KR100920951B1

KR100920951B1 - 미분화 인간 지방조직 유래 줄기세포를 포함하는 골 재생용복합 지지체

Info

Publication number: KR100920951B1
Application number: KR1020070077291A
Authority: KR
Inventors: 김병수; 이수홍; 전오주
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2007-08-01
Filing date: 2007-08-01
Publication date: 2009-10-09
Also published as: KR20090013302A

Abstract

본 발명은 골 재생용 복합 지지체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생분해성 고분자와 생체적합성 세라믹을 포함하여 성형 제조된 복합 지지체; 및 상기 복합 지지체에 로딩된 미분화 인간 지방조직 유래 줄기세포와 골 형성 단백질-2를 포함하는 골 재생용 복합 지지체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 복합 지지체는 미분화된 지방조직 유래 줄기세포를 사용함으로써, 이를 골 형성세포로 분화시키는 배양과정의 비용문제, 배양기간, 세포독성, 균오염 문제 등을 해결할 수 있다. 또한, 복합 지지체가 체내에서 골 형성 단백질-2를 적절히 방출하여 미분화 지방조직 유래 줄기세포의 분화 및 골 형성을 자극하므로 골 재생을 효과적으로 도모할 수 있다.

골 재생, 인간 지방조직 유래 줄기세포, 골 형성 단백질-2, 하이드록시아파타이트, 복합 지지체

Description

미분화 인간 지방조직 유래 줄기세포를 포함하는 골 재생용 복합 지지체{COMPOSITE SCAFFOLD FOR BONE REGENERATION COMPRISING UNDIFFERENTIATED HUMAN ADIPOSE-DERIVED STEM CELL}

본 발명은 미분화 인간 지방조직 유래 줄기세포를 포함하는 골 재생용 복합 지지체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 복합 지지체가 체내에서 골 형성 단백질-2를 적절히 방출하여 미분화 지방조직 유래 줄기세포의 분화 및 골 형성을 자극하므로, 배양을 통해 골 형성세포로 분화된 지방조직 유래 줄기세포를 사용하지 않아도 골 재생을 효과적으로 도모할 수 있는 골 재생용 복합 지지체에 관한 것이다.

골 조직은 고등 척추동물에서 지지역할을 하는 조직으로 석회화된 견고한 표면인 골과 내부 세포 성분인 골수가 결합된 특수한 분화 형태를 갖는다. 이렇게 상이한 두 구조의 결합은 일생을 두고 지속되는 골의 재형성(remodeling) 과정에 기인한 것이다. 이는 골에 공급되는 호르몬이나 물리적 자극에 의해 골수에 있는 파골세포(osteoclast)가 골의 표면으로 모여 골을 파들어 가면서 파괴하는 '골흡수'와 흡수가 일어난 자리에 모여든 조골세포(osteoblast)에 의한 '골기질의 합성'(bone formation)으로 설명된다.

이러한 골 조직이 손상될 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 되어 정상적인 생활이나 직업적인 활동을 방해하게 된다.

손상된 골 조직의 치료방법으로 자가 골 이식이 일차적으로 많이 사용되고 있다. 그러나 상기 방법은 이식된 부위와 원래 조직 사이에 틈이 남는 문제 등이 있어 완전한 치료 방법이라 하기 어려우며, 그나마 자가이식이 가능한 환자만을 대상으로 시행할 수 있어 보편적인 방법이 될 수 없다. 또한, 정상 골 부위를 희생하므로, 희생 부위에 새로운 통증이 생길 수 있는 등의 취약점이 있으며, 수술 후 통증, 골절, 출혈, 반흔을 비롯하여 재활이 더디게 이루어지는 등의 합병증이 발생할 수 있다. 한편, 타인의 골 이식도 사용되어 왔으나 공급에 제한이 있으며 전염병이 전달될 수 있는 단점이 있다.

최근 생명공학분야의 발달로 줄기세포를 이용하여 조직 및 장기를 재생시켜 그 기능을 복원하기 위한 방법들이 시도되고 있다. 줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.

만능 줄기세포(totipotent stem cells)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8 세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며, 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다.

전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유 래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 이러한 배아 줄기세포는 만능으로 분화할 수 있는 능력이 있지만 목적하는 세포 및 조직으로 완벽히 분화를 제어하지 못한다. 또한, 종양을 유발할 수 있는 위험성, 윤리적 법률적 한계로 인하여 빠른 시간 내에 치료목적으로 사용되기 어려운 문제점이 있다.

다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며, 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라 한다. 이러한 성체 줄기세포는 자가 조직에서 분리하여 체외에서 배양가능하기 때문에 배아 줄기세포의 한계를 극복할 수 있을 뿐만 아니라 자기 자신의 조직에서 분리, 배양, 증폭하여 자기 자신에게 다시 전달하기 때문에 생리적이고 이상적인 방법이다.

자가 혹은 타가 성체 줄기세포를 전달하여 질환을 치료하는 방법 중에서 30년 전부터 현재까지 널리 사용되고 있는 치료법 중 골수세포전달, 즉 조혈모세포전달이 가장 대표적이며, 백혈병, 재생 불량성 빈혈, 고형 암의 방사선과 항암치료 후 저하된 골수기능을 복원하기 위해 일반적으로 널리 사용되고 있다.

이러한 성체 줄기세포는 여러 장기와 조직에서 발견되었고, 특히 골수조직에 서 발견된 중간엽계 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)는 중배엽 기원의 세포와 조직으로 분화하는 능력이 있을 뿐만 아니라 신경세포와 같은 외배엽 기원의 세포와 조직, 그리고 심장 근육세포로도 분화할 수 있는 다능(multipotent) 줄기세포이며, 조혈모세포와는 달리 체외 배양과 증폭이 가능한 장점이 있어 세포치료제로서의 그 가능성이 아주 높다.

이러한 중간엽계 줄기세포는 골세포, 연골세포, 반월판세포, 심장근육세포, 신경세포 등으로 분화할 수 있는 능력과 해당 결손 조직을 재건할 수 있는 능력이 실험적으로 밝혀져 이런 조직과 장기의 기능을 재건하기 위한 세포치료제로 사용되거나 혹은 임상시험을 진행 중에 있다.

