ES2950632T3 - Biomaterial que comprende células madre derivadas de tejido adiposo y método para producir el mismo - Google Patents

Biomaterial que comprende células madre derivadas de tejido adiposo y método para producir el mismo Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a un biomaterial que comprende células madre derivadas del tejido adiposo (ASC), un material cerámico y una matriz extracelular. En particular, el biomaterial según la presente invención secreta osteoprotegerina (OPG) y comprende factor de crecimiento similar a la insulina (IGF1) y factor 1-alfa derivado de células estromales (SDF-1α). La presente invención también se refiere a métodos para producir el biomaterial y sus usos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Biomaterial que comprende células madre derivadas de tejido adiposo y método para producir el mismo
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de las células madre y su uso para la producción de biomateriales multidimensionales. En particular, la presente invención se refiere a biomateriales que comprenden células madre derivadas de tejido adiposo (ASC), métodos para preparar y usar dichos biomateriales para la terapia.
Antecedentes de la invención
[El defecto óseo es una falta de tejido óseo en un área corporal, donde el hueso normalmente debe estar. Los defectos óseos se pueden tratar mediante diversos métodos quirúrgicos. Sin embargo, a menudo hay factores que afectan la cicatrización ósea, como la diabetes mellitus, la terapia inmunosupresora, el estado locomotor deficiente y otros que se debe tener en cuenta cuando se planee un procedimiento.
Los métodos quirúrgicos de reconstrucción de defectos óseos incluyen, entre otros, decortiación, escisión y fijación, injerto de hueso esponjoso y el método de transporte de hueso intercalado Ilizarov. Sin embargo, los pacientes comúnmente tienen una discapacidad ambulatoria prolongada con resultados funcionales y estéticos subóptimos.
La ingeniería de tejidos implica la restauración de la estructura o función del tejido mediante el uso de células vivas. El proceso general consiste en aislamiento y proliferación celular, seguido de un procedimiento de reimplantación en el que se usa un material de estructura. Las células madre mesenquimales (MSC) proporcionan una buena alternativa a las células del tejido maduro y tienen una serie de ventajas como una fuente celular para la regeneración del tejido óseo y cartilaginoso.
Por definición, una célula madre se caracteriza por su capacidad para someterse a autorrenovación y su capacidad para someterse a diferenciación multilinaje y formar células diferenciadas terminalmente. Idealmente, una célula madre para aplicaciones medicinales regenerativas debe cumplir con el siguiente conjunto de criterios: (i) debe encontrarse en cantidades abundantes (millones a miles de millones de células); (ii) se puede recoger y recoger mediante un procedimiento mínimamente invasivo (iii) puede diferenciarse a lo largo de múltiples rutas de linaje celular de manera reproducible; (iv) puede trasplantarse de forma segura y efectiva a un huésped autólogo o alogénico.
Los estudios han demostrado que las células madre tienen la capacidad de diferenciarse en células de origen mesodérmico, endodérmico y ectodérmico. La plasticidad de las MSC se refiere con mayor frecuencia a la capacidad inherente retenida dentro de las células madre para cruzar las barreras de linaje y adoptar las propiedades fenotípicas, bioquímicas y funcionales de las células únicas para otros tejidos. Las células madre mesenquimales adultas se pueden aislar de la médula ósea y el tejido adiposo, por ejemplo.
[Las células madre obtenidas de tejido adiposo son multipotentes y tienen grandes capacidades regenerativas. Los siguientes términos se han usado para identificar la misma población de células de tejido adiposo: células madre/estromales derivadas de tejido adiposo (ASC); células madre adultas derivadas de tejido adiposo (ADAS), células estromales adultas derivadas de tejido adiposo, células estromales derivadas de tejido adiposo (ADSC), células estromales adiposas (ASC), células madre mesenquimales adiposas (AdMSC), lipoblastos, pericitos, preadipocitos, células de lipoaspirado procesadas (PLA). El uso de esta nomenclatura diversa ha conducido a una confusión significativa en la bibliografía. Para abordar este problema, la International Fat Applied Technology Society alcanzó un consenso para adoptar la expresión “Células madre derivadas de tejido adiposo” (ASC) para identificar la población de células multipotenciales, adherentes de plástico aislada.
Se demostró que las ASC diferenciadas osteogénicas tenían un gran potencial de curación en diversos modelos preclínicos cuando se sembraron en diversos armazones, tales como p-fosfato tricálcico (p-TCP), hidroxiapatita (HA), colágeno tipo I, ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) y alginato. La solicitud de patente internacional WO 2013/059089 se refiere a una pasta ósea que comprende células madre y una mezcla de cemento de fosfato de calcio tal como fosfato tricálcico e hidroxiapatita. El documento US 2011/104230 describe un parche óseo que comprende material de estructura que comprende material cerámico sintético, células madre mesenquimales y moléculas de señalización.
Sin embargo, a pesar de los resultados alentadores en modelos animales pequeños, la reconstrucción ósea de tamaño crítico mediante el uso de ASC cargadas en armazones permanece limitada por el gran tamaño del defecto óseo y, en consecuencia, por el tamaño del implante para diseñar. El injerto celular de las células sembradas también está limitado por la mala difusión de oxígeno y nutrientes. Además, la posición celular dentro del armazón es una limitación importante para su supervivencia in vitro y in vivo. Los biorreactores con perfusión de flujo de los armazones se diseñaron para mejorar la migración celular dentro del implante para una distribución celular más homogénea, la supervivencia celular al suministrar oxígeno y nutrientes al núcleo del implante y la diferenciación de células osteogénicas (por la fuerza de cizallamiento de fluido). Aunque estas técnicas son prometedoras, los datos preclínicos y clínicos relevantes en grandes modelos animales son limitados.
Por lo tanto, todavía existe una necesidad en la técnica de materiales de ingeniería de tejidos para la regeneración de tejidos óseos que sean completamente biocompatibles y proporcionen características mecánicas adecuadas para las aplicaciones designadas. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un injerto hecho de ASC diferenciadas en una estructura osteogénica multidimensional con material cerámico.
Resumen
La presente invención se refiere a biomaterial que tiene una estructura multidimensional que comprende células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) osteogénicas diferenciadas, un material cerámico y una matriz extracelular, en donde el biomaterial secreta osteoprotegerina (OPG) y comprende factor de crecimiento similar a la insulina (IGF1) y factor 1 -alfa derivado de células estromales (SDF-1 a),
en donde el material cerámico está en forma de partículas,
en donde la multidimensión del biomaterial de la invención se debe a la síntesis de matriz extracelular por células madre derivadas de tejido adiposo de la invención, y en donde las ASC y las partículas cerámicas dentro del biomaterial de la invención están incrustadas en la matriz extracelular
En una realización, el biomaterial secreta al menos aproximadamente 5 ng de OPG por g de biomaterial, preferiblemente al menos aproximadamente 10 ng/g.
En una realización, el biomaterial comprende al menos aproximadamente 50 ng de IGF1 por g de biomaterial, preferiblemente al menos 75 ng.
En una realización, el biomaterial comprende como máximo aproximadamente 100 ng de SDF-1a por g de biomaterial, preferiblemente como máximo 75 ng.
El material cerámico está en forma de partículas. En una realización, el material cerámico es partículas de fosfato de calcio. En una realización, las partículas de fosfato de calcio tienen un tamaño promedio que varía de aproximadamente 50 μm a aproximadamente 1500 μm. En una realización, las partículas de fosfato de calcio son partículas de hidroxiapatita (HA) y/o p-fosfato tricálcico (p-TCP).
En una realización, las partículas de fosfato de calcio son partículas de HA/β-TCP en una relación que varía de aproximadamente 10/90 a aproximadamente 90/10. En otra realización, las partículas de HA/β-TCP están en una relación de aproximadamente 20/80 a aproximadamente 80/20. En otra realización, las partículas de HA/β-TCP están en una relación de aproximadamente 30/70 a aproximadamente 70/30. En otra realización, las partículas de HA/β-TCP están en una relación de aproximadamente 40/60 a aproximadamente 60/40. En otra realización, las partículas de HA/β-TCP están en una relación de aproximadamente 50/50. En otra realización, las partículas de HA/β-TCP están en una relación de 65/35.
En una realización, el biomaterial comprende al menos aproximadamente 10 ng de VEGF por g de biomaterial. En una realización, el biomaterial es tridimensional.
En determinadas realizaciones, el biomaterial es moldeable o conformable.
Otro objeto de la presente invención es un biomaterial como se describe en el presente documento para su uso para tratar el defecto óseo o cartilaginoso.
Definiciones
En la presente invención, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
- El término “aproximadamente” precediendo a un valor significa más o menos 10 % del valor de dicho valor.
- El término “tejido adiposo” se refiere a cualquier tejido graso. El tejido adiposo puede ser tejido adiposo marrón o blanco, derivado de un sitio de tejido adiposo subcutáneo, omental/visceral, mamario, gonadal u otro. Preferentemente, el tejido adiposo es tejido adiposo blanco subcutáneo. Dichas células pueden comprender un cultivo celular primario o una línea celular inmortalizada. El tejido adiposo puede ser de cualquier organismo, vivo o disminuido, que tenga tejido graso. Preferentemente, el tejido adiposo es animal, más preferentemente mamífero, con la máxima preferencia el tejido adiposo es humano. Una fuente conveniente de tejido adiposo es de la cirugía de liposucción, sin embargo, la fuente de tejido adiposo o el método de aislamiento del tejido adiposo no es crítica para la invención. - El término “células madre derivadas de tejido adiposo” (también llamadas “células madre derivadas de tejido adiposo” ) como se usa en la presente descripción se refiere a la fracción “ no adipocitaria” de tejido adiposo. Las células pueden ser frescas o en cultivo. “ Células madre derivadas de tejido adiposo” (ASC) se refiere a células estromales que se originan a partir de tejido adiposo que pueden servir como precursores de diversos tipos de células diferentes tales como, pero sin limitación, adipocitos, osteocitos y condrocitos.
- El término “material cerámico” como se usa en la presente descripción se refiere a un material sólido inorgánico, no metálico. El material cerámico puede ser fosfato de calcio (CaP), carbonato de calcio (CaCO3), sulfato de calcio, hidróxido de calcio (Ca[OH]2), o combinaciones de los mismos. El material cerámico puede estar en forma de partículas. El material cerámico puede estar en forma de polvo, perlas o gránulos. El material cerámico puede ser poroso.
- El término “ regeneración” o “ regeneración de tejidos” incluye, pero no se limita al crecimiento, generación o reconstrucción de nuevos tipos de células o tejidos de las ASC de la presente divulgación. En una realización, estos tipos de células o tejidos incluyen, pero no se limitan a, células osteogénicas (por ejemplo, osteoblastos), condrocitos, células endoteliales, cardiomiocitos, células hematopoyéticas, células hepáticas, adipocitos, células neuronales y miotubos. En una realización particular, el término “ regeneración” o “ regeneración de tejidos” se refiere a la generación o reconstrucción de células osteogénicas (p. ej., osteoblastos) a partir de las ASC de la presente descripción.
- El término “factores de crecimiento” como se usa en el presente documento son moléculas que promueven el crecimiento tisular, la proliferación celular, la vascularización y similares. En una realización particular, el término “factores de crecimiento” incluye moléculas que promueven la formación de tejido óseo.
- El término “cultivada” como se usa en el presente documento se refiere a una o más células que se someten a división celular o no experimentan división celular en un entorno in vitro, in vivo, o ex vivo. Un medio in vitro puede ser cualquier medio conocido en la técnica que sea adecuado para mantener células in vitro, como medios líquidos adecuados o agar, por ejemplo. Se describen ejemplos concretos de entornos in vitro adecuados para cultivos celulares en Culture of Animal Cells: a manual of basic techniques (3a edición), 1994, R. I. Freshney (ed.), Wiley-Liss, Inc.; Cells: a laboratory manual (vol. 1), 1998, D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press; y Animal Cells: culture and media, 1994, D. C. Darado, S. J. Morgan John Wiley and Sons, Ltd.
- El término “confluencia” se refiere al número de células adherentes en una superficie de cultivo celular (tal como una placa de cultivo o un matraz), es decir, a la proporción de la superficie que está cubierta por células. Una confluencia del 100 % significa que la superficie está completamente cubierta por las células. En una realización, la expresión “células alcanza la confluencia” o “ las células son confluentes” significa que las células cubren del 80 al 100 % de la superficie. En una realización, la expresión “ las células son subconfluentes” significa que las células cubren del 60 al 80 % de la superficie. En una realización, la expresión “ las células son demasiado confluentes” significa que las células cubren al menos el 100 % de la superficie y/o son confluentes al 100 % desde varias horas o días.
- El término “ refrigerar” o “ refrigeración” se refiere a un tratamiento que lleva temperaturas menores que la temperatura fisiológica normal del sujeto. Por ejemplo, a una o más temperaturas seleccionadas en el intervalo de aproximadamente -196 °C a aproximadamente 32 °C, durante períodos de tiempo prolongados, por ejemplo, al menos aproximadamente una hora, al menos aproximadamente un día, al menos aproximadamente una semana, al menos aproximadamente 4 semanas, al menos aproximadamente 6 meses, etc. En una realización, “ refrigeración” o “ refrigeración” se refiere a un tratamiento que lleva temperaturas de menos de 0 °C. La refrigeración puede llevarse a cabo manualmente, o preferiblemente llevarse a cabo usando un aparato ad hoc capaz de ejecutar un programa de refrigeración. En una realización, el término “ refrigeración” incluye los métodos conocidos en la técnica como “congelación” y “crioconservación” . El experto entenderá que el método de refrigeración puede incluir otras etapas, que incluyen la adición de reactivos para ese propósito.
- El término “célula no embrionaria” como se usa en el presente documento se refiere a una célula que no está aislada de un embrión. Las células no embrionarias pueden diferenciarse o no diferenciarse. Las células no embrionarias pueden referirse a casi cualquier célula somática, como las células aisladas de un animal ex utero. En una realización, las células no embrionarias incluyen células germinales. Estos ejemplos no pretenden ser limitantes.
- El término “célula diferenciada” como se usa en el presente documento se refiere a una célula precursora que se ha desarrollado a partir de un fenotipo no especializado a un fenotipo especializado. Por ejemplo, las células madre derivadas de tejido adiposo pueden diferenciarse en células osteogénicas.
- El término “medio de diferenciación” como se usa en el presente documento se refiere a uno de una colección de compuestos que se usan en los sistemas de cultivo de esta invención para producir células diferenciadas. No se pretende ninguna limitación al modo de acción de los compuestos. Por ejemplo, el agente puede ayudar al proceso de diferenciación al inducir o ayudar a un cambio en el fenotipo, promover el crecimiento de células con un fenotipo particular o retrasar el crecimiento de otros. También puede actuar como un inhibidor a otros factores que pueden estar en el medio o sintetizados por la población celular que de otro modo la diferenciación directa por la ruta a un tipo de célula no deseada.
- Los términos “tratamiento” , “terapia” o “alivio” se refieren a tratamientos terapéuticos en donde el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) el defecto óseo. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno, así como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en los que se debe prevenir el defecto óseo. Un sujeto se “trata” con éxito para un defecto óseo si, después de recibir una cantidad terapéutica de un biomaterial según los métodos de la presente invención, el paciente muestra una reducción observable y/o medible en ausencia de uno o más de los siguientes: reducción en el defecto óseo y/o alivio en cierta medida, uno o más de los síntomas asociados con el defecto óseo; reducción de la morbilidad y mortalidad, y mejora en los problemas de calidad de vida. Los parámetros anteriores para evaluar el tratamiento exitoso y la mejora en la enfermedad son fácilmente medibles mediante procedimientos de rutina familiares para un médico.
En el contexto del uso terapéutico de los biomateriales divulgados, en la terapia “alogénica” , el donante y el receptor son individuos diferentes de la misma especie, mientras que en la terapia “autóloga” , el donante y el receptor son el mismo individuo, y en la terapia “xenogénica” , el donante procede de un animal de una especie diferente a la del receptor.
- El término “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad suficiente para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluidos los resultados clínicos. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones.
- El término “sujeto” se refiere a un mamífero, preferiblemente un ser humano. Los ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, primates no humanos, perros, gatos, ratones, ratas, caballos, vacas y especies transgénicas de los mismos. En una realización, un sujeto puede ser un “paciente” , es decir, un animal de sangre caliente, más preferiblemente un ser humano, que está esperando la recepción, o está recibiendo atención médica o fu/es/será el objeto de un procedimiento médico, o se controla para el desarrollo de una enfermedad. En una realización, el sujeto es un adulto (por ejemplo, un sujeto humano por encima de la edad de 18). En otra realización, el sujeto es un niño (por ejemplo, un sujeto humano por debajo de la edad de 18). En una realización, el sujeto es un hombre. En otra realización, el sujeto es una mujer.
- El término “ biocompatible” se refiere a un material no tóxico que es compatible con un sistema biológico tal como una célula, cultivo celular, tejido u organismo.
- El término “ multidimensional” se refiere a más de una dimensión, tal como, por ejemplo, bidimensional (2D) o tridimensional (3D). En una realización, un biomaterial que tiene una estructura multidimensional se refiere a un biomaterial que tiene una estructura 2D o 3D.
Descripción detallada
Esta invención se refiere a un biomaterial que tiene una estructura multidimensional que comprende células madre derivadas de tejido adiposo (ASC), un material cerámico y una matriz extracelular, que secreta osteoprotegerina (OPG), y que comprende factor de crecimiento similar a la insulina (IGF1) y factor 1 -alfa derivado de células estromales (SDF-1 a),
en donde el material cerámico está en forma de partículas,
en donde la multidimensión del biomaterial de la invención se debe a la síntesis de matriz extracelular por células madre derivadas de tejido adiposo de la invención, y
en donde las ASC y las partículas cerámicas dentro del biomaterial de la invención están incrustadas en la matriz extracelular.
Como se usa en la presente descripción, el término “biomaterial que tiene una estructura multidimensional” puede reemplazarse por toda la presente invención por el término “biomaterial multidimensional” .
En una realización, las células se aíslan del tejido adiposo y se denominan en lo sucesivo células madre derivadas de tejido adiposo (ASC).
En una realización, el tejido de las ASC es de origen animal, preferiblemente de origen mamífero, más preferiblemente de origen humano. Por consiguiente, en una realización, las ASC son ASC animales, preferiblemente ASC de mamífero, más preferiblemente ASC humanas. En una realización preferida, las ASC son ASC humanas.
