TW202136500A - 用於預防及治療組織疾病之生物材料 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種無菌且乾燥的生物材料，其包含具有組織再生和/或修復特性的失活的分化細胞以及顆粒材料，該細胞和該顆粒材料被埋入胞外基質。該顆粒材料較佳為明膠或陶瓷材料。

Description

用於預防及治療組織疾病之生物材料
本發明涉及組織再生和組織修復的領域，包含預防和/或治療皮膚疾病、骨骼疾病和/或軟骨疾病。更具體地，本發明涉及一種無菌且乾燥的生物材料，包含具有組織再生和/或修復特性的失活的分化細胞以及顆粒材料，該細胞和該顆粒材料被嵌入胞外基質。
組織重建涵括骨骼重建、軟骨重建，也涵括皮膚(包括真皮和表皮)重建和肌肉重建。
骨缺損係指正常應有骨骼的身體區域缺乏骨骼組織。骨缺損可以藉由多種手術方法治療。然而，通常有一些因素妨害骨骼的癒合，例如糖尿病、免疫抑制療法、運動狀態不良以及計劃程序時必須考量的其他因素。骨缺損重建的外科手術方法尤其包括去骨、切除和固定、疏鬆骨移植和Ilizarov橫向骨運輸方法。不過，患者通常具有為次優的功能及美學結果之延長的行動障礙。
組織工程涉及藉由使用活細胞來恢復組織結構或功能。一般過程包括細胞分離和增殖，接著為其中使用支架材料的再植入步驟。間質幹細胞 (MSC)對於來自成熟組織的細胞提供良好替代方案且具有許多優勢，例如，作為皮膚、骨骼和軟骨組織再生的細胞來源。
根據定義，幹細胞的特徵在於其具有能力進行自我更新以及其具有能力進行多譜系分化且形成終期分化細胞的能力。理想情況下，用於再生醫學應用的幹細胞應符合以下標準：(i)應當發現數量眾多(數百萬至數十億個細胞)；(ii)可以透過微創步驟收集和收穫；(iii)可以沿多個細胞譜系途徑以可現性的方式分化；(iv)可以安全有效地移植至自體或同種異體宿主。
研究顯示幹細胞具有分化為中胚層、內胚層和外胚層來源的細胞的能力。MSC的可塑性通常係指保留於幹細胞內的固有能力以跨越譜系屏障並採用獨特於其他組織的細胞的表型、生化和功能特性。例如，成體間質幹細胞可單離自骨髓和脂肪組織。
衍生自脂肪組織的幹細胞(Adipose tissue-derived stem cells,ASCs)是多潛能性的，並具有深度的再生能力。當接種在各種支架時，例如β-磷酸三鈣(β-TCP)、羥磷灰石(HA)、I型膠原蛋白、聚乳酸-共-乙醇酸共聚物(PLGA)和藻酸鹽，成骨分化的ASC於多種臨床前模型中顯示具有強大的癒合潛力。專利公開案WO2013/059089涉及一種骨糊劑，其包括幹細胞和磷酸鈣黏固劑例如磷酸三鈣和羥磷灰石的混合物。US2011/104230揭露了一種骨糊劑，其包括支架材料，該支架材料包括合成陶瓷材料、間質幹細胞和傳信分子。US2016/287753揭露了一種骨再生劑，其包含失活的細胞構建體，該失活的細胞構建體包含衍生自幹細胞的細胞、礦物質和胞外基質的細胞。
然而，儘管在小型動物模型中的令人鼓舞的結果，但是使用ASC負載於框架的臨界尺寸骨骼重建仍受到大尺寸骨缺損的限制，並因此受到植入 物尺寸工程的限制。接種細胞的細胞植入也受到氧氣和營養物質擴散不良的限制。此外，支架內的細胞位置是其體外和體內存活的主要限制。具有支架的流灌注的生物反應器經設計以改善埋植物內的細胞遷移，以實現更均勻的細胞分佈，並向埋植物的芯心輸送氧氣和營養物質以提高細胞存活率以及成骨細胞分化(通過流體剪力)。儘管這些技術未來有望，但是在大型動物模型中相關的臨床前和臨床數據仍然有限。
最近，專利公開案WO2019/057861揭露了一種生物材料，其包括脂肪衍生的幹細胞(ASC)、生物相容性材料和胞外基質，其中該生物材料分泌OPG(骨保護素)。
此外，專利公開案WO2019/057862揭露了一種具有多維度結構的生物材料，其包括成骨分化脂肪組織衍生的幹細胞(ASC)、陶瓷材料和胞外基質，其中該生物材料分泌骨保護素(OPG)，並包含類胰島素生長因子(IGF1)和基質細胞衍生的因子1-alpha(SDF-1α)。該申請案表明該生物材料可用於治療骨或軟骨缺損。
進一步地，專利公開案WO2020/058511亦揭露了一種具有多維度結構的生物材料，其包含分化的脂肪組織衍生的幹細胞(ASC)、胞外基質和明膠。該申請案表明該生物材料可以用於治療組織疾病，例如骨骼、軟骨、肌肉或皮膚疾病。
儘管兩種生物材料都可能適於自體植入，但另一方面，不能進行同種異體或異種植入，因為可能引起免疫反應，從而導致植入物被排斥，或者其可能攜帶不定病原體，導致接受者因生物材料的感染。JP2004/305259揭露了一種生物組織假體，其能夠處置歸因於埋植的可能性免疫排斥並且適於長 期保存。
通常進行滅菌過程以減輕前揭問題。然而，該等苛刻條件常致使滅菌材料的生物學特性變差。
因此，在本領域中仍然需要一種用於組織重建和/或再生的組織工程材料，該材料儘管可在廣泛的組織上使用，但能對指定的應用為完全地生物相容性並且提供適當的力學特性。
亦有需要於提供一種適於異體或異種移植物之組織重建和/或再生的生物材料，包括用於治療皮膚、骨或軟骨缺損的生物材料。亦有需要於提提供一種無菌生物材料，該生物材料與新鮮生物材料相比，亦即與滅菌前的生物材料相比，保持生物特性。
本發明的第一方面涉及一種無菌且乾燥的生物材料，包含具有組織再生和/或修復特性的失活的分化細胞以及顆粒材料，該細胞和該顆粒材料被嵌入胞外基質。
在某些實施例中，該細胞選自包含初代細胞、幹細胞、基因改造細胞以及其組合的群組。在一些實施例中，該細胞至多10%是活的，以至多1%為較佳。
在某些實施例中，該顆粒材料選自包含或者由下述組成的群組：
-有機物質、包括去礦質骨基質(DBM)、明膠、瓊脂/瓊脂糖、藻酸鹽幾丁聚醣、硫酸軟骨素、膠原蛋白、彈性蛋白或類彈性蛋白肽 (ELP)、纖維蛋白原、纖維蛋白、纖維接合素、蛋白聚醣、硫酸乙醯肝素蛋白聚醣(Heparan sulfate proteoglycan)、玻尿酸、多醣、層連結蛋白和纖維素衍生物；
-陶瓷材料，包括磷酸鈣(CaP)、碳酸鈣(CaCO3)、硫酸鈣(CaSO4)或氫氧化鈣(Ca(OH)2)的顆粒或其組合；
-聚合物，包括聚酐、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-甘醇酸)(PLGA)、聚氧化乙烯/聚乙二醇(PEO/PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、富馬酸系聚合物，如例如聚(富馬酸丙二醇酯)(PPF)或聚(富馬酸丙二醇酯-共-乙二醇)(P(PF-co-EG))、寡(聚(乙二醇)富馬酸酯)(OPF)、聚(N-異丙基丙烯醯胺)(PNIPPAAm)、聚(醛古羅糖醛酸酯)(PAG)、聚(n-乙烯吡咯酮)(PNVP)、或其組合；
-凝膠，包括自組裝化的寡肽凝膠、微凝膠、奈米凝膠、顆粒凝膠、水凝膠、觸變凝膠、乾凝膠、響應性凝膠(responsive gel)或其組合；
-奶精；
及其任何組合。
在一些實施例中，與從相應之新鮮的、非無菌的、非乾燥的生物材料獲得的因子內容物相比，該生物材料包含改變的因子內容物。在某些實施例中，因子內容物包括生長因子和/或轉錄因子。在一些實施例中，因子內容物包括IGF-1和/或VEGF和/或SDF-1α和/或OPG。在一些實施例中，該因子內容物包括RNA內容物。在某些實施例中，RNA內容物包含選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12的任何一者的至少一種miRNA。在一些實施例中，該乾燥的生物材料係透過冷凍乾燥所獲得。在某些 實施例中，該無菌生物材料透過γ-輻射獲得，以約7kGy至約45kGy的劑量較佳，以在室溫更佳。
本發明的另一方面涉及一種用於產生無菌和乾燥的生物材料的方法，該生物材料包含失活的分化細胞和顆粒材料，其中該細胞和該顆粒材料被嵌入胞外基質，該方法包括以下步驟：
-(1)使(i)能夠進行分化的活細胞與(ii)顆粒物質接觸，以獲得第一組合；
-(2)在培養基中培養步驟(1)中獲得的第一組合，使得細胞分泌胞外基質並合成因子內容物，以獲得組織再生和/或修復特性，其中，細胞和顆粒材料嵌入胞外基質，形成多維結構。
-(3)將在步驟(2)中獲得的多維結構進行乾燥，以獲得乾燥的生物材料；
-(4)將在步驟(3)中獲得的乾燥的生物材料進行滅菌，獲得無菌、乾燥的生物材料，以透過γ-射線照射較佳。
在一些實施例中，能夠進行分化的活細胞選自下述的群組，包含初代細胞；幹細胞，特別是來自脂肪組織、骨髓或臍帶血的幹細胞；基因改造細胞；以及其混合物。
本發明的另一方面係涉及根據本發明揭露的方法可獲得的乾燥且無菌的生物材料。
本發明的再另一方面係涉及一種醫藥組成物，包含本發明的生物材料和藥學上可接受的載體。在某些實施例中，該組成物為糊劑或膜的形式。
本發明的一個方面涉及一種醫療器材，其包含本發明的生物材料或本發明的醫藥組成物。
一方面，本發明亦涉及將本發明的生物材料或本發明的醫藥組成物用作藥物之用途。在一些實施例中，將生物材料或醫藥組成物用於預防和/或治療組織疾病之用途。在某些實施例中，該組織係選自包含下述之群組：骨組織、軟骨組織、皮膚組織、肌肉組織、上皮組織、內皮組織、神經組織、結締組織和脂肪組織。在一些實施例中，該組織疾病選自包含下述之群組：先天性皮膚形成不全；燒傷；癌症，包括乳癌、皮膚癌和骨癌；腔室症候群(CS)；水疱性表皮鬆解症；巨大先天性痣；下肢缺血性肌肉損傷；肌肉挫傷、破裂或拉傷；放射後病變；潰瘍，包括糖尿病性潰瘍，以糖尿病性足潰瘍較佳；關節炎；骨折；骨脆弱；卡費氏症；先天性假關節；顱骨變形；顱骨畸形；骨折癒合延遲；骨浸潤性疾病；骨肥大；骨礦物質密度流失；代謝性骨流失；骨發生不全；骨軟化症；骨壞死；骨量減少；骨質疏鬆症；佩吉特氏病(Paget’s disease)；假關節；硬化性病變；脊柱裂；脊髓滑脫症；椎弓斷裂；軟骨發育不全；肋軟骨炎；內生軟骨瘤；拇指僵硬；髖關節內軟骨破裂；剝離性骨軟骨炎；骨軟骨發育異常；多發性軟骨炎；以及此等相類疾病。在某些實施例中，生物材料或醫藥組成物用於預防和/或治療骨疾病和/或軟骨疾病。在一些實施例中，生物材料或醫藥組成物用於組織重建。在某些實施例中，生物材料或醫藥組成物用於補償組織疾病的初級治療的副作用，和/或用於增強組織疾病的初級治療。在一些實施例中，生物材料或醫藥組成物用於補償已知對組織具有有害作用的治療性處理的副作用，該組織特別是骨組織、軟骨組織、皮膚組織、肌肉組織、上皮組織、內皮組織、神經組織、結締組織和脂肪組織。
定義
除非另有定義，否則本申請使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解的相同含義。在發生衝突的情況下，本申請提供的當前定義將被認為是真實的。
在本發明中，以下術語具有以下含義：
-數值之前的術語「約」表示該數值的正或負10%的值。應當理解，術語「約」所指的值本身也被具體地並且較佳地被揭露。
-術語「包含(comprise)」旨在表示「含有(contain)」，「涵蓋(encompass)」和「包括(include)」。在一些實施例中，術語「包含(comprise)」還涵蓋術語「由...組成(consists of)」。
