TW201919718A - 包括脂肪幹細胞之生物材料及用於製造該生物材料之方法 - Google Patents

Abstract

本發明係有關一種生物材料，其包含脂肪幹細胞(ASC)、陶瓷材料、與細胞外母質。特定言之，根據本發明生物材料分泌護骨素(OPG)，並包含類胰島素生長因子(IGF1)與基質細胞衍生因子1-α(SDF-1α)。本發明亦有關一種製造該生物材料之方法及其用途。

Description

包括脂肪幹細胞之生物材料及用於製造該生物材料之方法

本發明係有關幹細胞領域及其於製造多維空間生物材料上之用途。特定言之，本發明係有關一種包含脂肪幹細胞(ASC)之生物材料、其製備方法、及此等生物材料於醫療之用途。

骨缺損為原本應有正常骨頭的身體部位缺少骨組織。骨缺損可採用各種不同外科手術方法治療。然而，當計畫一個過程時，經常需要考慮破壞骨頭癒合的原因，如：糖尿病、免疫抑制療法、肢體運動狀態不良，等等。

骨缺損重建之外科手術方法特別包括剝皮術、切除與固定、海綿骨移植與伊利查洛夫間介骨段滑移法(the Ilizarov intercalary bone transport method)。然而，患者經常出現長期行動受損，在功能及美學上之結果不佳。

組織工程處理涉及透過利用活細胞恢復組織結構或功能。該一般製程包括單離細胞並增殖後，進行再 植入過程，其中使用骨架材料。間質幹細胞(MSC)為來自成熟組織之細胞之良好替代物，作為骨頭與軟骨組織再生之細胞來源具有許多優點。

在定義上，幹細胞之特徵在於其進行自我更新之能力及其進行多元性分化並形成最終分化細胞之能力。理想上，用於再生醫學應用之幹細胞應符合下列一套標準：(i)應有豐富存量(數百萬至數十億個細胞)；(ii)可採用最低侵入性過程收集及收成；(iii)可依可再現之方式，沿用多重細胞系途徑分化；(iv)可以安全且有效地轉殖至自體或同種異體宿主。

研究證實，幹細胞有能力分化成中胚層、內胚層與外胚層來源之細胞。MSC之可塑性最常指幹細胞保留跨越細胞系障壁之固有能力，並可接納不同於其他組織之特有細胞表型、生化、與功能性質。成人間質幹細胞可從例如骨髓與脂肪組織中單離。

脂肪幹細胞為多潛能，且具有豐富的再生能力。下列術語已用於判別相同之脂肪組織細胞族群：脂肪幹細胞/基質細胞(ASC)；脂肪衍生之成人幹(ADAS)細胞、脂肪衍生之成人基質細胞、脂肪衍生之基質細胞(ADSC)、脂肪基質細胞(ASC)、脂肪間質幹細胞(AdMSC)、成脂細胞(Lipoblasts)、周細胞(Pericytes)、前脂肪細胞(Pre-Adipocytes)、處理過之脂肪抽吸物(Processed Lipoaspirate)(PLA)細胞。採用這種不同命名法已造成文獻上嚴重混淆。為了解決此問題，國際脂肪應用技術協會 (International Fat Applied Technology Society)已達成共識採用術語「脂肪幹細胞」(ASC)來判別單離之可塑黏貼性之多潛能細胞族群。

成骨性分化ASC當接種在各種不同骨架(如：β-磷酸三鈣(β-TCP)、羥磷灰石(HA)、I型膠原蛋白、聚-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)與藻酸鹽)時，已在各種不同臨床前模式中顯示具有很大癒合潛力。國際專利申請案WO2013/059089係有關一種包含幹細胞與磷酸鈣水泥混合物(如：磷酸三鈣與羥磷灰石)之骨泥。US2011/104230揭示一種包含骨架材料之骨片，其包含合成之陶瓷材料、間質幹細胞與傳訊分子。

然而，儘管在小動物模式中有令人鼓舞的成果，但採用承載在骨架上之ASC進行之臨界尺寸骨重建時，仍然受到大尺寸骨缺損之限制，因此受到需工程處理之植入物大小之限制。所接種細胞之細胞植入亦受到氧氣與營養素之擴散性不佳之限制。此外，骨架內之細胞位置為其活體內與活體外存活性之主要限制。具有流動輸注骨架之生物反應器之設計在於改善植入物內之細胞移動，使細胞分佈更均勻，藉由傳送氧氣與營養素至植入物核心使細胞存活，及成骨性之細胞分化(藉由流體剪切力)。雖然此等技術很有希望，但大型動物模式之相關臨床前與臨床數據仍受到限制。

相關技藝上仍然需要供骨組織再生之組織工程處理材料，且其係完全生物相容並提供指定用途之適當 機械特色。因此，本發明係有關一種由在具有陶瓷材料之多維空間成骨結構中分化之ASC構成之移植物。

本發明係有關一種具有多維空間結構之生物材料，其包含成骨性分化脂肪幹細胞(ASC)、陶瓷材料、與細胞外母質，其中該生物材料會分泌護骨素(OPG)，並包含類胰島素生長因子(IGF1)與基質細胞衍生因子1-α(SDF-1α)。

一具體例中，生物材料為每克生物材料分泌至少約5ng OPG，較佳為至少約10ng/g。

一具體例中，生物材料為每克生物材料包含至少約50ng IGF1，較佳為至少75ng。

一具體例中，生物材料為每克生物材料包含至多約100ng SDF-1α，較佳為至多75ng。

一具體例中，陶瓷材料係呈粒子形式。一具體例中，陶瓷材料為磷酸鈣粒子。

一具體例中，磷酸鈣粒子具有之平均粒度範圍為約50μm至約1500μm。一具體例中，磷酸鈣粒子為羥磷灰石(HA)與/或β-磷酸三鈣(β-TCP)之粒子。一具體例中，磷酸鈣粒子為HA/β-TCP之粒子，其比例範圍為10/90至90/10，較佳為20/80至80/20。

一具體例中，生物材料為每克生物材料包含至少約10ng VEGF。

一具體例中，生物材料為三維空間。

本發明亦有關一種醫學裝置，係包含本發明多維空間生物材料。

本發明另一個目的為一種製造本發明多維空間生物材料之方法，其包括下列步驟：-使脂肪幹細胞(ASC)增殖，-使ASC在第四次傳代時進行成骨性分化，及-誘發多維空間，較佳為誘發3D。

本發明進一步有關一種可採用本發明方法得到之多維空間生物材料。

本發明另一個目的為一種如本文說明之生物材料，其用於治療骨缺損與/或軟骨缺損。

定義

本發明中，下列術語具有下列定義：

-置於數值之前之術語「約」意指該數值加或減10%之數值。

-術語「脂肪組織」係指任何脂肪組織。脂肪組織可能為褐色或白色脂肪組織，衍生自皮下、網膜/內臟、乳房、性腺、或其他脂肪組織部位。較佳係該脂肪組織為皮下白色脂肪組織。此等細胞可能包括初生細胞培養物或永生細胞株。脂肪組織可能來自任何具有脂肪組織之活的或死的生物體。較佳係該脂肪組織為動物的，更佳為哺乳動物的，最佳係該脂肪組織為人類的。方便的脂肪組織來源係來自抽脂手術，然而，脂肪組織之來源或脂肪組織之單離方法 並非本發明之重點。

-本文所採用術語「脂肪幹細胞」(亦稱為「脂肪組織衍生之幹細胞」)係指脂肪組織之「非脂肪細胞」部份。細胞可為新鮮細胞或培養中之細胞。「脂肪幹細胞」(ASC)係指來源於脂肪組織之基質細胞，其可作為各種不同細胞型態(如(但不限於)：脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞)之前驅體。

-本文所採用術語「陶瓷材料」係指無機之非金屬固態材料。陶瓷材料可為磷酸鈣(CaP)、碳酸鈣(CaCO₃)、硫酸鈣、氫氧化鈣(Ca[OH]₂)、或其組合。陶瓷材料可呈粒子型式。陶瓷材料可呈粉末、珠粒、或顆粒形式。陶瓷材料可為多孔性。

-術語「再生」或「組織再生」包括(但不限於)：由本揭露之ASC生長、生成、或重建新的細胞型態或組織。一具體例中，此等細胞型態或組織包括(但不限於)成骨性細胞(例如：成骨細胞)、軟骨細胞、內皮細胞、心肌細胞、造血細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經元細胞、與肌小管。一特定具體例中，術語「再生」或「組織再生」係指由本揭露之ASC生成或重建之成骨性細胞(例如：成骨細胞)。

-本文所採用術語「生長因子」為促進組織生長、細胞增殖、血管化等之分子。一特定具體例中，術語「生長因子」包括促進骨組織形成之分子。

-本文所採用術語「培養」係指一或多個細胞在活體外、活體內、或離體環境中進行細胞分裂或未進行細胞分裂。活體外環境可為熟悉此相關技藝已知適合於活體外維 持細胞之任何培養基，如，例如：合適之液體培養基或洋菜。適合細胞培養之活體外環境之明確實例說明於：Culture of Animal Cells：a manual of basic techniques(第3版)，1994,R.I.Freshney(編輯)，Wiley-Liss,Inc.；Cells：a laboratory manual(vol.1),1998,D.L.Spector,R.D.Goldman,L.A.Leinwand(編輯)，Cold Spring Harbor Laboratory Press；及Animal Cells：culture and media,1994,D.C.Darling,S.J.Morgan John Wiley and Sons,Ltd.。

-術語「滿盤度」係指細胞培養表面(如：培養皿或培養燒瓶)附著細胞之數，亦即被細胞覆蓋之表面比例。100%滿盤度意指表面完全被細胞覆蓋。一具體例中，表示「細胞達到滿盤」或「細胞滿盤」意指細胞覆蓋80至100%表面。一具體例中，表示「細胞次滿盤」意指細胞覆蓋60至80%表面。一具體例中，表示「細胞超過滿盤」意指細胞覆蓋至少100%表面及/或幾小時或幾天以來為100%滿盤。

-術語「低溫處理」或「低溫」係指使溫度降至低於個體之正常生理溫度之處理。例如：在選自約-196℃至約+32℃範圍內之一或多種溫度下連續一段長時間，例如：至少約一小時、至少約一天、至少約一週、至少約4週、至少約6個月等。一具體例中，「低溫處理」或「低溫」係指使溫度降至低於0℃之處理。低溫處理可以手動進行，或較佳係利用可以執行低溫程式之hoc設備進行。一具體例中，術語「低溫」包括熟悉此相關技藝已知之「冷凍」 與「低溫保存」等方法。熟悉此相關技藝者咸了解，低溫處理方法包括其他步驟，包括添加針對該目的之試劑。

-本文所採用術語「非胚胎細胞」係指非從胚胎單離之細胞。非胚胎細胞可為已分化或未分化。非胚胎細胞係指幾乎任何體細胞，如：自子宮外(ex utero)動物單離之細胞。一具體例中，非胚胎細胞包括生殖細胞。此等實例並未受到限制。

-本文所採用術語「分化細胞」係指已從未特化表型發展成特化表型之前驅體細胞。例如：脂肪幹細胞可以分化成成骨細胞。

-本文所採用術語「分化培養基」係指用於本發明培養系統來產生分化細胞之化合物集合。隨化合物之作用模式而定，並無意限制。例如：該製劑可能藉由誘發或協助改變表型、促進具有特定表型之細胞生長或延遲其他細胞生長，來協助分化過程。亦可能作為抑制其他可能存在於培養基或由細胞族群合成而主導分化成不期望細胞型態之途徑之因子之抑制劑。

-術語「治療」、「處理」或「緩和」係指其中目的在於預防或減慢(減輕)骨缺損之醫療性處理。彼等需要處理者包括彼等已患有骨缺損者及彼等容易患有該疾患者或彼等需要預防該疾患者。若在接受醫療量之根據本發明方法之生物材料後，患者在以下一項或多項顯示可觀察到及/或可量測到的下降或消失：骨缺損、與骨缺損相關之一或多種症狀減少及/或解除至某些程度；減少發病率與死亡率， 及生活品質改善時，則該個體已成功「治療」骨缺損。上述評估疾病之成功治療與改善之參數很容易由習知此例行過程之醫師測定。

-所揭示生物材料之醫療用途內容中，「同種異體」療法中，供者與接受者為相同物種之不同個體，而「自體」療法中，供者與接受者為相同個體，「異種異體」療法中，供者與接受者衍生自不同動物物種。