Los métodos para aislar células madre del tejido adiposo son conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Zuk y col. (Tissue Engineering. 2001,7:211-228). En una realización, las ASC se aíslan del tejido adiposo mediante liposucción.
Como ilustración, el tejido adiposo puede recogerse mediante biopsia con aguja o aspiración con liposucción. Las ASC pueden aislarse del tejido adiposo lavando primero la muestra de tejido extensamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS), que opcionalmente contiene antibióticos, por ejemplo penicilina/estreptomicina al 1 % (P/S). Después, la muestra se puede colocar en una placa de cultivo de tejidos estéril con colagenasa para la digestión de tejidos (por ejemplo, colagenasa tipo I preparada en PBS que contiene P/S al 2 %), y se incuba durante 30 min a 37 0C, CO2 al 5 %. La actividad de la colagenasa se puede neutralizar añadiendo medio de cultivo (por ejemplo, DMEM que contiene suero al 10 %). Tras la desintegración, la muestra puede transferirse a un tubo. La fracción vascular estromal (SVF), que contiene las ASC, se obtiene centrifugando la muestra (por ejemplo, a 2000 rpm durante 5 min). Para completar la separación de las células estromales de los adipocitos primarios, la muestra se puede agitar vigorosamente para romper completamente el sedimento y mezclar las células. La etapa de centrifugación puede repetirse. Después de centrifugar y aspirar la solución de colagenasa, el sedimento se puede resuspender en tampón de lisis, se incuba en hielo (por ejemplo, durante 10 min), se lava (por ejemplo, con PBS/2 % P/S) y se centrifuga (por ejemplo a 2000 rpm durante 5 min). A continuación, se puede aspirar el sobrenadante, se resuspende el sedimento celular en medio (por ejemplo, medio estromal, es decir, a-MEM, complementado con 20 % de FBS, 1 % de L-glutamina y 1 % de P/S), y se filtró la suspensión celular (por ejemplo, a través de un filtro de células de 70 μm). La muestra que contiene las células puede sembrarse finalmente en placas de cultivo y incubarse a 37 0C, CO2 al 5 %.
En una realización, las ASC de la invención se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo. En una modalidad, el lipoaspirado puede mantenerse varias horas a temperatura ambiente, o a 4 0C durante 24 horas antes de su uso, o por debajo de 0 0C, por ejemplo, -18 0C, para la conservación a largo plazo.
En una realización, las ASC pueden ser ASC frescas o ASC refrigeradas. Las ASC frescas son ASC aisladas que no se han sometido a un tratamiento de refrigeración. Las ASC refrigeradas son ASC aisladas que se han sometido a un tratamiento de refrigeración. En una realización, un tratamiento de refrigeración significa cualquier tratamiento por debajo de 0 0C. En una realización, el tratamiento de refrigeración puede realizarse a aproximadamente -18 0C, a -80 0C o a -180 0C. En una realización específica, el tratamiento de refrigeración puede ser crioconservación.
Como ilustración del tratamiento de refrigeración, las ASC pueden cosecharse con una confluencia del 80-90 %. Después de las etapas de lavado y separación de la placa, las células pueden peletizarse a temperatura ambiente con un medio de conservación de refrigeración y colocarse en viales. En una realización, el medio de conservación de refrigeración comprende suero bovino fetal al 80 % o suero humano, dimetilsulfóxido (DMSO) al 10 % y DMEM al 10 %/F-12 de Ham. Luego, los viales se pueden almacenar a -80 0C durante la noche. Por ejemplo, los viales se pueden colocar en un recipiente de congelación de alcohol que enfría los viales lentamente, a aproximadamente 1 0C cada minuto, hasta alcanzar -80 0C. Finalmente, los viales congelados se pueden transferir a un recipiente de nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.
En una realización, las ASC son ASC diferenciadas. En una realización preferida, las ASC son ACS diferenciadas osteogénicas. En otras palabras, en una realización preferida, las ASC se diferencian en células osteogénicas. En una realización particular, las ASC se diferencian en osteoblastos.
Los métodos para controlar y evaluar la diferenciación osteogénica son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la osteodiferenciación de las células o tejidos de la invención puede evaluarse mediante tinción de osteocalcina y/o fosfato (por ejemplo, con von Kossa); mediante tinción de fosfato de calcio (p. ej., con rojo de alizarina); por resonancia magnética (IRM); por medición de la formación de matriz mineralizada; o mediante la medición de la actividad de fosfatasa alcalina.
En una realización, la diferenciación osteogénica de las ASC se realiza mediante cultivo de ASC en medio de diferenciación osteogénica (MD).
En una realización, el medio de diferenciación osteogénica comprende suero humano. En una realización particular, el medio de diferenciación osteogénica comprende lisado plaquetario humano (hPL). En una realización, el medio de diferenciación osteogénica no comprende ningún otro suero animal, preferiblemente no comprende ningún otro suero que el suero humano.
En una realización, el medio de diferenciación osteogénica comprende o consiste en medio de proliferación complementado con dexametasona, ácido ascórbico y fosfato de sodio. En una realización, el medio de diferenciación osteogénica comprende además antibióticos, tales como penicilina, estreptomicina, gentamicina y/o anfotericina B. En una realización, todos los medios están libres de proteínas animales.
En una realización, el medio de proliferación puede ser cualquier medio de cultivo diseñado para soportar el crecimiento de las células conocidas por un experto en la técnica. Como se usa en el presente documento, el medio de proliferación también se denomina “ medio de crecimiento” . Los ejemplos de medio de crecimiento incluyen, sin limitación, MEM, DMEM, IMDM, RPMI 1640, FGM o FGM-2, medio 199/109, HamF10/HamF12 o 5A de McCoy. En una realización preferida, el medio de proliferación es DMEM.
En una realización, el medio de diferenciación osteogénica comprende o consiste en DMEM suplementado con L-alanil-L-glutamina (Ala-Gln, también llamado “ Glutamax®” o “ Ultraglutamine®” ), hPL, dexametasona, ácido ascórbico y fosfato sódico. En una realización, el medio de diferenciación osteogénica comprende o consiste en DMEM complementado con L-alanil-L-glutamina, hPL, dexametasona, fosfato ascórbico y sódico, y antibióticos, preferiblemente penicilina, estreptomicina, gentamicina y/o anfotericina B.
En una realización, el medio de diferenciación osteogénica comprende o consiste en DMEM complementado con L-alanil-L-glutamina, hPL (aproximadamente 5 %, v/v), dexametasona (aproximadamente 1 μM), ácido ascórbico (aproximadamente 0,25 mM) y fosfato de sodio (aproximadamente 2,93 mM). En una realización, el medio de diferenciación osteogénica comprende o consiste en DMEM complementado con L-alanil-L-glutamina, hPL (aproximadamente 5 %, v/v), dexametasona (aproximadamente 1 μM), ácido ascórbico (aproximadamente 0,25 mM) y fosfato de sodio (aproximadamente 2,93 mM), penicilina (aproximadamente 100 U/mL) y estreptomicina (aproximadamente 100 μg/mL). En una realización, el medio de diferenciación osteogénica comprende además anfotericina B (aproximadamente 0,1 %).
En una realización, el medio de diferenciación osteogénica consiste en DMEM complementado con L-alanil-L-glutamina, hPL (aproximadamente 5 %, v/v), dexametasona (aproximadamente 1 μM), ácido ascórbico (aproximadamente 0,25 mM) y fosfato de sodio (aproximadamente 2,93 mM). En una realización, el medio de diferenciación osteogénica comprende o consiste en DMEM complementado con L-alanil-L-glutamina, hPL (aproximadamente 5 %, v/v), dexametasona (aproximadamente 1 μM), ácido ascórbico (aproximadamente 0,25 mM) y fosfato de sodio (aproximadamente 2,93 mM), penicilina (aproximadamente 100 U/mL), estreptomicina (aproximadamente 100 μg/mL) y anfotericina B (aproximadamente 0,1 %).
En una realización, las ASC son células madre derivadas de tejido adiposo de pasaje tardío. Como se usa en la presente descripción, el término “pases tardíos” significa células madre derivadas de tejido adiposo diferenciadas al menos después del pasaje 4. Como se usa en el presente documento, el pasaje 4 se refiere al cuarto pasaje, es decir, el cuarto acto de dividir las células separándolos de la superficie del recipiente de cultivo antes de resuspenderse en medio fresco. En una modalidad, las células madre derivadas de tejido adiposo pasan tarde se diferencian después del pasaje 4, el pasaje 5, el pasaje 6 o más. En una realización preferida, las ASC se diferencian después del pasaje 4.
Como se usa en el presente documento, el término “ recipiente” significa cualquier superficie de cultivo celular, tal como, por ejemplo, un matraz o una placa de pocillos.
El pasaje inicial de las células primarias se denominó pasaje 0 (P0). De acuerdo con la presente invención, el pasaje P0 se refiere a la siembra de la suspensión celular de la fracción vascular estromal (SVF) sedimentada en recipientes de cultivo. Por lo tanto, el pasaje P4 significa que las células se separaron 4 Veces (en P1, P2, P3 y P4) de la superficie del recipiente de cultivo (por ejemplo, mediante digestión con tripsina) y se resuspendieron en medio fresco.
En una realización, las ASC de la invención se cultivan en medio de proliferación hasta el cuarto pasaje. En una realización, las ASC de la invención se cultivan en medio de diferenciación después del cuarto pasaje. Por consiguiente, en una realización, en los pasajes P1, P2 y P3, las ASC se separan de la superficie del recipiente de cultivo y luego se diluyen a la densidad celular apropiada en medio de proliferación. Todavía según esta realización, en el pasaje P4, las ASC se separan de la superficie del recipiente de cultivo y luego se diluyen a la densidad celular apropiada en medio de diferenciación. Por lo tanto, según esta realización, en P4 las ASC de la invención no se resuspenden y cultivan en medio de proliferación hasta que alcanzan la confluencia antes de diferenciarse (es decir, antes de cultivarse en medio de diferenciación), pero se resuspenden directamente y se cultivan en un medio de diferenciación.
En una realización, las células se mantienen en medio de diferenciación osteogénica al menos hasta que alcanzan la confluencia, preferiblemente entre el 70 % y el 100 % de confluencia, más preferiblemente entre el 80 % y el 95 % de confluencia. En una realización, las células se mantienen en medio de diferenciación osteogénica durante al menos 5 días, preferiblemente al menos 10 días, más preferiblemente al menos 15 días. En una realización, las células se mantienen en medio de diferenciación osteogénica de 5 a 30 días, preferiblemente de 10 a 25 días, más preferiblemente de 15 a 20 días. En una realización, el medio de diferenciación se reemplaza cada 2 días. Sin embargo, como se conoce en la técnica, la tasa de crecimiento celular de un donante a otro podría diferir ligeramente. Por lo tanto, la duración de la diferenciación osteogénica y el número de cambios de medio pueden variar de un donante a otro.
En una realización, las células se mantienen en medio de diferenciación osteogénica al menos hasta la formación del osteoide, es decir, la porción orgánica no mineralizada de la matriz ósea que se forma antes de la maduración del tejido óseo.
El material cerámico de la invención está en forma de partículas, denominadas en la presente memoria partículas cerámicas. En una realización, las partículas pueden ser perlas, polvo, esferas, microesferas y similares.
En una realización, el material cerámico de la invención son partículas de fosfato de calcio (CaP), carbonato de calcio (CaCO3), sulfato de calcio o hidróxido de calcio (Ca[OH]2), o combinaciones de los mismos.
Ejemplos de partículas de fosfato de calcio incluyen, pero no se limitan a, hidroxiapatita (HA, Ca10(PO4)6(OH)2), fosfato tricálcico (TCP, Ca3[PO4]2), a-fosfato tricálcico (a-TCP, (a-Ca3(PO4)2), p-fosfato tricálcico (p-TCP, p-Ca3(PO4)2), fosfato tetracálcico (TTCP, Ca4(PO4)2O), fosfato octacálcico (Ca8H2(PO4)6. 5H2O), fosfato de calcio amorfo (Ca3(PO4)2), hidroxiapatita/p-fosfato tricálcico (HA/β-TCP), hidroxiapatita/tetracalcio fosfato (HA/TTCP), y similares.
En una realización, el material cerámico de la invención comprende o consiste en hidroxiapatita (HA), fosfato tricálcico (TCP), hidroxiapatita/p-fosfato tricálcico (HA/β-TCP), sulfato de calcio o combinaciones de los mismos. En una realización, el material cerámico de la invención comprende o consiste en hidroxiapatita (HA), p-fosfato tricálcico (p-TCP), hidroxiapatita/pfosfato tricálcico (HA/β-TCP), a-fosfato tricálcico (a-TCP), sulfato de calcio, o combinaciones de los mismos.
En una realización, las partículas cerámicas de la invención son partículas de hidroxiapatita (HA). En otra realización, las partículas cerámicas de la invención son partículas de p-fosfato tricálcico (p-TCP). En otra realización, las partículas cerámicas de la invención son partículas de hidroxiapatita/p-fosfato tricálcico (HA/β-TCP). En otras palabras, en una realización, las partículas cerámicas de la invención son una mezcla de partículas de hidroxiapatita y p-fosfato tricálcico (llamadas partículas de HA/β-TCP). En una realización, las partículas cerámicas de la invención consisten en partículas de hidroxiapatita y partículas de p-fosfato tricálcico (llamadas partículas de HA/β-TCP).
En una realización, las partículas cerámicas, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, están en forma de gránulos, polvo o perlas. En una realización, las partículas cerámicas, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, están en forma de gránulos porosos, polvo o perlas. En una realización, las partículas cerámicas, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, son material cerámico poroso. En una realización, las partículas cerámicas, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, son partículas de polvo. En una realización particular, las partículas cerámicas, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, están en forma de gránulos porosos. En otra realización particular, las partículas cerámicas, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, están en forma de polvo. En una realización, las partículas cerámicas, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, no están estructuradas para formar una forma o estructura base 3D predefinida, tal como, por ejemplo, un cubo. En una realización, el material cerámico de la invención no es un armazón 3D. En una realización, el material cerámico no tiene una forma o estructura base predefinida. En una realización, el material cerámico de la invención no tiene la forma de un cubo. En una realización, el biomaterial de la invención está libre de estructuras.
En una realización, las partículas cerámicas de la invención, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, son mayores de aproximadamente 50 μm, preferiblemente mayores de aproximadamente 100 μm. En una realización, las partículas cerámicas de la invención, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, tienen un diámetro medio mayor de aproximadamente 50 μm, preferiblemente mayor de aproximadamente 100 μm.
En una realización, las partículas cerámicas de la invención, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, tienen un diámetro medio de al menos aproximadamente 50 μm, preferiblemente de al menos aproximadamente 100 μm, más preferiblemente de al menos aproximadamente 150 μm. En otra realización, las partículas cerámicas de la invención, preferiblemente partículas de HA, TCP y/o HA/β-TCP, tienen un diámetro medio de al menos aproximadamente 200 μm, preferiblemente de al menos aproximadamente 250 μm, más preferiblemente de al menos aproximadamente 300 μm.
En otra realización, las partículas cerámicas de la invención, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, tienen un diámetro medio de como máximo aproximadamente 2500 μm, preferiblemente de como máximo aproximadamente 2000 μm, más preferiblemente de como máximo aproximadamente 1500 μm. En una realización, las partículas cerámicas de la invención, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, tienen un diámetro medio de como máximo aproximadamente 1000 μm, 900 μm, 800 μm, 700 μm o 600 μm.
En una realización, las partículas cerámicas de la invención, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, tienen un diámetro medio que varía de aproximadamente 50 μm a aproximadamente 1500 μm, preferiblemente de aproximadamente 50 μm a aproximadamente 1250 μm, más preferiblemente de aproximadamente 100 μm a aproximadamente 1000 μm. En una realización, las partículas cerámicas de la invención, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, tienen un diámetro medio que varía de aproximadamente 100 μm a aproximadamente 800 μm, preferiblemente de aproximadamente 150 μm a aproximadamente 700 μm, más preferiblemente de aproximadamente 200 μm a aproximadamente 600 μm.
En una realización, las partículas de HA/β-TCP tienen un diámetro medio que varía de aproximadamente 50 μm a aproximadamente 1500 μm, preferiblemente de aproximadamente 50 μm a aproximadamente 1250 μm, más preferiblemente de aproximadamente 100 μm a aproximadamente 1000 μm. En una realización, las partículas de HA y p-TCP tienen un diámetro medio que varía de aproximadamente 100 μm a aproximadamente 800 μm, preferiblemente de aproximadamente 150 μm a aproximadamente 700 μm, más preferiblemente de aproximadamente 200 μm a aproximadamente 600 μm.
En una realización, la relación entre HA y p-TCP (relación HA/β-TCP) en las partículas varía de aproximadamente 0/100 a aproximadamente 100/0, preferiblemente de aproximadamente 10/90 a aproximadamente 90/10, más preferiblemente de aproximadamente 20/80 a aproximadamente 80/20. En una realización, la relación HA/β-TCP en las partículas varía de aproximadamente 30/70 a aproximadamente 70/30, de aproximadamente 35/65 a aproximadamente 65/35, o de aproximadamente 40/60 a aproximadamente 60/40.
En una realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es 0/100, es decir, las partículas son partículas de pfosfato tricálcico. En otra realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es 100/0, es decir, las partículas son partículas de hidroxiapatita. En una realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es aproximadamente 10/90. En otra realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es de aproximadamente 90/10. En una realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es de aproximadamente 20/80. En otra realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es aproximadamente 80/20. En una realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es aproximadamente 30/70. En otra realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es aproximadamente 70/30. En otra realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es aproximadamente 35/65. En otra realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es aproximadamente 65/35. En una realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es aproximadamente 40/60. En otra realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es aproximadamente 60/40. En otra realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es aproximadamente 50/50.
