发明的生物材料在骨形成中的功效，设计了大鼠模型中的临界尺寸的骨缺损。该模型在文献中(Saxer等人,Stem Cells 2016–Manassero et al.,Journal ofVisualized Experiments 2016)进行了充分的描述。

材料和方法

选择雄性裸大鼠作为本发明的人生物材料的受体，以避免任何T细胞免疫反应。简而言之，使用

(RISystem-瑞士)在14只裸大鼠中进行了大鼠股骨的临界尺寸的骨缺损研究(分为2组，每组7个受体，分别接受单独的HA/β-TCP颗粒和生物材料)。产生5mm的缺损，并通过用螺钉固定的板将股骨的两个部分连接在一起。

骨缺损诱导后三周，进行放射线检查以评估骨缺损的不可逆性并避免任何自发性骨再生。

将HA/β-TCP颗粒(总体积为0.344cm³，对应于500mg)或用ASC和1.5cm³HA/β-TCP颗粒形成的的本发明生物材料(总体积为0.313cm³，对应于500mg，具有4.7*10⁶个细胞)植入裸大鼠受体(具有持久的骨缺损，且没有任何固定材料断裂)。

植入后1个月，对每只动物进行微型CT扫描和组织学检查，以评估植入物整合和骨融合的水平。

结果

植入后1个月，本发明的生物材料完全整合在股骨的两个部分之间，表现出双皮质骨融合(2个股骨皮质结构的连续性)(图15，左上和左下)，而单独的HA/β-TCP颗粒位于骨缺损中，没有任何整合(图15，右上和右下)。实际上，在没有双侧皮质融合(如图15右下的符号*所示)和萎缩的四肢股骨缺损的情况下，没有发现骨皮质与HA/β-TCP颗粒之间的桥梁。

这些结果通过组织学证实(图16和图17)。单独植入HA/β-TCP颗粒后1个月，该产品未整合并且观察到重要的纤维化(图16A，白色箭头)。在天然骨与HA/β-TCP植入物之间的界面处的缺损中未发现软骨内成骨(图16B，黑色箭头)。在植入本发明的生物材料后1个月，观察到产品整合和骨融合(图17A，白色箭头)。在天然骨与生物材料之间的直接接触中发现软骨内成骨，这揭示了骨结合过程(图17B，黑色箭头)。HLA-1染色揭示了人细胞的存在(图17C)。

这些体内研究证明(i)本发明的生物材料在缺氧环境中能够改善成骨性，和(ii)在临界尺寸的骨缺损的情况下能够进行骨融合。与单独的HA/β-TCP颗粒相比，本发明的生物材料在成骨性和骨重塑方面显示出其优越性。

实施例6：脊柱融合大鼠模型中生物材料的研究(研究CP-2017025-生物分布分支)

研究目标

进行GLP依从性研究(研究CP-2017025)是为了实现双重目标，即评估(i)在与研究产品的预期临床用途相关的条件下相关动物模型中生物材料的总体毒性(因此称为“CP-2017025-毒理学分支”，以及(ii)研究细胞的生物分布和异位组织的潜在连续发展(所谓的“CP-2017025-生物分布分支”)。

选择免疫缺陷(裸)大鼠模型以避免免疫细胞动物所预期的人细胞排斥。选择脊柱融合手术模型作为相关模型，因为它在文献中有完善的描述(Wang等人,J.Bone and JointSurg.2003,85:905-911)，并且它可以在相似组织环境中容纳比股骨骨缺损更大的植入体积(Belill等人,Comp.Med.2014,61(3):186-192)。另外，认为在脊柱融合手术过程中产生的植入环境与诸如骨股骨缺损的骨未愈合模型中产生的环境相比非常相似。

研究设计

出于“生物分布研究分支”的目的，将二十只(20)健康的9周龄纯合裸无胸腺大鼠(雄性10只和雌性10只，Hsd：RH-Foxn1 rnu/rnu)随机分为第1组和第2组(每组雄性5只和雌性5只)(表2)。

表2：研究(CP-2017025-生物分布分支)设计

按照以下所述的外科手术程序，用生物材料(根据与临床批次相同的方法制造的一批)在D0处理第1组的动物。第2组的动物未用生物材料处理，但在D0与第1组的动物进行了相同的外科手术。