중간엽계 줄기세포는 골수에서 자가 골수조직을 취득하여 줄기세포를 분리하고 체외에서 확대 배양하여 사용한다. 이때 치료용으로는 최소 500백만 개 이상의 세포가 요구된다. 그러나, 골수조직 내 중간엽계 줄기세포는 약 10억 분의 1에 해당하는 세포만이 줄기세포로 체외 증폭 배양이 용이하지 않은 단점이 있다. 따라서, 세포치료제 수준까지 이를 배양하려면 최소 100cc 이상의 골수조직이 필요해 다량의 골수조직을 취득해야 하는 위험성을 지니고 있을 뿐만 아니라 체내에 자원이 풍부한 조직이 아니라는 문제점이 있다.

최근 지방 조직이 성체 줄기세포의 새로운 소스임이 밝혀졌다(B.Cousin et al., BBRC., 2003;301:1016, A. Miranville et al., Circulation, 2004;110:349, S. Gronthos et al., J. Cell Physiol., 2001;189:54, M.J.Seo et al.,BBRC., 2005;328:258.). 즉, 지방추출(liposuction)에 의해 얻어진 인간 지방조직에 자가 재생능력이 뛰어나고, 간, 골, 연골, 지방, 혈관, 심장,신경계 등 다능 분화능력을 가지는 성체 줄기세포인 지방줄기세포(adipose-derived stem cells; ASCs)가 발견되었다(P.A.Zuk et al., Tissue Eng., 2001;7:211, A.M Rodriguez et al., BBRC., 2004;315:255.). 이러한 인간 지방조직 유래 줄기세포는 중간엽계 줄기세포와 비교하여 지방 조직이 대량으로 추출할 수 있다는 점에서 취득과정이 용이하고 안전하며, 조직수급상의 제한이 없는 장점과 체외배양이 용이하여 조직 접근성, 안정성, 유효성, 그리고 경제적 측면에서 이점이 있다.

따라서, 이러한 인간 지방조직 유래 줄기세포의 분화능을 이용하여 질병을 치료하는 방법이 활발히 연구되고 있다. 그 일예로 대한민국 특허등록 제10-0679642호는 스피어 형성을 통해 미분화 상태로 장기간 유지가 가능하고, 증식율이 우수한 인간 유방 지방조직 유래 다분화능 성체 줄기세포 및 상기 성체 줄기세포의 분리 및 유지 방법 ,상기 다분화능 성체 줄기세포로부터 신경세포, 지방세포, 연골세포, 골형성세포 및 인슐린 분비 췌장 베타 세포로의 분화방법 및 상기 분화된 세포 또는 성체 줄기세포를 함유하는 세포 치료제에 대해 개시하고 있다. 대한민국 특허공개 제10-2006-0099232호는 지방조직, 지방조직에서 이동하여 성장한 세포, 하이드로겔로 구성된 지방조직 치료제를 기술하고 있다. 그러나 전술한 특허는 지방조직 유래 줄기세포를 추출하여 특정세포로 적절히 분화하여 대량 생산하는 기술에 대해 제시하고 있을 뿐이다.

한편, 지방조직 유래 줄기세포의 골 세포 분화능을 이용하여 손상된 골 조직을 치료하는 방법이 연구되고 있다. 즉, 지방조직 유래 줄기세포를 생체외(in vitro) 덱사메타손, l-아르코르브산, 베타-글리세로포스페아트 등을 첨가한 배지에서 배양을 통해 골세포로 분화한 후 손상된 골 조직에 이식하는 방법이다(Conejero JA et al.,Plast Reconstr Surg 2006;117:857-863., Justesen J et al.,Tissue Eng 2004;10:381-391.). 그러나 이 방법은 이식하려는 골세포를 확보하기 위해 배양에 오랜 시간이 소요되며, 특히 배지에 첨가되는 덱사메타손 등은 세포 독성을 지니고 있으며 분화 유도 과정에서 오염이 발생할 수 있는 문제점이 있다.

본 발명의 목적은 배양과정을 통해 인간 지방조직 유래 줄기세포를 골 형성세포로 분화하지 않더라도, 체내 이식 후 골 형성 단백질-2를 적절히 방출하여 미분화 지방조직 유래 줄기세포의 분화 및 골 형성을 자극하여 골 재생을 효과적으로 도모할 수 있는 골 재생용 복합 지지체를 제공하는 것이다.

본 발명은 생분해성 고분자와 생체적합성 세라믹을 포함하여 성형 제조된 복합 지지체; 및 상기 복합 지지체에 로딩된 미분화 인간 지방조직 유래 줄기세포와 골 형성 단백질-2를 포함하는 골 재생용 복합 지지체를 제공한다.

본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체는 미분화된 지방조직 유래 줄기세포를 사용함으로써 이를 골 형성세포로 분화시키는 배양과정의 비용문제, 배양기간, 세포독성, 균오염 문제 등을 해결한다. 또한 복합 지지체로부터 지속적으로 방출되는 골 형성 단백질-2는 함께 로딩된 미분화 지방조직 유래 줄기세포의 골세포로의 분화를 자극하여 골 조직 재생이 효과적으로 이루어진다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체는, 생분해성 고분자와 생체적합성 세라믹을 포함하여 성형 제조된 복합 지지체에 골 형성세포로 분화되지 않은 미분화 인간 지방조직 유래 줄기세포와 골 형성 단백질-2가 로딩된 것을 특징으로 한다.

상기 생분해성 고분자는 생체 내에서 일정 기간 후 자발적으로 서서히 분해되는 것으로, 혈액친화성, 항(抗)석회화 특성, 세포의 영양성분 및 세포간 기질 형성능 중에서 하나 이상의 특성을 갖춘 고분자를 말한다.

이러한 생분해성 고분자는 본 발명에서 특별히 그 종류를 한정하지는 않으나, 대표적으로 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체, 이들의 혼합물이 가능하다.