En una realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es de 100 a 0, 99 a 1, 98 a 2, 97 a 3, 96 a 4, 95 a 5, 94 a 6, 93 a 7, 92 a 8, 91 a 9, 90 a 10, 89 a 11, 88 a 12, 87 a 13, 86 a 14, 85 a 15, 84 a 16, 83 a 17, 82 a 18, 81 a 19, 80 a 20. En una realización, la relación HA/β-TCP en las partículas es de 79 a 21, 78 a 22, 77 a 23, 76 a 24, 75 a 25, 74 a 26, 73 a 27, 72 a 28, 71 a 29, 70 a 30, 69 a 31, 68 a 32, 67 a 33, 66 a 34, 65 a 35, 64 a 36, 63 a 37, 62 a 38, 61 a 39, 60 a 40, 59 a 41, 58 a 42, 57 a 43, 56 a 44, 55 a 45, 54 a 46, 53 a 47, 52 a 48, 51 a 49, 50 a 50, 49 a 51,48 a 52, 47 a 53, 46 a 54, 45 a 55, 44 a 56, 43 a 57, 42 a 58, 41 a 59, 40 a 60, 39 a 61, 38 a 62, 37 a 63, 36 a 64, 35 a 65, 34 a 66, 33 a 67, 32 a 68, 31 a 69, 30 a 70, 29 a 71, 28 a 72, 27 a 73, 26 a 74, 25 a 75, 24 a 76, 23 a 77, 22 a 78, 21 a 79, 20 a 80, 19 a 81, 18 a 82, 17 a 83, 16 a 84, 15 a 85, 14 a 86, 13 a 87, 12 a 88, 11 a 89, 10 a 90, 9 a 91, 8 a 92, 7 a 93, 6 a 94, 5 a 95, 4 a 96, 3 a 97, 2 a 98, 1 a 99, o 0 a 100.
Según una realización, la cantidad de partículas cerámicas, preferiblemente HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, es óptima para proporcionar una estructura 3D al biomaterial. En una realización, las partículas cerámicas, preferiblemente HA, p-TCP y/o partículas HA/β-TCP, se añaden a una concentración que oscila entre 0,1 cm3 y 5 cm3 para un recipiente de 150 cm2, preferiblemente entre 0,5 cm3 y 3 cm3, más preferiblemente entre 1 cm3 y 2 cm3. En una realización preferida, las partículas cerámicas, preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, se añaden a una concentración de aproximadamente 1,5 cm3 para un recipiente de 150 cm2.
En una realización, las partículas cerámicas, preferiblemente las partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, se añaden a una concentración que varía de aproximadamente 7,10-3 a 7,10-2 cm3 por mL de medio. En una realización, las partículas cerámicas, preferiblemente las partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, se añaden a una concentración que varía de aproximadamente 3,3,10-3 a 3,3,10-2 cm3 por cm2 de recipiente.
En una realización, el material cerámico de la invención se añade al medio de cultivo después de la diferenciación de las células. En una realización, el material cerámico de la invención se añade cuando las células son subconfluentes. En una realización, el material cerámico de la invención se añade cuando las células son demasiado confluentes. En una realización, el material cerámico de la invención se añade cuando las células han alcanzado la confluencia después de la diferenciación. En otras palabras, en una realización, el material cerámico de la invención se añade cuando las células han alcanzado la confluencia en medio de diferenciación. En una realización, el material cerámico de la invención se añade al menos 5 días después de P4, preferiblemente 10 días, más preferiblemente 15 días. En una realización, el material cerámico de la invención se añade de 5 a 30 días después de P4, preferiblemente de 10 a 25 días, más preferiblemente de 15 a 20 días.
En una realización, el biomaterial según la invención es bidimensional. En esta realización, el biomaterial de la invención puede formar una película delgada de menos de 1 mm.
En otra realización, el biomaterial según la invención es tridimensional. En esta realización, el biomaterial de la invención puede formar una película gruesa que tiene un espesor de al menos 1 mm. El tamaño del biomaterial puede adaptarse al uso.
En una realización, el biomaterial de la invención no comprende un armazón. Como se usa en la presente descripción, el término “ armazón” significa una estructura que imita la porosidad, el tamaño de poro y/o la función de los tejidos de mamíferos nativos, que incluyen tejidos humanos y animales, tales como huesos de mamíferos nativos o matriz extracelular. Los ejemplos de tales armazones incluyen, pero no se limitan a, hueso artificial, esponjas de colágeno, hidrogeles, tales como hidrogeles de proteínas, hidrogeles peptídicos, hidrogeles poliméricos y hidrogeles de nanocelulosa basados en madera, y similares. En una realización, el biomaterial de la invención no comprende un hueso artificial. En una realización, el material cerámico de la invención no es un hueso artificial.
En una realización, la multidimensión del biomaterial de la invención no se debe a un armazón que imita la estructura de la matriz extracelular natural. En una realización, el biomaterial de la invención no comprende un armazón que imita la estructura de la matriz extracelular natural.
La multidimensión del biomaterial de la invención se debe a la síntesis de matriz extracelular por células madre derivadas de tejido adiposo de la invención.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende una matriz extracelular. En una realización, la matriz extracelular de la invención deriva de las ASC. En una realización, la matriz extracelular de la invención es producida por las ASC.
Como se usa en el presente documento, el término “ matriz extracelular” (ECM) significa una red macromolecular tridimensional no celular. Los componentes de matriz de la ECM se unen entre sí, así como también los receptores de adhesión celular, formando así una red compleja en la que las células residen en los tejidos o en los biomateriales de la invención.
En una realización, la matriz extracelular de la invención comprende colágeno, proteoglucanos/glucosaminoglucanos, elastina, fibronectina, laminina y/u otras glicoproteínas. En una realización particular, la matriz extracelular de la invención comprende colágeno. En otra realización particular, la matriz extracelular de la invención comprende proteoglicanos. En otra realización particular, la matriz extracelular de la invención comprende colágeno y proteoglicanos. En una realización, la matriz extracelular de la invención comprende factores de crecimiento, proteoglicanos, factores secretores, reguladores de la matriz extracelular y glicoproteínas.
En una realización, las ASC dentro del biomaterial de la invención forman un tejido, denominado en el presente documento tejido de ASC.
Las ASC y las partículas cerámicas, más preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, dentro del biomaterial de la invención están incrustadas en la matriz extracelular. En una realización, las ASC, preferiblemente diferenciadas en células óseas, con el material cerámico, preferiblemente las partículas cerámicas, más preferiblemente partículas de HA, p-TCP y/o HA/β-TCP, forman una estructura 3D con la matriz extracelular. En una realización, el tejido de las ASC es un tejido vascularizado. En una realización, el biomaterial de la invención está vascularizado.
En una realización, el tejido de las ASC es un tejido interconectivo celularizado. En una realización, las partículas cerámicas se integran en el tejido interconectivo celularizado. En una realización, las partículas cerámicas se dispersan dentro del tejido de las ASC.
En una realización, el biomaterial de la invención se caracteriza por un tejido interconectivo formado entre partículas cerámicas. En una realización, el biomaterial de la invención se caracteriza por la mineralización que rodea las partículas cerámicas. En una realización, la naturaleza tisular del biomaterial formado puede confirmarse por la aparición de una retracción tisular.
En una realización, el biomaterial de la invención tiene las mismas propiedades que un hueso real con expresión de osteocalcina y propiedades de mineralización. En una realización, el biomaterial de la invención comprende células óseas. En una realización, el biomaterial de la invención comprende células óseas y una matriz extracelular. En una realización, el biomaterial de la invención comprende células óseas y colágeno. En una realización particular, el colágeno es colágeno calcificado y mineralizado. En una realización, el biomaterial de la invención comprende una matriz ósea.
En una realización, el biomaterial de la invención es tal que la diferenciación de las células del biomaterial ha alcanzado un punto final, y el fenotipo del biomaterial permanecerá inalterado cuando se implanta.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende factores de crecimiento. En una realización, el contenido o secreción de factores de crecimiento por el biomaterial de la invención se evalúa a las 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después de la adición del material biocompatible.
La osteoprotegerina (OPG), también conocida como factor inhibidor de osteoclastogénesis (OCIF), o miembro 11B de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFRSF11B), es un receptor de citocinas. Se encontró que la sobreexpresión o administración de OPG elimina la osteoclastogénesis en ratones. De manera similar, se estableció que los animales que carecen de OPG tienen osteoclastogénesis acelerada y desarrollan osteoporosis severa. Ahora se sabe que OPG es un Receptor señuelo soluble que compite con RANK por RANKL (Receptor activador del ligando Kappa-B del factor Nuclear, también conocido como miembro 11 de la superfamilia del ligando del factor de necrosis tumoral [TNFSF11], citocina inducida por activación relacionada con TNF [TRANCE], ligando de osteoprotegerina [OPGL] o factor de diferenciación de osteoclastos [ODF]). Se ha identificado la vía de señalización RANK/RANKL/OPG como regulación de la diferenciación y activación de osteoclastos. Por lo tanto, el equilibrio entre la expresión del estimulador de osteoclastogénesis, RANKL y del inhibidor, OPG, dicta la cantidad de hueso reabsorbido.
En una realización, el contenido y/o secreción de OPG del biomaterial de la invención puede cuantificarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como por ejemplo mediante ELISA, preferiblemente a 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después de la adición del material biocompatible.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende OPG. En una realización, el biomaterial de la invención secreta OPG. En una realización, las ASC del biomaterial de la invención secretan OPG. En una realización, el biomaterial de ingeniería celular de la invención secreta OPG.
En una realización, el biomaterial de la invención secreta al menos aproximadamente 1000, 1250, 1500, 1750 o 2000 μg de OPG por 106 células. En una realización, el biomaterial de la invención secreta al menos aproximadamente 2100, 2200, 2300, 2400 o 2500 μg de OPG por 106 células. En otra realización, el biomaterial de la invención secreta al menos aproximadamente2550, 2600, 2650 o 2700 μg de OPG por 106 células. En otra realización, el biomaterial de la invención secreta al menos aproximadamente 2750, 2800, 2850, 2900 o 2950 μg de OPG por 106 células.
En una realización, el biomaterial de la invención secreta al menos aproximadamente 2750 μg de OPG por 106 células. En otra realización, el biomaterial de la invención secreta aproximadamente 2500 μg de OPG por 106 células. En otra realización, el biomaterial de la invención secreta aproximadamente 3000 μg de OPG por 106 células.
En una realización, el biomaterial de la invención secreta de aproximadamente 1000 a aproximadamente 10000 μg de OPG por 106 células, preferiblemente de aproximadamente 1250 a aproximadamente 7500 μg/106 células, más preferiblemente de aproximadamente 1500 a aproximadamente 5000 μg/106 células. En una realización, el biomaterial de la invención secreta de aproximadamente 1000 a aproximadamente 5000 μg de OPG por 106 células, preferiblemente de aproximadamente 1250 a aproximadamente 4500 μg/106 células, más preferiblemente de aproximadamente 1500 a aproximadamente 4000 μg/106 células. En una realización preferida, el biomaterial de la invención secreta OPG a una concentración que varía de aproximadamente 2000 a aproximadamente 3500 μg/106 células. En una realización particular, el biomaterial de la invención secreta OPG a una concentración de aproximadamente 3000 o 3500 μg/106 células.
En una realización, el biomaterial de la invención secreta al menos aproximadamente 5 ng de OPG por g de biomaterial, preferiblemente al menos aproximadamente 10 ng/g, más preferiblemente al menos aproximadamente 15 ng/g. En otra realización, el biomaterial de la invención secreta al menos aproximadamente 20 ng de OPG por g de biomaterial, preferiblemente al menos aproximadamente 25 ng/g, más preferiblemente al menos aproximadamente 30 ng/g.
En otra realización, el biomaterial de la invención secreta al menos aproximadamente 50 ng de OPG por g de biomaterial, preferiblemente al menos aproximadamente 60 ng/g, más preferiblemente al menos aproximadamente 70 ng/g. En una realización, el biomaterial de la invención secreta al menos aproximadamente 75 ng de OPG por g de biomaterial. En otra realización, el biomaterial de la invención secreta al menos aproximadamente 80 ng de OPG por g de biomaterial.
En una realización, el biomaterial de la invención secreta de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 ng de OPG por gramo de biomaterial, preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 175 ng/g, más preferiblemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 150 ng/g. En otra realización, el biomaterial de la invención secreta de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 ng de OPG por gramo de biomaterial, preferiblemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 175 ng/g, más preferiblemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 150 ng/g, incluso más preferiblemente de aproximadamente 25 a aproximadamente 125 ng/g. En una realización, el biomaterial de la invención secreta de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 ng/g de biomaterial. En otra realización, el biomaterial de la invención secreta de aproximadamente 25 a aproximadamente 100 ng/g de biomaterial. En otra realización, el biomaterial de la invención secreta de aproximadamente 30 a aproximadamente 100 ng/g de biomaterial, de aproximadamente 30 a aproximadamente 90 ng/g de biomaterial o de aproximadamente 30 a aproximadamente 85 ng/g de biomaterial.
En una realización particular, el biomaterial de la invención secreta OPG a una concentración de aproximadamente 30 ng/g de biomaterial. En otra realización particular, el biomaterial de la invención secreta OPG a una concentración de aproximadamente 75 ng/g de biomaterial. En otra realización particular, el biomaterial de la invención secreta OPG a una concentración de aproximadamente 85 ng/g de biomaterial.
En una realización, el biomaterial de la invención secreta OPG a concentraciones como se ha descrito anteriormente en la presente memoria después de 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después de la adición del material cerámico. En otras palabras, en una realización, el biomaterial de la invención secreta OPG a concentraciones como se ha descrito anteriormente en la presente memoria después de 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después del comienzo de la inducción multidimensional.
En una realización, el contenido y/o secreción de RANKL del biomaterial de la invención puede cuantificarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como por ejemplo mediante ELISA, preferiblemente a 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después de la adición del material cerámico.
En una realización, el nivel de RANKL en el biomaterial de la invención o en los sobrenadantes del biomaterial cuando está en un medio es indetectable. En una realización, el nivel de RANKL se expresa en μg por mL de sobrenadante. En una realización, el biomaterial de la invención comprende o las ASC del biomaterial secretan menos de 200 μg de RANKL por mL, preferiblemente menos de 156 μg/mL, preferiblemente menos de 100 μg/mL, más preferiblemente menos de 78 μg/mL, incluso más preferiblemente menos de 50 μg/mL, incluso más preferiblemente menos de 10 μg/mL, incluso más preferiblemente menos de 7,8 μg/mL.
En una realización, el biomaterial de la invención no comprende sustancialmente RANKL. En una realización, las ASC del biomaterial de la invención no secretan sustancialmente RANKL.
En una realización, el biomaterial de la invención secreta RANKL a concentraciones como se ha descrito anteriormente en la presente memoria después de 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después de la adición del material cerámico. En otras palabras, en una realización, el biomaterial de la invención secreta RANKL a concentraciones como se ha descrito anteriormente en la presente memoria después de 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después del comienzo de la inducción multidimensional.
En una realización, el biomaterial de la invención secreta OPG y no secreta RANKL, o no secreta niveles detectables de RANKL.
En una realización, el biomaterial de la invención secreta OPG en una concentración de al menos como se ha descrito anteriormente, y secreta RANKL en una concentración de como máximo tal como se ha descrito anteriormente.
En una realización, el biomaterial de la invención muestra una actividad de inhibición de la resorción ósea. En una realización, la actividad de inhibición de la resorción ósea incluye la secreción de osteoprotegerina (OPG). En una realización, la actividad de inhibición de resorción ósea incluye la secreción de OPG y la secreción baja o nula de RANKL.
El factor de crecimiento insulínico (IGF-1) se asocia positivamente con el mantenimiento de la densidad mineral ósea y la adquisición de una masa ósea máxima más alta que reduce el riesgo de fractura posterior.
En una realización, el contenido de IGF-1 del biomaterial de la invención puede cuantificarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, por ELISA, preferiblemente a 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después de la adición del material cerámico.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende IGF-1. En una realización particular, el biomaterial de la invención comprende altos niveles de IGF-1.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende IGF-1 a una concentración de al menos aproximadamente 50 ng/g de biomaterial, preferiblemente al menos aproximadamente 60 ng/g, más preferiblemente al menos aproximadamente 70 ng/g, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 80 ng/g. En una realización, el biomaterial de la invención comprende IGF-1 a una concentración de al menos aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 ng/g de biomaterial.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende IGF-1 a una concentración que varía de aproximadamente 10 ng/g a aproximadamente 500 ng/g de biomaterial, preferiblemente de aproximadamente 20 ng/g a aproximadamente 400 ng/g, más preferiblemente de aproximadamente 30 ng/g a aproximadamente 300 ng/g, incluso más preferiblemente de aproximadamente 40 ng/g a aproximadamente 250 ng/g.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende IGF-1 a una concentración que varía de aproximadamente 50 ng/g a aproximadamente 200 ng/g de biomaterial, preferiblemente de aproximadamente 60 ng/g a aproximadamente 175 ng/g, más preferiblemente de aproximadamente 70 ng/g a aproximadamente 150 ng/g. En una realización, el biomaterial de la invención comprende IGF-1 a una concentración que varía de aproximadamente 80 ng/g a aproximadamente 150 ng/g de biomaterial, preferiblemente de aproximadamente 85 ng/g a aproximadamente 125 ng/g, más preferiblemente de aproximadamente 90 ng/g a aproximadamente 100 ng/g.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende IGF-1 a una concentración que varía de aproximadamente 90 ng/g a aproximadamente 500 ng/g de biomaterial, de aproximadamente 90 ng/g a aproximadamente 400 ng/g, de aproximadamente 90 ng/g a aproximadamente 300 ng/g, de aproximadamente 90 ng/g a aproximadamente 200 ng/g, de aproximadamente 90 ng/g a aproximadamente 150 ng/g, de aproximadamente 90 ng/g a aproximadamente 125 ng/g o de aproximadamente 90 ng/g a aproximadamente 100 ng/g.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende IGF-1 a una concentración de aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 ng/g de biomaterial. En una realización, el biomaterial de la invención comprende aproximadamente 90 ng de IGF-1 por gramo de biomaterial. En otra realización, el biomaterial de la invención comprende aproximadamente 95 ng de IGF-1 por gramo de biomaterial. En otra realización, el biomaterial de la invención comprende aproximadamente 100 ng de IGF-1 por gramo de biomaterial.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende IGF-1 a concentraciones como se ha descrito anteriormente en el presente documento después de 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después de la adición del material cerámico. En otras palabras, en una realización, el biomaterial de la invención comprende IGF-1 a concentraciones como se ha descrito anteriormente en el presente documento después de 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después del comienzo de la inducción multidimensional.