根据Wang等人描述的外科手术方法，沿着第5或第6腰椎切开皮肤和肌肉。撕开并分开背部肌肉，可以看到腰椎。L5腰椎横突形成了圆形的骨缺损。通过使用恒定直径的钻头来控制，以将缺损直径控制在2.0mm，深度控制在1mm，将骨缺损尺寸标准化。腰椎两侧缺损。对于第1组的动物，将生物材料(两个0.375cm³的小块，分别包含0.56x10⁷个细胞)移植到脊柱的两侧(左侧和右侧)所创建的孔和周围区域中。然后缝合背部肌肉和皮肤。基于大鼠体重，该生物材料的量表示相对安全裕度为10(250g的大鼠相对于30kg的患者)和23.4(250g的大鼠相对于70kg的患者)。

在D29，处死大鼠并进行尸检。为了检测和定量大鼠组织中生物材料人细胞的存在，从施用部位、骨髓、脑、性腺、心脏、肠、肾、肝、肺、骨骼肌和脾中提取总基因组DNA，然后使用基于人Alu元素的qPCR方法进行分析。

收集器官，称重并保持在-80℃直至提取DNA。然后使用机械方法将组织在提取缓冲液中完全均质化，然后进行DNA提取。用125ng的测试大鼠组织样品的基因组DNA或对照大鼠组织样品的基因组DNA在20μl下进行qPCR实验。对每个样品进行三次重复测试。验证了基于Alu元素的qPCR方法的定量范围为20fg(所有器官的定量下限)或70fg(骨骼肌的定量下限)至7ng(定量上限)的人DNA掺入来自大鼠的125ng特定组织DNA基质。

结果

在第1组和第2组动物的骨髓、脑、性腺、心脏、肠、肾、肝、肺、骨骼肌和脾，以及来自第2组动物的施用部位处的样品中，未检测到人DNA或其低于定量极限。在第1组动物的所有施用部位和第1组10只动物中的1只的心脏中检测到人DNA。

除了经生物材料处理的大鼠的所有植入部位外，在10只经生物材料处理以分析生物分布目的大鼠中的1只大鼠的心脏中检测到人DNA。虽然无法解释，但该结果也可能是由于采样期间的污染所致，因为在分析的10只动物中仅观察到了一只，并且检测到的DNA量很低(估计的心脏中的人细胞数量相当于166个细胞)。另外，在植入后29天，对10只经生物材料处理的大鼠的心脏进行的组织病理学分析中，没有组织病理学观察证据暗示异位组织形成。

实施例7：脊柱融合大鼠模型中生物材料的研究(CP-2017025-毒理学分支)

通过以下3项动物研究，包括2项GLP依从性研究，解决了生物材料开发的非临床毒理学问题：

-脊柱融合大鼠模型中生物材料的单剂量毒性研究(GLP研究CP-2017025-毒理学分支)；

-NSG小鼠中生物材料的致瘤性研究(GLP研究CP-2017026)；和

-NSG小鼠中生物材料的局部耐受性研究以及对肿瘤形成潜力的研究(CP-2017073)。

背景和目标

进行GLP依从性研究(研究CP-2017025)是为了实现双重目标，即评估(i)在与研究产品的预期临床用途相关的条件下相关动物模型中生物材料的总体毒性(因此称为“CP-2017025-毒理学分支”，以及(ii)研究细胞的生物分布和异位组织的潜在连续发展(所谓的“CP-2017025-生物分布分支”)。

“毒理学研究分支”的目的是鉴定、表征和量化潜在的毒性，其发作(急性或延迟)以及解决任何观察到的毒性的可能性。

选择免疫缺陷(裸)大鼠模型以避免免疫细胞动物所预期的人细胞排斥。选择脊柱融合手术模型作为相关模型，因为它在文献中有完善的描述(Wang等人2003)，并且它可以在相似组织环境中容纳比股骨骨缺损更大的植入体积(Belill等人2014)。另外，认为在脊柱融合手术过程中产生的植入环境与诸如骨股骨缺损的骨未愈合模型中产生的环境相比非常相似。

研究设计

出于“毒性研究分支”的目的，将40只(40)健康的9周龄纯合裸性无胸腺大鼠(雄性20只和雌性20只；Hsd：RH-Foxn1 rnu/rnu)随机分为第1组和第2组(每组雄性10只和雌性10只)(表3)。

表3：研究(CP-2017025-毒理学分支)设计

按照以下所述的外科手术程序，用生物材料(根据与临床批次相同的方法制造的一批)在D0处理第1组的动物。第2组的动物未用生物材料处理，但在D0与第1组的动物进行了相同的手术程序。