이때 복합 지지체 중의 생분해성 고분자의 함량은 5 내지 99 중량%인 것이 바람직하다. 만약 상기 생분해성 고분자의 함량이 상기 범위 미만이면 복합 지지체의 성형이 잘 이루어지지 않는 문제점이 있고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하면 상대적으로 생체적합성 세라믹의 함량이 낮아져 골 형성 단백질-2의 로딩이 어려워지는 문제점이 있다.

상기 생분해성 고분자와 함께 복합 지지체를 구성하는 생체적합성 세라믹은 조직세포의 유착과 증식이 잘 일어나고 분화된 세포의 기능이 보전되며, 체내 이식 후에도 주위 조직과 잘 융화되어 염증 반응을 유발하지 않는 세라믹을 말한다.

이러한 생체적합성 세라믹은 본 발명에서 한정하지 않으며, 이 분야에서 공지된 바의 세라믹이 사용된다. 대표적으로 하이드록시아파타이트, 불소화 아파타이트, 옥시 아파타이트, 인산삼칼슘, 인산일칼슘, 육인산사칼슘, 이들의 혼합물이 가능하다.

이때 복합 지지체 중의 생체적합성 세라믹의 함량은 1 내지 95 중량%인 것이 바람직하다. 만약 상기 생체적합성 세라믹의 함량이 상기 범위 미만이면 생체적합성 세라믹의 골 전도 매체로서의 생리활성 효과가 미미하고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하면 복합 지지체의 성형이 잘 이루어지지 않아서 지지체의 기계적 강도가 약해지게 된다. 그러므로, 골 재생 효과 및 지지체의 강도를 고려하여 상기 범위 내에서 적절히 조절하여 사용한다.

상기 복합 지지체는 기존의 공지된 방법에 따라 생분해성 고분자와 생체적합성 세라믹을 혼합하여 성형 제조된다. 예를 들어, 염 침출법(solvent-casting and particle-leaching technique), 가스발포법(gas forming technique), 고분자 섬유를 부직포로 만들어 고분자 메쉬(mesh)로 제조하는 방법(fiber extrusion and fabric forming process), 상분리법(thermally induced phase separation technique), 유화 동결 건조법(emulsion freeze drying method), 고압 기체 팽창법(high pressure gas expansion) 등이 가능하다.

상기와 같이 성형 제조된 복합 지지체는 로딩된 인간 지방조직 유래 줄기세포와 골 형성 단백질-2를 이식된 조직 내로 전달하고, 3차원적으로 세포가 부착 성장하여 새로운 조직이 형성되도록 하는 역할을 한다.

이때 복합 지지체에 세포가 부착 성장되기 위해서는 지지체의 공극의 크기와 구조가 중요한 요소가 된다. 본 발명의 실시예 1을 참조하면, 본 발명의 복합 지지체는 공극이 서로 연결된(inter-connecting) 구조를 가지고 있어(도 1 참조), 영양액이 지지체 내부까지 고르게 침투하여 세포가 잘 성장될 수 있다. 또한, 평균 공극 직경이 약 160 ㎛로(도 2 참조), 지지체로서 바람직한 공극의 크기인 50 내지 600 ㎛에 속한다.

또한, 상기 복합 지지체는 이식된 조직 내에서 로딩된 골 형성 단백질-2를 장기간 지속적으로 방출하여 전달한다. 이렇게 방출된 골 형성 단백질-2는 함께 로딩된 인간 지방조직 유래 줄기세포의 골 생성 분화(osteogenic differentiation)를 자극한다.

본 발명의 실험예 2를 참조하면, 본 발명의 복합 지지체는 생체외(in vitro)에서 로딩된 골 형성 단백질-2를 28일 이상 지속하여 방출하였다(도 3 참조).

또한, 본 발명의 실험예 3을 참조하면, 골 형성 단백질-2가 로딩된 복합 지지체에서 인간 지방조직 유래 줄기세포를 생체외(in vitro) 배양한 경우, 전체 배양기간 동안 알칼리 포스파타제의 활성이 증가하였고, 알칼리 포스파타제, 오스테오폰틴, 오스테오칼신 mRNA가 모두 발현되었다(도 4, 도 5 및 도 6 참조).

이는 복합 지지체로부터 골 형성 단백질-2가 지속적으로 방출되었고, 방출된 골 형성 단백질-2가 인간 지방조직 유래 줄기세포의 골 생성 분화(osteogenic differentiation)를 자극하였음을 보여준다.

본 발명의 골 재생용 복합 지지체는 전술된 방법에 따라 성형 제조된 복합 지지체에 미분화 인간 지방조직 유래 줄기세포(Adipose-derived stem cells; ADSCs, 이하, 'ADSCs')와 골 형성 단백질-2(Bone Morphogenetic Protein-2; BMP-2, 이하, 'BMP-2')를 로딩하여 제조한다. 이때 복합 지지체의 표면 및 기공 내부에 ADSCs와 BMP-2가 도포되어 부착된 상태로 존재하게 된다. 로딩 방법은 지지체에 세포와 성장인자를 파종하기 위해 사용하는 공지의 방법이 가능하며, 바람직하게는 복합 지지체를 ADSCs, BMP-2 함유 용액에 함침하여 흡수시키거나, 복합 지지체에 ADSCs, BMP-2 함유 용액을 도포한다.

이와 같이 로딩된 BMP-2는 골 발달 과정 전체에 걸쳐 함께 로딩된 ADSCs의 골 생성 분화를 자극한다. 골 발달 단계별로 BMP-2의 ADSC 골 분화 자극을 살펴보면 다음과 같다.

골 발달은 매트릭스 분비, 매트릭스 성숙 및 매트릭스 미네랄화의 3단계로 이루어진다. 이때 각각의 단계는 서로 다른 골 생성 유전자의 발현으로 특징 된다.

첫 번째 매트릭스 분비의 증식 단계는 세포 성장, 성숙과 세포외 기질의 발달로 구성된다. 본 단계에서는 I형 콜라겐(type I collagen; Col I) 발현이 주로 이루어진다. 이때 I형 콜라겐은 골 유도 과정 중 생성되는 최초 세포외 기질(extracellular matrix) 중 하나로, 이후 미네랄화가 일어 세포외 기질의 기초가 된다.