SDF-1a, también llamado factor 1 -alfa derivado de células estromales o CXCL12, juega un papel estimulante en la diferenciación y activación de osteoclastos. Los osteoclastos, y especialmente los precursores de osteoclastos, son altamente positivos para CXCR4, un receptor único para SDF-1a. Aunque SDF-1a induce directamente la osteoclastogénesis, recientemente se encontró que SDF-1a puede afectar indirectamente a la osteoclastogénesis mediante la regulación positiva de la expresión de RANKL. La presencia de RANK sobre osteoclastos y sus precursores sugirió que el factor de diferenciación de osteoclastos, que reside en las células estromales, puede ser RANKL.
En una realización, el contenido de SDF-1a del biomaterial de la invención puede cuantificarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, mediante ELISA, preferiblemente a 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después de la adición del material cerámico.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende SDF-1a. En una realización particular, el biomaterial de la invención comprende niveles bajos de SDF-1a.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende SDF-1a a una concentración de como máximo aproximadamente 300 ng/g de biomaterial, preferiblemente como máximo aproximadamente 250 ng/g, más preferiblemente como máximo aproximadamente 200 ng/g, incluso más preferiblemente como máximo aproximadamente 150 ng/g. En una realización, el biomaterial de la invención comprende SDF-1a a una concentración de como máximo aproximadamente 100 ng/g de biomaterial, preferiblemente como máximo aproximadamente 90 ng/g, más preferiblemente como máximo aproximadamente 80 ng/g. En una realización, el biomaterial de la invención comprende SDF-1a a una concentración de como máximo aproximadamente 75 ng/g de biomaterial, aproximadamente 70 ng/g, aproximadamente 65 ng/g, aproximadamente 60 ng/g o aproximadamente 55 ng/g. En una realización, el biomaterial de la invención comprende SDF-1a a una concentración de como máximo aproximadamente 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52 o 51 ng/g de biomaterial.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende SDF-1a a una concentración de como máximo aproximadamente 50 ng/g de biomaterial. En una realización, el biomaterial de la invención comprende SDF-1a a una concentración de como máximo aproximadamente 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42 o 41 ng/g de biomaterial. En una realización particular, el biomaterial de la invención comprende SDF-1a a una concentración de como máximo aproximadamente 40 ng/g de biomaterial. En una realización, el biomaterial de la invención comprende SDF-1a a una concentración de como máximo aproximadamente 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32 o 31 ng/g de biomaterial. En una realización particular, el biomaterial de la invención comprende SDF-1a a una concentración de como máximo aproximadamente 30 ng/g de biomaterial.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende SDF-1a a una concentración que varía de aproximadamente 5 ng/g a aproximadamente 100 ng/g de biomaterial, preferiblemente de aproximadamente 10 ng/g a aproximadamente 90 ng/g, más preferiblemente de aproximadamente 15 ng/g a aproximadamente 90 ng/g. En otra realización, el biomaterial de la invención comprende SDF-1a a una concentración que varía de aproximadamente 20 ng/g a aproximadamente 80 ng/g de biomaterial, preferiblemente de aproximadamente 25 ng/g a aproximadamente 70 ng/g, más preferiblemente de aproximadamente 25 ng/g a aproximadamente 60 ng/g. En una realización, el biomaterial de la invención comprende SDF-1a a una concentración que varía de aproximadamente 25 ng/g a aproximadamente 55 ng/g de biomaterial. En una realización, el biomaterial de la invención comprende SDF-1a a una concentración que varía de aproximadamente 30 ng/g a aproximadamente 100 ng/g de biomaterial, de aproximadamente 30 ng/g a aproximadamente 90 ng/g, de aproximadamente 30 ng/g a aproximadamente 80 ng/g, de aproximadamente 30 ng/g a aproximadamente 70 ng/g, de aproximadamente 30 ng/g a aproximadamente 60 ng/g, de aproximadamente 30 ng/g a aproximadamente 55 ng/g, o de aproximadamente 30 ng/g a aproximadamente 50 ng/g.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende aproximadamente 30 ng de SDF-1a por gramo de biomaterial. En otra realización, el biomaterial de la invención comprende aproximadamente 40 ng de SDF-1a por gramo de biomaterial. En otra realización, el biomaterial de la invención comprende aproximadamente 50 ng de SDF-1a por gramo de biomaterial. En una realización, el biomaterial de la invención comprende SDF-1 a a concentraciones como se ha descrito anteriormente en la presente memoria después de 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después de la adición del material cerámico. En otras palabras, en una realización, el biomaterial de la invención comprende s DF-1 a a concentraciones como se ha descrito anteriormente en la presente memoria después de 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después del comienzo de la inducción multidimensional.
En una realización, el biomaterial de la invención secreta OPG a concentraciones como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, comprende IGF1 a concentraciones como se ha descrito anteriormente y comprende SDF-1a a concentraciones como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.
En una realización particular, el biomaterial de la invención:
- secreta al menos aproximadamente 5 ng de OPG por g de biomaterial, preferiblemente al menos aproximadamente 10 ng/g, más preferiblemente al menos aproximadamente 15 ng/g,
- comprende al menos aproximadamente 10 ng de IGF-1 por g de biomaterial, preferiblemente al menos aproximadamente 25 ng/g, más preferiblemente al menos aproximadamente 50 ng/g, y
- comprende como máximo aproximadamente 200 ng de SDF-1 a por g de biomaterial, preferiblemente como máximo aproximadamente 150 ng/g, más preferiblemente como máximo aproximadamente 100 ng/g.
En otra realización particular, el biomaterial de la invención:
- secreta al menos aproximadamente 10 ng de OPG por g de biomaterial, preferiblemente al menos aproximadamente 20 ng/g, más preferiblemente al menos aproximadamente 30 ng/g,
- comprende al menos aproximadamente 50 ng de IGF 1 por g de biomaterial, preferiblemente al menos aproximadamente 75 ng/g, más preferiblemente al menos aproximadamente 90 ng/g, y
- comprende como máximo aproximadamente 100 ng de SDF-1 a por g de biomaterial, preferiblemente como máximo aproximadamente 75 ng/g, más preferiblemente como máximo aproximadamente 50 ng/g.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
En una realización particular, el biomaterial de la invención comprende altos niveles de VEGF.
En una realización, el contenido de VEGF del biomaterial de la invención puede cuantificarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, por ELISA, preferiblemente a 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después de la adición del material cerámico.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende VEGF a una concentración de al menos aproximadamente 10 ng/g de biomaterial, preferiblemente al menos aproximadamente 20 ng/g, más preferiblemente al menos aproximadamente 30 ng/g. En otra realización, el biomaterial de la invención comprende VEGF a una concentración de al menos aproximadamente 50 ng/g de biomaterial, aproximadamente 60 ng/g, aproximadamente 70 ng/g, o aproximadamente 75 ng/g. En otra realización, el biomaterial de la invención comprende VEGF a una concentración de al menos aproximadamente 95 o 100 ng/g de biomaterial.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende VEGF a una concentración que varía de aproximadamente 10 ng/g a aproximadamente 150 ng/g de biomaterial, preferiblemente de aproximadamente 20 ng/g a aproximadamente 125 ng/g, más preferiblemente de aproximadamente 25 ng/g a aproximadamente 100 ng/g. En otra realización, el biomaterial de la invención comprende VEGF a una concentración que varía de aproximadamente 20 ng/g a aproximadamente 100 ng/g de biomaterial. En otra realización, el biomaterial de la invención comprende VEGF a una concentración que varía de aproximadamente 30 ng/g a aproximadamente 100 ng/g de biomaterial. En otra realización, el biomaterial de la invención comprende VEGF a una concentración que varía de aproximadamente 35 ng/g a aproximadamente 100 ng/g de biomaterial. En otra realización, el biomaterial de la invención comprende VEGF a una concentración que varía de aproximadamente 35 ng/g a aproximadamente 95 ng/g de biomaterial.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende VEGF a una concentración de aproximadamente 35 ng/g de biomaterial. En otra realización, el biomaterial de la invención comprende VEGF a una concentración de aproximadamente 75 ng/g de biomaterial. En otra realización, el biomaterial de la invención comprende VEGF a una concentración de aproximadamente 95 ng/g de biomaterial. En otra realización, el biomaterial de la invención comprende VEGF a una concentración de aproximadamente 100 ng/g de biomaterial.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende VEGF a concentraciones como se ha descrito anteriormente en el presente documento después de 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después de la adición del material cerámico. En otras palabras, en una realización, el biomaterial de la invención comprende VEGF a concentraciones como se ha descrito anteriormente en el presente documento después de 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después del comienzo de la inducción multidimensional.
La proteína morfogenética ósea 2 o BMP2 desempeña un papel importante en la estimulación del desarrollo del hueso. Por ejemplo, se ha demostrado inducir potentemente la diferenciación de osteoblastos.
La proteína morfogenética ósea 7 o BMP7 desempeña un papel clave en la transformación de células mesenquimales en hueso, en particular mediante la inducción de la fosforilación de SMAD1 y SMADS, que a su vez induce la transcripción de numerosos genes osteogénicos.
En una realización, el contenido de BMP2 y BMP7 del biomaterial de la invención puede cuantificarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como por ejemplo mediante ELISA, preferiblemente a 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después de la adición del material cerámico.
En una realización, el nivel de BMP2 en el biomaterial de la invención o en los sobrenadantes del biomaterial cuando está en un medio es indetectable. En una realización, el biomaterial de la invención no comprende sustancialmente BMP2. En una realización, las ASC del biomaterial de la invención no secretan sustancialmente BMP2.
En una realización, el nivel de BMP2 se expresa en μg por mL de sobrenadante. En una realización, el biomaterial de la invención comprende o las ASC del biomaterial secretan menos de 100 μg de BMP2 por mL, preferiblemente menos de 85 μg/mL, más preferiblemente menos de 75 μg/mL, incluso más preferiblemente menos de 62,5 μg/mL.
En una realización, el nivel de BMP7 en el biomaterial de la invención o en los sobrenadantes del biomaterial cuando está en un medio es indetectable. En una realización, el biomaterial de la invención no comprende sustancialmente BMP7. En una realización, las ASC del biomaterial de la invención no secretan sustancialmente BMP7.
En una realización, el nivel de BMP7 se expresa en μg por mL de sobrenadante. En una realización, el biomaterial de la invención comprende o las ASC del biomaterial secretan menos de 50 μg de BMP7 por mL, preferiblemente menos de 40 μg/mL, más preferiblemente menos de 35 μg/mL, incluso más preferiblemente menos de 31,2 μg/mL.
En una realización, el biomaterial de la invención comprende BMP2 y/o BMP7 a concentraciones como se ha descrito anteriormente en el presente documento después de 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después de la adición del material cerámico. En otras palabras, en una realización, el biomaterial de la invención comprende BMP2 y/o BMP7 a concentraciones como se ha descrito anteriormente en el presente documento después de 4, 5, 6, 7 u 8 semanas después del comienzo de la inducción multidimensional.
En una realización, el biomaterial según la invención se mineraliza. Como se usa en el presente documento, el término “ mineralización” o “densidad mineral de tejido óseo” se refiere a la cantidad de materia mineral por centímetro cuadrado de huesos o tejidos “ similares a huesos” formados por biomaterial, también expresado en porcentaje. Por consiguiente, como se usa en el presente documento, el término “ mineralización” o “densidad mineral de tejido óseo” se refiere a la cantidad de materia mineral por centímetro cuadrado de biomaterial, también expresado en porcentaje.
Se conocen en la técnica métodos para evaluar el grado de mineralización de un biomaterial. Los ejemplos de tales métodos incluyen, pero no se limitan a, análisis de tomografía computarizada (micro-CT), espectrometría de masas de formación de imágenes, tinción con azul de calceína, análisis de distribución de densidad mineral ósea (BMDD) y similares.
En una realización, el grado de mineralización del biomaterial de la invención no es inferior a aproximadamente 1 %. En una realización, el grado de mineralización del biomaterial de la invención es superior a aproximadamente 1 %.
En otra realización, el grado de mineralización del biomaterial de la invención es de al menos aproximadamente el 5 %, preferiblemente al menos aproximadamente el 10 %, más preferiblemente al menos aproximadamente el 15 %. En otra realización, el grado de mineralización del biomaterial de la invención es de al menos aproximadamente el 20 %, preferiblemente al menos aproximadamente el 25 %, más preferiblemente al menos aproximadamente el 30 %, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 35 %. En una realización, el grado de mineralización del biomaterial de la invención es de al menos aproximadamente 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 % o 38 %.
En una realización, el grado de mineralización del biomaterial de la invención varía de aproximadamente 5 % a aproximadamente 50 %, preferiblemente de aproximadamente 10 % a aproximadamente 45 %, más preferiblemente de aproximadamente 15 % a aproximadamente 40 %. En otra realización, el grado de mineralización del biomaterial de la invención varía de aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, preferiblemente de aproximadamente 25 % a aproximadamente 45 %, más preferiblemente de aproximadamente 30 % a aproximadamente 40 %. En una realización, el grado de mineralización del biomaterial de la invención varía de aproximadamente 35 % a aproximadamente 40 %. En una realización particular, el grado de mineralización del biomaterial de la invención es de aproximadamente 38 %.
En una realización, el grado de mineralización del biomaterial de la invención es proporcional a la secreción de OPG. En una realización, más el biomaterial comprende OPG, más se mineraliza el biomaterial.
La invención también se refiere a un biomaterial multidimensional que se puede obtener mediante el método según la invención. En una realización, el biomaterial multidimensional se obtiene mediante el método según la invención. En una realización, el biomaterial multidimensional se produce mediante el método según la invención. En una realización, el biomaterial obtenible u obtenido por el método de la invención está destinado a ser implantado en un cuerpo humano o animal. En una realización, el biomaterial implantado puede ser de origen autólogo o alogénico. En una realización, el biomaterial de la invención puede implantarse en un área de hueso o cartílago. En una realización, este biomaterial puede implantarse en áreas irregulares del cuerpo humano o animal.
En una realización, el biomaterial de la invención es homogéneo, lo que significa que la estructura y/o constitución del biomaterial son similares a lo largo de todo el tejido. En una realización, el biomaterial tiene una manipulación y características mecánicas deseables requeridas para la implantación en el área de enfermedad nativa. En una realización, el biomaterial obtenible u obtenido por el método de la invención puede mantenerse con un instrumento quirúrgico sin rasgarse.
Otro objeto de la presente invención es un dispositivo médico que comprende un biomaterial según la invención.
Otro objeto más es una composición farmacéutica que comprende un biomaterial según la invención y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también se refiere a un biomaterial o una composición farmacéutica según la invención para su uso como medicamento.
La invención se refiere a cualquier uso del biomaterial de la invención, como un dispositivo médico o incluido en un dispositivo médico, o en una composición farmacéutica. En ciertas realizaciones, el biomaterial, el dispositivo médico o la composición farmacéutica de la invención es un material similar a la masilla que puede manipularse y moldearse antes de su uso.
La presente invención se refiere además a un método para tratar un defecto óseo o cartilaginoso en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un biomaterial, dispositivo médico o composición farmacéutica de acuerdo con la invención.
Como se usa en la presente descripción, el término “defecto óseo” significa una falta de tejido óseo en un área corporal, donde el hueso normalmente debe ser, o donde se desee terapéuticamente la formación del tejido óseo.
Como se usa en el presente documento, el término “defecto de cartílago” significa una falta de tejido cartilaginoso en un área corporal, donde el cartílago debe ser normalmente, o donde se desea terapéuticamente la formación de tejido cartilaginoso.
Otro objeto de la presente invención es un biomaterial, dispositivo médico o composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de un defecto óseo o cartilaginoso en un sujeto que lo necesita. Otro objeto de la presente invención es el uso de un biomaterial, dispositivo médico o composición farmacéutica de acuerdo con la invención para tratar un defecto óseo en un sujeto que lo necesita.
Algunos ejemplos de defectos óseos son, entre otros, fractura ósea, fragilidad ósea, pérdida de densidad mineral ósea, artritis, pseudoartrosis como la pseudoartrosis congénita, osteoporosis, espondilolisis, espondilolistesis, osteomalacia, osteopenia, cáncer de hueso, enfermedad de Paget, lesiones escleróticas, trastornos infiltrativos del hueso, osteonecrosis esponjosa y cortical, espina bífida, retraso de la unión, osteogénesis imperfecta, defecto craneal (por ejemplo, tras resección tumoral o hemorragia), osteonecrosis y pérdida ósea metabólica.
Los ejemplos de defectos de cartílago incluyen, pero no se limitan a, cartílago dañado o falta de cartílago en un área corporal. La causa de un defecto de cartílago puede deberse a traumatismo, osteonecrosis, osteocondritis y otras afecciones. Los defectos de cartílago se ven más comúnmente en la articulación de la rodilla, donde a menudo se produce por traumatismo y se observa en asociación con lesiones del ligamento, tales como roturas del ligamento cruzado anterior (ACL).
En una realización, el biomaterial, el dispositivo médico o la composición farmacéutica de la invención es para tratar, o para su uso para tratar, un defecto óseo seleccionado del grupo que comprende o que consiste en fractura ósea, fragilidad ósea, pérdida de densidad mineral ósea, artritis, pseudoartrosis tal como pseudoartrosis congénita, osteoporosis, espondilolisis, espondilolistesis, osteomalacia, osteopenia, cáncer de huesos, enfermedad de Paget, lesiones escleróticas, trastornos infiltrados de hueso, osteonecrosis esponjosa y cortical, spina bifida, unión retardada, osteogénesis imperfecta, defecto craneal (por ejemplo después de resección tumoral o sangrado), osteonecrosis y pérdida ósea metabólica.
En una realización, el biomaterial, el dispositivo médico o la composición farmacéutica de la invención es para tratar, o para su uso para tratar, un defecto óseo seleccionado del grupo que comprende o consiste en fractura ósea, artritis, pseudoartrosis congénita, osteoporosis, espondilolisis, espondilolistesis, cáncer óseo, enfermedad de Paget, lesiones escleróticas, osteonecrosis aguda y cortical y pérdida ósea metabólica.
En una realización, el biomaterial, dispositivo médico o composición farmacéutica de la invención es para tratar, o para su uso para tratar, espondilolisis y/o espondilolistesis. La espondilolisis es un defecto o fractura por estrés en la pars interarticularis del arco vertebral. La espondilolistesis o el deslizamiento es el desplazamiento traslacional o la alineación no anatómica de una vértebra con respecto a la vértebra adyacente y se produce en aproximadamente el 30 % de los pacientes con una espondilolisis.