根据Wang等人描述的外科手术方法，沿着第5或第6腰椎切开皮肤和肌肉。撕开并分开背部肌肉，可以看到腰椎。L5腰椎横突形成了圆形的骨缺损。使用恒定直径的钻头来控制，以将缺损直径控制在2.0mm，深度控制在1mm，将骨缺损尺寸标准化。腰椎两侧缺损。对于第1组的动物，将生物材料(两个0.375cm³的小块，分别包含0.56x10⁷个细胞)移植到脊柱的两侧(左侧和右侧)所创建的孔和周围区域中。然后缝合背部肌肉和皮肤。基于大鼠体重，该生物材料的量表示相对安全裕度为10(250g的大鼠相对于30kg的患者)和23.4(250g的大鼠相对于70kg的患者)。

手术后观察大鼠的麻醉后恢复情况，然后每天监测动物的伤口愈合、活动性、发病率、死亡率和明显的毒性迹象，直到D29。

为了随机化目的，在D0时测量体重，然后每周至少测量两次。评估和比较第1组和第2组动物的体重变化。

在D3和D29，收集来自第1组和第2组禁食大鼠的血液以测量血液学、凝血和生化参数。在D29，处死大鼠，并进行尸检。

为了研究毒性，肉眼观察并收集每组每种性别5只动物的器官。称重脾、肝、肾和心脏。将所有收集的器官在室温下保存在4％福尔马林中，石蜡包埋，并制成载玻片(每个器官3个载玻片；20只动物)并进行显微镜分析。

结果

监测期间未报告相关观察。就体重而言，在第1组和第2组的动物之间没有观察到统计学上显著的体重差异。根据对第3天和第29天采集的血样进行的分析，第1组和第2组动物的血液学、生物化学和凝血参数没有相关差异的报告。宏观上，从进行的尸检中没有相关的报告。在显微镜下，在第1组所有动物的植入部位观察到异物肉芽肿，可能是由于生物材料植入所致。没有其他可归因于生物材料植入的组织病理学系统性变化。

总之，使用相关模型在裸大鼠体内植入生物材料后，没有发现毒性。

实施例8：细胞转化风险评估

在人类中可获得大量证据支持包括骨肉瘤在内的各种肉瘤来源于间充质。然而，尽管长期培养中出现了染色体异常，但尚未显示MSC在体外自发转化(Aguilar等人,StemCells.2007,25(6):1586-1594；Bernardo等人,Cancer Res.2007,67(19):9142-9149；Xiao等人,Clin.Sarcoma Res.2013,3(1):10)。已经描述了这些异常，并提出这些异常是对体外培养条件的自然适应，而与转化的风险增加无关(Tarte等人,Blood.2010,115(8):1549-1553)。

通过用分子核型分析法(aCGH/SNP方法)研究生物材料原料药的细胞遗传学稳定性，在建议用于临床批次的方法所制备的3种以上开发批次的生物材料的制备期间，在体外评估了ASC自发细胞转化的潜力。阵列比较基因组杂交(aCGH)与高密度单核苷酸多态性(SNP)的结合是行之有效的分子基因分型方法，提供了全基因组范围内的拷贝数变化筛查和临床相关染色体异常和病症检测的替代方法，而无需事先分离有丝分裂细胞(Cooper等人,Nat.Genetics.2011,43(9):838-846；Slavotinek.A.M.,Hum.Genetics.2008,124(1):1-17)。

结果表明，在制造过程中以及在与生物材料原料药的释放测试相对应的传代水平上，hASC表现出细胞遗传学稳定性。

NSG小鼠中生物材料的体内GLP致瘤性研究(研究CP-2017026)

背景和目标

尽管获得的结果既未证实也未排除对患者的致瘤性风险，但在使用MSC衍生的细胞疗法的情况下，迄今尚未观察到人类患者的肿瘤形成(Barkholt等人,Cytotherapy.2013,15(7):753-759)。

研究CP-2017026的目的是评估在植入NSG(NOD scidγ)免疫缺陷小鼠后长达6个月的时间里，生物材料中包含的人脂肪衍生的MSC细胞发生涉及致癌性潜力的细胞转化的风险。选择HT-29细胞系作为阳性对照，该细胞系经验证具有致瘤性。

研究设计

这项研究包括30只(30)7周龄健康NSG雌性小鼠。将小鼠随机分为2组(第1组20只小鼠和第2组10只小鼠)。第1组动物通过切口(研究CP-2017025使用的同一批次，其制备方法与临床批次相同)在皮下空间内植入生物材料(1g(±1cm³)含有1.5x10⁷个细胞)。第2组动物通过皮下注射HT-29细胞(在200μl的0.9％NaCl中10⁷个细胞/小鼠)进行接种。