-術語「有效量」係指足以達成有利或所需結果(包括臨床結果)之用量。有效量可以投與一次或多次。

-術語「個體」係指哺乳動物，較佳為人類。個體之實例包括人類、非人類靈長類、狗、貓、小鼠、大鼠、馬、牛、與其轉殖基因物種。一具體例中，個體可為「患者」，亦即恆溫動物，更佳為人類，其正等待接受或正接受醫學照護，或曾為/目前為/將成為醫學過程對象，或被追蹤疾病發展。一具體例中，個體為成人(例如：18歲以上之人類個體)。另一具體例中，個體為兒童(例如：18歲以下之人類個體)。一具體例中，個體為男性。另一具體例中，個體為女性。

-術語「生物相容性」係指可與生物系統相容之無毒材料，如：細胞、細胞培養物、組織、或生物體。

-術語「多維空間」係指超過一維，如：例如：二維空間(2D)或三維空間(3D)。一具體例中，具有多維空間結構之生物材料係指具有2D或3D結構之生物材料。

[詳細說明]

本發明係有關一種具有多維空間結構之生物材料，其包含脂肪幹細胞(ASC)、陶瓷材料、與細胞外母質，其會分泌護骨素(OPG)，且包含類胰島素生長因子(IGF1)與基質細胞衍生因子1-α(SDF-1α)。

一具體例中，細胞係從脂肪組織單離，下文稱為脂肪幹細胞(ASC)。

一具體例中，ASC組織來源於動物，較佳係來源於哺乳動物，更佳為來源於人類。因此，一具體例中，ASC為動物ASC，較佳為哺乳動物ASC，更佳為人類ASC。較佳具體例中，ASC為人類ASC。

從脂肪組織單離幹細胞之方法係此相關技藝所習知，且揭示於例如：Zuk等人(Tissue Engineering.2001,7：211-228)。一具體例中，ASC係採用抽脂法從脂肪組織單離。

舉例而言，採用針頭穿刺切片或脂肪抽吸法可收集脂肪組織。先使用磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)(可視需要包含抗生素，例如：1%青黴素/鏈黴素(P/S))澈底洗滌組織樣本，從脂肪組織單離ASC。然後，樣本可以置入含有分解組織之膠原蛋白酶(例如：於含2%P/S之PBS中製備之I型膠原蛋白酶)之無菌組織培盤中，於37℃，5% CO₂中培養30min。添加培養基(例如：含10%血清之DMEM)中和膠原蛋白酶活性。崩解時，樣本可以移至試管中。樣本離心(例如：2000rpm下5min)後，得到包含ASC之基質血管部份(SVF)。為了從初代脂肪細胞中完全分離基質細 胞，樣本可以經過激烈振盪來瓦解集結塊，並混合細胞。可以重覆離心步驟。離心後，抽吸膠原蛋白酶溶液。集結塊再懸浮於溶胞緩衝液中，於冰上培養(例如：10min)，洗滌(例如：使用PBS/2% P/S)，及離心(例如：2000rpm下5min)。然後再吸出上清液，細胞集結塊再懸浮於培養基(例如：基質培養基，亦即α-MEM，補充20% FBS、1% L-麩醯胺、與1% P/S)中，細胞懸浮液過濾(例如：通過70μm細胞濾器)。含細胞之樣本最後平鋪於培養盤中，於37℃，5% CO₂培養。

一具體例中，本發明ASC係從脂肪組織之基質血管部份單離。一具體例中，脂肪抽吸物在使用前可以保存在室溫下數小時，或在+4℃下24小時，或可在0℃以下，例如：-18℃下長期保存。

一具體例中，ASC可為新鮮ASC或低溫ASC。新鮮ASC為單離後未經低溫處理之ASC。低溫ASC為單離後經過低溫處理之ASC。一具體例中，低溫處理意指低於0℃之處理。一具體例中，低溫處理可在約-18℃、-80℃或-180℃下進行。明確具體例中，低溫處理可為低溫保存。

低溫處理之舉例說明，可以在80-90%滿盤度時採集ASC。經過洗滌及從培養盤剝離之步驟後，細胞可於室溫下，與低溫保存培養基離心而集結成塊，並置於小瓶中。一具體例中，低溫保存培養基包含80%胎牛血清或人類血清、10%二甲亞碸(DMSO)與10% DMEM/漢氏 (Ham’s)F-12。然後，小瓶保存在-80℃下一夜。例如：小瓶可以置入酒精冷凍容器中，讓小瓶依每分鐘約1℃慢慢冷卻，直到-80℃為止。最後，冷凍的小瓶可以移至液態氮容器中供長期存放。

一具體例中，ASC為分化之ASC。較佳具體例中，ASC為經成骨性分化之ASC。換言之，較佳具體例中，ASC已分化為成骨性細胞。一特定具體例中，ASC已分化為成骨細胞。

控制及分析成骨性分化之方法係此相關技藝已習知。例如：本發明細胞或組織之骨分化之分析可採用骨鈣素與/或磷酸鹽之染色法(例如：馮庫薩(von Kossa)法)；磷酸鈣染色法(例如：使用茜素紅(Alizarin red))；核磁共振顯影法(MRI)；測定礦物質化母質之形成；或測定鹼性磷酸酶活性。

一具體例中，ASC之成骨性分化係在成骨性分化培養基(MD)中培養ASC來進行。

一具體例中，成骨性分化培養基包含人類血清。一特定具體例中，成骨性分化培養基包含人類血小板溶胞液(hPL)。一具體例中，成骨性分化培養基不包含任何其他動物血清，較佳為不包含人類血清以外之其他血清。

一具體例中，成骨性分化培養包含或其組成為補充地塞米松(dexamethasone)、抗壞血酸與磷酸鈉之增殖培養基。一具體例中，成骨性分化培養基進一步包含抗生素，如：青黴素、鏈黴素、慶大黴素與/或兩性黴素B。 一具體例中，所有培養基均不含動物蛋白質。

一具體例中，增殖培養基可為此相關技藝者已習知設計用於支持細胞生長之任何培養基。本文所採用增殖培養基亦稱為「生長培養基」。生長培養基實例包括(但不限於)：MEM、DMEM、IMDM、RPMI 1640、FGM或FGM-2、199/109培養基、HamF10/HamF12或McCoy’s 5A。較佳具體例中，增殖培養基為DMEM。

一具體例中，成骨性分化培養基包含或其組成為補充L-丙胺醯基-L-麩醯胺(Ala-Gln，亦稱為「Glutamax®」或「Ultraglutamine®」)、hPL、地塞米松、抗壞血酸與磷酸鈉之DMEM。一具體例中，成骨性分化培養基包含或其組成為補充L-丙胺醯基-L-麩醯胺、hPL、地塞米松、壞血酸與磷酸鈉、與抗生素(較佳為青黴素、鏈黴素、慶大黴素與/或兩性黴素B)之DMEM。

一具體例中，成骨性分化培養基包含或其組成為補充L-丙胺醯基-L-麩醯胺、hPL(約5%，v/v)、地塞米松(約1μM)、抗壞血酸(約0.25mM)與磷酸鈉(約2.93mM)之DMEM。一具體例中，成骨性分化培養基包含或其組成為補充L-丙胺醯基-L-麩醯胺、hPL(約5%，v/v)、地塞米松(約1μM)、抗壞血酸(約0.25mM)與磷酸鈉(約2.93mM)、青黴素(約100U/mL)與鏈黴素(約100μg/mL)之DMEM。一具體例中，成骨性分化培養基進一步包含兩性黴素B(約0.1%)。

一具體例中，成骨性分化培養基係由補充L- 丙胺醯基-L-麩醯胺、hPL(約5%，v/v)、地塞米松(約1μM)、抗壞血酸(約0.25mM)與磷酸鈉(約2.93mM)之DMEM組成。一具體例中，成骨性分化培養基包含或其組成為補充L-丙胺醯基-L-麩醯胺、hPL(約5%，v/v)、地塞米松(約1μM)、抗壞血酸(約0.25mM)與磷酸鈉(約2.93mM)、青黴素(約100U/mL)、鏈黴素(約100μg/mL)與兩性黴素B(約0.1%)之DMEM。

一具體例中，ASC為晚期傳代脂肪幹細胞。本文所採用術語「晚期傳代」意指在至少傳代4之後分化之脂肪幹細胞。本文所採用傳代4係指第四次傳代，亦即第四次分開細胞之作為，該作為係從培養容器表面剝離後，再懸浮於新鮮培養基中。一具體例中，晚期傳代脂肪幹細胞係在傳代4、傳代5、傳代6或更多次傳代之後分化。較佳具體例中，ASC在傳代4之後分化。

本文所採用術語「容器」意指任何細胞培養表面，如：例如：燒瓶或凹孔盤。

初代細胞之初次傳代稱為傳代0(P0)。根據本發明，傳代P0係指由來自離心集結成塊之基質血管部份(SVF)之細胞懸浮液接種至培養容器上。因此，傳代P4意指從培養容器表面剝離細胞4次(在P1、P2、P3、與P4時)(例如：使用胰蛋白酶分解)，並再懸浮於新鮮培養基中。

一具體例中，本發明ASC係培養在增殖培養基中，直到第四次傳代。一具體例中，本發明ASC係在第四次傳代之後培養在分化培養基中。因此，一具體例中， 在傳代P1、P2與P3時，從培養容器表面剝離ASC後，於增殖培養基中稀釋至適當細胞密度。仍然依據本具體例，在傳代P4時，從培養容器表面剝離ASC後，於分化培養基中稀釋至適當細胞密度。因此，依據本具體例，在P4時，本發明ASC未再懸浮，並在進行分化之前(亦即於分化培養基中培養之前)先於增殖培養基中培養直到滿盤，但即直接於分化培養基中再懸浮及培養。

一具體例中，細胞維持在成骨性分化培養基中至少直到達到滿盤，較佳為達到70%與100%之間之滿盤度，更佳為80%與95%之間之滿盤度。一具體例中，細胞維持在成骨性分化培養基中至少5天，較佳為至少10天，更佳為至少15天。一具體例中，細胞維持在成骨性分化培養基中5至30天，較佳為10至25天，更佳為15至20天。一具體例中，分化培養基每2天更換一次。然而，此相關技藝已習知，一位供者與另一位供者之間之細胞生長速率可能稍有差異。因此，成骨性分化的持續時間與培養基更換次數可能隨供者變化。

一具體例中，細胞維持在成骨性分化培養基中至少直到形成類骨質，亦即骨組織成熟前所形成骨母質之未礦物質化有機部分。

一具體例中，本發明陶瓷材料係呈粒子形式，本文稱為陶瓷粒子。一具體例中，粒子可為珠粒、粉末、球狀、微小球、與類似物。

一具體例中，本發明陶瓷材料為磷酸鈣(CaP)、 碳酸鈣(CaCO₃)、硫酸鈣、或氫氧化鈣(Ca[OH]₂)之粒子、或其組合。

磷酸鈣粒子實例包括(但不限於)：羥磷灰石(HA，Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)、磷酸三鈣(TCP，Ca₃[PO₄]₂)、α-磷酸三鈣(α-TCP，(α-Ca₃(PO₄)₂)、β-磷酸三鈣(β-TCP，β-Ca₃(PO₄)₂)、磷酸四鈣(TTCP，Ca₄(PO₄)₂O)、磷酸八鈣(Ca₈H₂(PO₄)₆5H₂O)、非晶形磷酸鈣(Ca₃(PO₄)₂)、羥磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCP)，羥磷灰石/磷酸四鈣(HA/TTCP)，與類似物。

一具體例中，本發明陶瓷材料包含或其組成為羥磷灰石(HA)、磷酸三鈣(TCP)、羥磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCP)、硫酸鈣、或其組合。一具體例中，本發明陶瓷材料包含或其組成為羥磷灰石(HA)、β-磷酸三鈣(β-TCP)、羥磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCP)、α-磷酸三鈣(α-TCP)、硫酸鈣、或其組合。

一具體例中，本發明陶瓷粒子為羥磷灰石(HA)粒子。另一具體例中，本發明陶瓷粒子為β-磷酸三鈣(β-TCP)粒子。另一具體例中，本發明陶瓷粒子為羥磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCP)粒子。換言之，一具體例中，本發明陶瓷粒子為羥磷灰石與β-磷酸三鈣粒子混合物(稱為HA/β-TCP粒子)。一具體例中，本發明陶瓷粒子係由羥磷灰石粒子與β-磷酸三鈣粒子組成(稱為HA/β-TCP粒子)。

一具體例中，陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)係呈顆粒、粉末或珠粒形式。一具 體例中，陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)係呈多孔性顆粒、粉末或珠粒形式。一具體例中，陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)為多孔性陶瓷材料。一具體例中，陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)為粉末粒子。特定具體例中，陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)係呈多孔性顆粒形式。另一特定具體例中，陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)係呈粉末形式。一具體例中，陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)未結構化形成預先界定之3D形狀或骨架，如，例如：立方體。一具體例中，本發明陶瓷材料不為3D骨架。一具體例中，該陶瓷材料沒有預先界定之形狀或骨架。一具體例中，本發明陶瓷材料不呈立方體形式。一具體例中，本發明生物材料沒有骨架。