En una realización, la espondilolistesis es una espondilolistesis displásica, istrómica, degenerativa, traumática, patológica y/o posquirúrgica/iatrogénica. En una realización, la espondilolistesis es una espondilolistesis displásica (también llamada tipo 1), de anomalías congénitas de las facetas sacrales superiores o facetas inferiores de la quinta vértebra lumbar. En otra realización, la espondilolistesis es espondilolistesis istrómica (también llamada tipo 2), causada por un defecto en la pars interarticularis, pero también puede verse con pars alargados. En otra realización, la espondilolistesis es una espondilolistesis degenerativa (también llamada tipo 3), resultante de artritis facetaria y remodelación articular. En otra realización, la espondilolistesis es una espondilolistesis traumática (también llamada tipo 4), resultante de fracturas agudas en el arco neural, distintas de las pardas. En otra modalidad, la espondilolistesis es una espondilolistesis patológica (también llamada tipo 5), causada por infección o una neoplasia maligna. En otra realización, la espondilolistesis es una espondilolistesis posquirúrgica/iatrogénica (también llamada tipo 6), causada por complicaciones después de la cirugía.
En una realización, la espondilolistesis es de grado I, grado II, grado III, grado IV o grado V de acuerdo con la clasificación de Myerding. En una realización, la espondilolistesis es de grado I, que corresponde a un grado de deslizamiento del 0 al 25 % medido como porcentaje del ancho del cuerpo vertebral. En otra realización, la espondilolistesis es de grado II, que corresponde a un grado de deslizamiento del 25 % al 50 %. En otra realización, la espondilolistesis es de grado III, que corresponde a un grado de deslizamiento del 50 % al 75 %. En otra realización, la espondilolistesis es de grado IV, que corresponde a un grado de deslizamiento del 75 % al 100 %. En otra realización, la espondilolistesis es de grado V, que corresponde a un grado de deslizamiento mayor del 100 %.
En una realización, el biomaterial, dispositivo médico o composición farmacéutica de la invención es para rellenar los espacios intercorporales y/o jaula(s) de fusión que implantar en un sujeto que lo necesite.
En una realización, el biomaterial, el dispositivo médico o la composición farmacéutica de la invención es para tratar, o para su uso para el tratamiento, la pseudoartrosis congénita. En una realización particular, el biomaterial, dispositivo médico o composición farmacéutica de la invención es para tratar, o para su uso para el tratamiento, la pseudoartrosis congénita de la tibia (CPT). CPT se refiere a la unión de una fractura tibial que se desarrolla espontáneamente o después de un traumatismo meno: la tibia muestra un área de displasia segmentaria que da como resultado un arqueamiento anterolateral del hueso. La CPT generalmente se asocia con neurofibromatosis, y permanece una de las condiciones más desafiantes y de lectura que se enfrentan a la cirugía ortopédica pediátrica. Por lo general, la enfermedad se vuelve evidente dentro del primer año de vida de un niño, pero puede no ser detectada hasta la edad de 12 años.
En una realización, la CPT es de Tipo I, Tipo II, Tipo III o Tipo IV de acuerdo con la clasificación Crawford. En una realización, la CPT es de Tipo I, correspondiente a un arqueamiento anterior con un aumento en la densidad cortical y una médula estrecha. En otra realización, la CPT es de Tipo II, correspondiente a un arqueamiento anterior con médula estrecha, esclerótica. En otra realización, la CPT es de Tipo III, correspondiente a un arqueamiento anterior asociado con un ciclo o signos de una prefractura. En otra realización, la CPT es de Tipo IV, correspondiente a un arqueamiento anterior y una fractura clara con pseudoartrosis que a menudo asocia la tibia y el fibrato.
En una realización, el biomaterial, el dispositivo médico o la composición farmacéutica de la invención es para tratar, o para su uso para el tratamiento, la pseudoartrosis congénita de la tibia en pacientes pediátricos. En una realización, el biomaterial, dispositivo médico o composición farmacéutica de la invención es para tratar, o para su uso para tratar, la pseudoartrosis congénita pediátrica de la tibia.
La invención también se refiere al uso del biomaterial, dispositivo médico o composición farmacéutica de la invención en ortopedia, especialmente en cirugía maxilofacial o plástica. El biomaterial de la invención también puede usarse en reumatología.
La invención se refiere además a un método de utilización del biomaterial, producto sanitario o composición farmacéutica de la invención para tratar, corregir o aliviar anomalías congénitas o adquiridas de las articulaciones, huesos cráneo-faciales-maxilares, trastornos ortodóncicos, trastornos óseos o articulares (por ejemplo que requieran sustitución) tras una intervención quirúrgica, traumatismo u otras anomalías congénitas o adquiridas, y para soportar otros implantes musculoesqueléticos, en particular implantes artificiales y sintéticos.
En otro aspecto, la invención se refiere al biomaterial, dispositivo médico o composición farmacéutica de la invención para su uso para la reconstrucción ósea. En una realización, el biomaterial de la invención es para su uso para llenar una cavidad ósea dentro del cuerpo humano o animal.
En otro aspecto más, la invención se refiere al biomaterial, dispositivo médico o composición farmacéutica de la invención para su uso para cirugía reconstructiva o estética.
En una realización, la invención se refiere al biomaterial, dispositivo médico o composición farmacéutica de la invención para su uso para cirugía reconstructiva. En otra realización, la invención se refiere al biomaterial de la invención para su uso por cirugía estética.
En una realización, el biomaterial, el dispositivo médico o la composición farmacéutica de la invención pueden usarse como un implante alogénico o como un implante autólogo. En una realización, el biomaterial, el dispositivo médico o la composición farmacéutica de la invención pueden usarse como un implante xenogénico. En una realización, el biomaterial, el dispositivo médico o la composición farmacéutica de la invención pueden usarse en el injerto de tejido.
El biomaterial de la invención es además ventajoso para estimular la angiogénesis. De hecho, las ASC del biomaterial liberan factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que estimula el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos.
En una realización, el sujeto es un sujeto humano. En otra realización, el sujeto es un sujeto animal tal como, por ejemplo, una mascota, un animal doméstico o un animal de producción. En una realización, el sujeto es un sujeto mamífero.
En una realización, el biomaterial, el dispositivo médico o la composición farmacéutica de la invención pueden usarse en un ser humano y/o un animal. En una realización, el biomaterial, el dispositivo médico o la composición farmacéutica de la invención pueden usarse en medicina humana y veterinaria.
En una realización, el sujeto padece defecto óseo y/o cartilaginoso.
En una realización particular, el sujeto padece espondilolisis y/o espondilolistesis. En otra realización particular, el sujeto padece pseudoartrosis congénita de la tibia (CPT). En una realización particular, el sujeto padece pseudoartrosis congénita pediátrica de la tibia (CPT).
En una realización, el sujeto ya ha sido tratado para el defecto óseo y/o cartilaginoso.
En una realización particular, el sujeto ya ha sido tratado para espondilolisis y/o espondilolistesis. Los ejemplos de otros tratamientos para la espondilolisis y/o la espondilolistesis incluyen, pero no se limitan a, gestión conservadora tal como refuerzo, restricción de actividad, ejercicios de extensión, ejercicios de flexión y resistencia abdominal profunda y cirugía tal como fusión espinal y laminectomía.
En otra realización particular, el sujeto ya ha sido tratado para CPT. Los ejemplos de otros tratamientos para CPT incluyen, pero no se limitan a, refuerzo y cirugía, tal como el infarto intramedular asociado con un injerto óseo, transferencia ósea vascularizada, la técnica Ilizarov, membrana inducida y injerto autólogo esponjoso.
En una realización, el sujeto no responde a al menos otro tratamiento para el defecto óseo y/o cartilaginoso.
En una realización, el sujeto es un bebé o un niño. Por consiguiente, en una realización, el sujeto es un sujeto pediátrico. En una realización, el sujeto es inferior a 18 años, preferiblemente inferior a 15 años, 12 años o 10 años.
En otra realización, el sujeto es un adulto. Por consiguiente, en una realización, el sujeto es más de 18 años.
En una realización, el biomaterial, el dispositivo médico o la composición farmacéutica de la invención se administra al sujeto que lo necesita durante un procedimiento de defecto óseo y/o cartilaginoso, tal como por ejemplo un procedimiento de fusión espinal.
En una realización, el biomaterial, dispositivo médico o composición farmacéutica de la invención se utiliza junto con el desbridamiento, la colocación de una o dos jaulas somáticas intercorporales y la fijación bilateral de tornillos pediculares, y/o la rehabilitación.
La invención también se refiere a un kit, que comprende un biomaterial, una composición farmacéutica o un dispositivo médico de acuerdo con la invención y medios de fijación adecuados. Los ejemplos de medios de fijación adecuados incluyen, pero no se limitan a, pegamento quirúrgico, pegamento de tejido o cualquier composición adhesiva para uso quirúrgico que sea biocompatible, no tóxico y opcionalmente biorreabsorbible.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un histograma que muestra la viabilidad celular de las hASC en contacto indirecto con HA/β-TCP a tres concentraciones diferentes (1,5, 2,85 y 5,91 cm3), en porcentaje comparado con las células no tratadas. La figura 2 es un conjunto de fotografías que muestran una vista macroscópica de un biomaterial formado con HA/β-TCP (A), HA (B) o p-TCP (C).
La figura 3 es un conjunto de fotografías que muestran una vista microscópica de un biomaterial formado con HA/β-TCP. La figura 4 es un conjunto de fotografías que muestran una tinción con hematoxilina-eosina (A), tricoma de Masson (B) y osteocalcina (C) de un biomaterial formado con HA/β-TCP.
La figura 5 es un conjunto de fotografías que muestran el análisis Micro-CT en un biomaterial formado con HA/β-TCP a tres escalas diferentes (A, B y C).
La figura 6 es un histograma que muestra el contenido de IGF1 (gris oscuro), VEGF (gris claro) y SDF-1 (gris medio) de un biomaterial formado con HA/β-TCP.
La figura 7 es un histograma que muestra la secreción de OPG por las ASC en μg por 106 células en cultivo 2D en medio MP y en medio MD, y en medio de cultivo de un biomaterial formado con HA/β-TCP.
La figura 8 es un histograma que muestra la secreción de OPG en ng por g de material por ASCs en cultivo 2D en medio MD, y en cultivo en un biomaterial formado con HA/β-TCP, HA y p-TCP.
La figura 9 es un conjunto de gráficos que muestran la expresión de los genes FGFR1 (A), IGFR1 (B), RUNX2 (C), TWIST1 (D), TGFBR1 (E), SMAD2 (F), SMAD4 (G), SMADS (H) en el biomaterial de la invención formado con HA/β-TCP (biomaterial) en comparación con ASC en Mp (MP) y en MD (MD). *: p<0,05, **: p<0,01, ***: p<0,001.
La figura 10 es un conjunto de gráficos que muestran la expresión de los genes ANG (A), EFNA1 (B), EFNB2 (C), VEGFA (D), FGF1 (E), LEP (F) en el biomaterial de la invención formado con HA/β-TCP (biomaterial) en comparación con ASCs en MP (MP) y en MD (MD). *: p<0,05, **: p<0,01.
La figura 11 es un conjunto de histogramas que muestran la secreción de VEGF (A) y SDF-1 a (B) en el biomaterial de la invención formado con HA/β-TCP (biomaterial) en comparación con ASCs en MP (MP) y en MD (MD) en hipoxia (1 %) o normoxia (21 %).
La figura 12 es una fotografía que muestra la inmunotinción para el factor von Willebrand de explantes de un biomaterial de la invención. Las partículas de HA/β-TCP se indican mediante el símbolo * y los recipientes mediante flechas negras. La figura 13 es un conjunto de histogramas que muestran el área vascular en porcentaje (A) y el número de vasos/mm2 (B) en biomateriales de la invención.
La figura 14 es una fotografía que muestra la presencia de células humanas revelada por inmunotinción HLA/ antígeno leucocitario humano en marrón por una revelación de peroxidasa (indicada aquí por flechas negras) en biomateriales de la invención en el día 28 post-implantación en ratas. Las partículas de HA/β-TCP se indican mediante el símbolo *. La figura 15 es un conjunto de fotografías que muestran microCT-scan del fémur a 1 mes post-implantación en ratas del biomaterial de la invención (superior e inferior izquierda) y partículas HA/β-TCP solas (superior e inferior derecha). Las fotografías inferiores son ampliaciones de las fotografías superiores. Los rectángulos de los puntos representan sitios de implantación.
La figura 16 es un conjunto de fotografías que muestran la histología del defecto óseo 1 mes después de la implantación de partículas de HA/β-TCP: tinción de hematoxilina-eosina, aumento original x5 (A); Tinción tricrómica de Masson, aumento original x20 (B). La flecha blanca representa la no integración del producto y una fibrosis importante. La flecha negra indica la ausencia de osificación endocondral en el defecto en la interfase entre el hueso nativo y el implante de HA/β-TCP.
La figura 17 es un conjunto de fotografías que muestran la histología del defecto óseo 1 mes después de la implantación del biomaterial de la invención: tinción de hematoxilina-eosina, aumento original x5 (A); Tinción tricrómica de Masson, aumento original x20 (B); Inmunotinción de HLA-I, aumento original x10 (C). Las flechas blancas representan la integración del producto y la fusión ósea. La flecha negra representa la osificación endocondral directamente en contacto entre el hueso nativo y el biomaterial que revela el proceso de unión ósea.
Ejemplos
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1: Producción de biomateriales de la invención
Aislamiento de las hASC
Se cosecharon los tejidos adiposos subcutáneos humanos mediante lipoaspiración después de la técnica de Coleman en la región abdominal y después del consentimiento informado y el cribado serológico.
Las células madre derivadas de tejido adiposo humano (hASC) se aislaron rápidamente del tejido adiposo entrante. El lipoaspirado se puede almacenar a 4 0C durante 24 horas o durante un tiempo más largo a -80 0C.
En primer lugar, se aisló una fracción del lipoaspirado para fines de control de calidad y se midió el volumen restante del lipoaspirado. Luego, el lipoaspirado se digirió mediante una solución de colagenasa (NB 1, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania) preparada en HBSS (con una concentración final de ~8 U/mL). El volumen de la solución enzimática usada para la digestión fue el doble del volumen del tejido adiposo. La digestión se realizó durante 50-70 min a 37 0C ±1 0C. Se realizó una primera agitación intermitente después de 15-25 min y un segundo después de 35-45 min. La digestión se detuvo mediante la adición de medio MP (medio de proliferación o medio de crecimiento). El medio MP comprendía el medio DMEM (4,5 g/L de glucosa y Ala-Gln; Sartorius Stedim Biotech, Gottingen, Alemania) complementado con lisado de plaquetas humanas al 5 % (hPL) (v/v). DMEM es un medio de cultivo estándar que contiene sales, aminoácidos, vitaminas, piruvato y glucosa, tamponado con un tampón de carbonato y tiene un pH fisiológico (7,2­ 7,4). El DMEM usado contenía Ala-Gln. El lisado de plaquetas humanas (hPL) es una fuente rica de factor de crecimiento usada para estimular in vitro crecimiento de células madre mesenquimales (tales como las hASC).
El tejido adiposo digerido se centrifugó (500 g, 10 min, temperatura ambiente) y se retiró el sobrenadante. La fracción vascular estromal (SVF) sedimentada se resuspendió en medio MP y se pasó a través de un filtro de malla de 200-500 μm. La suspensión celular filtrada se centrifugó una segunda vez (500 g, 10 min, 20 °C). El sedimento que contenía las hASC se resuspendió en medio MP. Una pequeña fracción de la suspensión celular se puede mantener para el recuento de células y la suspensión celular restante completa se usó para sembrar una de 75 cm2 en el matraz T (denominado pasaje P0). El recuento de células se realizó (solo para información) para estimar el número de células sembradas.
Día después de la etapa de aislamiento (día 1), el medio de cultivo se retiró de los 75 cm2 en T. Las células se enjuagaron tres veces con tampón fosfato y después se añadió medio MP recién preparado al matraz.
Crecimiento y expansión de células madre derivadas de tejido adiposo humano
Durante la fase de proliferación, las hASC se pasaron 4 veces (P1, P2, P3 y P4) para obtener una cantidad suficiente de células para las etapas posteriores del proceso.
Entre P0 y el cuarto pasaje (P4), las células se cultivaron en frascos T y se alimentaron con medio MP nuevo. Las células se pasaron al alcanzar una confluencia > 70 % y < 100 % (confluencia objetivo: 80-90 %). Todos los recipientes de cultivo celular de 1 lote se pasaron al mismo tiempo. En cada pasaje, las células se separaron de su recipiente de cultivo con TryμLE (Select 1X; 9 mL para matraces de 75 cm2 o 12 mL para matraces de 150 cm2), una enzima recombinante de disociación celular libre de animales. La digestión con TryLe se realizó durante 5-15 min a 37 0C ±2 0C y se detuvo mediante la adición de medio MP.
Después, las células se centrifugaron (500 g, 5 min, temperatura ambiente) y se resuspendieron en medio MP. Las células cosechadas se agruparon para garantizar una suspensión celular homogénea. Después de la resuspensión, se contaron las células.
En los pases P1, P2 y P3, la suspensión celular restante se diluyó a la densidad celular apropiada en medio MP y se sembró en superficies de cultivo tisular más grandes. En estas etapas, 75 cm2 se sembraron frascos con un volumen de suspensión celular de 15 mL, mientras que 150 cm2 se sembraron matraces con un volumen de suspensión celular de 30 mL. En cada pasaje, las células se sembraron entre 0,5 x 104 y 0,8 x 104 células/cm2. Entre los diferentes pases, el medio de cultivo se intercambió cada 3-4 días. El comportamiento celular y la tasa de crecimiento de un donante a otro podrían diferir ligeramente. Por lo tanto, la duración entre dos pases y el número de intercambios de medio entre pases puede variar de un donante a otro.
Diferenciación osteogénica
En el pasaje P4 (es decir, el cuarto pasaje), las células se centrifugaron una segunda vez y se resuspendieron en medio MD (medio de diferenciación). Después de la resuspensión, las células se contaron una segunda vez antes de diluirse a la densidad celular apropiada en medio MD, y un volumen de suspensión celular de 70 mL se sembró en 150 cm2 matraces y alimentados con medio MD osteogénico. Según este método, las células se cultivaron directamente en medio MD osteogénico después del cuarto pasaje. Por lo tanto, se añadió medio MD osteogénico mientras que las células no han alcanzado la confluencia.