-術語「組織疾病」旨在指稱組織生理功能的任何紊亂、失衡。在組織疾病中觀察到的症狀的非限制性實例包括損傷、拉傷、感染、扭傷、創傷、裂痕、腫脹、發紅、浮腫、疼痛、壓痛、酸痛、傷口、壞死或其任何組合。如本申請所用，諸如「組織疾病(tissue disorder)」，「組織疾患(tissue disease)」，「組織醫學狀況(tissue medical condition)」之類的術語旨在指稱等同意義。
-術語「再生」或「組織再生」包括但不限於在以本發明的生物材料治療後新細胞類型或新組織的生長、生成或重建。在一實施例中，這些細胞類型或組織包括但不限於骨原細胞(例如成骨細胞、骨細胞)、軟骨細胞、纖維母細胞、角質細胞、內皮細胞、心肌細胞、造血細胞、肝細胞、脂肪細胞、神經細胞和肌管。如本申請所用，術語「再生」係指稱在受傷、傷口、手術、先天性、退化性、創傷性或非創傷性的症狀或狀況，或其他導致組織之裂 縫、開口、凹陷、傷口等之預防和/或治療。
-術語「修復」或「組織修復」包括但不限於從患病或功能失調的組織重建健康組織的癒合過程。在一實施例中，組織修復包括皮膚修復，如例如傷口癒合、疤痕形成和減弱。在一實施例中，組織修復包括骨修復，如例如骨折復位。在一實施例中，組織修復包括軟骨修復。在一實施例中，組織修復包括填充、膨脹、支撐、擴大、延伸或增加身體組織的尺寸、體積或質量。
-如本申請所用，術語「失活細胞」是指稱不具有活性代謝並且當與合適的培養基接觸時不具有分裂能力的細胞。
-如本申請所用，術語「間質幹細胞」是指多潛能幹細胞，其可以分化為屬於骨骼組織的幾種類型的細胞，如軟骨、骨骼；皮膚組織；肌肉組織；上皮和/或內皮組織；神經組織；結締組織；和脂肪組織，如脂質。
-術語「脂肪組織」是指稱任何脂質組織。脂肪組織可以是棕色或白色脂肪組織，其源自皮下、網膜/內臟、乳腺、性腺或其他脂肪組織部位。較佳地，脂肪組織為皮下白色脂肪組織。該細胞可以包含初代細胞培養物或永生細胞系。脂肪組織可為來自具有脂質組織的任何活的或死的有機體。較佳地，脂肪組織係源自動物，更佳為源自哺乳動物，最佳地為脂肪組織係源自人類。脂肪組織的方便來源是抽脂手術，不過，脂肪組織的來源或脂肪組織的單離方法對本發明不是關鍵的。
-本申請所用的術語「脂肪組織衍生的幹細胞」(亦稱「脂肪組織衍生的幹細胞」)是指脂肪組織的「非脂肪細胞」部分。細胞可以是新鮮取得的，也可以是培養的。「脂肪組織衍生的幹細胞(ASC)」係指源自脂肪組織的基質細胞，可以作為多種不同類型細胞的前驅細胞，如但不限於脂肪細 胞、骨細胞、軟骨細胞、纖維母細胞、肌細胞、上皮細胞、內皮細胞、結締細胞、神經細胞等，及其原(始)細胞。
-如本申請所用，術語「顆粒材料」是指呈顆粒形式的固體材料。在本發明的範圍內，「顆粒材料」包括有機材料，例如去礦質的骨基質(DBM)和明膠；陶瓷材料；聚合物，例如聚酸酐；凝膠，例如水凝膠；及其任何組合。重要的是，顆粒材料還可以藉由其平均直徑予以特徵化。
-如本申請所用，術語「陶瓷材料」是指無機非金屬固體材料。陶瓷材料可包含磷酸鈣(CaP)、碳酸鈣(CaCO3)、硫酸鈣(CaSO4)、氫氧化鈣(Ca(OH)2)或其組合。陶瓷材料可以是顆粒形式。顆粒材料，較佳地該陶瓷材料可為粉末、珠粒或顆粒形式。顆粒材料，較佳地該陶瓷材料可為多孔的。
-本申請所用的術語「生長因子」涵蓋促進組織生長、細胞增殖、血管形成等的分子。在特定的實施例中，術語「生長因子」包括促進皮膚、肌肉、軟骨、內皮、上皮、神經、結締、脂肪或骨組織的分子。
-如本申請所用，術語「轉錄因子」是調控給定基因是否轉錄成其相應RNA的分子。
-如本申請所用，術語「分化細胞」是指從非特化表型發展為特化表型的前驅細胞。例如，幹細胞，尤為MSC，如ASC，可以分化為成骨、軟骨、脂肪、上皮、結締、神經或內皮細胞。
-本申請所用的術語「分化培養基」是指在本發明的培養系統中用於產生分化細胞的化合物的組合或集合之一。化合物的作用模式並無限制。例如，該試劑可藉由誘導或協助表型的改變、促進具有特定表型的細胞的生長或減緩其他細胞生長來協助分化過程。該化合物也可作為在培養基中或由細胞 群合成的其他因子的抑制劑，否則這些因子會將引導分化途徑至無用的細胞類型。
-術語「miRNA」或「miR」是指長度為約18至約25個核苷酸的非編碼RNA。這些miRNA可能源自多種來源，包括：編碼miRNA的單個基因、來自蛋白質編碼基因的內含子，或者來自與miRNA密切相關的通常多重編碼的多順反子轉錄物。在以下揭露中，使用標準命名系統，其中未大寫的「mir-X」是指pre-miRNA(前驅物)，大寫的「miR-X」是指成熟形式。當兩個成熟的miRNA源自同一pre-miRNA的相對臂時，它們以-3p或-5p後綴表示。在以下揭露中，除非另有說明，否則miR-X表達的使用是指包括-3p和-5p(如果有的話)形式的成熟miRNA。在本發明的範圍內，microRNA、miRNA和miR的表達係表示相同的化合物。
-術語「胞外體」是指中間胞吞腔室、多囊體(MVB)與質膜的融合後從細胞釋放的細胞外囊泡。換言之，胞外體對應於釋放到細胞外環境中的腔內囊泡。
-術語「分泌物」是指從其合成細胞中運輸出的生理活性物質。在一種實施例中，生理活性物質可以是任何分子，特別是蛋白質(如生長因子或轉錄因子)或核酸(如miRNA)。如本申請所用，術語「分泌」包括主動和被動分泌。在本申請中，術語「主動分泌」是指藉由活細胞之生理活性物質的分泌，特別是間質幹細胞及較佳地脂肪組織衍生的幹細胞，至細胞外作為對刺激的反應，從而擴散到細胞的環境，如胞外基質。「活細胞」在本申請中是指呈現以下特徵之至少一者的細胞：生長和發育、繁殖、恆定、對刺激的反應、消耗、代謝、排泄。在本申請中，術語「被動分泌」是指藉由無生命的細胞或 其片段或萃取物的生理活性物質，在沒有刺激的情況下釋放至細胞或其片段或萃取物外，從而擴散至來源細胞或其片段或萃取物的環境，例如胞外基質。「非活細胞」在本申請中是指不具有以下特徵的細胞：生長和發育、繁殖、恆定、對刺激的反應、消耗、代謝、排泄(非活細胞或其片段或萃取物，例如死細胞或細胞萃取物)。主動或被動分泌的生理活性物接著可以擴散到組織或器官，其中施用了包含此胞外基質的生物材料。
-術語「治療(treatment)」、「治療(treating)」或「緩解(alleviation)」係指目的是預防或減緩(減輕)包括皮膚疾病、骨疾病和/或軟骨疾病的組織疾病的治療方法。需要治療者包括已經患有該疾病者以及易於患該疾病者，或者要預防包括骨或軟骨缺損的組織疾病者。如果在接受根據本發明之方法的治療量的生物材料後，個體顯示出可觀察到的和/或可測量的減少或不存在下述的一種或多種：組織疾病的減少，包括皮膚疾病、骨骼疾病和/或軟骨疾病，和/或在某種程度上減輕了與組織疾病有關的一種或多種症狀，包括皮膚疾病、骨骼疾病和/或軟骨疾病，降低發病率和死亡率，並改善生活品質問題，則成功地「治療」了受試者的組織疾病，包括皮膚疾病、骨骼疾病和/或軟骨疾病。可以透過醫師熟悉的常規程序輕易地測量用於評估疾病的成功治療和改善的上述參數。在所揭露的生物材料的治療用途的背景下，在「異源」(或「同種異體」)療法中，供體和接受體是同一物種的不同個體，而在「自體」療法中，供體和接受體是相同個體。在「異種」治療中，供體衍生自與接受體係不同物種的動物。
-術語「預防」係指預防或避免組織疾病的症狀的發生，該組織疾病包括皮膚疾病、骨骼疾病和/或軟骨疾病。在本發明中，術語「預防」可以 指二級預防，即，預防症狀的再次發生或組織疾病的復發，包括皮膚疾病、骨骼疾病和/或軟骨疾病。當疾病是癌症，例如骨癌時，其也可以指預防在治療和/或切除腫瘤之後的轉移發生。
-術語「有效量」係指足以產生有益或期望結果(包括臨床結果)的量。可以一次或多次的施用來施用有效量。
-「藥學上可接受的載體(vehicle)」是指當施用於動物個體，較佳為人類個體，不會產生任何不良、過敏或其他不必要反應的載體。其包括任何和所有溶劑、分散介質、塗料、抗菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。對於人類施用，製劑應符合監管部門要求的無菌性、熱原性、一般安全性、品質和純度標準，監管部門例如美國食品藥品管理局(FDA)歐盟的歐洲藥品管理局(EMA)。
-術語「個體」係指脊椎動物，較佳為哺乳動物，更佳為人類。個體的實例包括人、非人靈長類、狗、貓、小鼠、大鼠、馬、牛、綿羊及其轉殖基因物種。在一種實施例中，個體可以是「患者」，即溫血動物，較佳為人類，其正在等待或正在接受醫療護理，或者已經/將要成為被醫療對象，或者正被監測疾病的發展。在一種實施例中，該個體是成年人(例如18歲以上的人類受試者)。在另一種實施例中，該個體是兒童(例如18歲以下的人類受試者)。在一種實施例中，個體是男性。在另一種實施例中，個體是女性。
在本揭露中，其他定義可能在上下文中出現。
詳細說明
發明人已進一步特徵化專利公開案WO2019/057862和WO2020/ 058511中揭露的生物材料。從該進一步的特徵表明，細胞內容物和/或分泌的內容物對於促進組織修復，包括皮膚修復、骨骼修復或軟骨修復是最重要的。值得注意的是，已顯示生長因子、轉錄因子和與組織形成有關的因子，包括皮膚形成、骨骼形成或軟骨形成，以及各種微RNA(miRNA)都可以代表活性劑，因為它們促進了例如生物材料的骨原性和/或軟骨原性特性。
此外，發明人已經觀察到，該生物材料可以有利地被冷凍乾燥和γ輻射，並且在各種情況下可以保持其組織再生和/或組織修復特性，包括其成骨和/或軟骨特性。新鮮的多維度生物材料已被特徵化，並包含許多因子，如生長因子、轉錄因子，包括多肽和miRNA。然而，發明人對以下事實感到驚訝：已知凍乾和γ射線照射改變所處理的生物材料的生物學特性，特別是miRNA的特性，卻未改變組織再生和/或組織修復特性，包括成骨特性和/或軟骨特性，儘管與未處理的原始生物材料相比，各種因子的相對量有顯著變化。
以下對實施例的敘述包括以該實施例作為任何單個實施例或者與任何其他實施例或其部分組合，並且所列舉的實施例適用於以下所列舉的一個或多個方面。根據詳細說明和申請專利範圍，本發明的其他特徵和優勢將顯而易見。因此，在以下揭露中描述了本發明的其他方面和實施例，皆為本發明的範圍內。
本發明涉及一種無菌且乾燥的生物材料，包含具有組織再生和/或修復特性的失活的分化細胞以及顆粒材料，該細胞和該顆粒材料被嵌入胞外基質。
如本申請所用，表述「具有組織再生和/或修復特性的分化細胞」旨在指稱具有促進組織再生和/或修復和/或在健康的生理狀態下維持現有 組織的能力的細胞群。
本發明還涉及一種無菌和乾燥的生物材料，包含具有組織再生和/或修復特性的失活的分化細胞和明膠，該細胞和明膠嵌入胞外基質。
本發明進一步涉及一種無菌和乾燥的生物材料，包含失活的骨分化和/或軟骨分化細胞，以及顆粒材料，該細胞和顆粒材料嵌入胞外基質。
如本申請所用，表述「骨分化和/或軟骨分化細胞」旨在指稱具有促進骨和/或軟骨形成和/或在健康的生理狀態下維持現有骨和/或軟骨的能力的細胞群。
在某些實施例中，該細胞選自包含初代細胞、幹細胞、基因改造細胞以及其組合的群組。。
在實施中，根據本發明的細胞可以是動物細胞，較佳為哺乳動物細胞，更佳為人類細胞。
在一些實施例中，初代細胞可以選自包含或由下述之群組組成：骨細胞、腦細胞、皮膚細胞、乳腺細胞、神經細胞、子宮頸細胞、上消化道細胞、結直腸細胞、子宮內膜細胞、生殖細胞、膀胱細胞、腎細胞、喉細胞、肝細胞、肺細胞、食道細胞、卵巢細胞、胰細胞、胸膜細胞、前列腺細胞、眼細胞、小腸細胞、胃細胞、睾丸細胞、甲狀腺細胞等及前述細胞之前驅細胞。