一具體例中，本發明陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)大於約50μm，較佳為大於約100μm。一具體例中，本發明陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)具有之平均直徑大於約50μm，較佳為大於約100μm。

一具體例中，本發明陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)具有之平均直徑為至少約50μm，較佳為至少約100μm，更佳為至少約150μm。另一具體例中，本發明陶瓷粒子(較佳為HA、TCP與/或HA/β-TCP粒子)具有之平均直徑為至少約200μm，較佳為 至少約250μm，更佳為至少約300μm。

另一具體例中，本發明陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)具有之平均直徑為至多約2500μm，較佳為至多約2000μm，更佳為至多約1500μm。一具體例中，本發明陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)具有之平均直徑為至多約1000μm、900μm、800μm、700μm或600μm。

一具體例中，本發明陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)具有之平均直徑範圍為約50μm至約1500μm，較佳為約50μm至約1250μm，更佳為約100μm至約1000μm。一具體例中，本發明陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)具有之平均直徑範圍為約100μm至約800μm，較佳為約150μm至約700μm，更佳為約200μm至約600μm。

一具體例中，HA/β-TCP粒子具有之平均直徑範圍為約50μm至約1500μm，較佳為約50μm至約1250μm，更佳為約100μm至約1000μm。一具體例中，HA與β-TCP粒子具有之平均直徑範圍為約100μm至約800μm，較佳為約150μm至約700μm，更佳為約200μm至約600μm。

一具體例中，粒子中之HA與β-TCP間之比例(HA/β-TCP比例)範圍為0/100至100/0，較佳為10/90至90/10，更佳為20/80至80/20。一具體例中，粒子中之HA/β-TCP比例範圍為30/70至70/30、35/65至65/35、或 40/60至60/40。

一具體例中，粒子中之HA/β-TCP比例為0/100，亦即該等粒子為β-磷酸三鈣粒子。另一具體例中，粒子中之HA/β-TCP比例為100/0，亦即該等粒子為羥磷灰石粒子。一具體例中，粒子中之HA/β-TCP比例為10/90。另一具體例中，粒子中之HA/β-TCP比例為90/10。一具體例中，粒子中之HA/β-TCP比例為20/80。另一具體例中，粒子中之HA/β-TCP比例為80/20。一具體例中，粒子中之HA/β-TCP比例為30/70。另一具體例中，粒子中之HA/β-TCP比例為70/30。另一具體例中，粒子中之HA/β-TCP比例為35/65。另一具體例中，粒子中之HA/β-TCP比例為65/35。一具體例中，粒子中之HA/β-TCP比例為40/60。另一具體例中，粒子中之HA/β-TCP比例為60/40。另一具體例中，粒子中之HA/β-TCP比例為50/50。

根據一具體例，陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP)之量係以提供生物材料3D結構者為最適量。一具體例中，針對150cm²容器，陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)之添加濃度範圍為約0.1cm³至約5cm³，較佳為約0.5cm³至約3cm³，更佳為約1cm³至約2cm³。較佳具體例中，針對150cm²容器，陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)之添加濃度為約1.5cm³。

一具體例中，陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)之添加濃度範圍為每mL培養基約 7.10^-3至7.10^-2cm³。一具體例中，陶瓷粒子(較佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)之添加濃度範圍為每cm²容器約3.3.10^-3至3.3.10^-2cm³。

一具體例中，本發明陶瓷材料係在細胞分化之後才加至培養基中。一具體例中，本發明陶瓷材料係在細胞次滿盤時添加。一具體例中，本發明陶瓷材料係在細胞超過滿盤時添加。一具體例中，本發明陶瓷材料係在細胞分化之後達到滿盤時添加。換言之，一具體例中，本發明陶瓷材料係在分化培養基中之細胞已達到滿盤時添加。一具體例中，本發明陶瓷材料係在P4之後至少5天，較佳為10天，更佳為15天時添加。一具體例中，本發明陶瓷材料係在P4之後5至30天，較佳為10至25天，更佳為15至20天時添加。

一具體例中，根據本發明生物材料為二維空間。本具體例中，本發明生物材料可形成小於1mm之薄膜。

另一具體例中，根據本發明生物材料為三維空間。本具體例中，本發明生物材料可形成厚度至少1mm之厚膜。生物材料之粒度可以配合用途。

一具體例中，本發明生物材料不包含骨架。本文所採用術語「骨架」意指模擬原生哺乳動物組織(包括人類與動物組織，如：原生哺乳動物骨頭或細胞外母質)之多孔性、孔徑、與/或功能之結構。此等骨架實例包括(但不限於)：人造骨頭、膠原蛋白海綿體、水凝膠，如：蛋白 質水凝膠、肽水凝膠、聚合物水凝膠、與木質奈米纖維素水凝膠、與類似物。一具體例中，本發明生物材料不包含人造骨頭。一具體例中，本發明陶瓷材料不為人造骨頭。

一具體例中，本發明生物材料之多維空間不歸因於模擬天然細胞外母質結構之骨架所致。一具體例中，本發明生物材料不包含模擬天然細胞外母質結構之骨架。

一具體例中，本發明生物材料之多維空間係由本發明脂肪幹細胞合成之細胞外母質所致。

一具體例中，本發明生物材料包含細胞外母質。一具體例中，本發明細胞外母質係衍生自ASC。一具體例中，本發明細胞外母質係由ASC產生。

本文所採用術語「細胞外母質」(ECM)意指非細胞三維空間大分子網狀結構。ECM之母質組份彼此與細胞附著受體結合，藉以形成複雜網狀結構，讓細胞駐留在本發明組織中或生物材料中。

一具體例中，本發明細胞外母質包含膠原蛋白、蛋白聚醣/醣胺聚醣、彈性蛋白、纖連蛋白、層黏連蛋白、與/或其他醣蛋白。一特定具體例中，本發明細胞外母質包含膠原蛋白。另一特定具體例中，本發明細胞外母質包含蛋白聚醣。另一特定具體例中，本發明細胞外母質包含膠原蛋白與蛋白聚醣。一具體例中，本發明細胞外母質包含生長因子、蛋白聚醣、分泌因子、細胞外母質調節劑、與醣蛋白。

一具體例中，本發明生物材料內之ASC形成 組織，本文稱為ASC組織。一具體例中，本發明生物材料內之ASC與陶瓷材料(較佳為陶瓷粒子，更佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)係包埋在細胞外母質中。一具體例中，ASC(較佳於骨細胞中分化)與陶瓷材料(較佳為陶瓷粒子，更佳為HA、β-TCP與/或HA/β-TCP粒子)利用細胞外母質形成3D結構。一具體例中，ASC組織為血管化組織。一具體例中，本發明生物材料為血管化。

一具體例中，ASC組織為細胞結構化互聯組織。一具體例中，陶瓷粒子係整合在細胞結構化互聯組織中。一具體例中，陶瓷粒子係勻散在ASC組織內。

一具體例中，本發明生物材料之特徵在於在陶瓷粒子之間形成互聯組織。一具體例中，本發明生物材料之特徵在於在陶瓷粒子周圍礦物質化。一具體例中，可由出現之組織回縮來證實所形成生物材料之組織性質。

一具體例中，本發明生物材料與具有骨鈣素表現及礦物質化性質之真骨頭具有相同性質。一具體例中，本發明生物材料包含骨細胞。一具體例中，本發明生物材料包含骨細胞與細胞外母質。一具體例中，本發明生物材料包含骨細胞與膠原蛋白。一特定具體例中，膠原蛋白為鈣化與礦物質化膠原蛋白。一具體例中，本發明生物材料包含骨母質。

一具體例中，本發明生物材料係生物材料之細胞分化已到達終點，並在植入時生物材料表型仍維持不變。

一具體例中，本發明生物材料包含生長因子。一具體例中，本發明生物材料之生長因子含量或分泌量係在添加生物相容性材料之後4、5、6、7、或8週時進行評估。

護骨素(OPG)(亦稱為蝕骨細胞新生作用抑制因子(OCIF)或腫瘤壞死因子受體超級家族成員11B(TNFRSF11B))為一種細胞素受體。已發現，OPG之過度表現或投藥會減弱小鼠之蝕骨細胞新生作用。同樣地，已確立缺少OPG之動物會加速蝕骨細胞新生作用，發展出嚴重骨質疏鬆症。現在已知OPG為可溶性誘餌受體(decoy receptor)，其與RANK競爭RANKL(核因子κ-B(Kappa-B)配體之受體活化劑，亦稱為腫瘤壞死因子配體超級家族成員11(TNFSF11)、TNF相關活化作用誘發細胞素(TRANCE)、護骨素配體(OPGL)、或蝕骨細胞分化因子(ODF))。已判別RANK/RANKL/OPG傳訊途徑會調節蝕骨細胞分化與活化。因此，蝕骨細胞新生作用之刺激劑RANKL之表現與抑制劑OPG之表現之間之平衡決定骨頭之再吸收量。

一具體例中，本發明生物材料之OPG含量與/或分泌可採用此相關技藝習知之任何方法定量，如：例如：ELISA，較佳為在添加生物相容性材料之後4、5、6、7、或8週時定量。

一具體例中，本發明生物材料包含OPG。一具體例中，本發明生物材料分泌OPG。一具體例中，本發明生物材料之ASC分泌OPG。一具體例中，本發明細胞- 工程處理生物材料分泌OPG。

一具體例中，本發明生物材料中，每10⁶個細胞分泌至少約1000、1250、1500、1750或2000pg OPG。一具體例中，本發明生物材料中，每10⁶個細胞分泌至少約2100、2200、2300、2400或2500pg OPG。另一具體例中，本發明生物材料中，每10⁶個細胞分泌至少約2550、2600、2650或2700pg OPG。另一具體例中，本發明生物材料中，每10⁶個細胞分泌至少約2750、2800、2850、2900或2950pg OPG。

一具體例中，本發明生物材料中，每10⁶個細胞分泌至少約2750pg OPG。另一具體例中，本發明生物材料中，每10⁶個細胞分泌約500pg OPG。另一具體例中，本發明生物材料中，每10⁶個細胞分泌約3000pg OPG。

一具體例中，本發明生物材料中，每10⁶個細胞分泌約1000至約10000pg OPG，較佳為約1250至約7500pg/10⁶個細胞，更佳為約1500至約5000pg/10⁶個細胞。一具體例中，本發明生物材料中，每10⁶個細胞分泌約1000至約5000pg OPG，較佳為約1250至約4500pg/10⁶個細胞，更佳為約1500至約4000pg/10⁶個細胞。較佳具體例中，本發明生物材料分泌之OPG濃度範圍為約2000至約3500pg/10⁶個細胞。特定具體例中，本發明生物材料分泌之OPG濃度為約3000或3500pg/10⁶個細胞。

一具體例中，本發明生物材料為每克生物材 料分泌至少約5ng OPG，較佳為至少約10ng/g，更佳為至少約15ng/g。另一具體例中，本發明生物材料為每克生物材料分泌至少約20ng OPG，較佳為至少約25ng/g，更佳為至少約30ng/g。

另一具體例中，本發明生物材料為每克生物材料分泌至少約50ng OPG，較佳為至少約60ng/g，更佳為至少約70ng/g。一具體例中，本發明生物材料為每克生物材料分泌至少約75ng OPG。另一具體例中，本發明生物材料為每克生物材料分泌至少約80ng OPG。

一具體例中，本發明生物材料為每克生物材料分泌約5至約200ng OPG，較佳為約10至約175ng/g，更佳為約15至約150ng/g。另一具體例中，本發明生物材料為每克生物材料分泌約10至約200ng OPG，較佳為約15至約175ng/g，更佳為約20至約150ng/g，甚至更佳為約25至約125ng/g。一具體例中，本發明生物材料分泌約20至約100ng/g生物材料。另一具體例中，本發明生物材料分泌約25至約100ng/g生物材料。另一具體例中，本發明生物材料分泌約30至約100ng/g生物材料、約30至約90ng/g生物材料、或約30至約85ng/g生物材料。

一特定具體例中，本發明生物材料分泌之OPG濃度為約30ng/g生物材料。另一特定具體例中，本發明生物材料分泌之OPG濃度為約75ng/g生物材料。另一特定具體例中，本發明生物材料分泌之OPG濃度為約85ng/g生物材料。

一具體例中，在添加陶瓷材料後4、5、6、7或8週之後，本發明生物材料分泌如本文上述說明濃度之OPG。換言之，一具體例中，在開始誘發多維空間後4、5、6、7或8週之後，本發明生物材料分泌如本文上述說明濃度之OPG。

一具體例中，本發明生物材料之RANKL含量與/或分泌量可採用此相關技藝習知之任何方法定量，如：例如：採用ELISA，較佳為在添加陶瓷材料後4、5、6、7或8週時定量。