이러한 매트릭스 분비 단계에서 복합 지지체에 로딩된 BMP-2는 ADSCs의 분화를 자극한다. 본 발명의 실험예 4를 참조하면, 본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체 생체내(in vivo) 이식시, I형 콜라겐이 현저히 많이 발현되었고(도 7 및 도 8 참조). 이는 BMP-2가 ADSCs에 의한 세포외 기질 침착의 시작을 자극함을 보여준다.

두 번째 매트릭스 성숙 단계는 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase; ALP), 오스테오폰틴(osteopontin; OPN)과 같은 초기 골 생성 마커에 의해 특징 된다. 이때 오스테오폰틴의 발현은 이중적(bimodally)으로 관찰되는데, 이는 첫 번째 증식 단계 및 세포외 기질의 초기 미네랄화 이후 발현되어, 총 2회에 걸쳐 발현되기 때문이다.

이러한 매트릭스 성숙 단계에서도 복합 지지체에 로딩된 BMP-2는 ADSCs의 분화를 자극한다. 본 발명의 실험예 4를 참조하면, 본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체 생체내(in vivo) 이식시, 오스테오폰틴의 발현이 이중적으로 나타났다(도 7 참조). 이는 BMP-2가 첫 번째 증식 단계 및 미네랄화 이후 단계 두 번에 걸쳐 ADSCs에 의한 골 재생을 자극하였음을 보여준다.

한편, 알칼리 포스파타제는 세포막 효소로서 초기 골 재생시 풍부하게 존재하는 것으로 알려져 있어, 알칼리 포스파타제 발현은 증가된 골 재생과 연관된다. 본 발명의 실험예 4를 참조하면, 이러한 알칼리 포스파타제는 본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체 이식시에만 발현되었다(도 7 참조). 이는 BMP-2가 초기 골 재생시 ADSCs에 의한 골 재생을 자극하였음을 의미한다.

마지막 매트릭스 미네랄화 단계에서는 뼈 시알로단백(bone sialoprotein; BSP), 오스테오칼신(osteocalcin; OCN)과 같은 후기 골 생성 마커가 발현된다. 뼈 시알로단백은 미네랄화되는 세포 타입에서만 생성되는 후기 골 생성 마커로서 콜라겐 매트릭스에 결합하고, 콜라겐 매트릭스를 활발하게 미네랄화하는 세포에서만 분 리된다고 알려져 있다. 따라서 마지막으로 분화되는 조골세포(osteoblast)를 구분하는 중요한 지표로 사용된다. 한편, 오스테오칼신은 조골세포에서만 분비되는 또 하나의 후기 골 생성 마커로서 마지막 조골세포의 분화를 의미한다.

마지막 매트릭스 미네랄화 단계에서도 복합 지지체에 로딩된 BMP-2는 ADSCs의 분화를 자극한다. 본 발명의 실험예 4를 참조하면, 본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체 생체내(in vivo) 이식 시 뼈 시알로단백과 오스테오칼신이 발현되었는데(도 7 참조), 이는 복합 지지체로부터 지속적으로 방출된 BMP-2가 로딩된 ADSCs의 마지막 골 분화 및 세포외 기질의 칼슘화를 자극하였음을 보여준다.

이때 복합 지지체 1㎖에 대하여 BMP-2 1 ㎍ 내지 3 ㎎이 로딩되는 것이 바람직하다. 만약 함량이 상기 범위 미만이면 ADSCs의 골 생성 분화를 자극하는 효과가 미미하며, 이와 반대로 상기 범위를 초과하면 더 이상의 효과 상승이 없어 비경제적이므로, 전술한 바의 범위 내에서 적절히 사용한다.

본 발명의 골 재생용 복합 지지체에는 BMP-2와 함께 ADSCs가 로딩된다. 본 발명은 체외 배양 과정 없이 미분화된 ADSCs를 사용하여 인공배양 및 분화과정에서 발생하는 세포독성, 오염 문제 등을 최소화한다.

이러한 ADSCs는 인간 지방조직에서 유래한 것으로, 환자 자신 또는 표현형이 일치하는 타인으로부터 용이하게 얻을 수 있다. 상기 인간 지방조직은 성숙한 지방세포와 이를 둘러싼 결체조직으로 구성된 것을 말한다. 이때 체내 위치에 상관없이 지방을 채취할 때 사용되는 모든 방법에 의하여 얻어지는 모든 지방조직을 사용할 수 있다. 대표적으로, 피하지방조직, 골수지방조직, 장간막 지방조직, 위장 지방조 직 및 후복막 지방조직 등이 가능하다.

상기 ADSCs는 복합 지지체 1㎖에 대하여 10⁶ 내지 5×10⁷개 로딩되는 것이 바람직하다. 만약 ADSCs의 개수가 상기 범위 미만이면 ADSCs의 골 생성 분화를 자극하는 효과가 미미하며, 이와 반대로 상기 범위를 초과하면 영양분의 부족으로 로딩된 세포가 죽는 문제가 발생한다.

상기 로딩된 ADSCs는 골세포로 분화하여, 본 발명의 골 재생용 복합 지지체가 이식된 조직에 골 조직이 재생되게 된다. 본 발명의 실험예 4를 참조하면, 본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체 생체내(in vivo) 이식 후 골드너-트리크롬(Goldner-Trichrome) 염색시, 분화된 골세포와 조골세포가 관찰되었으며(도 9 및 도 10 참조), 골 형성 면적비도 현저히 높았다(도 11 참조). 이는 복합 지지체에 로딩된 ADSCs가 골세포로 분화하여 골 조직이 재생되었음을 시사한다.