在一些實施例中，初代細胞可以選自包含或由下述之群組組成：骨細胞、成骨細胞、蝕骨細胞、軟骨母細胞、軟骨細胞、角質細胞、真皮纖維細胞、纖維母細胞、上皮細胞、造血細胞、肝細胞、神經細胞、肌纖維母細胞、內皮細胞、脂肪細胞，及前述細胞。
如本申請所用，術語「神經細胞」係涵蓋中樞神經系統的細胞，如神經元和神經膠質細胞。
在一些實施例中，初代細胞可以選自包含骨細胞、成骨細胞、蝕骨細胞、軟骨母細胞、軟骨細胞及其組合的群組。由於初代細胞是已分化細胞，因此可以以維持或增殖的目的在任何合適的培養基中培養。在一些實施例中，可以在允許細胞增殖或維持之合適培養基(也稱為增殖培養基(MP))中培養初代細胞。
在一實施例中，增殖培養基可以是所屬技術領域中具有通常知識者已知的設計用於支持細胞生長的任何培養基。如本申請所用，增殖培養基也稱為「生長培養基」。生長培養基的例子包括但不限於RPMI、MEM、DMEM、IMDM、RPMI 1640、FGM或FGM-2、199/109培養基、HamF10/HamF12或McCoy的5A。在一個較佳的實施例中，增殖培養基是DMEM。
在某些實施例中，幹細胞可以選自包含骨前驅細胞(osteoprogenitor)、胚胎幹細胞(ESC)、間質幹細胞(MSC)、多能幹細胞(pSC)和誘導性多能幹細胞(ipSC)的群組。
如本申請所用，「胚胎幹細胞」(ESC)通常是指能夠分化為三個胚胎生殖層(即內胚層、外胚層或中胚層)的任何一層的細胞，或者能夠保持未分化狀態的胚胎細胞。此類細胞可包含自妊娠後(例如胚母細胞)胚胎著床前形成的胚胎組織(即，著床前的胚母細胞)獲得的細胞、從著床後/前原腸形成階段胚母細胞獲得的擴張的胚母細胞(EBC)(參見WO2006/040763)、在妊娠期間的任何時間(較佳為妊娠10週之前)從胎兒的生殖組織以及使用未受精卵的其他方法(如單性生殖方法或核移植)獲得的胚胎生殖(EG)細胞。
在某些實施例中，根據本發明的ESC係動物的ESC，較佳為哺乳動物ESC，更佳為人類ESC(hESC)。
實際上，可以使用習知的細胞培養方法獲得合適的ESCs。例如可以從胚母細胞分離出ESC。胚母細胞通常從體內著床前的胚胎或者體外受精的(IVF)胚胎獲得。或者，可以將單個細胞胚胎擴增到胚母細胞階段。關於製備ESC的方法的進一步細節可以參見美國專利5,843,780號。
在一些實施例中，hESC可以有利地獲得而無胚胎破壞，如Chung等人所述(2008)。在一些實施例中，hESC可以有利地獲自受精後少於14天的收集或分離的胚胎。在一些實施例中，ESC不是人類ESC。
如本申請所用，「間質幹細胞」(MSC)通常係指來自特化組織(也稱為分化組織)並能夠在有機體的整個生命週期中自我更新(即製作相同的複製體)，且具有多潛能性分化潛能的基質細胞。
在一些實施例中，根據本發明的MSC是動物MSC，較佳為哺乳動物MSC，更佳為人類MSC(hMSC)。實際上，適用於實施本發明的hMSC因此涵蓋使用任何適當單離方法自任何合適組織衍生的任何合適人類多潛能性幹細胞。闡釋性地而言，hMSC涵蓋但不限於成年多譜系誘導(MIAMI)細胞(D'Ippolito et al.；2004)、臍帶血衍生的幹細胞(Kögler et al.；2004)、中胚層血管母細胞(Sampaolesi et al.；2006；Dellavalle et al.；2007)和羊水幹細胞(De Coppi et al.；2007)。此外，臍帶血庫(例如法國的Etablissement Français du Sang)為這些細胞的移植提供了安全且容易獲得的來源。
在一些實施例中，MSC是前成骨細胞、前軟骨母細胞、前角質細胞、前纖維母細胞。在一些實施例中，根據本發明的MSC是前成骨細胞或前 軟骨母細胞。
在一些實施例中，間質幹細胞是脂肪組織衍生的幹細胞(ASC)。如本申請所用，以下術語被認為是指ASC：脂肪衍生的幹細胞/基質細胞(ASC)；脂肪衍生的成體幹細胞(ADAS)、脂肪衍生的成體基質細胞、脂肪衍生的基質細胞(ADSC)、脂肪基質細胞(ASC)、脂肪間質幹細胞(AdMSC)、脂肪母細胞、外被細胞、前脂肪細胞、加工過的脂肪萃取細胞(Processed Lipoaspirate，PLA)。
在一種實施例中，ASC是動物來源，較佳為哺乳動物來源，更佳為人類來源。據此，在一種實施例中，ASC是動物ASC，較佳為哺乳動物ASC，更佳為人類ASC。在一個較佳的實施例中，ASC是人類ASC。
自脂肪組織單離幹細胞的方法在本領域中是已知的，例如揭露於Zuk等人(Tissue Engineering.2001,7：211-228)所著文中。在一實施例中，藉由抽脂從脂肪組織單離ASC。
作為說明，可以藉由穿刺活檢或者抽脂而收集脂肪組織。可以藉由用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)第一次充分洗滌組織樣品而自脂肪組織單離ASC，磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)可選擇性地含有抗生素，例如1%青黴素/鏈黴素(P/S)。接著將樣品與膠原酶放入無菌組織培養盤或無菌試管中進行組織消化(例如在含2%P/S的PBS中製備的I型膠原酶)，並在37℃、5%的二氧化碳水浴中培養60分鐘，每20分鐘手動搖動一次。膠原酶的活性可以藉由添加培養基(例如含有10%人類血小板溶解產物(hPL)的DMEM)予以中和。崩解後，可以將樣品轉移到試管中，藉由離心樣品(例如以2,000rpm離心5分鐘)獲得含有ASC的基質血管級分(SVF)。為使基質細胞與初代脂肪細胞的分離完 成，可劇烈搖晃樣品以徹底破壞沉澱物並混合細胞。可以重複離心步驟。於旋轉並吸出膠原酶溶液後，可將沉澱物再次懸浮於溶解緩衝液中，在冰上培養(例如10分鐘)、洗滌(例如用PBS/2%P/S)並離心(例如以2,000rpm離心5分鐘)。接著可以吸出上清液，將細胞沉澱物再次懸浮於培養基(例如基質培養基，即α-MEM，對其補充20%FBS、1% L-麩醯胺酸和1%P/S)，並過濾細胞懸浮液(例如透過70μm細胞過濾器)。最終可以將含有細胞的樣品接種在培養盤中，並培養在37℃、5%CO2。
在一實施例中，本發明的ASC單離自脂肪組織的基質血管級分。在一種實施例中，脂肪萃取物可以在室溫維持數小時，或使用前在+4℃保存24-72小時，或在0℃以下，例如-18℃或-80℃長時間保存。
在一實施例中，ASC可以是新鮮的ASC或冷凍的ASC。新鮮的ASC是未經冷凍處理的單離ASC。冷凍ASC是經過冷凍處理的單離ASC。在一實施例中，冷凍處理是指低於0℃的任何處理。在一實施例中，可在約-18℃、-80℃或-180℃進行冷凍處理。在一個具體的實施例中，該冷凍處理可以是冷凍保存(cryopreservation)。
作為冷凍處理的說明，ASC可在80-90%的匯合率(confluence)收穫。經過洗滌和自培養容器脫離的步驟後，可在20℃用冷凍保存介質沉澱細胞，然後放入小瓶中。在一種實施例中，冷凍保存介質包含80%的胎牛血清或人類血清、10%的二甲亞碸(DMSO)和10%的DMEM/Ham F-12。接著，將該小瓶在-80℃保存過夜，例如可將小瓶置於酒精冷凍容器中，該容器使小瓶以每分鐘大約1℃的速度緩慢冷卻，直至達-80℃。最後，可以將冷凍的小瓶轉移到液態氮容器中進行長期保存。
在一實施例中，ASC是已分化ASC。在一些實施例中，該分化細胞是分化之脂肪組織衍生的幹細胞(ASC)，較佳ASC分化成選自包含或由下述組成之群組：成骨細胞、軟骨細胞、角質細胞、肌纖維母細胞、上皮細胞、內皮細胞、結締細胞或神經細胞以及脂肪細胞。
在一個較佳的實施例中，ASC是骨原性分化的ACS。換言之，在一個較佳的實施例中，ASC分化為骨原細胞。在一個特定的實施例中，ASC分化為成骨細胞。
在另一種實施例中，ASC是軟骨原性分化的ACS。換言之，在一種實施例中，ASC分化為軟骨原細胞(chondrogenic cell)。在一個特定的實施例中，ASC分化為軟骨細胞(chondrocytes)。
在另一種實施例中，ASC是角蛋白分化的ACS。換言之，在一種實施例中，ASC分化為角蛋白細胞(keratinic cell)。在一個特定的實施例中，ASC分化為角質細胞(keratinocyte)。
在另一種實施例中，ASC是肌纖維原性細胞分化的ACS。換言之，在一種實施例中，ASC分化為肌纖維原性細胞(myofibroblastic cells)。在一個特定的實施例中，ASC分化為肌纖維原性細胞(myofibroblasts)。
在另一種實施例中，ASC是內皮分化的ACS。換言之，在一種實施例中，ASCs分化為內皮細胞。在一個特定的實施例中，ASCs分化成內皮細胞。
在另一種實施例中，ASC是上皮分化的ACS。換言之，在一種實施例中，ASCs分化成上皮細胞。在一個特定的實施例中，ASCs分化成上皮細胞。
在另一種實施例中，ASC是脂肪原性分化的ACS。換言之，在一種實施例中，ASCs分化為脂肪原細胞(adipogenic cells)。在一個特定的實施例中，ASCs分化成脂肪細胞(adipocytes)。
在另一種實施例中，ASC是神經分化的ACS。換言之，在一種實施例中，ASC分化為神經細胞。
如本申請所用，術語「多能的」是指具有生成可分化的細胞後代的能力，細胞後代可以在適當條件下分化為共同表現出與來自三個生殖層(內胚層、中胚層、和外胚層)的細胞譜系的特性。多能幹細胞可有助於產前、產後或成年有機體的組織。一種本領域所公認的標準測試，例如於8至12週大的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可以用來建立細胞群體的多能性。不過，各種多能幹細胞特性的鑑定也可用於鑑定多能細胞。在本發明的一些實施例中，多能幹細胞是動物多能幹細胞，較佳為哺乳動物多能幹細胞，更佳為人類多能幹細胞。
如本申請所用，「誘導性多能幹細胞」(iPSC)係指人工衍生自非多能細胞的多能幹細胞。與多能幹細胞相比，非多能細胞可以是自我更新和分化能力(或潛能)較低的細胞，但不限於體幹細胞、組織特異性前驅細胞、初代或次代細胞。在一些實施例中，iPSC是人類iPSC(hiPSC)。
反之，由於幹細胞和基因改造細胞不是分化的細胞，因此其可經歷分化過程，例如骨原性和/或成軟骨原性分化過程。
在一些實施例中，細胞是基因改造細胞。實際上，對基因改造的細胞進行改造，以合成促進組織再生和/或組織修復(包括骨原性和/或軟骨原性特性)的因子和核酸。
在本發明的範圍內，表述「基因改造」是指細胞在其基因組中具有一個或多個核苷酸取代、添加或缺失和/或包含一種或多種另外的編碼干擾細胞命運的生理結果一種或多種因子之一種或多種的額外染色體核酸。在某些實施例中，基因改造的細胞是動物來源，較佳為哺乳動物來源，更佳為人類來源。
在一些實施例中，對基因改造的細胞進行改造以允許合成涉及組織再生和/或組織修復，包括骨形成和/或軟骨形成的一種或多種生長因子、轉錄因子或RNA，
在一種實施例中，藉由在骨原性分化培養基(MD)培養細胞來進行幹細胞或基因改造的細胞的骨原性分化，特別是ASC的骨原性分化。在一實施例中，骨原性分化培養基包含人血清。在一個特定的實施例中，骨原性分化培養基包含人類血小板裂解物(hPL)。在一種實施例中，骨原性分化培養基不包含任何其他動物血清，較佳地為不包含人類血清之外的其他血清。
控制和評估骨原性分化的方法是本領域已知的。例如，本發明的細胞或組織的骨分化可以藉由骨鈣素和/或磷酸鹽的染色(例如von Kossa染色)、藉由染色磷酸鈣(例如，用茜素紅)、藉由核磁共振影像(MRI)、藉由測量礦化基質的形成或藉由測量鹼性磷酸酶活性來評估。