一具體例中，本發明生物材料中或生物材料在培養基中時之上清液中之RANKL含量係無法檢測。一具體例中，RANKL含量係以每mL上清液之pg表示。一具體例中，本發明生物材料包含之RANKL或生物材料之ASC分泌之RANKL為每mL低於200pg，較佳為低於156pg/mL，較佳為低於100pg/mL，更佳為低於78pg/mL，甚至更佳為低於50pg/mL，甚至更佳為低於10pg/mL，甚至更佳為低於7.8pg/mL。

一具體例中，本發明生物材料實質上不包含RANKL。一具體例中，本發明生物材料之ASC實質上不分泌RANKL。

一具體例中，在添加陶瓷材料後4、5、6、7或8週之後，本發明生物材料分泌如本文上述說明濃度之RANKL。換言之，一具體例中，在開始誘發多維空間後4、5、6、7或8週之後，本發明生物材料分泌如本文上述說 明濃度之RANKL。

一具體例中，本發明生物材料分泌OPG，且不分泌RANKL，或不分泌可檢測量之RANKL。

一具體例中，本發明生物材料分泌至少如本文上述說明濃度之OPG，及分泌至多如本文上述說明濃度之RANKL。

一具體例中，本發明生物材料展現骨頭再吸收抑制活性。一具體例中，該骨頭再吸收抑制活性包括分泌護骨素(OPG)。一具體例中，該骨頭再吸收抑制活性包括分泌OPG及低分泌或不分泌RANKL。

類胰島素生長因子(IGF-1)與維持骨頭礦物質密度具有正面相關性，並可提高尖峰骨質量，降低後續之骨折風險。

一具體例中，本發明生物材料之IGF-1含量可採用此相關技藝習知之任何方法定量，如：例如：採用ELISA，較佳為在添加陶瓷材料後4、5、6、7或8週定量。

一具體例中，本發明生物材料包含IGF-1。特定具體例中，本發明生物材料包含高量IGF-1。

一具體例中，本發明生物材料包含之IGF-1濃度為至少約50ng/g生物材料，較佳為至少約60ng/g，更佳為至少約70ng/g，甚至更佳為至少約80ng/g。一具體例中，本發明生物材料包含之IGF-1濃度為至少約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100ng/g生物材料。

一具體例中，本發明生物材料包含之IGF-1濃度範圍為約10ng/g至約500ng/g生物材料，較佳為約20ng/g至約400ng/g，更佳為約30ng/g至約300ng/g，甚至更佳為約40ng/g至約250ng/g。

一具體例中，本發明生物材料包含之IGF-1濃度範圍為約50ng/g至約200ng/g生物材料，較佳為約60ng/g至約175ng/g，更佳為約70ng/g至約150ng/g。一具體例中，本發明生物材料包含之IGF-1濃度範圍為約80ng/g至約150ng/g生物材料，較佳為約85ng/g至約125ng/g，更佳為約90ng/g至約100ng/g。

一具體例中，本發明生物材料包含之IGF-1濃度範圍為約90ng/g至約500ng/g生物材料、約90ng/g至約400ng/g、約90ng/g至約300ng/g、約90ng/g至約200ng/g、約90ng/g至約150ng/g、約90ng/g至約125ng/g或約90ng/g至約100ng/g。

一具體例中，本發明生物材料包含之IGF-1濃度為約90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100ng/g生物材料。一具體例中，本發明生物材料為每克生物材料包含約90ng IGF-1。另一具體例中，本發明生物材料為每克生物材料包含約95ng IGF-1。另一具體例中，本發明生物材料為每克生物材料包含約100ng IGF-1。

一具體例中，在添加陶瓷材料後4、5、6、7或8週之後，本發明生物材料包含如本文上述說明濃度之IGF-1。換言之，一具體例中，在開始誘發多維空間後4、 5、6、7或8週之後，本發明生物材料包含如本文上述說明濃度之IGF-1。

SDF-1α，亦稱為基質細胞衍生因子1-α或CXCL12，在蝕骨細胞分化與活化上扮演刺激角色。蝕骨細胞，特別是蝕骨細胞前驅體，對CXCR4(係SDF-1α之特定受體)呈高度陽性反應。雖然SDF-1α直接誘發蝕骨細胞新生作用，但近來發現SDF-1α會藉由上調RANKL表現而間接影響蝕骨細胞新生作用。蝕骨細胞與其前驅體存在RANK，表示駐留在基質細胞之蝕骨細胞-分化因子可能為RANKL。

一具體例中，本發明生物材料之SDF-1α含量可採用此相關技藝習知之任何方法定量，如：例如：採用ELISA，較佳為在添加陶瓷材料後4、5、6、7或8週定量。

一具體例中，本發明生物材料包含SDF-1α。一特定具體例中，本發明生物材料包含低量SDF-1α。

一具體例中，本發明生物材料包含之SDF-1α濃度為至多約300ng/g生物材料，較佳為至多約250ng/g，更佳為至多約200ng/g，甚至更佳為至多約150ng/g。一具體例中，本發明生物材料包含之SDF-1α濃度為至多約100ng/g生物材料，較佳為至多約90ng/g，更佳為至多約80ng/g。一具體例中，本發明生物材料包含之SDF-1α濃度為至多約75ng/g生物材料、約70ng/g、約65ng/g、約60ng/g或約55ng/g。一具體例中，本發明生物材料包含之SDF-1α濃度為至多約59、58、57、56、55、54、53、 52或51ng/g生物材料。

一具體例中，本發明生物材料包含之SDF-1α濃度為至多約50ng/g生物材料。一具體例中，本發明生物材料包含之SDF-1α濃度為至多約49、48、47、46、45、44、43、42或41ng/g生物材料。特定具體例中，本發明生物材料包含之SDF-1α濃度為至多約40ng/g生物材料。一具體例中，本發明生物材料包含之SDF-1α濃度為至多約39、38、37、36、35、34、33、32或31ng/g生物材料。特定具體例中，本發明生物材料包含之SDF-1α濃度為至多約30ng/g生物材料。

一具體例中，本發明生物材料包含之SDF-1α濃度範圍為約5ng/g至約100ng/g生物材料，較佳為約10ng/g至約90ng/g，更佳為約15ng/g至約90ng/g。另一具體例中，本發明生物材料包含之SDF-1α濃度範圍為約20ng/g至約80ng/g生物材料，較佳為約25ng/g至約70ng/g，更佳為約25ng/g至約60ng/g。一具體例中，本發明生物材料包含之SDF-1α濃度範圍為約25ng/g至約55ng/g生物材料。一具體例中，本發明生物材料包含之SDF-1α濃度範圍為約30ng/g至約100ng/g生物材料、約30ng/g至約90ng/g、約30ng/g至約80ng/g、約30ng/g至約70ng/g、約30ng/g至約60ng/g、約30ng/g至約55ng/g、或約30ng/g至約50ng/g。

一具體例中，本發明生物材料為每克生物材料包含約30ng SDF-1α。另一具體例中，本發明生物材料 為每克生物材料包含約40ng SDF-1α。另一具體例中，本發明生物材料為每克生物材料包含約50ng SDF-1α。

一具體例中，在添加陶瓷材料後4、5、6、7或8週之後，本發明生物材料包含如本文上述說明濃度之SDF-1α。換言之，一具體例中，在開始誘發多維空間後4、5、6、7或8週之後，本發明生物材料包含如本文上述說明濃度之SDF-1α。

一具體例中，本發明生物材料分泌如本文上述說明濃度之OPG、包含如本文上述說明濃度之IGF1，及包含如本文上述說明濃度之SDF-1α。

特定具體例中，本發明生物材料為：-每克生物材料分泌至少約5ng OPG，較佳為至少約10ng/g，更佳為至少約15ng/g，-每克生物材料包含至少約10ng IGF1，較佳為至少約25ng/g，更佳為至少約50ng/g，及-每克生物材料包含至多約200ng SDF-1α，較佳為至多約150ng/g，更佳為至多約100ng/g。

另一特定具體例中，本發明生物材料為：-每克生物材料分泌至少約10ng OPG，較佳為至少約20ng/g，更佳為至少約30ng/g，-每克生物材料包含至少約50ng IGF1，較佳為至少約75ng/g，更佳為至少約90ng/g，及-每克生物材料包含至多約100ng SDF-1α，較佳為至多約75ng/g，更佳為至多約50ng/g。

一具體例中，本發明生物材料包含血管內皮生長因子(VEGF)。特定具體例中，本發明生物材料包含高量VEGF。

一具體例中，本發明生物材料之VEGF含量可採用此相關技藝習知之任何方法定量，如：例如：採用ELISA，較佳在添加陶瓷材料後4、5、6、7、或8週定量。

一具體例中，本發明生物材料包含之VEGF濃度為至少約10ng/g生物材料，較佳為至少約20ng/g，更佳為至少約30ng/g。另一具體例中，本發明生物材料包含之VEGF濃度為至少約50ng/g生物材料、約60ng/g、約70ng/g，或約75ng/g。另一具體例中，本發明生物材料包含之VEGF濃度為至少約95或100ng/g生物材料。

一具體例中，本發明生物材料包含之VEGF濃度範圍為約10ng/g至約150ng/g生物材料，較佳為約20ng/g至約125ng/g，更佳為約25ng/g至約100ng/g。另一具體例中，本發明生物材料包含之VEGF濃度範圍為約20ng/g至約100ng/g生物材料。另一具體例中，本發明生物材料包含之VEGF濃度範圍為約30ng/g至約100ng/g生物材料。另一具體例中，本發明生物材料包含之VEGF濃度範圍為約35ng/g至約100ng/g生物材料。另一具體例中，本發明生物材料包含之VEGF濃度範圍為約35ng/g至約95ng/g生物材料。

一具體例中，本發明生物材料包含之VEGF濃度為約35ng/g生物材料。另一具體例中，本發明生物 材料包含之VEGF濃度為約75ng/g生物材料。另一具體例中，本發明生物材料包含之VEGF濃度為約95ng/g生物材料。另一具體例中，本發明生物材料包含之VEGF濃度為約100ng/g生物材料。

一具體例中，在添加陶瓷材料後4、5、6、7或8週之後，本發明生物材料包含如本文上述說明濃度之VEGF。換言之，一具體例中，在開始誘發多維空間後4、5、6、7或8週之後，本發明生物材料包含如本文上述說明濃度之VEGF。

骨形態蛋白質2或BMP2在刺激骨頭發展時扮演重要角色。例如：已證實有潛力誘發成骨細胞分化。

骨形態蛋白質7或BMP7在間質細胞轉形成骨頭時扮演重要角色，特定言之藉由誘發SMAD1與SMAD5之磷酸化，其進而誘發多種成骨性基因之轉錄。

一具體例中，本發明生物材料之BMP2與BMP7含量可採用此相關技藝習知之任何方法定量，如：例如：採用ELISA，較佳在添加陶瓷材料後4、5、6、7、或8週定量。

一具體例中，本發明生物材料中或生物材料在培養基中時之上清液中之BMP2含量係無法檢測。一具體例中，本發明生物材料實質上不包含BMP2。一具體例中，本發明生物材料之ASC實質上不分泌BMP2。

一具體例中，BMP2含量係以每mL上清液之pg表示。一具體例中，本發明生物材料包含之BMP2或生 物材料之ASC分泌之BMP2為每mL低於100pg，較佳為低於85pg/mL，更佳為低於75pg/mL，甚至更佳為低於62.5pg/mL。

一具體例中，本發明生物材料中或生物材料在培養基中時之上清液中之BMP7含量係無法檢測。一具體例中，本發明生物材料實質上不包含BMP7。一具體例中，本發明生物材料之ASC實質上不分泌BMP7。

一具體例中，BMP7之含量係以每mL上清液之pg表示。一具體例中，本發明生物材料包含之BMP7或生物材料之ASC分泌之BMP7為每mL低於50pg，較佳為低於40pg/mL，更佳為低於35pg/mL，甚至更佳為低於31.2pg/mL。

一具體例中，在添加陶瓷材料後4、5、6、7或8週之後，本發明生物材料包含如本文上述說明濃度之BMP2與/或BMP7。換言之，一具體例中，在開始誘發多維空間後4、5、6、7或8週之後，本發明生物材料包含如本文上述說明濃度之BMP2與/或BMP7。

一具體例中，根據本發明生物材料係礦物質化。本文所採用術語「礦物質化」或「骨組織礦物質密度」係指生物材料所形成每平方公分骨頭或「骨樣」組織之礦物質含量，亦可採用百分比表示。因此，本文所採用術語「礦物質化」或「骨組織礦物質密度」係指每平方公分生物材料之礦物質含量，亦可採用百分比表示。