El medio MD osteogénico estaba compuesto por medio de proliferación (DMEM, Ala-Gln, hPL 5 %) suplementado con dexametasona (1 μM), ácido ascórbico (0,25 mM) y fosfato de sodio (2,93 mM).
El comportamiento celular y la tasa de crecimiento de un donante a otro podrían diferir ligeramente. Por lo tanto, la duración de la etapa de diferenciación osteogénica y el número de intercambios de medio entre pases pueden variar de un donante a otro.
Inducción multidimensional de células
La inducción multidimensional de ASC se lanzó cuando las células alcanzaron una confluencia y si aparece un cambio morfológico y si se observó al menos un nódulo osteoide (es decir, la parte orgánica no mineralizada de la matriz ósea que se forma antes de la maduración del tejido óseo) en los matraces.
Después de exponerse al medio MD osteogénico, los recipientes de cultivo que contenían la monocapa confluente de células osteogénicas adherentes se pulverizaron lentamente y homogéneamente con diversos materiales cerámicos: - Partículas de HA/β-TCP: en una relación de 65/35, 1,5 cm3 para a 150 cm2 matraz (Tekineed, Francia), - Partículas de HA: 1,5 cm3 para a 150 cm2 matraz (Biocetis, Francia), o
- Partículas de p-TCP: 1,5 cm3 para a 150 cm2 matraz (Biocetis, Francia).
Las células se mantuvieron en medio MD. Se realizaron intercambios regulares de medio cada 3 a 4 días durante la inducción multidimensional. Dichos intercambios de medio se realizaron evitando cuidadosamente la eliminación de partículas de material cerámico y desarrollando estructura(s).
Ejemplo 2: Caracterización de los biomateriales
Materiales y métodos
Citotoxicidad
El objetivo de este método fue evaluar la toxicidad de un contacto indirecto de material celular (difusión de productos químicos lixiviables en el medio de cultivo). En este método, las hASC se sembraron con 8000 células/cm2 (15200 células por pocillo) y se incubaron a 37 0C en dos placas de 24 pocillos durante 72 horas. A continuación, cuando las células estaban en confluencia, se retiró el medio de cultivo y se cargó el material cerámico en insertos transwell que contenían una membrana microporosa inferior;
- tres cantidades diferentes de HA/β-TCP: 1,5 cm3, 2,85 cm3 y 5,91 cm3 para un recipiente de 150 cm 2, - 1,5 cm3de partículas de HA para un recipiente de 150 cm2, o
- 1,5 cm3 de partículas de p-TCP para un recipiente de 150 cm2,
y luego se colocó en cada pocillo individual y se incubó a 37 0C/CO2 al 5 % durante 24 horas.
Después de la incubación, la viabilidad celular se evaluó mediante el uso del “kit CCK-8” para la cuantificación del número de células viables en ensayos de proliferación y citotoxicidad (Sigma), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Brevemente, se retiró el medio de cultivo y se añadió un volumen de 100 μL de la solución CCK-8 a cada pocillo de la placa. La mezcla se incubó a 37 °C/5 % de CO2 durante 2 a 4 horas. La sal de tetrazolio estable se escinde a un colorante de formazán soluble mediante un mecanismo celular complejo. Esta biorducción depende en gran medida de la producción glucolítica de NAD(P)H en células viables. Por lo tanto, la cantidad de colorante de formazán formado directamente se correlaciona con el número de células metabólicamente activas en el cultivo. La cantidad de colorante de formazán se evalúa midiendo una densidad óptica (DO) a 450 nm usando un lector de placas de espectrofotómetro. La viabilidad celular relativa (%) se expresó como un porcentaje relativo a las células de control no tratadas. Se determinó de la siguiente manera:
Figure imgf000021_0001
(DO - blanco)no tratadas: media de (DO - blanco) del control negativo (células no tratadas).
Las células no pulverizadas con un material cerámico se usaron como control negativo (células no tratadas). Las células tratadas con una solución de Triton 1 % se usaron como control positivo.
Análisis histológico
Se tomaron biopsias de estructuras formadas en medio MD a las 4 semanas y 8 semanas después de la adición de partículas cerámicas.
Estructura/Celularidad/Presencia de matriz extracelular
La estructura del tejido, la celularidad y la presencia de matriz extracelular se evaluaron después de la tinción con hematoxilina-eosina y tricrómica de Masson.
Osteodiferenciación y mineralización
La osteodiferenciación y la mineralización de los tejidos se evaluaron en osteocalcina y micro-CT respectivamente. Las reacciones se llevaron a cabo usando un Skyscan 1172G (Bruker) (Erwan Pougonven, ULg, Liege). Las reconstrucciones se realizaron en NRecon, v. 1.6.10.1, el software Bruker microCT. Después de los ajustes, se reconstruyeron imágenes 3D alrededor de 1700 x 1700 x 700 vóxeles (píxeles 3D). Con la resolución indicada anteriormente, el volumen de un vóxel es de 985 μm3. Las mediciones de volumen y espesor promedio de las áreas atenuantes se informaron en % del volumen total. Las áreas atenuantes se asimigaron a las áreas mineralizadas. Contenido de factores de crecimiento
Para evaluar la bioactividad del tejido formado, se tomaron biopsias a las 4 y 8 semanas después de la adición de partículas cerámicas para la extracción y cuantificación de proteínas. El contenido total de proteínas y factores de crecimiento se cuantificó mediante colorimetría (Kit de ensayo de proteínas BCA, ThermoFisher Scientific) y ELISA para BMP2, BMP7, VEGF, SDF1a, IGF1 (kits ELISA de cuantiquina humana, RD Systems), según las instrucciones de los proveedores. Actividad osteoclástica
Los sobrenadantes de las ASC en cultivo 2D (en medio MD o medio MP) y de las ASC en cultivo multidimensional inducido por la adición de HA/βTCP durante aproximadamente 8 semanas, se cosecharon después de 72 horas de cultivo en condiciones libres de hPL y se almacenaron directamente a -20 0C para una cuantificación adicional. También se extrajeron proteínas de partículas cerámicas solas para cuantificar los niveles de OPG y RANKL.
Se cuantificaron OPG y RANKL usando kits ELISA (Kit ELISA de TNFSF11/RANKL/TRANCE humana; Kit ELISA de osteoprotegerina humana; LS Bio), de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
Resultados
Citotoxicidad
A baja concentración (10 mg/cm2), el contacto indirecto de las hASC con partículas de HA/β-TCP mejoró la viabilidad celular (111,1 % de la viabilidad de las células, en comparación con las células solas). En contraste, concentraciones de 19 y 39,4 mg/cm2 disminuyó la viabilidad celular del 10 y del 52,3 %, respectivamente (Figura 1).
Análisis histológico
No se encontró ninguna diferencia significativa entre las estructuras después de 4 semanas u 8 semanas de incubación con partículas biocompatibles.
Estructura/Celularidad/Presencia de matriz extracelular
Algunos días después de la adición del material cerámico, las células osteogénicas y las partículas de material cerámico dispersado se introducen progresivamente en la matriz extracelular mineralizante.
Posteriormente, las células osteogénicas y las partículas de material cerámico comienzan a formar un gran parche tridimensional (o pocos parches más pequeños) de masilla moldeable de color amarillo parduzco parcialmente mineralizada que se separa de cada recipiente de cultivo. Después de aproximadamente 15 días, el biomaterial multidimensional se ha desarrollado y puede separarse de los matraces.
El cocultivo de las hASC y cualquiera de las diferentes partículas (HA/β-TCP, HA y p-TCP) en medio de diferenciación osteogénica mostró la formación de una estructura multidimensional. Esta estructura era prensil con fórceps y resistió a los troncos mecánicos (Figura 2). La Figura 3 muestra una vista microscópica del biomaterial formado con HA/β-TCP. Una celularidad de 262 ±205 células/mm2 se encontró para el biomaterial formado con HA/β-TCP (n=7).
El análisis histológico mediante tinción con hematoxilina-eosina y tricrómica de Masson reveló la presencia de tejido interconectado entre células y partículas y que las partículas se integran en el tejido interconectivo celularizado (Figura 4A-B).
Osteodiferenciación / Mineralización
La tinción de osteocalcina fue positiva en la matriz extracelular (figura 4C), mostrando una diferenciación adecuada de las ASC en células osteogénicas.
El análisis de Micro-CT reveló un grado de mineralización del 1,9 % para el biomaterial formado con HA/β-TCP (Figura 5). Contenido de factores de crecimiento
No se encontró ninguna diferencia significativa entre las estructuras después de 4 semanas u 8 semanas de incubación con partículas biocompatibles.
Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 1 y en la Figura 6.
Tabla 1: Contenido de factores de crecimiento (en ng/g de biomaterial) de los biomateriales de la invención
Figure imgf000022_0001
Todos los biomateriales formados con partículas cerámicas de la invención comprenden VEGF, IGF1 y SDF-1a. El contenido en SDF-1a es inferior a los de VEGF e IGF1. No se detectaron BMP2 o BMP7 en todos los tejidos. Actividad osteoclástica
Se cuantificó la secreción de OPG/RANKL en el sobrenadante de las hASC en medio MP/MD, biomateriales formados con HA/β-TCP, biomateriales formados con HA y biomateriales formados con p-TCP.
No se detectó RANKL. No se encontró OPG en el sobrenadante de células en medio MP o MD.
Por el contrario, los biomateriales formados con HA/β-TCP secretan aproximadamente 3010 μg/106 células (Figura 7). En términos de concentraciones por gramo de tejido, biomateriales formados con HA/β-TCP aproximadamente 30 ng/g, biomateriales formados con HA aproximadamente 76 ng/g y biomateriales formados con p-TCP aproximadamente 84 ng/g (Figura 8).
La secreción de OPG por HA/β-TCP solo se evaluó y se encontró en niveles casi indetectables (figura 8).
Ejemplo 3: Potencial osteogénico y angiogénico
Materiales y métodos
Se extrajo ARN total de ASC en medio de proliferación (MP) (n=4, de 4 donantes diferentes de tejido adiposo humano), ASC en medio de diferenciación (MD, células cultivadas en un medio osteogénico clásico sin partículas) (n=4, de 4 donantes diferentes de tejido adiposo humano) y biomaterial formado con 1. 5 cm3 de HA/β-TCP (n=4, de 4 donantes diferentes de tejido adiposo humano) utilizando el reactivo de lisis Qiazol (Qiagen, Hilden, Alemania) y un homogeneizador Precellys (Bertin instruments, Montigny-le-Bretonneux, Francia). Los ARN se purificaron usando el mini kit Rneasy (Qiagen, Hilden, Alemania) con una digestión adicional en columna de ADNasa según las instrucciones del fabricante. La calidad y la cantidad del ARN se determinaron con un espectrofotómetro (Spectramax 190, Molecular Devices, California, EE.UU.). Se sintetizó ADNc a partir de 0,5 μg de ARN total con el kit RT2 RNA first strand (Qiagen, Hilden, Alemania) para obtener perfiles de expresión de genes osteogénicos y angiogénicos mediante matrices de PCR disponibles en el mercado (Human RT2 Profiler Assay - Angiogenesis; Human RT2 Profiler Assay - Osteogenesis, Qiagen). Se usaron el sistema ABI Quantestudio 5 (Applied Biosystems) y SYBR Green ROX Mastermezcla (Qiagen, Hilden, Alemania) para la detección del producto de amplificación. La cuantificación se obtuvo según el método AACT. El resultado final de cada muestra se normalizó a los medios de nivel de expresión de tres genes de mantenimiento (ACTB, B2M y GAPDH).
La expresión de genes osteogénicos y angiogénicos a nivel de ARNm se realizó usando RT-PCR en tiempo real (matriz Profiler RT2 humana, Qiagen).
Resultados
Entre los 84 genes osteogénicos ensayados, 11 genes implicados en el desarrollo esquelético (ACVR1, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, CSF1, EGFR, FGFR1, IGFR1, RUNX2, TGFBR1, TWIST1), 3 factores de transcripción (SMAD2, SMAD4, SMAD), 2 factores de crecimiento (VEGFA, VEGFB) y 3 moléculas de adhesión celular (ITGA1, ITGB1, ICAM1) se encontraron modulados en el biomaterial de la invención en comparación con ASC en MP o ASC en MD (figura 9).
El factor de transcripción 2 relacionado con la derivación (Runx2), un factor de transcripción específico de osteogénesis esencial que promueve la expresión de genes relacionados con osteogénesis, regula la progresión del ciclo celular, mejora el microambiente óseo y afecta las funciones de los condrocitos y osteoclastos (Bruderer Met al, Eur Cell Mater, 2014; Xu J y col, Am J Trans Res, 2015), fue significativamente mayor expresado en el biomaterial de la invención en comparación con las ASC en MP o MD (figura 9C).
Proteína relacionada con TWIST 1 (TWIST1), expresada en el mesénquima esquelético y juega papeles clave en el control de la asignación de linaje celular mesenquimatoso durante el desarrollo esquelético (Johnson D y col. Mech Dev. 2000; Rice DP, y col. Mech Dev. 2000), también se expresó significativamente más en el biomaterial de la invención en comparación con las ASC en MD (p = 0,09) (figura 9D).
Una vía importante de la osteogénesis es la vía de Factor de crecimiento transformante beta/proteína morfogenética ósea (TGF-b/BMP). TGF-b (a través de la activación de TGFBR1) activa las proteínas de señalización intracelular tales como SMAD. Estos factores modulan la transcripción de los genes regulados por TGF-beta y activan así la transcripción génica osteogénica, promoviendo la diferenciación osteoblástica (Song B, Cytokine Growth Factor Rev. Author, 2010). Curiosamente, se encontró una mayor expresión de ARNm de TGFBR1 y SMAD2/5 en el biomaterial de la invención en comparación con las ASC en MD (figura 9E-H).
Entre los 84 genes angiogénicos ensayados para las ASC en MP, MD y biomaterial de la invención, se habían modulado 6 genes con factores de crecimiento (ANG, EFNA1, EFNB2, VEGFA, FGF1, TGFB1), 2 moléculas de MEC (LEP, TIMP1) y 2 moléculas de adhesión celular (ENG, t Hb S1) (Figura 10).
Se encontró una expresión significativamente mayor de ARNm de angiopoyetina (ANG) en el biomaterial de la invención en comparación con las ASC en MP (figura 10A). La señalización de angiopoyetina promueve la angiogénesis, el proceso mediante el cual se forman nuevas arterias y venas a partir de vasos sanguíneos preexistentes (Fagiani E y otros, Cancer Lett, 2013).
Además, el ARNm de Efrina A1 (EFNA), que regula la angiogénesis en desarrollo embrionario y en los tejidos adultos (Pasquale et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2005, 6(6):462-475), se encontró que estaba altamente expresado en el biomaterial de la invención en comparación con las ASC en MP y MD (figuras 10B y 10C).
La expresión del ARNm del factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGFA) también mejoró significativamente para las ASC en el biomaterial de la invención en comparación con las ASC en MP o MD (figura 10D). VEGF es uno de los factores de crecimiento más importantes para la regulación del desarrollo vascular y la angiogénesis. Dado que el hueso es un órgano altamente vascularizado (con la angiogénesis como un regulador importante en la osteogénesis), el VEGF también afecta positivamente al desarrollo esquelético y la reparación ósea posnatal (Hu K et al, Hueso 2016).
La expresión del ARNm del factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF1), (un potente factor proangiogénico, Murakami M y otros, Curr Opin Hematol 2009) y el ARNm de Leptina (LEP) (un importante potenciador de la angiogénesis e inductor de la expresión de VEGF; Boulumie A y col., Circ. Res. 1998; Sierra-Honigmann MR y col., Science [Nueva York, NY] 1998) también se sobreexpresó en el biomaterial de la invención en comparación con las ASC en MP (figuras 10e y 10F respectivamente).
En conclusión, el biomaterial de la invención puede definirse como osteogénico por la presencia de células (en la estructura 3D) que expresan, a los niveles moleculares, la capacidad de osteodiferenciación y también la capacidad de promover la angiogénesis para el injerto celular después del trasplante.
Ejemplo 4: Promoción de la vascularización y la osteogénesis en un entorno fibrótico después del trasplante
4.1. In vitro
Uno de los elementos más comunes de lesión tisular es la presencia de hipoxia. El daño intersticial a menudo se asocia con la activación de la cascada de la coagulación, lo que da como resultado áreas de hipoxia. En este contexto, evaluamos la capacidad del biomaterial de la invención para secretar el VEGF, un factor de crecimiento clave para la vascularización después del trasplante (Madrigal M y otros, J Transl Med. 11 de octubre de 2014;12:260). Se sabe que la reducción en la tensión de oxígeno en una variedad de tejidos conduce A la activación del factor inducible por hipoxia (HIF-1a), que induce la transcripción de genes angiogénicos tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Ahluwalia A et al., Curr Med Chem. 2012;19(1):90-97; Hawkins KE y col., Regen Med. 2013;8(6):771-782), así como también el factor 1 derivado de células estromales quimioatrayente de MSC (SDF-1a) (Youn SW y col, Blood. 2011;117:4376-4386. Ceradini DJ y col., Nat Med. 2004;10(8):858-864).
Materiales y métodos
Para evaluar el impacto de la baja concentración de oxígeno en las propiedades proangiogénicas del biomaterial, el biomaterial formado con ASC de 3 donantes y 1,5 cm3 de HA/β-TCP se lavó dos veces con PBS y se incubó por duplicado en placas de 6 pocillos en 10 mL de medio de diferenciación osteogénica (MD) sin hPL (para evitar factores de crecimiento exógenos en el medio). Las placas se colocaron en hipoxia (1 % de O2) o normoxia (21 % de O2), 5 % de CO2, 37 0C, durante 72 horas. A continuación, se recogieron los sobrenadantes para la cuantificación de VEGF y SDF-1a mediante ELISA.
Además, ASCs confluentes en pasaje 4 de 3 donantes por duplicado en placas de 6 pocillos se lavaron dos veces con PBS y se colocaron en 5 o 10 mL de medio de proliferación (MP) o medio de diferenciación osteogénica (MD) sin hPL en hipoxia (1 % O2) o normoxia (21 % O2), 5 % CO2, 37 0C, durante 72 horas. A continuación, los sobrenadantes se cosecharon para la cuantificación de VEGF así como SDF-1a mediante ELISA.