在一種實施例中，骨原性分化培養基包含補充有地塞美松(dexamethasome)、抗壞血酸和磷酸鈉或由其組成的增殖培養基。在一種實施例中，骨原性分化培養基進一步包含抗生素，例如青黴素、鏈黴素、健大黴素(gentamycin)和/或雙性黴素B(amphotericin B)。在一種實施例中，所有培養基均不含動物蛋白。
在一種實施例中，骨原性分化培養基包含補充有L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸(Ala-Gln，亦稱為「Glutamax®」或「Ultraglutamine®」)、hPL、地塞美松、抗壞血酸和磷酸鈉的DMEM或由其組成。在一種實施例中，骨原性分化培養基包含補充有L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸、hPL、地塞美松、抗壞血酸和磷酸鈉的DMEM以及抗生素或由其組成，較佳地為青黴素、鏈黴素、健大黴素和/或雙性黴素B。
在一種實施例中，骨原性分化培養基包含補充有L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸、hPL(約5%，v/v)、地塞美松(約1μM)、抗壞血酸(約0.25mM)和磷酸鈉(約2.93mM)的DMEM或由其組成。在一種實施例中，骨原性分化培養基包含補充有L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸、hPL(約5%，v/v)、地塞美松(約1μM)、抗壞血酸(約0.25mM)和磷酸鈉(約2.93mM)的DMEM、青黴素(約100U/mL)和鏈黴素(約100μg/mL)或由其組成。在一實施例中，骨原性分化培養基進一步包含雙性黴素B(約0.1%)。
在一種實施例中，骨原性分化培養基由補充有L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸、hPL(約5%，v/v)、地塞美松(約1μM)、抗壞血酸(約0.25mM)和磷酸鈉(約2.93mM)的DMEM組成。在一種實施例中，骨原性分化培養基包含補充有L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸、hPL(約5%，v/v)、地塞美松(約1μM)、抗壞血酸(約0.25mM)和磷酸鈉(約2.93mM)的DMEM、青黴素(約100U/mL)和鏈黴素(約100μg/mL)以及雙性黴素B(約0.1%)或由其組成。
在另一種實施例中，該細胞，特別是ASC，是軟骨原性分化的。換言之，在一個較佳的實施例中，該細胞，特別是ASC，被分化為軟骨原性細 胞。再換言之，在一個較佳的實施例中，該細胞，特別是ASC，在軟骨原性培養基中分化。在一個特定的實施例中，該細胞，特別是ASC，被分化為軟骨細胞。
控制和評估軟骨原性分化的方法是本領域已知的。例如，本發明的細胞或組織的軟骨分化可以藉由阿辛藍(Alcian Blue)染色、藉由測量軟骨細胞特異性基因如聚蛋白多醣、膠原蛋白II和SOX-9的表達量級來評估。方法包括但不限於實時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)或組織學分析。
在一種實施例中，藉由在軟骨原性分化培養基中培養細胞，特別是ASC，以進行軟骨原性分化。
在一種實施例中，軟骨原性分化培養基包含DMEM、hPL、丙酮酸鈉、ITS、脯胺酸、TGF-β1和地塞美松或由其組成。在一種實施例中，軟骨原性分化培養基進一步包含抗生素，例如青黴素、鏈黴素、健大黴素和/或雙性黴素B。
在一種實施例中，軟骨原性分化培養基包含補充有丙酮酸鈉、抗壞血酸和地塞美松的增殖培養基或由其組成。在一種實施例中，軟骨原性分化培養基還包含抗生素，例如青黴素、鏈黴素、健大黴素和/或雙性黴素B。在一種實施例中，軟骨原性分化培養基還包含生長因子，例如IGF和TGF-β。在一實施例中，所有培養基均不含動物蛋白。
在一種實施例中，軟骨原性分化培養基包含補充有hPL、地塞美松、抗壞血酸和丙酮酸鈉的DMEM或由其組成。在一實施例中，軟骨原性分化培養基可進一步包含脯胺酸和/或生長因子和/或抗生素。
在一種實施例中，軟骨原性分化培養基包含DMEM、hPL(約5 %，v/v)、地塞美松(約1μM)、丙酮酸鈉(約100μg/mL)、ITS(約1X)、脯胺酸(約40μg/mL)和TGF-β1(約10ng/mL)或由其組成。
在另一種實施例中，該細胞，特別是ASC，是角蛋白生成分化的。換言之，在一個較佳的實施例中，該細胞，特別是ASC，被分化成角蛋白形成細胞。換言之，在一個較佳的實施例中，該細胞，特別是ASC，在角蛋白形成培養基中分化。在一個特定的實施例中，該細胞，特別是ASC，被分化為角質細胞。
控制和評估角蛋白原性分化的方法是本領域已知的。例如，本發明的細胞或組織的角蛋白生成分化可以藉由Pankeratin或CD34的染色來評估。
在一種實施例中，藉由在角蛋白原性分化培養基中培養細胞，特別是ASC，來分化為角質細胞。
在一種實施例中，角蛋白原性分化培養基包含DMEM、hPL、胰島素、KGF、hEGF、氫化皮質酮(hydrocortisone)和氯化鈣(CaCl2)或由其組成。在一實施例中，角蛋白原性分化培養基進一步包含抗生素，例如青黴素、鏈黴素、健大黴素和/或雙性黴素B。
在一實施例中，角蛋白原性分化培養基包含DMEM、hPL(約5%，v/v)、胰島素(約5μg/mL)、KGF(約10ng/mL)、hEGF(約10ng/mL)、氫化皮質酮(約0.5μg/mL)和CaCl2(約1.5mM)或由其組成。
在另一種實施例中，該細胞，特別是ASC，是內皮細胞原性分化的。換言之，在一較佳實施例中，該細胞，特別是ASC，在內皮培養基中分化。在一個特定的實施例中，該細胞，特別是ASC，被分化為內皮細胞。
控制和評估內皮細胞原性分化的方法是本領域已知的。例如， 本發明的細胞或組織的內皮分化可以藉由CD34的染色來評估。
在一種實施例中，藉由在內皮原性分化培養基中培養ASC來分化為內皮細胞。
在一種實施例中，內皮原性分化培養基包含EBMTM-2培養基、hPL、hEGF、VEGF、R3-IGF-1、抗壞血酸、氫化皮質酮和hFGFb或由其組成。在一實施例中，內皮原性分化培養基還包含抗生素，例如青黴素、鏈黴素、健大黴素和/或雙性黴素B。
在一種實施例中，內皮原性分化培養基包含或由EBMTM-2培養基、hPL(約5%，v/v)、hEGF(約0.5mL)、VEGF(約0.5mL)、R3-IGF-1(約0.5ml)、抗壞血酸(約0.5毫升)、氫化皮質酮(約0.2毫升)和hFGFb(約2毫升)、試劑盒CloneticsTMEGMTM-2MV BulletKitTMCC-3202(Lonza)的試劑所組成。
在另一種實施例中，該細胞，特別是ASC，是肌纖維原性分化的。換言之，在一個較佳的實施例中，該細胞，特別是ASC，被分化為肌纖維原性細胞。換言之，在較佳的實施例中，該細胞，特別是ASC，在肌纖維原性培養基中分化。在一個特定的實施例中，該細胞，特別是ASC，被分化為肌纖維原性細胞。
控制和評估肌纖維原性分化的方法是本領域已知的。例如，可以藉由α-SMA的染色來評估本發明的細胞或組織的成肌纖維分化。
在一種實施例中，藉由在肌纖維原性分化培養基中培養細胞，特別是ASC來分化為肌纖維原性細胞。
在一種實施例中，肌纖維原性分化培養基包含或由DMEM： F12、丙酮酸鈉，ITS、RPMI 1640維生素、TGF-β1、穀胱甘肽、MEM組成。在一種實施例中，肌纖維原性分化培養基還包含抗生素，例如青黴素、鏈黴素、健大黴素和/或雙性黴素B。
在一種實施例中，肌纖維原性分化培養基包括DMEM：F12、丙酮酸鈉(約100μg/mL)、ITS(約1X)、RPMI 1640維生素(約1X)、TGF-β1(約1ng/mL)、穀胱甘肽(約1μg/mL)、MEM(約0.1mM)或由其所組成。
在另一實施例中，該細胞，特別是ASC，是脂肪原性分化的。換言之，在較佳的實施例中，該細胞，特別是ASC，分化為脂肪原性細胞。換言之，在較佳的實施例中，該細胞，特別是ASC，在脂肪原性培養基中分化。在特定的實施例中，該細胞，特別是ASC，分化為脂肪細胞。
控制和評估成脂分化的方法是本領域已知的。例如，本發明的細胞或組織的脂肪原性分化可以藉由油紅(Oil-Red)染色來評估。
在一種實施例中，藉由在脂肪原性分化培養基中培養細胞，特別是ASC，來分化成脂肪細胞。
在一種實施例中，脂肪原性分化培養基包含DMEM、hPL、地塞美松、胰島素、吲哚美洒辛(Indomethacin)和IBMX或由其所組成。在一種實施例中，脂肪原性分化培養基進一步包含抗生素，例如青黴素、鏈黴素、健大黴素和/或雙性黴素B。
在一種實施例中，脂肪原性分化培養基包含DMEM，hPL(約5%)、地塞美松(約1μM)、胰島素(約5μg/mL)、吲哚美洒辛(約50μM)和IBMX(約0.5mM)或由其所組成。
在另一實施例中，該細胞，特別是ASC，是神經分化的。換言之，在較佳的實施例中，該細胞，特別是ASC，分化為神經細胞。在特定的實施例中，該細胞，特別是ASC，被分化為神經細胞。在特定的實施例中，該細胞，特別是ASC，被分化為神經元。在另一個具體的實施例中，該細胞，特別是ASC，分化為神經膠質細胞。
在一種實施例中，藉由在神經元或神經膠質細胞分化培養基中培養細胞，特別是ASC，來分化為神經細胞。
控制和評估神經分化的方法是本領域已知的。例如，可以根據形態學、生理學或整體基因表達模式來評估本發明的細胞或組織的神經分化。例如，本發明的細胞或組織的神經分化可以藉由細胞生長的長度、生長錐的發育和/或神經外胚層幹細胞標記物(包括NESTIN、PAX6和SOX2)的染色來評估。控制和評估神經分化的另一種方法是評估分化細胞的電生理趨勢。
在一種實施例中，該細胞，特別是ASC，是晚期繼代的脂肪組織衍生的幹細胞。如本文所用，術語「晚期繼代」是指至少在繼代4之後分化的脂肪組織衍生的幹細胞。如本文所用，繼代4是指第四繼代，即藉由將細胞重新懸浮於新鮮培養基中之前，自培養容器表面分離而分裂細胞的第四動作。在一種實施例中，晚期繼代的脂肪組織衍生的幹細胞在繼代4、繼代5、繼代6或更多之後被分化。在一個較佳的實施例中，特別是ASC在繼代4之後分化細胞。
如本文所用，術語「容器」是指任何細胞培養表面，例如燒瓶或孔盤。
初代細胞的初始繼代稱為繼代0(P0)。根據本發明，繼代P0是指從沉澱的基質血管級分(SVF)的細胞懸浮液種到培養容器。因此，繼代P4 是指將細胞從培養容器表面分離4次(於P1、P2、P3和P4)(例如，用胰蛋白酶消化)，接著將其重新懸浮在新鮮培養基中。
在一種實施例中，將本發明的細胞，特別是ASC，在增殖培養基培養直至第四繼代。在一種實施例中，本發明的細胞，特別是ASC，在第四繼代後在分化培養基培養。據此，在一種實施例中，在繼代P1、P2和P3，將本發明的細胞，特別是ASC，從培養容器的表面脫離，接著在增殖培養基稀釋至合適的細胞密度。並且根據該實施例，在繼代P4，將細胞，特別是ASC，從培養容器的表面脫離，接著在分化培養基稀釋至合適的細胞密度。因此，根據該實施例，本發明的細胞在P4時，特別是ASC，在分化之前(即在分化培養基培養之前)不在增殖培養基重新懸浮並培養直到匯合，而是直接在分化培養基重新懸浮並培養。