每周两次记录小鼠的活力、行为和体重，直到实验结束。观察每只动物，每周两次在施用部位触诊新形成的结节。测量任何新形成的结节。观察第1组小鼠(用生物材料处理)长达6个月，同时监测第2组小鼠(用HT-29细胞处理)，直到肿瘤体积达到1000mm³或观察到坏死为止。

尸检期间，对每只动物进行肉眼观察。对于第1组动物(测试物)，准备了用于组织病理学检查的载玻片，用于植入部位、肝、脾、肺、心脏、肾、脑、腹股沟淋巴结(如果可见)。

结果

第2组的10只小鼠(HT-29，阳性对照)已显示出逐渐生长的肿瘤，D27(首次处死日)的平均肿瘤体积(MTV)为611.6±335.4mm³。一只小鼠由于肿瘤坏死而处死，而另外9只小鼠因TV>1000mm³而处死。在第2组小鼠的尸检期间对器官进行肉眼观察，未发现异常。

第一组的一只小鼠由于在施用部位打开缝线而丢失了D0至D1的测试物。对于第1组的动物，植入后的平均植入部位体积(D2)为1194.6±392.7mm³(N＝19)。植入后，一些小鼠出现严重的伤口，在施用部位水平上无法愈合。

结果，出于伦理上的原因，由于施用部位的这些严重的皮肤伤口，在D3至D27处死了第1组的20只小鼠中的10只。在第1组的10只处死的小鼠中，有5只小鼠在植入部位出现皮肤干燥和发黄，在另外2只小鼠中观察到植入部位的坏死。组织病理学检查显示植入部位发炎，肿块有时会坏死。在上方的皮肤和周围的肌肉组织中观察到炎症和/或溃疡。

对于第1组动物，研究结束时(D180)的平均植入部位体积为1032.5±245.3(n＝9)mm³，与D2时的植入部位平均体积相比，体积没有增加。

在第1组小鼠的尸检期间对器官进行肉眼观察，未发现异常。对于在研究结束时(D180)处死的第1组小鼠，显微镜观察显示在植入部位有多囊肿块，没有坏死，组织附近通常没有发炎。在植入部位和所分析的其他器官的组织病理学检查中，在第1组的任何小鼠中均未观察到肿瘤。

该研究是有效的，因为第2组的10只动物中至少有9只(HT-29细胞治疗)已显示出逐渐生长的肿瘤。单次皮下植入含有约1.5x10⁷个细胞的测试物(1g生物材料)后，在任何第1组(雌性NSG)小鼠中，均未观察到肿瘤。

组织病理学报告表明，在该实验条件下，“在6个月的观察期内，在NSG小鼠中皮下植入约1g[生物材料]不会诱导任何细胞增殖。在植入部位，存在多囊肿块，与测试物直接相关。在某些小鼠中，由于皮肤溃疡和局部炎症反应，导致过早的处死。认为这与皮下植入大体积硬质材料引起的机械损伤有关。”

NSG小鼠中生物材料的体内局部耐受性研究以及肿瘤形成潜力的研究(研究CP-2017073)

背景和目标

在GLP致瘤性研究CP-2017026中，观察到生物材料植入物的局部耐受性差，并认为这与NSG免疫缺陷小鼠皮下植入大体积硬质材料引起的机械损伤有关。

发起研究CP-2017073以进一步研究在单个部位(如研究CP-2017026中所进行的那样)(n＝8)或两个部位(每个部位0.5g)(n＝8)植入后1g(±1cm³)生物材料的局部耐受性(按照原始计划，为期两周)。

值得注意的是，在研究CP-2017073期间，与研究CP-2017026相比，即使观察到病变(例如，植入部位的黄色皮肤，在肌肉水平上没有黏附)，也无需由于施用部位的严重皮肤伤口，出于伦理道德原因处死植入具有1g生物材料的动物。然后决定，为了补充研究CP-2017026中已经产生的致瘤性数据，对第1组(n＝8)的动物进行监测的时间要长于最初限定的2周随访时间(最多达6个月)。