Resultados
Mientras que la secreción de VEGF por las células en 2D (MP y MD) aumentó a baja tensión de oxígeno (242 ± 51 frente a 29 ± 27 μg/105 células en MP y 565 ± 507 frente a 182 ± 216 μg/105 células en MD al 1 frente al 21 % de O2, respectivamente (p<0,05)), no se encontró ningún impacto de la hipoxia en la secreción de VEGF para el biomaterial de la invención (760 ± 594 frente a 806 ± 530 μg/105 células al 1 frente al 21 % de O2, respectivamente) (Figura 11A). Por lo tanto, la baja tensión de oxígeno no es un factor limitante para el uso del biomaterial de la invención.
Además, se encontró una mayor secreción de VEGF en el biomaterial de la invención en comparación con las ASC en MP y MD tanto en el 1 como en el 21 % de O2 condiciones (Figura 11A).
Si bien se observó una estimulación de la secreción de SDF-1a para las ASC en MD después de la exposición hipóxica (p = 0,009), el biomaterial de la invención liberó una cantidad significativamente mayor de SDF-1a en comparación con las ASC en MP y MD a 21 % de O2 (p = 0,013 y 0,025, respectivamente) (Figura 11B).
Además, se demostró una menor secreción para las ASC MD en comparación con las ASC MP y el biomaterial de la invención al 1 % de O2 (p = 0,009 y 0,013, respectivamente) (Figura 11B).
La exposición del biomaterial de la invención a una tensión de oxígeno baja (al 1 % de oxígeno como se encuentra en un tejido fibrótico) reveló la capacidad de las ASC para secretar los efectores clave de la vasculogénesis. Estas secreciones fueron mejores (tanto en hipo- como normoxia) para las ASC en 3 dimensiones con matriz extracelular, es decir, en el biomaterial de la invención, en comparación con las ASC en medios de proliferación/osteogénica cultivados en 2 dimensiones.
4.2. In vivo
En vista de determinar la bioactividad del biomaterial de la invención en la condición hipóxica, se realizó un modelo preclínico de necrosis muscular. El modelo heterotópico, ilustrado por Schubert y col. (Biomaterials, 2011 ;32(34):8880-91), es un modelo estándar de oro para investigar la bioactividad de biomateriales y consiste en la implantación de un elemento de prueba (biomateriales) en el área lumbar, en un bolsillo constituido por el músculo paravertebral cauterizado.
Materiales y métodos
Se realizaron dos experimentos en ratas atímicas para permitir la implantación del biomaterial de la invención (origen humano) evitando cualquier rechazo de injerto.
El primer experimento se diseñó para evaluar el papel del biomaterial de la invención sobre la remodelación del tejido a los 1 mes después de la implantación. El segundo experimento se diseñó para evaluar a nivel molecular la remodelación del tejido (en el día 29 después de la implantación).
En ambos experimentos, el biomaterial se implantó bilateralmente en 10 ratas atímicas. El volumen implantado fue de aproximadamente 0,3 cm3 (correspondiente a 500 mg o 4,7*106 células) del biomaterial.
En el primer experimento, el día 28 después de la implantación, la angiogénesis se cuantificó mediante histomorfometría después de la inmunotinción para von Willebrand, y la presencia de células humanas se evaluó mediante inmunohistoquímica para HLA.
En el segundo experimento, el día 29 después de la implantación, se evaluó la presencia de células humanas mediante inmunohistoquímica para HLA y se evaluó la revascularización de los implantes mediante análisis de histomorfometría siguiendo una tinción tricrómica de Masson.
Además, el ARN total se extrajo de explantes usando el reactivo de lisis Qiazol (Qiagen, Hilden, Alemania) y un homogeneizador Precellys (Bertin instruments, Montigny-le-Bretonneux, Francia). Los ARN se purificaron usando el mini kit Rneasy (Qiagen, Hilden, Alemania) con una digestión adicional en columna de ADNasa según las instrucciones del fabricante. La calidad y la cantidad del ARN se determinaron con un espectrofotómetro (Spectramax 190, Molecular Devices, California, EE.UU.). Se sintetizó ADNc a partir de 0,5 μg de ARN total con el kit RT2 RNA first strand (Qiagen, Hilden, Alemania) para obtener perfiles de expresión de genes osteogénicos y angiogénicos mediante matrices de PCR disponibles en el mercado (Human RT2 Profiler Assay - Angiogenesis; Human RT2 Profiler Assay - Osteogenesis, Qiagen). Se usaron el sistema ABI Quantestudio 5 (Applied Biosystems) y SYBR Green ROX Mastermezcla (Qiagen, Hilden, Alemania) para la detección del producto de amplificación. La cuantificación se obtuvo según el método AACT. El resultado final de cada muestra se normalizó a los medios de nivel de expresión de tres genes de mantenimiento (ACTB, B2M y GAPDH).
Se comparó la expresión de genes osteogénicos entre los explantes obtenidos del biomaterial de la invención en el día 29 después de la implantación. A continuación, se analizaron ochenta y cuatro genes osteogénicos para el explante. Resultados
Primer experimento
La presencia de crecimiento vascular interno se confirmó dentro del biomaterial a los 1 mes después de la implantación (Figura 12).
Los resultados del área superficial de los vasos sanguíneos y el número de vasos/mm2 se presentan en la Figura 13. La presencia de células humanas en biomateriales de la invención demostró la capacidad de las ASC humanas en biomateriales de la invención para sobrevivir en un tejido huésped necrótico (seguido de la cauterización del área muscular/sitio de implantación) (figura 14).
Segundo experimento
En el día 29 después de la implantación, se demostró la presencia de células humanas en el biomaterial de la invención (datos no mostrados).
Como se describió anteriormente en el primer experimento de bioactividad, la revascularización de los implantes se confirmó el día 29 después de la implantación (datos no mostrados).
Los experimentos in vivo revelaron la capacidad del biomaterial de la invención para inducir la angiogénesis en el interior del producto.
Ejemplo 5: Tratamiento del defecto óseo
Para estudiar la eficacia del biomaterial de la invención en la formación ósea, se diseñó un defecto óseo de tamaño crítico en un modelo de rata. Este modelo se describe bien en la bibliografía (Saxer et al., Stem Cells 2016-Manasaso y col., Journal of Visualized Experiments 2016).
Materiales y métodos
Se seleccionaron ratas atímicas macho como receptores del biomaterial humano de la invención para evitar cualquier reacción inmunitaria de las células T. Brevemente, un defecto óseo de tamaño crítico en el fémur de las ratas mediante el uso del RataFix System® (RISystem-Suiza) se realizó en 14 ratas atímicas (2 grupos de 7 receptores para partículas de HA/β-TCP solas y biomaterial, respectivamente). Se produjo un defecto de 5 mm y se unieron los dos segmentos del fémur mediante la aplicación de una placa fijada con tornillos.
Tres semanas después de la inducción del defecto óseo, se realizó una radiografía para evaluar la irreversibilidad del defecto óseo y evitar cualquier regeneración ósea espontánea.
Se implantaron receptores de rata desnuda (con persistencia del defecto óseo y sin rotura del material de fijación) con partículas de HA/β-TCP (para un volumen total de 0,344 cm3 correspondiente a 500 mg) o con biomaterial de la invención formado con ASC y 1,5 cm3 de partículas de HA/β-TCP (para un volumen total de 0,313 cm3 correspondiente a 500 mg con 4,7 106 células).
En 1 mes después de la implantación, se realizaron exploraciones por microTC y histología para cada animal en vista para evaluar el nivel de integración del implante y fusión ósea.
Resultados
En 1 mes después de la implantación, el biomaterial de la invención estaba totalmente integrado entre ambos segmentos del fémur para realizar una fusión ósea bicortical (continuidad de las 2 estructuras corticales femorales) (figura 15, izquierda e inferior izquierda) mientras que las partículas de HA/β-TCP solas se ubicaron en el defecto óseo sin ninguna integración (figura 15, superior e inferior derecha). De hecho, no se encontró ningún puente entre los huesos corticales y las partículas de HA/β-TCP sin fusión cortical bilateral (como se indica con el símbolo * en la figura 15, derecha inferior) y el aspecto atrófico de las extremidades del defecto femoral.
Estos resultados fueron confirmados por histología (Figuras 16 y 17). 1 mes después de la implantación de partículas de HA/β-TCP solas, el producto no se integró y se observó una fibrosis importante (Figura 16A, flecha blanca). No se encontró osificación endocondral en el defecto en la interfase entre el hueso nativo y el implante de HA/β-TCP (Figura 16B, flecha negra). 1 mes después de la implantación del biomaterial de la invención, se observó una integración del producto y fusión ósea (Figura 17A, flechas blancas). Se encontró una osificación endocondral directamente en contacto entre el hueso nativo y el biomaterial, lo que revela el proceso de unión ósea (Figura 17B, flecha negra). La tinción con HLA-I revela la presencia de células humanas (Figura 17C).
Estos estudios in vivo demostraron (i) la capacidad del biomaterial de la invención para mejorar la osteogenicidad en ambiente hipóxico y (ii) la capacidad para realizar una fusión ósea en el contexto de un defecto óseo de tamaño crítico. El biomaterial de la invención demostró su superioridad en términos de osteogenicidad y remodelación ósea en comparación con las partículas de HA/β-TCP solas.
Ejemplo 6: Estudio del biomaterial en un modelo de rata con fusión espinal (Estudio CP-2017025-Grupo de biodistribución) Objetivo del estudio
Se llevó a cabo un estudio conforme a las BPL (Estudio CP-2017025) con el doble objetivo de evaluar (i) la toxicidad general del biomaterial en un modelo animal pertinente siguiendo las condiciones pertinentes para el uso clínico previsto del producto de investigación (el denominado “grupo de toxicología CP-2017025” ) y (ii) la biodistribución de las células en investigación y el posible desarrollo consecutivo de tejidos ectópicos (el denominado “grupo de biodistribución CP-2017025” ).
Se seleccionó un modelo de rata inmunodeficiente (atímica) para evitar el rechazo de células humanas como se esperaría con animales inmunocompetentes. Se eligió un modelo de cirugía de fusión espinal como modelo relevante porque se describe bien en la bibliografía (Wang y col., J. Bone and Joint Surg. 2003, 85:905-911) y puede acomodar volúmenes de implantación más grandes que en un defecto óseo femoral (Belill y otros, Comp. Med.
2014, 61 (3):186-192) en entornos tisulares similares. Además, el entorno de implantación creado durante el procedimiento quirúrgico de fusión espinal se ha considerado muy similar cuando se compara con el entorno creado en modelos óseos no de unión, tales como defectos óseos femorales.
Diseño del estudio
Para el propósito del “grupo del estudio de biodistribución” , veinte (20) ratas atímicas homocigotas de 9 semanas de edad (10 machos y 10 hembras; Hsd:RH-Foxn1 rnu/rnu) se asignaron aleatoriamente en los grupos 1 y 2 (5 machos y 5 hembras por grupo) (Tabla 2).
Tabla 2: Diseño del estudio (CP-2017025-grupo de biodistribución)
Figure imgf000027_0001
Los animales del grupo 1 se trataron en D0 con el biomaterial (un lote fabricado de acuerdo con el mismo proceso que para lotes clínicos) siguiendo el procedimiento quirúrgico descrito a continuación. Los animales del grupo 2 no se trataron con el biomaterial pero se sometieron al mismo procedimiento quirúrgico en D0 que los animales del grupo 1.
Según el método quirúrgico descrito por Wang et al., la piel y los músculos se abrieron a lo largo de la 5a o 6a vértebra lumbar. Los músculos dorsales se dividieron y se separaron permitiendo ver las vértebras lumbares. Se creó un defecto óseo redondo en el proceso transversal de la vértebra lumbar L5. El tamaño del defecto óseo se estandarizó mediante el uso de una broca de diámetro constante para controlar el diámetro del defecto a 2,0 mm, 1 mm de profundidad. Los dos lados de la vértebra lumbar estaban defectuosos. Para los animales del grupo 1, el biomaterial (dos piezas de 0,375 cm3 que contenían cada una 0,56x107 células) se injertó a cada lado de la columna vertebral (izquierda y derecha) en el orificio creado y en la zona circundante. A continuación, se suturaron los músculos dorsales y la piel. Basado en el peso corporal de la rata, esta cantidad del biomaterial representa un margen de seguridad relativo de 10 (para una rata de 250 g frente a un paciente de 30 kg) y 23,4 (para una rata de 250 g frente a un paciente de 70 kg).
En D29, se sacrificaron las ratas y se realizó una autopsia. Con el fin de detectar y cuantificar la presencia de las células humanas del biomaterial en tejidos de rata, se extrajo el ADN genómico total del sitio de administración, médula ósea, cerebro, gónadas, corazón, intestinos, riñones, hígado, pulmones, músculo esquelético y bazo, antes de analizarse usando un método qPCR basado en el elemento Alu humano.
Los órganos se recogieron, se pesaron y se mantuvieron a -80 °C hasta la extracción de ADN. Después, los tejidos se homogeneizaron completamente en tampón de extracción mediante el uso de un método mecánico seguido de extracción de ADN. Los experimentos de qPCR se realizaron en 20 μl con 125 ng de ADN genómico de muestra de tejido de rata de prueba o muestra de tejido de rata control. Cada muestra se probó por triplicado. El método qPCR basado en el elemento Alu se validó para un intervalo de cuantificación de 20 fg (límite inferior de cuantificación para todos los órganos) o 70 fg (límite inferior de cuantificación para el músculo esquelético) a 7 ng (límite superior de cuantificación) de ADN humano enriquecido en 125 ng de matriz de ADN tisular específica de rata.
Resultados
El ADN humano no se detectó en o por debajo del límite de cuantificación en muestras de médula ósea, cerebro, gónadas, corazón, intestinos, riñones, hígado, pulmones, músculo esquelético y bazo de animales de los grupos 1 y 2, y de los sitios de administración de animales del grupo 2. Se detectó ADN humano en todos los sitios de administración de animales del grupo 1 y en el corazón de 1 de 10 animales del grupo 1.
Además de todos los sitios de implantación de las ratas tratadas con biomaterial, se detectó ADN humano en el corazón de 1 de las 10 ratas tratadas con biomaterial analizadas para fines de biodistribución. Incluso no explicado, este resultado puede deberse a una contaminación durante el muestreo, ya que se observó solo en un animal de 10 analizado, y dado que la cantidad de ADN detectado fue baja (número estimado de células humanas en el corazón correspondiente a 166 células). Además, el análisis histopatológico realizado 29 días después de la implantación en corazones de las 10 ratas tratadas con biomaterial no evidenció observaciones histopatológicas que sugieran la formación de tejido ectópico.
Ejemplo 7: Estudio del biomaterial en un modelo de rata de fusión de columna vertebral (CP-2017025-grupo de toxicología)
La toxicología no clínica para el desarrollo del biomaterial se abordó a través de los siguientes 3 estudios en animales que incluyen 2 estudios compatibles con GLP:
- Estudio de toxicidad de dosis única del biomaterial en un modelo de rata de fusión espinal (Estudio GLP CP-2017025-Grupo de toxicología);
- Estudio de tumorigenicidad del biomaterial en ratones NSG (Estudio GLP CP-2017026); y
- Estudio de tolerancia local del biomaterial en ratones NSG con una investigación del potencial de formación de tumores (CP-2017073).
Contexto y objetivos
Se llevó a cabo un estudio conforme a las BPL (Estudio CP-2017025) con el doble objetivo de evaluar (i) la toxicidad general del biomaterial en un modelo animal pertinente siguiendo las condiciones pertinentes para el uso clínico previsto del producto de investigación (el denominado “grupo de toxicología CP-2017025” ) y (ii) la biodistribución de las células en investigación y el posible desarrollo consecutivo de tejidos ectópicos (el denominado “grupo de biodistribución CP-2017025” ).
El objetivo del “grupo de estudio de toxicología” fue identificar, caracterizar y cuantificar posibles toxicidades, su inicio (agudo o retardado) y la posibilidad de resolución de cualquier toxicidad observada.
Se seleccionó un modelo de rata inmunodeficiente (atímica) para evitar el rechazo de células humanas como se esperaría con animales inmunocompetentes. Se eligió un modelo de cirugía de fusión espinal como modelo relevante porque se describe bien en la bibliografía (Wang et al. 2003) y puede acomodar volúmenes de implantación más grandes que en un defecto óseo femoral (Belill y col. 2014) en entornos tisulares similares. Además, el entorno de implantación creado durante el procedimiento quirúrgico de fusión espinal se ha considerado muy similar cuando se compara con el entorno creado en modelos óseos no de unión, tales como defectos óseos femorales.
Diseño del estudio
Para el fin del “grupo de estudio de toxicidad” , cuarenta (40) ratas atímicas homocigotas sanas de 9 semanas de edad (20 machos y 20 mujeres; Hsd:RH-Foxn1 rnu/rnu) se asignaron aleatoriamente en los grupos 1 y 2 (10 machos y 10 hembras por grupo) (Tabla 3).
Tabla 3: Diseño del estudio (CP-2017025-brazo de toxicología)
Figure imgf000028_0001
Los animales del grupo 1 se trataron en D0 con el biomaterial (un lote fabricado de acuerdo con el mismo proceso que para lotes clínicos) siguiendo el procedimiento quirúrgico descrito a continuación. Los animales del grupo 2 no fueron tratados con el biomaterial pero fueron sometidos en D0 al mismo procedimiento quirúrgico que los animales del grupo 1.
Según el método quirúrgico descrito por Wang et al., la piel y los músculos se abrieron a lo largo de la 5a o 6a vértebra lumbar. Los músculos dorsales se dividieron y se separaron permitiendo ver las vértebras lumbares. Se creó un defecto óseo redondo en el proceso transversal de la vértebra lumbar L5. El tamaño del defecto óseo se estandarizó mediante el uso de una broca de diámetro constante para controlar el diámetro del defecto a 2,0 mm, 1 mm de profundidad. Los dos lados de la vértebra lumbar estaban defectuosos. Para los animales del grupo 1, el biomaterial (dos piezas de 0,375 cm3 que contenían cada una 0,56x107 células) se injertó a cada lado de la columna vertebral (izquierda y derecha) en el orificio creado y en la zona circundante. A continuación, se suturaron los músculos dorsales y la piel. Basado en el peso corporal de la rata, esta cantidad del biomaterial representa un margen de seguridad relativo de 10 (para una rata de 250 g frente a un paciente de 30 kg) y 23,4 (para una rata de 250 g frente a un paciente de 70 kg).