在一種實施例中，將細胞至少維持在分化培養基直至它們匯合，較佳在70%至100%匯合之間，更佳在80%至95%匯合之間。在一種實施例中，將細胞在分化培養基維持至少5天，較佳至少10天，更佳至少15天。在一種實施例中，將細胞在分化培養基維持5天至30天，較佳10天至25天，更佳15天至20天。在一種實施例中，分化培養基每2天更換一次。然而，如本領域所知，不同供體(donor)間的細胞生長速率可能些微不同。因此，分化的持續時間和培養基的數量變化亦可能在供體之間有所不同。
在一種實施例中，取決於所使用的分化培養基，將細胞維持在分化培養基中直至形成獨特的組織。
在一種實施例中，將細胞維持在骨原性分化培養基中，至少直到形成類骨質，即在骨組織成熟之前形成的骨基質的未礦化的有機部分。
在一種實施例中，將細胞在軟骨原性分化培養基中維持至少直至形成具有黏彈性的未成熟或成熟的軟骨。
在某些實施例中，至多10%的該細胞是活的，以至多1%為較佳。
在本發明的範圍內，表述「至多10%」包括10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%和0%。
根據本發明之細胞的生存力可以藉由現有技術中已知的任何合適的方法進行評估，或者從其等適調。例如，可以參考「哺乳動物細胞生存力：方法和方案」(2011；編輯：MJ Stoddart)。闡釋性地，細胞可在將乾燥的生物材料水合後回復，並在適調的培養條件下與合適的培養基接觸。細胞的生存力可以透過台盼藍(trypan blue)染料排斥染色來評估。或者，可透過測量培養基中碳源的消耗，特別是葡萄糖的消耗，來評估細胞的生存力。
在一些實施例中，生物材料包括實質上非存活的細胞。在該實施例中，該生物材料包含無法檢測量級的存活細胞。在該實施例中，生物材料可以被稱為失活的(devitalized)。
在一種實施例中，本發明的顆粒材料為顆粒形式。在一種實施例中，顆粒可以是珠粒、粉末、球體、微球體等。
在一些實施例中，本發明的顆粒材料由為細胞生長和繁殖提供結構支持的材料所形成。在一種實施例中，顆粒材料是生物相容的，並且包含天然或合成材料，或其化學衍生物。
在本發明的範圍內，「生物相容性」是指對身體沒有毒性或傷 害性的性質。
在一種實施例中，本發明的顆粒材料沒有被建構形成預定的3D形狀或支架，例如立方體。在一種實施例中，本發明的顆粒材料不具有預定的形狀或支架。在一種實施例中，本發明的顆粒材料不具有立方體的形式。在一種實施例中，顆粒材料非為3D支架。在一種實施例中，本發明的生物材料是無支架的。
在某些實施例中，該顆粒材料選自包含或者由下述組成的群組：
-有機物質、包括去礦質骨基質(DBM)、明膠、瓊脂/瓊脂糖、藻酸鹽幾丁聚醣、硫酸軟骨素、膠原蛋白、彈性蛋白或類彈性蛋白肽(ELP)、纖維蛋白原、纖維蛋白、纖維接合素、蛋白聚醣、硫酸乙醯肝素蛋白聚醣(Heparan sulfate proteoglycan)、玻尿酸、多醣、層連結蛋白和纖維素衍生物；
-陶瓷材料，包括磷酸鈣(CaP)、碳酸鈣(CaCO3)、硫酸鈣(CaSO4)或氫氧化鈣(Ca(OH)2)的顆粒或其組合；
-聚合物，包括聚酐、聚乳酸(PLA)、聚(乳酸-共-甘醇酸)(PLGA)、聚氧化乙烯/聚乙二醇(PEO/PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、富馬酸系聚合物，例如聚(丙烯富馬酸酯)(PPF)或聚(丙烯富馬酸酯-共-乙二醇)(P(PF-co-EG))、寡(聚(乙二醇)富馬酸酯)(OPF)、聚(n-異丙基丙烯醯胺)(PNIPPAAm)、聚(醛古羅糖醛酸酯)(PAG)、聚(n-乙烯吡咯酮)(PNVP)，或其組合；
-凝膠，包括自組裝化的寡肽凝膠、微凝膠、奈米凝膠、顆粒凝 膠、水凝膠、觸變凝膠、乾凝膠、響應性凝膠(responsive gel)或其組合；
-奶精；
及其任何組合。在一些較佳的實施例中，顆粒材料是明膠。
在一種實施例中，本發明的明膠是動物明膠，較佳哺乳動物明膠，更佳豬明膠。如本文所用，術語「豬明膠」可以被「豬肉明膠」或「豬明膠」代替。在一種實施例中，明膠是豬皮膚明膠。
在某些實施例中，所述明膠為顆粒形式，較佳為具平均直徑為約50μm至約1,000μm的顆粒。
在本發明的範圍內，表述「約50μm至約1,000μm」包括50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm和1,000μm。
在一種實施例中，本發明的明膠為顆粒、珠粒、球狀、微球狀等的形式。
在一種實施例中，本發明的明膠不建構形成預定的3D形狀或支架，例如立方體。在一種實施例中，本發明的明膠不具有預定的形狀或支架。在一種實施例中，本發明的明膠不具有立方體的形式。在一種實施例中，明膠，較佳為豬明膠，且不為3D支架。在一種實施例中，本發明的明膠是大孔微載體。
豬明膠顆粒的實例包括但不限於Cultispher® G、Cultispher® S、Spongostan和Cutanplast。在一種實施例中，本發明的明膠是Cultispher® G或Cultispher® S。
在一種實施例中，本發明的明膠，較佳為豬明膠，具平均直徑至少約50μm，較佳至少約75μm為較佳，更佳至少約100μm為更佳，更佳至少約130μm。在一實施例中，本發明的明膠，較佳為豬明膠，具平均直徑至多約1,000μm，較佳至多約750μm，更佳至多約500μm。在另一實施例中，本發明的明膠，較佳為豬明膠，具平均直徑至多約450μm，較佳至多約400μm，更佳至少為至多約380μm。
在一種實施例中，本發明的明膠，較佳為豬明膠，具平均直徑約50μm至約1,000μm，較佳約75μm至約750μm，更佳約100μm至約500μm。在另一實施例中，本發明的明膠，較佳為豬明膠，具平均直徑約50μm至約500μm，較佳約75μm至約450μm，更佳約100μm至約400μm。在另一實施例中，本發明的明膠，較佳為豬明膠，具平均直徑約130μm至約380μm。
評估本發明的明膠顆粒的平均直徑的方法是本領域已知的。該方法的例子包括但不限於粒度分析法，特別是使用合適的篩；沉降體積分析法；離心技術；雷射繞射；以及影像分析，特別是透過帶有遠心鏡頭的高性能相機；及相類方法。
在一種實施例中，以約0.1cm3至約5cm3的濃度添加明膠至150cm2的容器，較佳約0.5cm3至約4cm3，更佳約0.75cm3至約3cm3。在一種實施例中，以約1cm3至約2cm3的濃度添加明膠至150cm2的容器。在一種實施例中，以約1cm3、1.5cm3或2cm3的濃度添加明膠至150cm2的容器。在本發明的範圍內，表述「0.1cm3至約5cm3」涵蓋0.1cm3、0.2cm3、0.3cm3、0.4cm3、0.5cm3、0.6cm3、0.7cm3、0.8cm3、0.9cm3、1.0cm3、1.5cm3、2.0cm3、2.5cm3、3.0cm3、3.5cm3、4.0cm3、4.5cm3和5.0cm3。
在一種實施例中，添加濃度範圍為約0.1g至約5g的明膠至150cm2的容器，較佳約0.5g至約4g，更佳約0.75g至約3g。在一種實施例中，添加濃度範圍為約0.75g至約3g的明膠至150cm2的容器。在一種實施例中，以約1g、1.5g或2g的濃度添加明膠至150cm2的容器。在本發明的範圍內，表述「0.1g至約5g」涵蓋0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g、4.5g和5.0g。
在一種實施例中，將本發明的明膠在細胞分化後添加到培養基中。在一種實施例中，當細胞半匯合時，將本發明的明膠加入到培養基中。在一種實施例中，當細胞過度匯合時，將本發明的明膠加入到培養基中。在一種實施例中，當細胞在分化後已經達到匯合時，將本發明的明膠加入到培養基中。換言之，在一種實施例中，當細胞在分化培養基中達到匯合時，將本發明的明膠加入到培養基中。在一種實施例中，將本發明的明膠在P4之後至少5天添加到培養基中，較佳在P4之後10天，更佳在P4之後15天。在一種實施例中，將本發明的明膠在P4後5天至30天添加到培養基中，較佳在P4後10天至25天，更佳在P4後15天至20天。
在一些較佳的實施例中，顆粒材料是陶瓷材料。
在一種實施例中，本發明的陶瓷材料是磷酸鈣(CaP)、碳酸鈣(CaCO3)、硫酸鈣(CaSO4)或氫氧化鈣(Ca(OH)2)或其組合。
磷酸鈣顆粒的例子包括但不限於羥磷灰石(HA、Ca10(PO4)6(OH)2)、磷酸三鈣(TCP、Ca3(PO4)2)、α-磷酸三鈣(α-TCP、(α-Ca3(PO4)2)、β-磷酸三鈣(β-TCP、β-Ca3(PO4)2)、磷酸四鈣(TTCP、Ca4(PO4)2O)、磷酸八鈣(Ca8H2(PO4)6.5H2O)、無定形磷酸鈣 (Ca3(PO4)2))、羥磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCP)、羥磷灰石/磷酸四鈣(HA/TTCP)等。
在一種實施例中，本發明的陶瓷材料包括或由羥磷灰石(HA)、磷酸三鈣(TCP)、羥磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCP)、硫酸鈣(CaSO4)或其組合所組成。在一種實施例中，本發明的陶瓷材料包括或由羥磷灰石(HA)、β-磷酸三鈣(β-TCP)、羥磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCP)、α-磷酸三鈣(α-TCP)、硫酸鈣(CaSO4)或其組合所組成。
在一些實施例中，該顆粒材料包括陶瓷材料，以包括磷酸鈣為佳，以包括羥磷灰石(HA)和/或β-磷酸三鈣(β-TCP)為佳，以磷酸鈣的顆粒為較佳。
在某些實施例中，該陶瓷材料包括磷酸鈣，較佳羥磷灰石(HA)和/或β-磷酸三鈣(β-TCP)，更佳磷酸鈣顆粒。
在一種實施例中，本發明的陶瓷顆粒是羥磷灰石(HA)顆粒。在另一實施例中，本發明的陶瓷顆粒是β-磷酸三鈣(β-TCP)。在另一實施例中，本發明的陶瓷顆粒是羥磷灰石/β-磷酸三鈣(HA/β-TCP)的顆粒。換言之，在一種實施例中，本發明的陶瓷顆粒是羥磷灰石和β-磷酸三鈣顆粒的混合物(稱為HA/β-TCP顆粒)。在一種實施例中，本發明的陶瓷顆粒由羥磷灰石顆粒和β-磷酸三鈣顆粒(稱為HA/β-TCP顆粒)組成。
在一種實施例中，顆粒材料，較佳陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，為粒狀、粉末或珠粒形式。在一實施例中，顆粒材料，較佳陶瓷顆粒，以多孔顆粒、粉末或珠粒形式更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，為多孔粒、粉末或珠粒的形式。在一種實施例中，顆粒材料，較佳 陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，為多孔陶瓷材料。在一種實施例中，顆粒材料，較佳陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，為粉末顆粒。在特定的實施例中，顆粒材料，較佳陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，為多孔粒狀形式。在另一個特定實施例中，顆粒材料，較佳陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，為粉末形式。