또한, 본 발명의 실험예 5를 참조하면, 본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체에서 많은 양의 칼슘의 양이 침착되었다(도 12 참조). 미네랄화는 골형성과 골분화의 중요한 지표로서, 본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체에 의해 효과적으로 골 조직이 재생되었음을 뜻한다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 폴리 (락트산-co- 글리콜산 ) 및 하이드록시아파타이트 함유 복합 지 지체의 제조

폴리(락트산-co-글리콜산)(이하, 'PLGA') 및 하이드록시아파타이트(이하, 'HA') 함유 복합 지지체를 Kim et al., Biomaterials 2006;27:1399-1409에 언급된 가스 발포법/염 침출법을 수정하여 제조하였다. PLGA 75:25(직경 100~150 μm, 분자량 100,000 Da, Birmingham Polymers, Birmingham, AL), HA 나노입자(직경 100 nm, Berkeley Advanced Biomaterials Inc., Berkeley, CA)와 염화나트륨(직경 100~150 μm, Sigma, St. Louis, MO)을 무게비 0.5:0.5:9의 비율이 되도록 균일하게 혼합하여 주형(직경 1.35 cm, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)에 넣었다. 유압 프레스(Fred S. Carver, Inc., Menominee Falls, WI)를 사용하여 2000 psi, 1분 동안 압착하여 PLGA/HA/NaCl 시편을 제조하였다. 제조된 시편은 고압의 이산화탄소가스(800 psi)에서 48시간 동안 노출시켰다. 시편은 증류수를 사용하여 24시간 동안 염 침출에 의해 시편 내부에 존재하는 염화나트륨을 완전히 제거하였으며, 이때 증류수는 1일 동안 5회 교환하였다. 3 차 증류수 1 L 에 NaCl, NaHCO₃, KCl, K₂HPO₄·3H₂O, MgCl₂·6H₂O, CaCl₂ 및 Na₂SO₄를 첨가하고, 1M HCl 용액과 5 mM tris-(hydroxymethyl)-aminomethane 용액을 이용하여 최종 pH를 6.4로 조절하여 유사체액(SBF)를 제조하였다. 제조된 유사체액(SBF)에 제조된 복합 지지체를 3일 동안 침적 후 증류수로 불순물들을 제거한 다음 진공 하에 48시간 동안 건조하였다.

실시예 2: 인간 지방조직 유래 줄기세포의 분리 및 배양

인간 지방조직은 카톨릭대학교 의과대학 부속병원의 윤리위원회의 허가 아래 동의를 받고 지방흡입술에 의해 얻었다. 오염된 혈액을 제거하기 위해 얻어진 지방조직을 PBS(Sigma, St. Louis, MO)로 3회 세척하였다. 이어서 지방조직은 0.2 w/v% 소혈청알부민 함유 PBS와 2mg/ml 타입 II 콜라게네이즈(Sigma)로 45분 동안 37 ℃로 digest하였다. 25 mm 필터로 여과 및 원심분리한 후 부유하는 지방세포를 기질 분획으로부터 제거하였다. 기질 분획으로부터 분리된 지방조직 유래 줄기세포(ADSCs)는 100 U/ml의 페니실린, 100 μg/ml의 스트렙토마이신, 그리고 10%의 우태아 혈청(Invitrogen, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, Gibco BRL, Gaithersburg, MD)에서 배양되었다. 세 번째 혹은 네 번째 계대 배양된 세포를 실험에 사용하였다.

실험예 1: SEM 사진 측정 및 공극 지름 측정

1. SEM 사진 측정

지지체 단면의 구조를 알아보기 위해 상기 실시예 1에서 제조된 복합 지지체를 주사전자현미경(SEM; JSM-6330F, JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였으며, 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 이때, 시료는 현미경으로 관찰하기 전에 Sputter 코팅기(Cressington 108, Cressington Scientific Instruments, Cranberry, PA)를 이용하여 백금으로 코팅하였다.

도 1을 참조하면, PLGA 및 HA 함유 복합 지지체는 기공이 서로 연결되어 있고, 균일한 기공 구조로 되어 있음을 알 수 있다.

2. 공극 지름 측정

복합 지지체의 공극 크기를 알아보기 위해 수은주입 공극측정기(Autopore IV 9500, Micromeritics Instrument Corporation, Norcross, GA)를 이용해 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 복합 지지체의 공극 지름은 평균 160㎛이었다.

실험예 2: PLGA 및 HA 함유 복합 지지체로부터의 BMP-2 방출

복합 지지체로부터의 BMP-2 방출 거동을 알아보기 위해 상기 실시예 1에서 제조된 복합 지지체(5mmx5mmx2mm)에 BMP-2(Chinese hamster ovary cell-derived recombinant human BMP-2, R&D Systems, Minneapolis, MN) 2 w/v% 함유 생리식염수 용액 50 ㎕을 4 ℃에서 60분간 흡수시켜 결합시킨 후 1.5 mL 37 ℃, 인산완충용액 (PBS)에서 BMP-2의 방출량을 5회에 걸쳐 면역효소측정법(ELISA)를 이용하여 측정하였다. ELISA 플레이트(NUNC, Polylabo, Strasbourg, France)는 포획 단원 항체(capture monoclonal antibody)로 코팅되었으며, 1 w/v % 소혈청알부민(bovine serum albumin)과 5 w/v % 수크로오스로 1시간 동안 차단되었다. 희석된 샘플을 ELISA 플레이트에 첨가한 후 결합된 BMP-2를 anti-human BMP-2 다클론 항체를 이용하여 측정하였다. 이어서 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 복합체( streptavidin-conjugated horseradish peroxidase)를 플레이트에 가하였다. 다음 퍼옥시다제와 테트라메틸벤지딘을 가하고 20분간 반응시켰다. 효소반응을 산용액을 추가하여 중지시킨 후 샘플의 흡광도를 ELISA plate reader(PowerWave X340, Bio- Tek Instruments, Inc., Winooski, VT)를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.

도 3은 ELISA를 통해 측정한 복합 지지체로부터의 BMP-2의 방출 거동을 나타낸 그래프이다.

도 3을 참조하면, PLGA 및 HA 함유 복합 지지체에 92±3%의 BMP-2가 흡수되고, 이러한 복합 지지체로부터 BMP-2는 생체외(in vitro)에서 28일 이상 지속하여 매우 서서히 방출되었다.

실험예 3: 생체외 ( in vitro ) 골 재생

BMP-2가 1μg 로딩된 상기 실시예 1의 복합 지지체(5mmx5mmx2mm)에 상기 실시예 2에서 얻은 ADSCs(5×10⁴ cells/ml)를 2주간 배양하였다. 하기 표 1과 같이 대조군으로 BMP-2가 로딩 안된 복합지지체(NO BMP-2)와 배양 배지에 시험시작일에 BMP-2 1μg를 첨가한 BMP-2가 로딩 안된 복합지지체(BMP-2 addition day 0)를 설정하여 ADSCs를 배양하였다.