Las ratas se observaron después de la cirugía para la recuperación posterior a la anestesia, luego los animales se monitorizaron cada día hasta que D29 para la cicatrización, movilidad, morbilidad, mortalidad y signos evidentes de toxicidad.
El peso corporal se midió con fines de aleatorización, y en D0, luego al menos dos veces por semana. Se evaluó la evolución del peso y se comparó entre los animales de los grupos 1 y 2.
En D3 y D29, se recogió sangre de ratas en ayunas del grupo 1 y 2 para medir los parámetros hematológicos, de coagulación y bioquímica. En D29, se sacrificaron las ratas y se realizó una autopsia.
Para fines de toxicidad, se observaron y recogieron macroscópicamente órganos de 5 animales por sexo por grupo. Se pesaron bazos, hígado, riñones y corazón. Todos los órganos recolectados se conservaron a temperatura ambiente en formalina al 4 %, se incrustaron en parafina y se generaron portaobjetos (3 portaobjetos por organo; 20 animales) y se analizaron microscópicamente.
Resultados
No se informó ninguna observación relevante durante el período de monitorización. En términos de pesos corporales, no se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa en el peso corporal entre los animales de los grupos 1 y 2. A partir de los análisis realizados en muestras de sangre tomadas los días 3 y 29, no se informó ninguna diferencia relevante entre los animales de los grupos 1 y 2 para los parámetros hematológicos, bioquímicos y de coagulación. Macroscópicamente, nada relevante se informó de las autopsias realizadas. Microscópicamente, el granuloma de cuerpo extraño, probablemente debido a la implantación del biomaterial, se observó en el sitio de implantación de todos los animales del grupo 1. No hubo otros cambios sistémicos histopatológicos que podrían atribuirse a la implantación del biomaterial.
En conclusión, no se evidenció ninguna toxicidad después de la implantación del biomaterial mediante el uso de un modelo relevante en ratas atímicas.
Ejemplo 8: Evaluación del riesgo de transformación celular
La evidencia sustancial está disponible en seres humanos para respaldar el origen mesenquimatoso de un espectro de sarcomas, lo que incluye osteosarcomas. Sin embargo, no se ha demostrado que las MSC experimenten transformación espontánea in vitro a pesar de que se desarrollan anomalías cromosómicas en cultivos a largo plazo (Aguilar y col., Stem Cells. 2007, 25(6):1586-1594; Bernardo y col., Cancer Res. 2007, 67(19):9142-9149; Xiao y col., Clin. Sarcoma Res.
2013, 3(1 ):10). Estas anomalías se han descrito y sugerido como una adaptación natural a la in vitro las condiciones de cultivo no vinculadas a un mayor riesgo de transformación (Tarte y otros, Blood. 2010, 115(8):1549-1553).
Se evaluó el potencial de transformación celular espontánea de las ASC in vitro estudiando la estabilidad citogenética de la sustancia farmacológica del biomaterial mediante cariotipo molecular (método aCGH/SNP) durante la fabricación de más de 3 lotes de desarrollo del biomaterial producido con el proceso propuesto para los lotes clínicos. La hibridación genómica comparativa de matriz (aCGH) en combinación con polimorfismo de nucleótido único (SNP) de alta densidad es como método de genotipado molecular bien establecido para proporcionar un medio alternativo de cribado de todo el genoma para alteraciones en el número de copias y la detección de anomalías cromosómicas clínicamente relevantes y trastornos sin la limitación de requerir el aislamiento previo de células mitóticas (Cooper y col., Nat. Genetics. 2011,43(9):838-846; Slavotink. A.M., Hum. Genetics. 2008, 124(1): 1-17).
Los resultados indican que durante el proceso de fabricación y al nivel de pasaje correspondiente al ensayo de liberación de la sustancia farmacológica del biomaterial, las hASC parecen citogenéticamente estables.
Estudio de tumorigenicidad in vivo GLP del biomaterial en ratones NSG (estudio CP-2017026)
Contexto y objetivos
En el caso de la administración de la terapia celular derivada de MSC, no se ha observado la formación de tumores en pacientes humanos hasta la fecha, aunque los resultados obtenidos no confirman ni excluyen el riesgo de tumorigenicidad en los pacientes (Barkholt y col., Cytotherapy. 2013, 15(7):753-759).
El objetivo del estudio CP-2017026 era evaluar el riesgo de transformación celular de las CMM derivadas de tejido adiposo humano contenidas en el biomaterial con respecto a su potencial de tumorigenicidad durante un periodo de hasta 6 meses tras su implantación en ratones inmunodeficientes NSG (NOD scid gamma). La línea celular HT-29, seleccionada por su tumorigenicidad validada, se usó como control positivo.
Diseño del estudio
En este estudio se incluyeron treinta (30) ratones hembra NSG sanos, de 7 semanas de edad. Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en 2 grupos (20 ratones en el grupo 1 y 10 ratones en el grupo 2). A los animales del grupo 1 se les implantó el biomaterial (1 g [± 1 cm3] que contenía 1,5x107 células) en el espacio subcutáneo a través de una incisión (el mismo lote utilizado en el estudio CP-2017025, que se fabricó siguiendo el mismo proceso que para los lotes clínicos). Los animales del grupo 2 fueron inoculados mediante inyección subcutánea con células HT-29 (107 células/ratón en 200 μl de NaCl 0,9 %).
La viabilidad, el comportamiento y el peso corporal de los ratones se registraron dos veces por semana hasta el final del experimento. Cada animal se observó y palpó dos veces por semana para nódulos recién formados en el sitio de administración. Se midió cualquier nódulo recién formado. Los ratones del grupo 1 (tratados con el biomaterial) fueron observados hasta los 6 meses, mientras que los ratones del grupo 2 (tratados con células HT-29) fueron controlados hasta que el volumen del tumor alcanzó los 1000 mm3 o hasta que se observó necrosis.
Durante la autopsia, se realizaron observaciones macroscópicas para cada animal. Para los animales del grupo 1 (elemento de prueba), se prepararon portaobjetos para el examen histopatológico para el sitio de implantación, hígado, bazo, pulmones, corazón, riñón, cerebro, ganglios linfáticos inguinales (donde visibles).
Resultados
Los 10 ratones del grupo 2 (HT-29, control positivo) han mostrado tumores de crecimiento progresivo con un volumen tumoral medio (MTV) en D27 (día del primer sacrificio) de 611,6 ± 335,4 mm3. Se sacrificó un ratón debido a la necrosis del tumor y los 9 ratones se sacrificaron para el TV>1.000 mm3. La observación macroscópica de los órganos realizados durante la autopsia de los ratones del grupo 2 no reveló anomalías.
Un ratón del grupo 1 perdió el elemento de prueba entre D0 y D1 debido a la apertura de la sutura en el sitio de administración. Para los animales del grupo 1, el volumen medio del sitio de implantación después de la implantación (D2) fue de 1194,6 ±392,7 mm3 (N = 19). Después de la implantación, algunos ratones presentaron heridas graves que no cicatrizan al nivel del sitio de administración.
Como consecuencia, 10 de los 20 ratones del grupo 1 se sacrificaron por razones éticas entre D3 y D27 debido a estas graves heridas cutáneas en el sitio de administración. Entre los 10 ratones sacrificados del grupo 1, 5 ratones presentaron piel seca y amarilla en el sitio de implantación y se observó necrosis en el sitio de implantación en 2 ratones. El examen histopatológico reveló inflamación en el sitio de implantación y la masa a veces estaba necrótica. Se observó inflamación y/o ulceración en la piel suprayacente y el tejido muscular circundante.
El volumen medio del sitio de implantación fue 1032,5 ± 245,3 (n=9) mm 3 al final del estudio (D180) para animales del grupo 1 que muestra una ausencia de aumento del volumen en comparación con el volumen medio de sitio de implantación en D2.
La observación macroscópica de los órganos realizados durante la autopsia de los ratones del grupo 1 no reveló anomalías. Para los ratones del grupo 1 sacrificados al final del estudio (D180), las observaciones microscópicas revelaron una masa multilular en el sitio de implantación sin necrosis y generalmente no se acompañaron por inflamación cercana a los tejidos. No se observaron tumores en ninguno de los ratones del grupo 1 durante el examen histopatológico de los sitios de implantación y los otros órganos analizados.
El estudio es válido ya que al menos 9 de los 10 animales del grupo 2 (células HT-29 tratadas) han mostrado tumores de crecimiento progresivo. No se observaron tumores en ninguno de los ratones del grupo 1 (NSG hembras) después de una sola implantación subcutánea del elemento de prueba (1 g del biomaterial) que contenía aproximadamente 1,5 x 107 células.
El informe histopatológico indicaba que, en las condiciones de este experimento, “ la implantación subcutánea de aproximadamente 1 g de [el biomaterial] en ratones NSG no indujo ninguna proliferación celular durante un periodo de observación de 6 meses. En el sitio de implantación, estaba presente una masa multilocular directamente relacionada con el elemento de prueba. En algunos ratones, condujo a un sacrificio prematuro debido a la ulceración de la piel con reacción inflamatoria local. Se consideró que esto estaba relacionado con el traumatismo mecánico causado por la implantación subcutánea de un gran volumen de un material duro” .
Estudio de tolerancia local in vivo del biomaterial en ratones NSG con una investigación del potencial de formación de tumores (estudio CP-2017073).
Contexto y objetivos
Durante el estudio de tumorigenicidad de GLP CP-2017026, se observó una mala tolerancia local del implante de biomaterial y se consideró relacionada con el traumatismo mecánico causado por la implantación subcutánea en ratones inmunodeficientes NSG de un gran volumen de un material duro.
El estudio CP-2017073 se inició para seguir investigando la tolerancia local (en un periodo de dos semanas, según el plan original) de 1 g (± 1 cm3) del biomaterial tras su implantación en un único sitio (como se realizó en el estudio c P-2017026) (n=8) o en dos sitios (0,5 g por sitio)(n=8).
Es de destacar que durante el estudio CP-2017073 y en contraste con el estudio CP-2017026, ningún animal implantado con 1 g del biomaterial tuvo que sacrificarse por razones éticas debido a las graves heridas cutáneas en el sitio de administración, incluso si se observaron lesiones (por ejemplo, piel amarilla en el sitio de implantación sin adhesión a nivel muscular). Luego se decidió, con el fin de complementar los datos de tumorigenicidad ya generados en el estudio CP-2017026, para controlar los animales del grupo 1 (n=8) durante un período más largo (hasta 6 meses) que el período de seguimiento de 2 semanas definido originalmente.
Diseño del estudio
Dieciséis (16) ratones hembra inmunodeficientes NSG (NOD scid gamma) sanos, de 7 semanas de edad, se asignaron al azar en 2 grupos (8 ratones por grupo). A los animales del grupo 1 se les implantó el biomaterial (1 g que contenía 1,5x107 células) a través de una incisión en el espacio subcutáneo del flanco derecho. A los animales del grupo 2 se les implantó el biomaterial (2x 0,5 g conteniendo 0,75x107 células en cada sitio) a través de una incisión en el espacio subcutáneo del flanco derecho e izquierdo. La viabilidad, el comportamiento y el peso corporal de los ratones se registraron dos veces por semana hasta el final del experimento. Cada animal se observó diariamente para detectar signos clínicos y reacciones locales. Los ratones del grupo 1 (tratados con el elemento de prueba en un sitio) se observaron hasta 6 meses. Los ratones del grupo 2 (tratados con el elemento de prueba en dos sitios) se monitorizaron durante un período de 15 días. Se realizó una autopsia macroscópica para cada animal. Para los animales del grupo 1 (elemento de prueba), se prepararon portaobjetos para el examen histopatológico para el sitio de implantación, hígado, bazo, pulmones, corazón, riñón, cerebro, ganglios linfáticos inguinales (donde visibles).
Resultados
El peso corporal de cada ratón aumentó progresivamente desde D0 hasta sacrificar excepto por un ratón del grupo 1 con pérdida de peso corporal de D79 a D85. Ese ratón se encontró muerto en D89.
Para los animales del grupo 1, el volumen medio de los sitios de implantación en D2 fue de 1228,3 ± 195,3 mm3 (n=8). El volumen medio del lugar de implantación disminuyó a 945,5 ± 92,7 mm3 (n=7) al final del estudio (D180), lo que demuestra que, tras la implantación subcutánea del elemento de prueba, no se observó ningún aumento del tamaño de ningún lugar de implantación durante el estudio.
Los parámetros de monitorización (movilidad y marcha, transporte, comportamiento, respiración, ojos, piel (aparte de los sitios de implantación), pelaje, membranas mucosas, excreciones y ninguna parálisis) fueron normales para todos los ratones del grupo 1 (un sitio) y el grupo 2 (dos sitios).
En el sacrificio, las observaciones macroscópicas realizadas en ratones del grupo 1 (un sitio) o grupo 2 (dos sitios) no revelaron órganos anormales. Para los ratones del grupo 1 sacrificados en D180, el análisis histopatológico no evidenció ninguna proliferación celular. Se observó mineralización multilular en el sitio de implantación, pero sin inflamación en la piel suprayacente y el tejido muscular cercano. Se interpreta que este material mineralizado es el elemento de prueba implantado.
En las condiciones de este experimento, se puede concluir que:
• La administración del biomaterial en uno o dos sitios no tuvo un efecto significativo sobre la tolerancia local incluso si se observó piel amarilla en el sitio de implantación en ambos grupos. Con respecto a esa observación, los animales del grupo 1 se recuperaron ya que la última observación de una piel amarilla en el sitio de implantación se observó en D44.
• Una única implantación subcutánea del biomaterial que contenía 1,5x107 células no indujo la formación de tumores en ratones NSG hembra, según se investigó macroscópica y microscópicamente tras un seguimiento de 6 meses.
• El informe histopatológico indicó que la implantación subcutánea de 1 g del biomaterial que contenía 1,5x107 células a ratones NSG no indujo ninguna proliferación celular durante un periodo de 6 meses. En el lugar de implantación se observó la presencia de mineralización multilocular, directamente relacionada con el elemento de prueba.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Biomaterial que tiene una estructura multidimensional que comprende células madre derivadas de tejido adiposo (ASC) osteogénicas diferenciadas, un material cerámico y una matriz extracelular, en donde el biomaterial secreta osteoprotegerina (OPG) y comprende factor de crecimiento similar a la insulina (IGF1) y factor 1 -alfa derivado de células estromales (SDF-1a),
en donde el material cerámico está en forma de partículas,
en donde la multidimensión del biomaterial se debe a la síntesis de matriz extracelular por células madre derivadas de tejido adiposo y
en donde las ASC y las partículas cerámicas dentro del biomaterial de la invención están incrustadas en la matriz extracelular
2. El biomaterial según la reivindicación 1, en donde el biomaterial secreta al menos aproximadamente 5 ng de OPG por g de biomaterial, preferiblemente al menos aproximadamente 10 ng/g.
3. El biomaterial según la reivindicación 1, en donde el biomaterial comprende al menos aproximadamente 50 ng de IGF1 por g de biomaterial, preferiblemente al menos 75 ng.
4. El biomaterial según la reivindicación 1, en donde el biomaterial comprende como máximo aproximadamente 100 ng de SDF-1a por g de biomaterial, preferiblemente como máximo 75 ng.
5. El biomaterial según la reivindicación 1, en donde el material cerámico es partículas de fosfato de calcio.
6. El biomaterial según la reivindicación 1, en donde las partículas de fosfato de calcio tienen un tamaño promedio que varía de aproximadamente 50 μm a aproximadamente 1500 μm.
7. El biomaterial según la reivindicación 1, en donde las partículas de fosfato de calcio son partículas de hidroxiapatita (HA) y/o p-fosfato tricálcico (p-TCP).
8. El biomaterial según la reivindicación 1, en donde las partículas de fosfato de calcio son partículas de HA/β-TCP en una relación que varía de 10/90 a 90/10, preferiblemente de 20/80 a 80/20.
9. El biomaterial según la reivindicación 1, en donde el biomaterial comprende al menos aproximadamente 10 ng de VEGF por g de biomaterial.
10. El biomaterial según la reivindicación 1, en donde el biomaterial es tridimensional.
11. Dispositivo médico que comprende el biomaterial multidimensional según la reivindicación 1.
12. Biomaterial según la reivindicación 1 para su uso para tratar el defecto óseo o cartilaginoso.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4041250A1 (en) 2019-11-29 2022-08-17 Novadip Biosciences Mirna-based pharmaceutical compositions and uses thereof for the prevention and the treatment of tissue disorders
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Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100920951B1 (ko) * 2007-08-01 2009-10-09 한양대학교 산학협력단 미분화 인간 지방조직 유래 줄기세포를 포함하는 골 재생용복합 지지체
WO2009125402A2 (en) * 2008-04-10 2009-10-15 Bonus Therapeutics Ltd Bone-like prosthetic implants
US20100055078A1 (en) * 2008-08-15 2010-03-04 The Government of the U.S.A, as represented by the Department of Veterans Affairs Methods of making a transplantable bone repair system using multipotent stem cells
EP2258413A1 (en) 2009-06-04 2010-12-08 Université Catholique de Louvain Multi-dimensional biomaterial and method for producing the same.
US9707318B2 (en) 2009-10-29 2017-07-18 Shaker A. Mousa Compositions of novel bone patch in bone and vascular regeneration
US8834928B1 (en) * 2011-05-16 2014-09-16 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissugenic implants, and methods of fabricating and using same
US9427491B2 (en) 2011-10-21 2016-08-30 University Of Maryland, Baltimore Bone pastes comprising biofunctionalized calcium phosphate cements with enhanced cell functions for bone repair
US9044530B2 (en) 2012-12-19 2015-06-02 Southwest Research Institute Fabrication of bone regeneration scaffolds and bone filler material using a perfusion flow system
EP3090764A1 (en) * 2015-05-08 2016-11-09 Université Catholique De Louvain Compositions comprising mesenchymal stem cells and uses thereof
US20170021058A1 (en) * 2015-07-24 2017-01-26 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
CN105779383A (zh) * 2016-03-12 2016-07-20 上海盛缘生物技术有限公司 一种脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的制备方法及应用
EP3684433B1 (en) * 2017-09-20 2022-07-06 Novadip Biosciences Biomaterial comprising adipose-derived stem cells and method for producing the same
CN108310467B (zh) * 2018-04-17 2020-10-27 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种组装型细胞衍生细胞外基质膜复合骨修复材料及其制备方法和应用

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