分析生物材料礦物質化程度之方法係此相關 技藝習知。此等方法實例包括(但不限於)：微米級電腦斷層掃瞄(micro-CT)分析法、影像質譜儀、鈣黃綠素藍染色法(calcein blue staining)、骨礦物質密度分佈(BMDD)分析法，與類似方法。

一具體例中，本發明生物材料之礦物質化程度未低於約1%。一具體例中，本發明生物材料之礦物質化程度超過約1%。

另一具體例中，本發明生物材料之礦物質化程度為至少約5%，較佳為至少約10%，更佳為至少約15%。另一具體例中，本發明生物材料之礦物質化程度為至少約20%，較佳為至少約25%，更佳為至少約30%，甚至更佳為至少約35%。一具體例中，本發明生物材料之礦物質化程度為至少約30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%或38%。

一具體例中，本發明生物材料之礦物質化程度範圍為約5%至約50%，較佳為約10%至約45%，更佳為約15%至約40%。另一具體例中，本發明生物材料之礦物質化程度範圍為約20%至約50%，較佳為約25%至約45%，更佳為約30%至約40%。一具體例中，本發明生物材料之礦物質化程度範圍為約35%至約40%。一特定具體例中，本發明生物材料之礦物質化程度為約38%。

一具體例中，本發明生物材料之礦物質化程度係與OPG分泌成比例。一具體例中，生物材料之OPG含量越高，生物材料之礦物質化程度越高。

本發明亦有關一種製造多維空間生物材料之方法，該生物材料包含會分化成成骨性細胞之脂肪組織衍生之幹細胞(ASC)、陶瓷材料、與細胞外母質，其中該生物材料包含護骨素(OPG)。

一具體例中，製造根據本發明生物材料之方法包括下列步驟：-細胞增殖，-細胞分化，及-誘發多維空間。

一具體例中，製造根據本發明生物材料之方法包括下列步驟：-ASC增殖，-ASC成骨性分化，及-誘發多維空間，較佳為誘發3D。

一具體例中，製造根據本發明生物材料之方法包括下列步驟：-在增殖培養基中培養細胞，較佳為ASC，-在分化培養基中培養細胞，較佳為ASC，及-誘發多維空間，較佳為3D結構。

一具體例中，製造本發明生物材料之方法進一步包括在細胞增殖步驟之前先單離細胞(較佳為ASC)之步驟。一具體例中，製造本發明生物材料之方法進一步包括在細胞增殖步驟之前先單離細胞(較佳為ASC)之步驟。

一具體例中，增殖步驟係於增殖培養基中進 行。一特定具體例中，增殖培養基為DMEM。一具體例中，增殖培養基係補充Ala-Gln與/或人類血小板溶胞物(hPL)。一具體例中，增殖培養基進一步包含抗生素，如：青黴素與/或鏈黴素。

一具體例中，增殖培養基包含或其組成為補充Ala-Gln與hPL(5%)之DMEM。一具體例中，增殖培養基包含或其組成為補充Ala-Gln、hPL(5%，v/v)、青黴素(100U/mL)與鏈黴素(100μg/mL)之DMEM。

一具體例中，如本文上述說明進行增殖步驟。一具體例中，增殖步驟係進行到至高P8。一具體例中，增殖步驟持續至P4、P5、P6、P7或P8。因此，一具體例中，細胞增殖步驟包括至少3次傳代。一具體例中，細胞增殖步驟包括至多7次傳代。一具體例中，細胞增殖步驟包括3至7次傳代。一特定具體例中，增殖步驟係進行到至高P4。因此，一具體例中，細胞增殖步驟包括從培養容器表面剝離細胞後，於傳代P1、P2與P3時，在增殖培養基中稀釋。在增殖達到P6之具體例中，細胞增殖步驟包括從培養容器表面剝離細胞，然後於傳代P1、P2、P3、P4與P5時，在增殖培養基中稀釋。

一具體例中，依細胞傳代3、4、5、6或7次所需之時間持續進行增殖步驟。一特定具體例中，依細胞傳代3次所需之時間持續進行增殖步驟。一具體例中，增殖步驟持續進行直到最後一次傳代之後之細胞達到滿盤，較佳為70%與100%之間之滿盤度，更佳為80%與95%之 間之滿盤度。一具體例中，增殖步驟持續進行直到第三、第四、第五、第六、或第七次傳代之細胞達到滿盤。

一項有利之具體例中，在添加生物相容性粒子之前先於分化培養基中培養細胞(較佳為ASC)係本發明之關鍵步驟。需要此等步驟才得以讓ASC分化為成骨性細胞。此外，需要此步驟才可以得到多維空間結構。

一具體例中，分化步驟係在P4、P5、P6、P7或P8之後進行。一具體例中，分化步驟係在細胞尚未滿盤時進行。一特定具體例中，分化步驟係在P4、P5、P6、P7或P8之後，細胞培養未達滿盤時進行。

一具體例中，分化步驟係在P4、P5、P6、P7或P8時進行。一具體例中，分化步驟係在細胞尚未滿盤時進行。一特定具體例中，分化步驟係在P4、P5、P6、P7或P8細胞培養未達滿盤時進行。

一具體例中，進行分化步驟時，細胞係於分化培養基(較佳為成骨性分化培養基)中培養。一具體例中，進行分化之步驟，係將從培養容器表面剝離之細胞再懸浮於分化培養基(較佳為成骨性分化培養基)中。

一具體例中，ASC於成骨性分化培養基中之培養係進行至少5天，較佳為至少10天，更佳為至少15天。一具體例中，ASC於成骨性分化培養基中之培養係進行5至30天，較佳為10至25天，更佳為15至20天。一具體例中，每2天更換分化培養基。

一具體例中，進行誘發多維空間(較佳為誘發 3D)之步驟時，添加如上述定義之陶瓷材料至分化培養基中。一具體例中，在誘發多維空間(較佳為誘發3D)期間，細胞係維持在分化培養基中。

一具體例中，當細胞在分化培養基中達到滿盤時，較佳係於70%與100%之間之滿盤度，更佳為80%與95%之間之滿盤度時，進行誘發多維空間(較佳為誘發3D)之步驟。

另一具體例中，當出現形態變化(如：例如：形成小節)時，進行誘發多維空間(較佳為誘發3D)之步驟。一具體例中，當形成至少一個類骨質小節時，進行誘發多維空間(較佳為誘發3D)之步驟。本文所採用術語「類骨質」意指骨組織成熟前形成之骨母質未礦物質化之有機部分。

另一具體例中，當細胞達到滿盤時、當出現形態變化時、及當形成至少一個類骨質小節時，進行誘發多維空間(較佳為誘發3D)之步驟。

一具體例中，細胞與本發明陶瓷材料係培養至少5天，較佳為至少10天，更佳為至少15天。一具體例中，細胞與本發明陶瓷材料係培養10天至30天，較佳為15至25天，更佳為20天。一具體例中，在誘發多維空間(較佳為誘發3D)步驟期間，每2天更換培養基。

本發明亦有關一種根據本發明方法製得之多維空間生物材料。一具體例中，該多維空間生物材料係根據本發明方法製得。一具體例中，採用本發明方法可以得到或已得到之生物材料係計畫植入人類或動物身體中。一 具體例中，植入之生物材料可為自體來源，或同種異體。一具體例中，本發明生物材料可以植入骨頭或軟骨區域。一具體例中，此生物材料可以植入人類或動物身體之不規則區域。

一具體例中，本發明生物材料為同源性，其意指整個組織之生物材料具有類似結構與/或組成。一具體例中，生物材料具有植入原生疾病區域所需之理想操作性與機械特徵。一具體例中，採用本發明方法可以得到或已得到之生物材料不需要撕開即可利用手術儀器把持。

本發明另一個目的為一種醫學裝置，其包含根據本發明之生物材料。

本發明再另一個目的為一種醫藥組成物，其包含根據本發明之生物材料與至少一種醫藥上可接受之載劑。

本發明亦有關一種用於作為醫藥之根據本發明之生物材料或醫藥組成物。

本發明係有關以本發明生物材料作為醫學裝置、或包括在醫學裝置中、或含在醫藥組成物中之任何用途。

本發明進一步有關一種為有需要之個體治療骨缺損或軟骨缺損之方法，其包括對個體投與醫療有效量之根據本發明之生物材料、醫學裝置或醫藥組成物。

本文所採用術語「骨缺損」意指原本骨頭應正常之身體區域缺少骨組織或需要在醫療上形成骨組織。

本文所採用術語「軟骨缺損」意指原本軟骨應正常之身體區域缺少軟骨組織或需要在醫療上形成軟骨組織。

本發明另一個目的為一種根據本發明之生物材料、醫學裝置或醫藥組成物，其用於對有需要之個體治療骨缺損或軟骨缺損。本發明另一個目的為以根據本發明之生物材料、醫學裝置或醫藥組成物作為有需要之個體治療骨缺損之用途。

骨頭缺損實例包括(但不限於)：骨折、骨脆弱、骨礦物質密度流失、關節炎、假關節(如：先天性假關節)、骨質疏鬆症、椎弓斷裂、脊椎滑脫、軟骨病、骨質缺乏症、骨癌、柏哲德氏症(Paget’s disease)、硬結病變、骨浸潤疾患、網狀骨質與皮質骨壞死、脊柱裂、延遲癒合、成骨不全症、顱骨缺損(例如：腫瘤切除或失血之後)、骨壞死與代謝性骨流失。

軟骨缺損實例包括(但不限於)：身體區域之軟骨受傷或缺少軟骨。軟骨缺損之原因可能歸因於創傷、骨壞死、骨軟骨炎、與其他病症。軟骨缺損最好發於膝關節，其經常由創傷引起，且與韌帶受傷有關，如：前十字韌帶(ACL)撕裂。

一具體例中，本發明生物材料、醫學裝置或醫藥組成物係治療或用於治療選自包含下列各項或由下列各項組成之群中之骨缺損：骨折、骨脆弱、骨礦物質密度流失、關節炎、假關節(如：先天性假關節)、骨質疏鬆症、 椎弓斷裂、脊椎滑脫、軟骨病、骨質缺乏症、骨癌、柏哲德氏症、硬結病變、骨浸潤疾患、網狀骨質與皮質骨壞死、脊柱裂、延遲癒合、成骨不全症、顱骨缺損(例如：腫瘤切除或失血之後)、骨壞死與代謝性骨流失。

一具體例中，本發明生物材料、醫學裝置或醫藥組成物係治療或用於治療選自包含下列各項之群組或由下列各項所組成之群組之骨缺損：骨折、關節炎、先天性假關節、骨質疏鬆症、椎弓斷裂、脊椎滑脫、骨癌、柏哲德氏症、硬結病變、網狀骨質與皮質骨壞死、與代謝性骨流失。

一具體例中，本發明生物材料、醫學裝置或醫藥組成物係治療或用於治療椎弓斷裂與/或脊椎滑脫。椎弓斷裂為椎弓之椎弓峽部缺損或壓力骨折。脊椎滑脫或滑移為一個椎骨相對於相鄰椎骨平移位移或呈非解剖軸線，發生在約30%椎弓斷裂患者。

一具體例中，脊椎滑脫為發育不良型、峽部型、退化型、創傷型、病理型、與/或手術後/醫源性脊椎滑脫。一具體例中，脊椎滑脫為發育不良性脊椎滑脫(亦稱為第1型)，由上薦椎面或第五腰椎之內面先天性異常所致。另一具體例中，脊椎滑脫為峽部型脊椎滑脫(亦稱為第2型)，由椎弓峽部缺損引起，但亦可能出現峽部延長。另一具體例中，脊椎滑脫為退化型脊椎滑脫(亦稱為第3型)，為關節突關節炎與關節重塑之結果。另一具體例中，脊椎滑脫為創傷型脊椎滑脫(亦稱為第4型)，歸因於峽部以外之椎 弓急性骨折。另一具體例中，脊椎滑脫為病理型脊椎滑脫(亦稱為第5型)，由感染或惡性病引起。另一具體例中，脊椎滑脫為手術後/醫源性脊椎滑脫(亦稱為第6型)，由手術後併發症引起。

一具體例中，脊椎滑脫依據梅爾丁分類法(Meyerding classification)分為第I級、第II級、第III級、第IV級、或第V級。一具體例中，脊椎滑脫為第I級，以椎體寬度之百分比來測定時，其相當於滑移程度為0至25%。另一具體例中，脊椎滑脫為第II級，其相當於滑移程度為25%至50%。另一具體例中，脊椎滑脫為第III級，其相當於滑移程度為50%至75%。另一具體例中，脊椎滑脫為第IV級，其相當於滑移程度為75%至100%。另一具體例中，脊椎滑脫為第V級，其相當於滑移程度超過100%。