구분	비고
NO BMP-2	PLGA 및 HA 함유 복합지지체
BMP-2 addition day 0	PLGA 및 HA 함유 복합지지체 (시험시작일 배양 배지에 BMP-2 첨가)
BMP-2-loaded scaffold	PLGA 및 HA 함유 복합지지체에 BMP-2 로딩

배양 배지로 10% v/v FBS, 100 units/ml 페니실린과 0.1 mg/ml 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였고, 3일 마다 교환하였다. 실험시작일, 1, 3, 5, 7, 9, 11과 14일에 알칼리 포스파타제 활성을 ELISA법으로 측정하였다. 50 ㎕ 라이시스 버퍼(lysis buffer, Cell Culture Lysis Reagent 5X, Promega)를 각각의 웰에 첨가하고, 세포 용해물(lysate)을 10분간 13000rpm에서 초원심분리(Micro 17R, Hanil Science Industrial, Seoul, Korea)하여 제거하였다. 각각의 샘플은 p-nitrophenylphosphate(pNPP, Sigma)를 첨가한 300 ㎕ ALP substrate, 37℃에서 30분간 배양되었다. 반응을 중지하기 위해 3 N NaOH를 첨가하였다. 각 샘플의 흡광도는 ELISA plate reader를 사용하여 405 nm에서 측정하였다. 배양 2주 후 실시간 역전사 중합연쇄반응(real time reverse transcription-polymerase chanin reaction)을 이용하여 유전자 발현을 조사하였다. 각 샘플을 1 ml TRIzol(Invitrogen, USA)에 넣어 가위로 잘게 자른 후 균질기(IKA-WERKE, Germany)를 이용하여 분쇄하였다. 200 ml의 클로로포름을 가하고 12,000 rpm, 15분간 원심분리하였다. 얻어진 RNA pellet을 70% (v/v) 에탄올로 세척, 건조한 뒤 리보핵산분해효소 제거 초순수물(RNase-free water)에 용해하였다. 역적사 반응은 SuperScript^TM II reverse transcriptase(Invitrogen)을 이용하여 5 mg pure RNA로 수행되었다. 합성 cDNA는 하기 표 2의 인간 특이적 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭되었다. PCR은 변성(94℃ , 30 sec), 어닐링(60℃ , 30 sec), 및 연장(72℃ , 60 sec)의 30 사이클, 마지막 연장은 72℃, 5분간 수행되었다. PCR 산물은 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)를 첨가한 2 w/v% 아가로즈젤에서 전기영동하여 gel documentation system(Gel Doc 1000, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)으로 분석하였다. 인간 β-액틴은 관리유전자(housekeeping gene)로 작용하였다.

Primer	Sequences	Product size (bp)
ALP Sense Antisense	5‘-GGACATGCAGTACGAGCTGA-3’ 5‘-GCAGTGAAGGGCTTCTTGTC-3’	357
COL-I Sense Antisense	5‘-CTG ACC TTC CTG CGC CTG ATG TTC-3’ 5‘-TTG GAC GTT GGT GCC CCA GAC-3’	599
OPN Sense Antisense	5‘-ACGCCGACCAAGGAAAACTC-3’ 5‘-GTCCATAAACCACACTATCACCTCG-3’	483
OCN Sense Antisense	5‘-ATG AGA GCC CTC AGA CTC CTC-3’ 5‘-CGG GCC GTA GAA GCG CCG ATA-3’	297
BSP Sense Antisense	5‘-GCT CAG CAT TTT GGG AAT GGC-3’ 5‘-CTG CAT TGG CTC CAG TGA CAC-3’	614
β-actin Sense Antisense	5‘-CCTTCCTGGGCATGGAGTGGTG-3’ 5‘-GGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’	202

도 4는 복합 지지체를 사용하여 생체외(in vitro) ADSCs 배양시 ELISA를 통해 측정한 알칼리 포스파타제 활성을 나타낸 그래프이다.

도 4를 참조하면, NO BMP-2의 경우, 전체 배양기간 동안 알칼리 포스파타제의 활성이 증가하지 않았다. 한편, BMP-2 addition on day 0의 경우, 배양시작 5일 동안 알칼리 포스파타제의 활성이 증가하였으나 그 후는 감소하였다. 반면, BMP-2-loaded scaffold의 경우, 전체 배양기간 동안 알칼리 포스파타제의 활성이 증가하였다.

도 5는 복합 지지체에서 인간 지방조직 유래 줄기세포를 2주 배양한 후 골 형성 유전자 발현 정도를 알아보기 위해 실시한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.

도 5를 참조하면, NO BMP-2의 경우, 알칼리 포스파타제 mRNA가 발현되었고, BMP-2 addition on day 0의 경우, 알칼리 포스파타제, 오스테오폰틴 mRNA만 발현되었고, 오스테오칼신 mRNA는 발현되지 않았다. 반면, BMP-2-loaded scaffold의 경우, 알칼리 포스파타제, 오스테오폰틴, 오스테오칼신 mRNA가 모두 발현되었다.

도 6은 골 형성 유전자 mRNA 발현 정도를 인간 특이 β-액틴 mRNA에 의해 표준화하여 비교한 그래프이다.

도 6을 참조하면, BMP-2-loaded scaffold의 경우, NO BMP-2와 BMP-2 addition on day 0와 비교하여 알칼리 포스파타제, 오스테오폰틴, 오스테오칼신 mRNA 모두 발현 정도가 매우 높음을 알 수 있다.

실험예 4: 생체내 ( in vivo ) 골 재생

1. 동물실험

동물실험은 차병원 동물실험 규정을 따라 실시되었다. 무흉선암컷쥐(BALB/c-nu, 7 weeks old, female, SLC, Tokyo, Japan) 20마리를 4개의 실험군으로 나눴고, xylazine 20 mg/kg과 케타민 100 mg/kg으로 마취하였다.