在一種實施例中，顆粒材料，較佳陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，為未被建構成形成預定的3D形狀或支架，例如立方體。在一種實施例中，顆粒材料，較佳本發明的陶瓷材料不為3D支架。在一種實施例中，顆粒材料，較佳為陶瓷材料不具有預定的形狀或支架。在一種實施例中，顆粒材料，較佳為本發明的陶瓷材料不具有立方體形式。
在一實施例中，顆粒材料，較佳本發明的陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，為大於約50μm，較佳大於約100μm。在一種實施例中，顆粒材料，較佳本發明的陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，具有平均直徑大於約50μm，更佳大於約100μm。
在一種實施例中，顆粒材料，較佳本發明的陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，具有平均直徑至少約50μm，較佳至少約100μm，更佳至少約150μm。在另一實施例中，顆粒材料，較佳本發明的陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，具有平均直徑至少約200μm，較佳至少約250μm，更佳至少約300μm。
在另一實施例中，顆粒材料，較佳本發明的陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，具有平均直徑至多為約2,500μm，較佳為至多為約2,000μm，更佳為至多約1,500μm。在一實施例中，顆粒材料，較佳本 發明的陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，具有平均直徑至多為約1,000μm、900μm、800μm、700μm或600μm。
在一種實施例中，顆粒材料，較佳本發明的陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，具有平均直徑範圍為約50μm至約1,500μm，較佳約50μm至約1,250μm，更佳約100μm至約1,000μm。在一種實施例中，顆粒材料，較佳本發明的陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，具有平均直徑範圍約100μm至約800μm，較佳約150μm至約700μm，更佳約200μm至約600μm。
在一種實施例中，HA/β-TCP顆粒具有平均直徑範圍為約50μm至約1,500μm，較佳約50μm至約1,250μm，更佳約100μm至約1,000μm。在一種實施例中，HA和β-TCP顆粒具有平均直徑範圍為約100μm至約800μm，較佳150μm至約700μm，更佳約200μm至約600μm。
在實施中，顆粒的平均尺寸和直徑的測量可以藉由現有技術中已知的任何合適的方法或由其適調的方法來進行。此類方法的非限制性示例包括原子力顯微術(AFM)、穿透電子顯微術(TEM)、掃描電子顯微術(SEM)、動態光散射(DLS)。
在一種實施例中，顆粒中HA與β-TCP之間的比率(HA/β-TCP比率)範圍為約0/100至約100/0，較佳約10/90至約90/10，更佳約20/80至約80/20更佳。在一種實施例中，顆粒中HA/β-TCP的比率為約30/70至約70/30，約35/65至約65/35，或約40/60至約60/40。
在一種實施例中，顆粒中的HA/β-TCP比率為0/100，即該顆粒為β-磷酸三鈣的顆粒。在另一實施例中，該顆粒中的HA/β-TCP比率為100/0， 即該顆粒為羥磷灰石顆粒。在一種實施例中，顆粒中的HA/β-TCP比率為約10/90。在另一實施例中，顆粒中的HA/β-TCP比率為約90/10。在一種實施例中，顆粒中的HA/β-TCP比率為約20/80。在另一實施例中，顆粒中的HA/β-TCP比率為約80/20。在一種實施例中，顆粒中的HA/β-TCP比率為約30/70。在另一實施例中，顆粒中的HA/β-TCP比率為約70/30。在另一實施例中，顆粒中的HA/β-TCP比率為約35/65。在另一實施例中，顆粒中的HA/β-TCP比率為約65/35。在一種實施例中，顆粒中的HA/β-TCP比率為約40/60。在另一實施例中，顆粒中的HA/β-TCP比率為約60/40。在另一實施例中，顆粒中的HA/β-TCP比率為約50/50。
在一種實施例中，顆粒中的HA/β-TCP比率為100/0、99/1、98/2、97/3、96/4、95/5、94/6、93/7、92/8、91/9、90/10、89/11、88/12、87/13、86/14、85/15、84/16、83/17、82/18、81/19、80/20、79/21、78/22、77/23、76/24、75/25、74/26、73/27、72/28、71/29、70/30、69/31、68/32、67/33、66/34、65/35、64/36、63/37、62/38、61/39、60/40、59/41、58/42、57/43、56/44、55/45、54/46、53/47、52/48、51/49、50/50、49/51、48/52、47/53、46/54、45/55、44/56、43/57、42/58、41/59、40/60、39/61、38/62、37/63、36/64、35/65、34/66、33/67、32/68、31/69、30/70、29/71、28/72、27/73、26/74、25/75、24/76、23/77、22/78、21/79、20/80、19/81、18/82、17/83、16/84、15/85、14/86、13/87、12/88、11/89、10/90、9/91、8/92、7/93、6/94、5/95、4/96、3/97、2/98、1/99或0/100。
根據一種實施例，顆粒材料的量，較佳陶瓷顆粒較佳，更佳 HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，對於向生物材料提供3D結構是最佳的。在一種實施例中，顆粒材料，較佳陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，濃度範圍以約0.1cm3至約5cm3添加至150cm2的容器，較佳約0.5cm3至約3cm3，更佳約1cm3至約3cm3。在一個較佳的實施例中，顆粒材料，較佳陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，以濃度範圍約1.5cm3至約3cm3添加至150cm2的容器。
在一種實施例中，顆粒材料，較佳陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，以約7×10-3至7×10-2cm3每毫升培養基的濃度範圍添加。在一種實施例中，顆粒材料，較佳陶瓷顆粒，更佳HA、β-TCP和/或HA/β-TCP顆粒，以約3.3×10-3至3.3×10-2的濃度範圍添加至每cm2容器。
在一種實施例中，本發明的顆粒材料，較佳陶瓷材料，在細胞分化後添加至培養基。在一種實施例中，本發明的顆粒材料，較佳陶瓷材料，當細胞半匯時添加。在一種實施例中，本發明的顆粒材料，較佳陶瓷材料，當細胞過度匯合時添加。在一種實施例中，本發明的顆粒材料，較佳陶瓷材料當細胞在分化後已達到匯合時添加。換言之，在一種實施例中，添加本發明的顆粒材料，較佳陶瓷材料，當細胞在分化培養基中達到匯合時添加。在一種實施例中，本發明的顆粒材料，較佳陶瓷材料，在P4之後至少5天添加，較佳在P4之後10天，更佳在P4之後15天。在一種實施例中，本發明的顆粒材料，較佳陶瓷材料，在P4之後5至30天添加，較佳在P4之後10至25天，更佳在P4之後15至20天。
在另一實施例中，本發明的顆粒材料是脫礦骨基質(demineralized bone matrix，DBM)。
在一種實施例中，DBM是源自動物，較佳源自哺乳動物，更佳源自人類。在特定的實施例中，人類DBM是藉由研磨來自人類供體的皮質骨而獲得的。
獲得DBM的方法是本領域已知的。例如，可首先將人類的骨組織用丙酮(例如，約99%)浴脫脂隔夜，接著在脫礦水中洗滌約2小時。脫鈣可藉由浸入(每克骨頭20mL溶液)HCL(例如約0.6N)中，在室溫攪拌約3小時內進行。接著，可以用脫礦水沖洗脫礦的骨粉約2小時，並控制pH值。如果pH值過酸，則可在攪拌下用磷酸鹽溶液(例如約0.1M)緩衝DBM。最後，可以將DBM乾燥並稱重。DBM可以按照本領域已知的技術藉由射線照射進行滅菌，例如以約25kGray進行。
在一種實施例中，DBM是同種異體的。在一種實施例中，DBM是同質的。在另一種實施例中，DBM是異質的。
在一種實施例中，DBM為顆粒形式，在本文中稱為脫礦骨基質顆粒或DBM顆粒。在一種實施例中，DBM顆粒具有平均直徑範圍為約50至約2,500μm，較佳約50μm至約1500μm，更佳約50μm至約1,000μm。在一種實施例中，DBM顆粒具有平均直徑範圍為約100μm至約1,500μm，更佳約150μm至約1,000μm。在一種實施例中，DBM顆粒具有平均直徑範圍為約200至約1,000μm，較佳約200μm至約800μm，更佳約300μm至約700μm。
在一種實施例中，本發明的生物材料包含胞外基質。在一種實施例中，本發明的胞外基質衍生自細胞，較佳ASC。在一種實施例中，本發明的胞外基質由細胞生成，較佳ASC。在一種實施例中，本發明的生物材料的胞外基質衍生自分化的細胞，較佳為分化的ASC。
如本文所用，術語「胞外基質」(ECM)係指非細胞的三維大分子網路。ECM的基質組分彼此以及細胞黏附受體結合，從而形成細胞駐留在本發明的組織或生物材料中的複雜網路。
在一種實施例中，本發明的胞外基質包含膠原蛋白、蛋白聚醣/醣胺聚醣、彈性蛋白、纖維連接蛋白、層連結蛋白和/或其他醣蛋白。在特定的實施例中，本發明的細胞外基質包含膠原蛋白。在另一個特定的實施例中，本發明的胞外基質包含蛋白聚醣。在另一個特定的實施例中，本發明的胞外基質包含膠原蛋白和蛋白聚醣。在一種實施例中，本發明的胞外基質包括生長因子、蛋白聚醣、分泌因子、胞外基質調節劑和醣蛋白。
在一種實施例中，將本發明的細胞(較佳ASC)和顆粒材料(較佳明膠)、DBM或陶瓷材料埋入到胞外基質。
在某些實施例中，與從相應的新鮮的、非無菌的、非乾燥的生物材料獲得的因子內容物相比，所述生物材料包含改變的因子內容物。
在本發明的範圍內，術語「改變的因子內容物」是指與參考相比時生物材料內的因子內容物為不同。如本文所用，當考慮特定因子時，與參考相比，該因子的改變內容物旨在指該因子的增加相對量增加或該因子的減少相對量。
在一些實施例中，參考是從相應的新鮮的、非無菌的、非乾燥的生物材料中獲得的因子內容物。