研究设计

将7周龄的十六(16)只健康NSG(NOD scidγ)免疫缺陷雌性小鼠随机分为2组(每组8只小鼠)。第1组动物通过在右胁皮下的切口植入生物材料(1g，含有1.5x10⁷个细胞)。第2组动物通过在右胁皮下和左胁皮下的切口植入生物材料(2x0.5g，每个部位含0.75x10⁷个细胞)。每周两次记录小鼠的活力、行为和体重，直到实验结束。每天观察每只动物的临床体征和局部反应。观察第1组的小鼠(在一个部位用测试物处理)长达6个月。监测第2组的小鼠(在两个部位用测试物处理)15天。对每只动物进行肉眼尸检。对于第1组动物(测试物)，准备了用于组织病理学检查的载玻片，用于植入部位、肝、脾、肺、心脏、肾、脑、腹股沟淋巴结(如果可见)。

结果

除了第1组的一只小鼠的体重从D79至D85出现降低之外，每只小鼠的体重从D0开始逐渐增加直至处死。发现那只老鼠死于D89。

对于第1组的动物，D2时的平均植入部位体积为1228.3±195.3mm³(n＝8)。在研究结束时(D180)，平均植入部位的体积减少至945.5±92.7mm³(n＝7)，这表明在皮下植入测试物后，研究期间未观察到任何植入部位的尺寸增加。

第1组(1个部位)和第2组(2个部位)所有小鼠的监测参数(运动和步态、运输、行为、呼吸、眼睛、皮肤(植入部位除外)、毛皮、黏液膜、排泄和无麻痹)均正常。

处死时，对第1组小鼠(一个部位)或第2组(两个部位)进行的肉眼观察未发现器官异常。对于在D180处死的第1组小鼠，组织病理学分析没有发现任何细胞增殖。在植入部位观察到多囊矿化，但在上皮和附近的肌肉组织中没有发炎。该矿化材料被解释为植入的测试物。

在此实验的条件下，可以得出以下结论：

·即使在两组中均观察到植入部位的黄色皮肤，在一个或两个部位施用生物材料对局部耐受性仍无明显影响。关于该观察结果，注意到第1组动物在D44自植入部位的最后一次观察的黄色皮肤得以恢复。

·经过6个月的随访，通过肉眼和显微镜观察，单次皮下植入含有1.5x10⁷个细胞的生物材料不会在雌性NSG小鼠中诱导肿瘤形成。

·组织病理学报告表明，向NSG小鼠皮下植入1g含1.5x10⁷个细胞的生物材料在6个月内没有诱导任何细胞增殖。在植入部位，存在多囊矿化，这与测试物直接相关。

Claims (15)

1.一种具有多维结构的生物材料，所述生物材料包含成骨分化型脂肪干细胞(ASC)、陶瓷材料和细胞外基质，其中所述生物材料分泌护骨因子(OPG)并包含胰岛素样生长因子(IGF1)和基质细胞衍生因子1-α(SDF-1α)。

2.根据权利要求1所述的生物材料，其中所述生物材料分泌至少约5ng OPG/g生物材料，优选至少约10ng OPG/g生物材料。

3.根据权利要求1所述的生物材料，其中所述生物材料包含至少约50ng IGF1/g生物材料，优选至少75ng IGF1/g生物材料。

4.根据权利要求1所述的生物材料，其中所述生物材料包含至多约100ng SDF-1α/g生物材料，优选至多75ng SDF-1α/g生物材料。

5.根据权利要求1所述的生物材料，其中所述陶瓷材料为颗粒形式。

6.根据权利要求1所述的生物材料，其中所述陶瓷材料是磷酸钙颗粒。

7.根据权利要求6所述的生物材料，其中所述磷酸钙颗粒的平均尺寸为约50μm至约1500μm。

8.根据权利要求6所述的生物材料，其中所述磷酸钙颗粒是羟基磷灰石(HA)颗粒和/或β-磷酸三钙(β-TCP)颗粒。

9.根据权利要求6所述的生物材料，其中所述磷酸钙颗粒是HA/β-TCP颗粒，其比例为10/90至90/10，优选为20/80至80/20。

10.根据权利要求1所述的生物材料，其中所述生物材料包含至少约10ng VEGF/g生物材料。

11.根据权利要求1所述的生物材料，其中所述生物材料是三维的。

12.一种医疗装置，其包括根据权利要求1的多维生物材料。

13.一种用于制备根据权利要求1的多维生物材料的方法，其包括以下步骤：

-使脂肪干细胞(ASC)增殖，

-使第四代ASC发生成骨分化，和

-进行多维诱导，优选3D诱导。

14.一种通过根据权利要求13所述的方法能够获得的多维生物材料。

15.根据权利要求1所述的生物材料，其用于治疗骨缺损或软骨缺损。

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