상기 실시예 1에서 제조된 복합 지지체(5mmx5mmx2mm)를 저온 에틸렌옥사이드 가스로 멸균하였으며, 에탄올을 제거하기 위하여 멸균된 증류수로 세척하였다(Mikos et al., Biomaterials, 1994;15: 55-58). 0.04 ㎍/㎕ BMP-2 용액 25 ㎕을 지지체에 4℃에서 60분간 흡수시킨 후 인간 지방조직 유래 줄기세포는 4x10⁷ 세포/ml의 농도로 희석하여 이 중 25 ㎕(10⁶ 세포)를 각각의 지지체에 도포하였다. 세포는 지지체에서 1시간 동안 부착하였다. 1시간 후 골 재생용 복합 지지체를 무흉선쥐(BALB/c-nu)의 등쪽 피하에 이식하였다. 대조군으로 아래 표 3과 같이 PLGA 및 HA 함유 복합 지지체(GROUP 1), BMP-2만 로딩된 복합 지지체(GROUP 2, 1 ㎍), 미분화 ADSCs만 로딩된 복합 지지체(GROUP 3, 10⁶ 세포)를 각각 이식하였다.

구분	비고
GROUP 1	PLGA 및 HA 함유 복합지지체
GROUP 2	PLGA 및 HA 함유 복합지지체에 BMP-2 로딩
GROUP 3	PLGA 및 HA 함유 복합지지체에 ADSCs 로딩
GROUP 4	PLGA 및 HA 함유 복합지지체에 BMP-2 및 ADSCs 로딩

2. 생체내 ( in vivo ) 골 재생용 복합 지지체에 의한 골 형성 특이적 유전자( osteoblastic specific gene)의 발현 증가

I형 콜라겐은 골세포 분화 초기에, 알칼리 포스파타제, 오스테오폰틴은 분화 중기, 오스테오칼신과 뼈 시알로프로테인는 골세포로 분화되는 말기의 지표이다. 쥐에서 적출된 지지체는 쥐세포를 함유하고 있을 수 있으므로, 총 mRNA 발현 대신에 인간 mRNA 표현 정도를 측정하였다. 이식 8 주 후 이식된 조직을 적출하여 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 실시간 역전사 중합연쇄반응(real time reverse transcription-polymerase chanin reaction)을 이용하여 유전자 발현을 조사하였다.

도 7은 골 형성 유전자 발현 정도를 알아보기 위해 실시한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다. 이러한 결과를 통해 I형 콜라겐, 알칼리 포스파타제, 오스테오폰틴, 오스테오칼신과 뼈 시알로프로테인과 같은 인간 특이적 골 형성 유전자의 mRNA 발현 정도를 비교할 수 있다.

도 7을 참조하면, ADSCs를 포함하지 않는 지지체인 GROUP 1 및 GROUP 2의 경우, 골 형성 유전자가 발현되지 않았다. 본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체의 경우(GROUP 4), BMP-2가 로딩 안된 복합 지지체(GROUP 3) 보다 I형 콜라겐(COL-I), 알칼리 포스파타제(ALP), 오스테오칼신(OCN)과 뼈 시알로프로테인(BSP)의 발현이 높았으며, 특히 오스테오칼신(OPN)의 발현이 이중적으로 나타났다.

도 8은 인간 특이 β-액틴 mRNA에 의해 표준화된 GROUP 3 및 GROUP 4의 mRNA 발현 정도를 나타낸 그래프이다.

도 8을 참조하면, 본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체에 의한 mRNA의 발현 정도는 GROUP 1, 2, 3에 비하여 의미 있게 높음을 알 수 있다.

3. 생체내 ( in vivo ) 골 재생용 복합 지지체에 의한 골 생성 분화와 골 재생

이식 8주 후에 실험동물들을 희생시켜 이식된 조직을 적출하여 파라핀에 포매시켜(embedding), 4 ㎛의 두께로 가로로 절단한 뒤 Weber, F. E., et al. [Biochem. Biophys Res. Commun. 286 (2001) 554-558]에 기술된 것처럼 골드너-트리크롬(Goldner-Trichrome) 염색을 하였다. 골 재생 면적은 광학 현미경과 연결된 image analysis system(KS400, Zeiss, Munich, Germany)를 이용하여 분석하였고, 전체 횡단면에 대한 골 형성 면적비[(골 면적/전체 면적)×100%]로 정량화하였다.

도 9는 적출된 조직의 단면을 골드너-트리크롬(Goldner-Trichrome) 염색 후 광학현미경으로 관찰한 사진이다. 여기서 녹색 부분과 B는 재생된 골 부위, 화살표는 지지체를 나타내며, 스케일 바는 100 ㎛이다.

도 9를 참조하면, PLGA 및 HA 함유 복합 지지체의 경우(GROUP 1) 거의 골이 재생되지 않았고, BMP-2만 로딩된 복합 지지체의 경우(GROUP 2)에는 어느 정도 골이 재생되었음을 알 수 있다. 한편, ADSCs만 로딩된 복합 지지체 경우(GROUP 3) 골 재생이 매우 미미한 반면 ADSCs와 BMP-2가 함께 로딩된 복합 지지체의 경우(GROUP 4)의 경우 골 재생이 매우 우수하였다.

도 10은 본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체 이식 후 적출된 단면을 골드너-트리크롬(Goldner-Trichrome) 염색 후 광학현미경으로 관찰한 사진이다. 여기서 스케일 바는 20 ㎛이다.

도 10을 참조하면, ADSCs와 BMP-2를 함께 로딩한 복합 지지체의 경우(GROUP 4), 분화된 조골세포(osteoblast)와 골세포(osteocyte)를 관찰할 수 있었다.

도 11은 (골 면적/전체 면적)×100%에 의해 계산된 골 형성 면적비를 나타낸 그래프로, 별표(*)는 통계학적 의미를 나타낸다(*p<0.01, **p<0.001).

도 11을 참조하면, 복합 지지체만 이식한 경우(GROUP 1) 2±1%, 복합 지지체에 ADSCs만을 로딩한 경우(GROUP 3) 2±1%의 골 형성 면적비를 나타내었다. 한편BMP-2가 로딩된 복합 지지체를 이식한 경우(GROUP 2) 32±8%, 복합 지지체에 ADSCs와 BMP-2를 함께 로딩한 경우(GROUP 4) 56±12%로, 본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체를 이식한 경우 골 재생이 매우 우수함을 알 수 있었다.