如本文所用，術語「改變的」旨在表示「具有實質上不同的相對量」。換言之，「成分的改變含量」係指來自本發明生物材料成分的相對量相對於來自參考生物材料成分的相對量變化至少約10%。在本發明的範圍內， 表述「至少約10%」涵蓋10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%、700%、750%、800%、850%、900%、950%、1,000%、1,250%、1,500%、1,750%、2,000%、2,250%、2,500%、2,750%、3,000%、3,250%、3,500%、3,750%、4,000%、4,250%、4,500%、4,750%、5,000%、6,000%、7,000%、8,000%、9,000%和10,000%。
在本發明的範圍內，術語「變化」旨在表示「減少」或「增加」。
在一些實施例中，本發明的生物材料中所包含的平均相對量，相對於從相應的新鮮的、非無菌的、非乾燥的生物材料獲得的該內容物的平均相對量，變化至少約10%。
在一些實施例中，本發明的生物材料中所包含的內容物的平均相對量相對於自活分化細胞(包括骨分化的和/或軟骨分化細胞)獲得的該內容物的平均相對量變化至少約10%，接著再進行產生無菌和乾燥生物材料的步驟。
在一些實施例中，因子內容物包括蛋白質，例如生長因子、轉錄因子、骨原性因子和軟骨原性因子，以及核酸，例如RNA，特別是miRNA。
在一些實施例中，因子內容物包括生長因子和/或轉錄因子。
在一些實施例中，因子內容物包括生長因子和/或轉錄因子，和/或骨原性因子，和/或軟骨原性因子。
如本文所用，生長因子旨在指調節細胞功能的許多方面的多 肽，包括存活、增殖、遷移和分化。根據本發明的生長因子的非限制性實例包括BMP、EGF、FGF、HGF、IGF-1、OPG(骨保護素)、SDF-1α、TGFB-1、TGFB-3，包括VEGFA和VEGFB的VEGF。
如本文所用，轉錄因子旨在指調控給定基因是否轉錄成其相應RNA的多肽。在一些實施例中，本發明的轉錄因子包括但不限於SMAD-2、SMAD-3、SMAD-4、SMAD-5。在某些實施例中，本發明的轉錄因子包括但不限於AKT、ANG、ANGPT1、ANGPTL4、ANPEP、COL18A1、CTGF、CXCL1、EDN1、EFNA1、EFNB2、ENG、EPHB4、F3、FGF1、FGF2、FN1、HIF1A、ID1、IL6、ITGAV、JAG1、LEP、MMP14、MMP2、NRP1、PTGS1、SERPINE1、SERPINF1、TGFB1、TGFBR1、THBS1、THBS2、TIMP1、TIMP2、TIMP3、VEGFA、VEGFB、VEGFC。
如本文所用，骨原性因子旨在指促進成骨和/或消弱骨破壞的多肽。在一些實施例中，本發明的骨原性因子參與骨骼發育。本發明的骨原性因子的非限制性實例包括OPG、SDF-1α、BMPR-1A、BMPR-2、FGFR-1、FGFR-2、TWIST-1、CSF-1、IGFR、RUNX2、TGFBR-1。
在一些實施例中，因子內容物包括VEGF和/或IGF-1和/或SDF-1α。在不希望受限於特定理論的情況下，發明人認為諸如VEGF和/或IGF-1和/或SDF-1α的因子參與了癒合過程；VEGF，藉由促進血管生成；IGF-1，藉由與傷口癒合過程呈正相關，包括肌纖維母細胞趨化、促進膠原蛋白合成以及刺激纖維母細胞和角質形成細胞；以及SDF-1α，藉由針對傷口癒合促進幹細胞趨化。
在一些實施例中，因子內容物包括IGF-1和/或VEGF和/或SDF-1α 和/或(OPG)。
自下面的示例部分可以看出，在本發明的乾燥並且無菌的生物材料中，因子OPG、SDF-1α、BMPR-1A、BMPR-2、CSF-1、IGF1R、TWIST-1、SMAD-2、SMAD-3、SMAD-4、SMAD-5的平均相對量，相對於從相應的新鮮的、非無菌的、非乾燥的生物材料獲得的該內容物的平均相對量，增加了10%以上。
在一些實施例中，本發明的生物材料，每克(w/w)生物材料包含約0.1ng至約200ng的IGF-1，較佳每克生物材料約1ng至約150ng的IGF-1，更佳每克生物材料約10ng至約80ng。在本發明的範圍內，表述「每克約0.1ng至約200ng」包括每克約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190和200ng。
在一些實施例中，本發明的生物材料，每克(w/w)生物材料包含約0.1ng至約100ng OPG，較佳生物材料每克約1ng至約50ng。在本發明的範圍內，表述「每克約0.1ng至約100ng」包括每克約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100ng。
在一些實施例中，本發明的生物材料，每克(w/w)生物材料包含約0.1ng至約200ng VEGF，較佳生物材料每克約1ng至約150ng，更佳生物材料每克約20ng至約100ng。在本發明的範圍內，表述「每克約0.1ng至約200ng」包括每克 約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190和200ng。
在一些實施例中，本發明的生物材料，每克(w/w)生物材料包含約0.1ng至約20ng的VEGF，較佳每克生物材料約1ng至約15ng。在本發明的範圍內，表述「每克約0.1ng至約20ng」包括每克約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19和20ng。
在某些實施例中，本發明的生物材料，每克(w/w)生物材料包含約0.1ng至約400ng的SDF-1α，較佳每克生物材料包含約1ng至約250ng，更佳每克生物材料包含約10ng至約200ng更佳。在本發明的範圍內，表述「每克約0.1ng至約400ng」包括每克約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390和400ng。
在實施中，於合適的培養條件下，細胞分泌胞外基質並合成促進組織再生和/或組織修復的因子，包括多肽和核酸。該因子，包括多肽和核酸，可被認為是用於組織再生和/或組織修復的生物標記。
在實施中，可以藉由本領域已知的任何合適方法或由其適調的 任何方法來評估本發明的生物材料中作為多肽的因子的內容物。闡釋性地，可以在核酸層級或多肽層級監測這些生物標記的表達或不表達(無表達)。在核酸層級監測生物標記的方法的非限制性實例涵蓋使用特異性引子對從培養細胞中萃取的RNA進行RT-PCR(qPCR)分析。在多肽層級監測生物標記的方法的非限制性實例包括用標誌物特異性抗體進行的免疫螢光分析，例如西方墨點或酵素免疫分析法(ELISA)等；螢光活化細胞分選(FACS)；質譜分析和酶法測定。
在某些實施例中，所述因子內容物包括RNA內容物。
在一些實施例中，本發明的生物材料中包含的RNA的平均相對表達相對於來自相應的新鮮的、非無菌的、非乾燥的生物材料之該RNA的平均相對表達，至少約10%變化。
在某些實施例中，RNA內容物包含一種或多種miRNA。
在本發明的範圍內，在Ambros等人所著一文(microRNA註釋的統一系統。RNA 2003 9(3)：277-279)中已經描述了miRNA鑑定和命名的標準和慣例。可以從miRbase資料庫(http：//www.mirbase.org/)或miRDB資料庫(http：//www.mirdb.org/)輕鬆檢索miRNA序列。
在某些實施例中，RNA內容物包含至少一種miRNA，該miRNA係選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表10、表11或表12中的任何一者。
如本文所用，術語「至少一個」包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或更多。
表1：本發明的miRNA
Figure 109141731-A0202-12-0047-1
Figure 109141731-A0202-12-0048-3
在一些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下之群組：hsa-let-7a-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-411-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-505-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-24-3p、hsa- miR-382-5p、hsa-miR-2053、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-5096、hsa-miR-377-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-590-3p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-4449、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-3651、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-374a-3p、hsa-miR-199b-5p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-103b、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-99b-3p、hsa-miR-126-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-3605-3p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-6724-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-7847-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-miR-664b-3p、hsa- miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-98-3p、hsa-let-7i-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-1273a、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-664a-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-1291、hsa-miR-146b-5p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-4454、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-505-3p、hsa-miR-3609、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-34b-3p、hsa-miR-4461、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-663b、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-409-3p，以及其組合。