一具體例中，本發明生物材料、醫學裝置或醫藥組成物係用於填充有需要之個體之椎間空間及/或計畫植入之融合支架(群)中。

一具體例中，本發明生物材料、醫學裝置或醫藥組成物係治療或用於治療先天性假關節。一特定具體例中，本發明生物材料、醫學裝置或醫藥組成物係治療或用於治療先天性脛骨假關節(CPT)。CPT係指自發性發展或經過小創傷後之脛骨骨折未融合：脛骨出現節段性發育不良，造成骨頭向前外側彎曲。CPT通常與神經纖維瘤症候群有關，而且成為幼兒骨科手術要面對的最具挑戰性且 令人恐懼的狀態。通常該疾病在幼兒出生第一年即顯現，但亦可能直到12歲都不會檢測到。

一具體例中，依據克勞福德分類法(Crawford classification)，CPT分為I型、II型、III型、或IV型。一具體例中，CPT為I型，相當於前弓曲度具有提高之皮質骨密度與狹窄髓質。另一具體例中，CPT為II型，相當於前弓曲度具有狹窄之硬結髓質。另一具體例中，CPT為IIII型，相當於前弓曲度與囊腫相關或為骨折前之徵兆。另一具體例中，CPT為IV型，相當於前弓曲度及伴有假關節之顯著骨折，經常與脛骨及腓骨有關。

一具體例中，本發明生物材料、醫學裝置或醫藥組成物係治療或用於治療幼兒患者之先天性脛骨假關節。一具體例中，本發明生物材料、醫學裝置或醫藥組成物係治療或用於治療幼兒先天性脛骨假關節。

本發明亦有關一種以本發明生物材料、醫學裝置或醫藥組成物於骨科，尤指口腔頜面外科或整形手術之用途。本發明生物材料亦可用於風濕病。

本發明進一步有關一種使用本發明生物材料、醫學裝置或醫藥組成物之方法，其係繼手術、創傷或其他先天或後天異常之後，用於治療、矯正或緩解先天或後天異常之關節、顱-顏面-上頜骨、齒顎矯正學疾患、骨頭或關節骨頭疾患(例如：需要置換)，及支持其他肌肉骨骼植入物，特別是人造與合成之植入物。

另一態樣，本發明係有關一種本發明生物材 料、醫學裝置或醫藥組成物，其用於骨頭重建。一具體例中，本發明生物材料係用於填充人類或動物之骨腔。

又另一態樣，本發明係有關一種本發明生物材料、醫學裝置或醫藥組成物，其係用於重建或整形手術。

一具體例中，本發明係有關一種用於重建手術之本發明生物材料、醫學裝置、或醫藥組成物。另一具體例中，本發明係有關一種用於美容手術之本發明生物材料。

一具體例中，本發明生物材料、醫學裝置、或醫藥組成物可用於作為同種異體植入物或自體植入物。一具體例中，本發明生物材料、醫學裝置、或醫藥組成物可用於作為異源基因植入物。一具體例中，本發明生物材料、醫學裝置、或醫藥組成物可用於組織移植。

本發明生物材料進一步有利於刺激血管新生作用。事實上，生物材料之ASC會釋出血管內皮生長因子(VEGF)，刺激新血管生長。

一具體例中，個體為人類個體。另一具體例中，個體為動物個體，如：例如：寵物、家畜動物、或生產動物。一具體例中，個體為哺乳動物個體。

一具體例中，本發明生物材料、醫學裝置、或醫藥組成物可用於人類與/或動物。一具體例中，本發明生物材料、醫學裝置、或醫藥組成物可用於人類醫學與獸醫學。

一具體例中，個體係罹患骨缺損與/或軟骨缺 損。

特定具體例中，個體係罹患椎弓斷裂與/或脊椎滑脫。另一特定具體例中，個體係罹患先天性脛骨假關節(CPT)。特定具體例中，個體係罹患幼兒先天性脛骨假關節(CPT)。

一具體例中，個體曾經接受治療骨缺損與/或軟骨缺損。

特定具體例中，個體曾經接受治療椎弓斷裂與/或脊椎滑脫。椎弓斷裂與/或脊椎滑脫之其他治療實例包括(但不限於)：保守性處理，如：支撐、限制活動、伸展運動、屈曲運動、與深層腹部強化運動；及手術，如：脊椎融合、與椎板切除術。

另一特定具體例中，個體曾經接受治療CPT。CPT之其他治療實例包括(但不限於)：支撐與手術，如：與骨頭移植有關之髓內釘、帶血管之骨轉移、伊利查洛夫(Ilizarov)技術、誘發性之膜與海綿骨自體移植。

一具體例中，個體為對骨缺損與/或軟骨缺損之至少一種其他治療沒有反應。

一具體例中，個體為嬰兒或兒童。因此，一具體例中，個體為幼兒個體。一具體例中，個體為18歲以下，較佳為15歲、12歲或10歲以下。

另一具體例中，個體為成人。因此，一具體例中，個體為18歲以上。

一具體例中，本發明生物材料、醫學裝置或 醫藥組成物係在骨缺損與/或軟骨缺損過程(如，例如：脊椎融合過程)期間投與有需要之個體。

一具體例中，本發明生物材料、醫學裝置或醫藥組成物係與清創、放置一個或兩個椎間體支架及雙側椎弓根固定、與/或復健組合使用。

本發明亦有關一種套組，其包含根據本發明之生物材料、醫藥組成物或醫學裝置及合適之固定裝置。合適之固定裝置實例包括(但不限於)：手術膠、組織膠、或任何為生物相容性、無毒性、及視需要為生物可再吸收性之手術用黏著性組成物。

第1圖為出示hASC與三種不同濃度之HA/β-TCP(1.5、2.85與5.91cm³)間接接觸之細胞活力之柱狀圖，以相較於未處理組細胞之百分比表示。

第2圖為出示使用HA/β-TCP(A)、HA(B)或β-TCP(C)所形成之生物材料之一組巨觀視圖照片。

第3圖為出示使用HA/β-TCP(A)所形成之生物材料之一組微觀視圖照片。

第4圖為出示使用HA/β-TCP所形成之生物材料之蘇木精-伊紅法(A)、馬森三色法(Masson’s trichome)(B)、與骨鈣素(C)法染色之一組照片。

第5圖為出示使用HA/β-TCP所形成之生物材料之micro-CT分析法在三種不同規格下之一組照片(A、B與C)。

第6圖為出示使用HA/β-TCP所形成之生物材料之IGF1(深灰)、VEGF(淺灰)與SDF-1(中灰)含量之柱狀圖。

第7圖為出示ASC於MP培養基中及於MD培養基中進行2D培養、及於使用HA/β-TCP所形成生物材料之培養基中培養時，每10⁶個細胞之OPG分泌(pg)之柱狀圖。

第8圖為出示ASC於MD培養基中進行2D培養、及於使用HA/β-TCP、HA與β-TCP所形成之生物材料之培養基中培養時，每克材料之OPG分泌(pg)之柱狀圖。

第9圖為出示基因FGFR1(A)、IGFR1(B)、RUNX2(C)、TWIST1(D)、TGFBR1(E)、SMAD2(F)、SMAD4(G)、SMAD5(H)在使用HA/β-TCP所形成之本發明生物材料中(生物材料)之表現相較於ASC於MP中(MP)及於MD中(MD)時之表現之一組照片。*：P<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001。

第10圖為出示基因ANG(A)、EFNA1(B)、EFNB2(C)、VEGFA(D)、FGF1(E)、LEP(F)在使用HA/β-TCP所形成本發明之生物材料中(生物材料)之表現相較於ASC於MP中(MP)及於MD中(MD)時之表現之一組照片。*：p<0.05，**：p<0.01。

第11圖為出示在缺氧(1%)或常氧(21%)下，VEGF(A)與SDF-1α(B)在使用HA/β-TCP所形成之本發明 生物材料中(生物材料)之分泌相較於ASC於MP中(MP)及於MD中(MD)時之分泌之一組柱狀圖。

第12圖為來自本發明生物材料之外植體之溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)之免疫染色照片。HA/β-TCP粒子係以星號*表示，血管係以黑色箭頭表示。

第13圖為出示本發明生物材料之血管面積百分比(A)及血管數/mm²(B)之一組柱狀圖。

第14圖為出示本發明生物材料植入大鼠後28天，採用HLA/人類白血球抗原免疫染色法的照片，由過氧化酶顯現褐色，表示有人類細胞存在(此處以黑色箭頭表示)。HA/β-TCP粒子係以星號*表示。

第15圖為出示本發明生物材料(左上與左下圖)與單獨HA/β-TCP粒子(右上與右下圖)植入大鼠後一個月之一組股骨micro-CT-掃描照片。下排照片為上排照片之放大圖。虛線方框代表植入位點。

第16圖為出示植入HA/β-TCP粒子後一個月之一組骨缺損組織學照片：蘇木精-伊紅染色，原始放大x5(A)；馬森三色染色，原始放大x20(B)。白色箭頭代表產物未整合及重大之纖維化。黑色箭頭指示原生骨與HA/β-TCP植入物之間界面之缺損未出現軟骨內骨化。

第17圖為植入本發明生物材料後一個月之一組骨缺損組織學照片：蘇木精-伊紅染色，原始放大x5(A)；馬森三色染色，原始放大x20(B)；HLA-I免疫染色，原始放大x10(C)。白色箭頭代表產物整合及骨融合。黑色 箭頭代表軟骨內骨化，直接接觸原生骨與生物材料，表示出現骨接合過程。

[實例]

本發明進一步利用下列實例說明。

實例1：本發明生物材料之製法

hASC之單離

人類皮下脂肪組織之採集法係依據科柯曼技術(Coleman technique)，在取得同意書及經過血液篩檢之後，採用脂肪抽吸法，在腹部區域採集。

從採集到之脂肪組織快速單離人類脂肪幹細胞(hASC)。脂肪抽吸物可在+4℃存放24小時或在-80℃存放更久。

首先，單離一部份脂肪抽吸物以供品質管控，再測量剩餘脂肪抽吸物體積。然後，使用於HBSS中製備之膠原蛋白酶溶液(NB 1,Serva Electrophoresis GmbH,Heidelberg,Germany)(終濃度~8U/mL)分解脂肪抽吸物。用於分解之酵素溶液體積為脂肪組織體積之二倍。在37℃±1℃下進行分解50-70min。在15-25min後進行第一次間歇性振盪，35-45min後再進行第二次。添加MP培養基(增殖培養基或生長培養基)中止分解作用。MP培養基包含補充5%人類血小板溶胞物(hPL)(v/v)之DMEM培養基(4.5g/L葡萄糖與4mM Ala-Gln；Sartorius Stedim Biotech, Gottingen,Germany)。DMEM為包含鹽類、胺基酸、維生素、丙酮酸鹽、與葡萄糖，且經過碳酸鹽緩衝劑緩衝之標準培養基，其具有生理pH值(7.2-7.4)。所使用之DMEM含有Ala-Gln。人類血小板溶胞物(hPL)為用於刺激間質幹細胞(如：hASC)之活體外生長之生長因子之豐富來源。

經過分解之脂肪組織離心(500g，10min，室溫)及排除上清液。集結成粒之基質血管部份(SVF)再懸浮於MP培養基中，通過200-500μm篩目濾器。過濾之細胞懸浮液離心第二次(500g,10min,20℃)。取含hASC之集結粒再懸浮於MP培養基中。保留一小部份細胞懸浮液供計算細胞數，其餘細胞懸浮液全用於接種一個75cm² T-燒瓶(稱為傳代P0)。計算細胞數(僅供參考)，以估算接種細胞數。

單離步驟後隔日(第1天)，從75cm² T-燒瓶中排除生長培養基。使用磷酸鹽緩衝劑潤洗細胞3次，然後添加新鮮製備之MP培養基至燒瓶中。

人類脂肪幹細胞之生長與擴增

在增殖期期間，hASC係傳代4次(P1、P2、P3與P4)，以得到足量細胞供進行接續之製程步驟。

在P0與第四次傳代(P4)之間，細胞於T-燒瓶上培養，並添加新鮮MP培養基。當細胞達到滿盤度70%且100%(目標滿盤度：80-90%)時即進行傳代。來自同一批之所有細胞培養物接受者均同時進行傳代。每一次傳代時，均使用TrypLE(Select 1X；75cm²燒瓶使用9mL或 150cm²燒瓶使用12mL)(係一種重組之非動物性細胞解離酵素)從培養容器中剝離細胞。TrypLe分解作用係在37℃±2℃進行5-15min並藉由添加MP培養基而中止。