실험예 5: 골 재생용 복합 지지체에서의 미네랄화된 골 조직 형성

미네랄화된 골 조직 형성을 확인하기 위해 이식된 지지체에서의 칼슘의 양을 측정하였다. 침착된 칼슘의 양은 Jeon et al., Biomaterials 2007;28(17):2763-2771에 기술된 방법으로 측정하였다. 간단히 말하면, 이식 8주 후 적출된 조직을 인산 완충 용액을 이용하여 부드럽게 세척한 후 0.6 N 염산을 첨가한 후 잘게 자르고 교반기에서 하룻밤 동안 교반하였다. 이후 이를 1,000g에서 5분간 원심분리하였다. 상층액에 있는 칼슘의 양은 상용화된 칼슘 정량 키트(Sigma)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다.

도 12는 이식체에서의 칼슘의 양을 측정하여 나타낸 그래프로, 별표(*)는 통계학적 의미를 나타낸다(*p<0.01, **p<0.001).

도 12를 참조하면, 복합 지지체만 이식한 경우(GROUP 1) 6 ㎍/㎎ dry tissue, 복합 지지체에 ADSCs만을 로딩한 경우(GROUP 3) 7 ㎍/㎎ dry tissue, BMP-2가 로딩된 복합 지지체를 이식한 경우(GROUP 2) 20 ㎍/㎎ dry tissue인 반면 복합 지지체에 ADSCs와 BMP-2를 함께 로딩한 경우(GROUP 4)의 경우 39 ㎍/㎎ dry tissue으로 나타났다.

본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체는 골 조직 재생을 효과적으로 유도하여, 골절, 골다공증, 골관절염 등 정형외과 및 성형외과의 골 재생 치료에 빠르고 효율적인 방법으로 적용될 것이다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 복합 지지체의 SEM(Scanning Electronic Microscope) 사진이다.

도 2는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 복합 지지체의 공극 지름 분포를 나타낸 그래프이다.

도 4는 BMP-2가 로딩 안된 복합 지지체, 시험시작일에 배지에 BMP-2를 첨가한 복합 지지체 및 BMP-2가 로딩된 복합 지지체에서 각각 ADSCs를 생체외(in vitro) 배양한 경우, ELISA를 통해 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase) 활성을 측정하여 비교한 그래프이다.

도 5는 BMP-2가 로딩 안된 복합 지지체, 시험시작일에 배지에 BMP-2를 첨가한 복합 지지체 및 BMP-2가 로딩된 복합 지지체에서 각각 ADSCs를 생체외(in vitro) 배양한 경우, 골 형성 유전자 발현 정도를 알아보기 위해 실시한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 BMP-2가 로딩 안된 복합 지지체, 시험시작일에 배지에 BMP-2를 첨가한 복합 지지체 및 BMP-2가 로딩된 복합 지지체에서 각각 ADSCs를 생체외(in vitro) 배양한 경우, 인간 특이 β-액틴 mRNA에 의해 표준화된 골 형성 유전자 mRNA 발현 정도를 나타낸 그래프이다.

도 7은 PLGA 및 HA 함유 복합 지지체, BMP-2만 로딩된 복합 지지체, ADSCs만 로딩된 복합지지체 및 BMP-2 및 ADSCs가 로딩된 복합 지지체를 생체내(in vivo) 이식한 경우, 골 형성 유전자 발현 정도를 알아보기 위해 실시한 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 ADSCs만 로딩된 복합지지체 및 BMP-2 및 ADSCs가 로딩된 복합 지지체를 생체내 이식한 경우, 인간 특이 β-액틴 mRNA에 의해 표준화된 골 형성 유전자 mRNA 발현 정도를 나타낸 그래프이다.

도 11은 (골 면적/전체 면적)×100%에 의해 계산된 골 형성 면적 비율을 나타낸 그래프로, 별표(*)는 통계학적 의미를 나타낸다(*p<0.01, **p<0.001).

Claims

생분해성 고분자와 인산칼슘계 생체적합성 세라믹을 포함하여 성형 제조된 복합 지지체; 및

상기 복합 지지체에 로딩된 미분화 인간 지방조직 유래 줄기세포와 골 형성 단백질-2를 포함하고,

상기 복합 지지체 1㎖에 대하여 골 형성 단백질-2가 1 ㎍ 내지 3 ㎎ 로딩된 것인 골 재생용 복합 지지체.
제1항에 있어서,

상기 인간 지방조직은 피하지방조직, 골수지방조직, 장간막 지방조직, 위장 지방조직 및 후복막 지방조직으로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 골 재생용 복합 지지체.
제1항에 있어서,

상기 생분해성 고분자는 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 골 재생용 복합 지지체.
제1항에 있어서,

상기 생체적합성 세라믹은 하이드록시아파타이트, 불소화 아파타이트, 옥시 아파타이트, 인산삼칼슘, 인산일칼슘, 육인산사칼슘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인 골 재생용 복합 지지체.
제1항에 있어서,

상기 복합 지지체 중의 생분해성 고분자의 함량은 5 내지 99 중량%인 것인 골 재생용 복합 지지체.
제1항에 있어서,

상기 복합 지지체 중의 생체적합성 세라믹의 함량은 1 내지 95 중량%인 것인 골 재생용 복합 지지체.
제1항에 있어서,

상기 복합 지지체 1㎖에 대하여 인간 지방조직 유래 줄기세포가 10⁶ 내지 5×10⁷개 로딩된 것인 골 재생용 복합 지지체.
삭제
폴리(락트산-co-글리콜산)과 하이드록시아파타이트를 포함하여 성형 제조된 복합 지지체; 및

상기 복합 지지체에 로딩된 미분화 인간 지방조직 유래 줄기세포와 골 형성 단백질-2를 포함하고,

상기 복합 지지체 1㎖에 대하여 골 형성 단백질-2가 1 ㎍ 내지 3 ㎎ 로딩된 것인 골 재생용 복합 지지체.