隨後取細胞離心(500g，5min，室溫)，再懸浮於MP培養基中。合併所採集之細胞，以保證其為同源性細胞懸浮液。再懸浮後，計算細胞數。

在傳代P1、P2與P3時，剩餘細胞懸浮液再於MP培養基中稀釋至適當細胞密度，並接種在更大組織培養表面。此等步驟中，在75cm²燒瓶中接種15mL體積之細胞懸浮液，而150cm²燒瓶中則接種30mL體積之細胞懸浮液。每一次傳代時，接種0.5x10⁴至0.8x10⁴個細胞/cm²之間之細胞。不同傳代之間，每3-4天更換培養基。一位供者與另一位供者之間之細胞表現與生長速率可能有些微差異。因此兩次傳代之間之時間及傳代之間之培養基更換次數可能隨供者與供者而變化。

成骨性分化

在傳代P4(亦即第四次傳代)時，將細胞第二次離心，再懸浮於MD培養基(分化培養基)中。再懸浮後，第二次計算細胞數後，於MD培養基中稀釋至適當細胞密度，在150cm²燒瓶中接種70mL體積之細胞懸浮液，並添加成骨性MD培養基。依據此方法，細胞在第四次傳代之後，直接於成骨性MD培養基中培養。因此在細胞未達到滿盤時即添加成骨性MD培養基。

成骨性MD培養基係由補充地塞米松 (dexamethasone)(1μM)、抗壞血酸(0.25mM)與磷酸鈉(2.93mM)之增殖培養基(DMEM,Ala-Gln,hPL 5%)構成。

一位供者與另一位供者間之細胞表現與生長速率可能有些微差異。因此成骨性分化步驟之持續時間及傳代之間之培養基更換次數可能隨供者與供者而變化。

細胞誘發多維空間

當細胞達到滿盤時，及若出現形態變化及若燒瓶中觀察到至少一個類骨質小節(骨組織成熟前所形成之骨母質未礦物質化之有機部分)時，即開始誘發3D。

曝露於成骨性MD培養基後，使用各種不同陶瓷材料緩慢且均勻噴灑包含滿盤單層附著成骨性細胞之培養容器：-HA/β-TCP粒子：為比例65/35，150cm²燒瓶使用1.5cm³(Teknimed,France)，-HA粒子：150cm²燒瓶使用1.5cm³(Biocetis,France)，或-β-TCP粒子：150cm²燒瓶使用1.5cm³(Biocetis,France)。

細胞維持在MD培養基中。誘發多維空間期間，每3至4天規律更換培養基。進行彼等培養基之更換時，小心防止排出陶瓷材料粒子與發展中之結構。

實例2：生物材料之特徵

材料與方法

細胞毒性

本方法之目的在於分析細胞-材料間接接觸之毒性(滲出性化學物於培養基中之擴散)。本方法中，接種hASC，8000個細胞/cm²(每孔15200個細胞)，於37℃，在兩個24-孔盤中培養72小時。然後，當細胞達滿盤時，排除培養基，添加陶瓷材料至包含底部微孔膜之細胞移行小室(Transwell insert)中：-150cm²容器使用三種不同量之HA/β-TCP：1.5cm³、2.85cm³與5.91cm³，-150cm²容器使用1.5cm³ HA粒子，或-150cm²容器使用1.5cm³ β-TCP粒子，然後置入各孔中，於37℃/5% CO₂下培養24小時。

培養後，使用於增殖與細胞毒性分析法(Sigma)定量活細胞數之「CCK-8套組」，依據供應商之指示，分析細胞活力。簡言之，排除培養基，在培養盤各孔中添加體積100μL之CCK-8溶液。混合物於37℃/5% CO₂下培養2至4小時。安定之四唑鎓鹽會經由複雜之細胞機轉裂解成可溶性甲(formazan)染劑。此生物還原法主要依賴活細胞之糖解作用產生NAD(P)H。因此，甲染劑之形成量與培養物中代謝活性細胞數呈正相關性。採用光度計讀數機測定450nm之光密度(OD)，來分析甲染劑之量。

相對細胞活力(%)係以相對於未處理對照組細胞之百分比表示。其測定法如下：

(OD-空白值)未處理組：陰性對照組(未處理組細胞)之(OD-空白值)之平均值。

採用未噴灑陶瓷材料之細胞作為陰性對照組(未處理組細胞)。採用經過Triton 1%溶液處理之細胞作為陽性對照組。

組織學分析

在添加陶瓷粒子後4週與8週時，取得MD培養基中結構之活體組織切片。

結構/細胞結構性/細胞外母質之存在

在蘇木精-伊紅染色與馬森三色染色之後，分析組織結構、細胞結構性、及細胞外母質之存在。

骨之分化與礦物質化

組織之骨分化與礦物質化係分別採用骨鈣素與micro-CT分析。

使用Skyscan 1172G(Bruker)(Erwan Plougonven,ULg,Liège)取得數據。使用NRecon,v.1.6.10.1(Bruker micro-CT軟體)進行重建。調整後，重建約1700x1700x700立體像素(3D像素)之3D影像。依上述解析度，立體像素體積為985μm³。減弱區域之平均體積與厚度測定值係以佔總體積之%表示。減弱區域已同化為礦物質化區域。

生長因子含量

為了分析所形成組織之生物活性，在添加陶瓷粒子後4與8週時取出活體組織切片，供萃取及定量蛋白質。依據供應商之指示，採用比色法(BCA蛋白質分析套組，ThermoFisher Scientific)及針對BMP2、BMP7、VEGF、SDF1α、IGF1之ELISA(Human Quantikine ELISA套組，RD Systems)定量總蛋白質與生長因子含量。

蝕骨細胞活性

從含ASC之2D培養物(於MD培養基或MP培養基中)及從含ASC之多維空間培養物(添加HA/βTCP約8周期間所誘發)於無hPL條件下培養72小時後，採集上清液，直接存放在-20℃供進一步定量。亦單獨萃取陶瓷粒子之蛋白質來定量OPG與RANKL含量。

使用ELISA套組(Human TNFSF11/RANKL/TRANCE ELISA套組；Human Osteoprotegerin ELISA套組；LS Bio)，依據供應商之指示，定量OPG與RANKL。

結果

細胞毒性

在低濃度(10mg/cm²)下，hASC與HA/β-TCP粒子之間接接觸會改善細胞活力(相較於僅細胞單獨時，達111.1%細胞活力)。反之，19與39.4mg/cm²之濃度分別會降低細胞活力10與52.3%(第1圖)。

組織學分析

與生物相容性粒子培養4週後或8週後之結構之間沒有顯著差異。

結構/細胞結構性/細胞外母質之存在

添加陶瓷材料幾天後，成骨性細胞與勻散之陶瓷材料粒子逐漸包埋在礦物質化細胞外母質中。

幾天後，成骨性細胞與陶瓷材料粒子開始形成大的三維空間貼片(或幾片小的貼片)之部分礦物質化黃褐色可模壓堵料，從各培養容器剝離。約15天後，已發展成多維空間生物材料，並可從燒瓶剝離。

hASC與任何不同粒子(HA/β-TCP、HA與β-TCP)於成骨性分化培養基中之共同培養物顯示形成多維空間結構。此結構可以使用鑷子把持並抵抗機械強度(第2圖)。第3圖出示使用HA/β-TCP所形成之生物材料之微觀視圖。

已發現使用HA/β-TCP所形成之生物材料之細胞結構性為262±205個細胞/mm²(n=7)。

蘇木精-伊紅染色與馬森三色染色之組織學分析顯示細胞與粒子之間存在互聯組織，且粒子均整合在細胞結構化之互聯組織中(第4圖A至第4圖B)。

骨之分化/礦物質化

骨鈣素染色在細胞外母質上呈陽性反應(第4圖C)，顯示ASC適當分化成成骨性細胞。

micro-CT分析法顯示使用HA/β-TCP所形成之生物材料之礦物質化程度為1.9%(第5圖)。

生長因子含量

已發現與生物相容性粒子培養4週後或8週 後之結構之間沒有顯著差異。

結果示於下述表1與第6圖。

所有使用本發明陶瓷粒子所形成之生物材料均包含VEGF、IGF1與SDF-1α。SDF-1含量低於彼等VEGF與IGF1之含量。所有組織均未檢測到BMP2或BMP7。

蝕骨細胞活性

取hASC於MP/MD培養基、使用HA/β-TCP形成之生物材料、使用HA形成之生物材料、及使用β-TCP形成之生物材料中之上清液，定量OPG/RANKL之分泌量。

沒有檢測到RANKL。MP或MD培養基中之細胞上清液中沒有發現OPG。

反之，使用HA/β-TCP形成之生物材料分泌約3010pg/10⁶個細胞(第7圖)。以每克組織之濃度而言，使用HA/β-TCP形成之生物材料為約30ng/g，使用HA形成之生物材料為約76ng/g，及使用β-TCP形成之生物材料為約84ng/g(第8圖)。

亦分析由HA/β-TCP單獨分泌之OPG，並發現幾乎沒有可檢測到之含量(第8圖)。

實例3：成骨性與血管新生潛力

材料與方法

採用Qiazol溶胞試劑(Qiagen,Hilden,Germany)與Precellys均質器(Bertin instruments,Montigny-le-Bretonneux,France)，從在增殖培養基(MP)中之ASC(n=4，來自四位不同人類脂肪組織供者)、在分化培養基(MD，細胞培養在沒有粒子之典型成骨性培養基)中之ASC(n=4，來自四位不同人類脂肪組織供者)、及在使用1.5cm³ HA/β-TCP所形成之生物材料中之ASC(n=4，來自四位不同人類脂肪組織供者)萃取總RNA。RNA使用Rneasy迷你套組(Qiagen,Hilden,Germany)及外加管柱DNase分解，依據製造商之指示純化。採用光度計(Spectramax 190,Molecular Devices,California,USA)進行RNA之定性與定量。cDNA係由0.5μg總RNA，使用用於成骨性與血管新生基因表現形態之RT² RNA第一股套組(Qiagen,Hilden,Germany)，透過自商品取得之PCR陣列(Human RT² Profiler Assay-Angiogenesis；Human RT² Profiler Assay-Osteogenesis,Qiagen)合成。採用ABI Quantstudio 5系統(Applied Biosystems)與SYBR Green ROX Mastermix(Qiagen,Hilden,Germany)來檢測擴增產物。依據△△CT方法得到定量結果。每個樣本之最終結果將隨三種管家基因(ACTB、B2M與GAPDH)之表現程度平均值校正。

成骨性與血管新生基因在mRNA階段之表現係採用實時RT-PCR(Human RT2 Profiler Array,Qiagen)進行。

結果

測試之84種成骨性基因中，相較於ASC於MP中時或ASC於MD中時，發現11種涉及骨骼發展之基因(ACVR1、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、CSF1、EGFR、FGFR1、IGFR1、RUNX2、TGFBR1、TWIST1)、3種涉及轉錄因子之基因(SMAD2、SMAD4、SMAD5)、2種涉及生長因子之基因(VEGFA、VEGFB)、及3種涉及細胞附著分子之基因(ITGA1、ITGB1、ICAM1)在本發明生物材料中受到調控(第9圖)。

Runt-相關轉錄因子2(Runx2)係促進成骨作用相關基因表現、調節細胞週期進展、改善骨微環境及影響軟骨細胞與蝕骨細胞功能之必要成骨作用特異性轉錄因子(Bruderer M等人，Eur Cell Mater,2014；Xu J等人，Am J Trans Res,2015)，相較於在ASC於MP中或MD中時，其於本發明生物材料中之表現顯著較高(第9圖C)。

TWIST-相關蛋白質1(TWIST1)係表現在骨骼間葉組織，並在骨骼發展期間控制間葉細胞系分佈上扮演關鍵角色(Johnson D等人，Mech Dev.2000；Rice DP等人，Mech Dev.2000)，相較於ASC於MD中時，其於本發明生物材料中之表現亦顯著較高(p=0.09)(第9圖D)。

一種重要之成骨作用途徑為轉形生長因子 -β/骨形態蛋白質(TGF-b/BMP)途徑。TGF-b(透過TGFBR1活化作用)活化細胞內傳訊蛋白質，如：SMAD。此等因子調控受TGF-β調節之基因之轉錄，藉以活化成骨基因轉錄，促進成骨細胞分化(Song B,Cytokine Growth Factor Rev.Author,2010)。值得注意的是，相較於ASC於MD中時，已發現TGFBR1與SMAD2/5 mRNA於本發明生物材料中之表現較高(第9圖E至第9圖H)。

針對ASC於MP中、MD中及本發明生物材料中所測試之84種血管新生基因，發現有6種與生長因子相關之基因(ANG、EFNA1、EFNB2、VEGFA、FGF1、TGFB1)、2種與ECM分子相關之基因(LEP、TIMP1)、及2種與細胞附著分子相關之基因(ENG、THBS1)受到調控(第10圖)。

相較於ASC於MP中時，已發現血管生成素(ANG)mRNA於本發明生物材料中之表現顯著較高(第10圖A)。血管生成素傳訊促進血管新生作用，已存在之血管可藉由該過程形成新的動脈與靜脈(Fagiani E等人，Cancer Lett,2013)。

此外，相較於ASC於MP中及MD中時，已發現Ephrin A1(EFNA)mRNA(其係在胚胎發展與成人組織中調節血管新生作用(Pasquale EB.等人，Nat Rev Mol Cell Biol 2005))於本發明生物材料中有高度表現(第10圖B與第10圖C)。

相較於ASC於MP中或MD中時，ASC於本 發明生物材料中時之血管內皮生長因子A mRNA(VEGFA)表現亦顯著改善(第10圖D)。VEGF為調節血管發展與血管新生作用之最重要生長因子之一。由於骨頭為高度血管化之器官(具有血管新生作用而為成骨作用之重要調節劑)，VEGF亦正面影響骨骼發展與產後骨頭修復(Hu K等人，Bone 2016)。

相較於ASC於MP中時，纖維母細胞生長因子1(FGF1)mRNA(係一種強力之促血管新生因子，Murakami M等人，Curr Opin Hematol 2009)與瘦體蛋白(LEP)mRNA(係一種血管新生作用之重要加強劑及VEGF表現之誘發劑；Bouloumie A等人，Circ.Res.1998；Sierra-Honigmann MR等人，Science(New York,N.Y.)1998)於本發明生物材料中亦過度表現(分別示於第10圖E與第10圖F)。

總結，本發明生物材料可藉由出現分子級(呈3D結構)之細胞表現、骨分化之能力、與促進血管新生作用之能力，界定為對移植後植入細胞具有成骨作用。

實例4：在移植後之纖維化環境中促進血管化與成骨作用

4.1. 活體外

最常見之一種組織傷害元素為出現缺氧。間質性傷害經常與凝血級聯反應之活化相關，造成缺氧區域。本文中，吾等分析本發明生物材料分泌VEGF(係移植後血管化之關鍵生長因子)之能力(Madrigal M等人，J Transl Med.2014 Oct 11；12：260)。已知在各種不同組織中，氧張 力下降會造成缺氧誘發因子(HIF-1α)活化，誘發血管新生基因轉錄(如：血管內皮生長因子(VEGF)(Ahluwalia A等人，Curr Med Chem.2012；19(1)：90-97；Hawkins KE等人，Regen Med.2013；8(6)：771-782)，及MSC化學引誘基質細胞衍生因子1(SDF-1α)(Youn SW等人，Blood.2011；117：4376-4386.Ceradini DJ等人，Nat Med.2004；10(8)：858-864))。

材料與方法

分析低氧濃度對生物材料之促血管新生性質之影響時，取由來自3位供者之ASC與1.5cm³ HA/β-TCP所形成之生物材料，使用PBS洗滌2次，以二重覆於含10mL成骨性分化培養基(MD)但不含hPL(以避免外因性生長因子出現在培養基中)之6孔培養盤中培養。培養盤置於缺氧(1% O₂)或常氧(21% O₂)、5% CO₂、37℃下72小時。採集上清液，使用ELISA定量VEGF與SDF-1α。

此外，取來自3位供者之傳代4達滿盤之ASC以二重覆於6孔培養盤中，使用PBS洗滌2次，並置於沒有hPL之5或10mL增殖培養基(MP)或成骨性分化培養基(MD)中，於缺氧(1% O₂)或常氧(21% O₂)、5% CO₂、37℃下培養72小時。然後採集上清液，使用ELISA定量VEGF與SDF-1α。

結果

雖然在低氧張力下之細胞在2D(MP與MD)中之VEGF分泌提高(在1% O₂相對於21% O₂下，分別為 於MP中之242±51相對於29±27pg/10⁵個細胞，及於MD中之565±507相對於182±216pg/10⁵個細胞(p<0.05))，本發明生物材料並未發現缺氧對VEGF分泌之影響(在1% O₂相對於21% O₂下，分別為760±594相對於806±530pg/10⁵個細胞)(第11圖A)。因此，低氧張力不為限制本發明生物材料用途之因素。

此外，在1%與21% O₂兩種條件下，相較於ASC於MP中及MD中時，本發明生物材料均發現較高之VEGF分泌(第11圖A)。

雖然ASC在MD中在缺氧挑戰後，觀察到刺激SDF-1α分泌(p=0.009)，但在21%O₂下，相較於ASC於MP中及MD中時，本發明生物材料釋出顯著較高量之SDF-1α(分別為p=0.013與0.025)(第11圖B)。

此外，在1% O₂下，相較於ASC MP及本發明生物材料(分別為p=0.009與0.013)，證實ASC MD具有較低分泌(第11圖B)。

曝露在低氧張力下(如：出現在纖維化組織之1%氧)之本發明生物材料顯示ASC有能力分泌血管新生所需之關鍵效應子。相較於ASC於增殖/成骨性培養基中呈二維空間培養時，ASC在使用細胞外母質之三維空間(亦即在本發明生物材料)中培養時該等分泌較佳(包括在缺氧及在常氧下)。

4.2. 活體內

為了測定本發明生物材料在缺氧條件下之生 物活性，進行肌肉壞死臨床前模式。由Schubert等人(Biomaterials,2011；32(34)：8880-91)說明之異位模式係探討生物材料之生物活性之黃金標準模式，其包括植入試驗項目(生物材料)至腰部由經燒灼的脊椎旁肌構成之口袋內。

材料與方法

在裸大鼠進行兩項實驗，以避免任何移植排斥下植入本發明生物材料(人類來源)。

第一項實驗之設計為分析本發明生物材料在植入後一個月之組織重塑上之角色。第二項實驗之設計為以分子級分析組織重塑(植入後第29天)。

兩項實驗中，生物材料均植入10隻裸大鼠之兩側。植入體積為約0.3cm³(相當於500mg或4.7*10⁶個細胞)生物材料。

第一項實驗中，在植入後第28天，依序採用組織形態計量學及針對溫韋伯氏(von Willebrand)因子之免疫染色法定量血管新生作用，及採用針對HLA之免疫組織化學法分析人類細胞之存在。

第二項實驗中，在植入後第29天，採用針對HLA之免疫組織化學法分析人類細胞之存在，及依序採用組織形態計量學及馬森三色染色法分析植入物之再血管化。

此外，採用Qiazol溶胞試劑(Qiagen,Hilden,Germany)與Precellys均質器(Bertin instruments, Montigny-le-Bretonneux,France)從外植體萃取總RNA。RNA使用Rneasy迷你套組(Qiagen,Hilden,Germany)及外加管柱DNase分解，依據製造商之指示純化。採用光度計(Spectramax 190,Molecular Devices,California,USA)進行RNA之定性與定量。cDNA係由0.5μg總RNA，使用用於成骨性與血管新生基因表現形態之RT² RNA第一股套組(Qiagen,Hilden,Germany)，透過自商品取得之PCR陣列(Human RT² Profiler Assay-Angiogenesis；Human RT² Profiler Assay-Osteogenesis,Qiagen)合成。採用ABI Quantstudio 5系統(Applied Biosystems)與SYBR Green ROX Mastermix(Qiagen,Hilden,Germany)來檢測擴增產物。依據△△CT方法得到定量結果。每個樣本之最終結果將隨三種管家基因(ACTB、B2M與GAPDH)之表現程度平均值校正。

比較本發明生物材料植入後第29天所得到外植體之間之成骨性基因表現。然後測試外植體之84種成骨性基因。

結果

第一項實驗

在植入後一個月確認血管向生物材料內生長(第12圖)。

血管表面面積與血管數/mm²結果示於第13圖。

本發明生物材料內有人類細胞存在，證實本 發明生物材料中之人類ASC有能力存活進入壞死之宿主組織(接著肌肉區域/植入位點之燒灼法)(第14圖)。

第二項實驗

在植入後第29天，證實本發明生物材料中存在人類細胞(未出示數據)。

如先前第一項生物活性實驗所示，在植入後第29天證實植入物之再血管化(未出示數據)。

活體內實驗顯示，本發明生物材料有能力在產品內部誘發血管新生作用。

實例5：骨頭缺損之治療

為了研究本發明生物材料在骨形成中之效力，在大鼠模式中設計臨界大小骨缺損。該模式已完整說明於文獻中(Saxer等人，Stem Cells 2016-Manassero et al.,Journal of Visualized Experiments 2016)。

材料與方法

選擇雄性裸大鼠作為本發明人類生物材料之接受者，以避免任何T-細胞免疫反應。簡言之，在14隻裸大鼠(2組各7隻接受者，分別接受單獨之HA/β-TCP粒子及生物材料)，採用RatFix System®(RISystem-Switzerland)，在大鼠股骨上進行臨界大小骨缺損。製造5mm缺損並應用使用螺釘固定的板片連接兩段股骨。

誘發骨缺損後三週，進行放射線照相，以評估骨缺損之不可逆性及避免任何自發性骨再生。

由裸大鼠接受者(具有持續性骨缺損且沒有 任何固定材料破裂)接受植入HA/β-TCP粒子(總體積0.344cm³，相當於500mg)或接受ASC與1.5cm³ HA/β-TCP粒子所形成之本發明生物材料(總體積0.313cm³，相當於500mg，含4.7*10⁶個細胞)。

植入後一個月，每隻動物進行micro-CT-掃描與組織學檢查，以評估植入物整合及骨融合程度。

結果

在植入後一個月，本發明生物材料完全整合進入兩段股骨之間，進行雙-皮質骨融合(2個股骨皮質結構之連續性)(第15圖，左上與左下圖)，而HA/β-TCP粒子僅單獨位於骨缺損中，沒有任何整合(第15圖，右上與右下圖)。事實上，皮質骨與HA/β-TCP粒子之間沒有出現橋連，沒有兩側皮質融合(由第15圖右下圖中符號*指示)與股骨缺損肢端之異位現象。

由組織學確認此等結果(第16圖與第17圖)。在單獨植入HA/β-TCP粒子一個月後，產物仍未整合，並觀察到重要的纖維化(第16圖A，白色箭頭)。在原生骨與HA/β-TCP植入物之間界面缺損沒有發現軟骨內骨化(第16圖B，黑色箭頭)。植入本發明生物材料後一個月，觀察到產物整合及骨融合(第17圖A，白色箭頭)。發現軟骨內骨化直接接觸原生骨與生物材料之間，表示有骨接合過程(第17圖B，黑色箭頭)。HLA-I染色顯示有人類細胞存在(第17圖C)。

此等活體內研究證實(i)本發明生物材料有能 力改善缺氧環境下之骨形成性，及(ii)有能力在臨界大小之骨缺損情況下進行骨融合。本發明生物材料在骨形成性與骨重塑方面證實係優於單獨之HA/β-TCP粒子。

Claims (15)

1. 一種生物材料，係具有多維空間結構且包含成骨性分化之脂肪幹細胞(ASC)、陶瓷材料、與細胞外母質，其中該生物材料分泌護骨素(OPG)，並包含類胰島素生長因子(IGF1)與基質細胞衍生因子1-α(SDF-1α)。
2. 如申請專利範圍第1項所述之生物材料，其中生物材料為每克生物材料分泌至少約5ng OPG，較佳為至少約10ng/g。
3. 如申請專利範圍第1項所述之生物材料，其中生物材料為每克生物材料包含至少約50ng IGF1，較佳為至少75ng。
4. 如申請專利範圍第1項所述之生物材料，其中生物材料為每克生物材料包含至多約100ng SDF-1α，較佳為至多75ng。
5. 如申請專利範圍第1項所述之生物材料，其中陶瓷材料係呈粒子形式。
6. 如申請專利範圍第1項所述之生物材料，其中陶瓷材料為磷酸鈣粒子。
7. 如申請專利範圍第6項所述之生物材料，其中磷酸鈣粒子具有之平均粒度範圍為約50μm至約1500μm。
8. 如申請專利範圍第6項所述之生物材料，其中磷酸鈣粒子為羥磷灰石(HA)與/或β-磷酸三鈣(β-TCP)之粒子。
9. 如申請專利範圍第6項所述之生物材料，其中磷酸鈣粒子為HA/β-TCP粒子，其比例為10/90至90/10之範圍， 較佳為20/80至80/20。
10. 如申請專利範圍第1項所述之生物材料，其中生物材料為每克生物材料包含至少約10ng VEGF。
11. 如申請專利範圍第1項所述之生物材料，其中生物材料為三維空間。
12. 一種醫學裝置，係包含如申請專利範圍第1項之多維空間生物材料。
13. 一種製造如申請專利範圍第1項之多維空間生物材料之方法，其包括下列步驟：-使脂肪幹細胞(ASC)增殖，-使ASC在第四次傳代時進行成骨性分化，及-誘發多維空間，較佳為誘發3D。
14. 一種多維空間生物材料，係由如申請專利範圍第13項之方法製得。
15. 如申請專利範圍第1項所述之生物材料，係用於治療骨缺損或軟骨缺損。