表2：本發明的miRNA
Figure 109141731-A0202-12-0050-5
Figure 109141731-A0202-12-0051-7
Figure 109141731-A0202-12-0052-8
在一些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下或由其組成之群組：hsa-let-7a-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-542-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-663a、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-2053、hsa-miR-143-3p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-3648、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-374a-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-532- 3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-214-3p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-409-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-543、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-5787、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-6089、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-5096、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-103b、hsa-miR-222-5p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-1273a、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-365b-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-4449、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-3960、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-6087、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-4454、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-655-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-7-1-3p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-miR-1291、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-425-5p、 hsa-miR-3605-3p、hsa-let-7i-3p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-6832-3p、hsa-miR-455-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-1271-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-4461、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-6724-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-3609、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-708-5p、hsa-miR-411-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-98-3p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-1237-5p、hsa-miR-4485-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-99b-3p，以及其組合。
表3：本發明的miRNA
Figure 109141731-A0202-12-0054-9
Figure 109141731-A0202-12-0055-10
Figure 109141731-A0202-12-0056-11
在一些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下之群組：hsa-let-7a-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-98-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-1273a、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-505-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-34b-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-2053、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-320b、hsa-miR-5096、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-505-5p、hsa-let-7c-5p、hsa- miR-151a-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-377-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-590-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-99b-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-222-3p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-374a-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-3605-3p、hsa-miR-103b、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-126-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-4454、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-7847-3p、hsa-miR-6724-5p、hsa-miR-369-5p，以及其組合。
表4：本發明的miRNA
Figure 109141731-A0202-12-0057-12
Figure 109141731-A0202-12-0058-13
Figure 109141731-A0202-12-0059-14
在某些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下或由其組成之群組：hsa-let-7a-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-6832-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-181b-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-320b、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-193a- 5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-99b-3p、hsa-miR-708-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-98-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-1237-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-2053、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-542-3p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-3648、hsa-miR-663a、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-374a-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-5096、hsa-miR-1246、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-409-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-543、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-5787、hsa-miR-4454、hsa-miR-4449、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-6089、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-103b、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-1273a、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-574-5p、hsa- miR-98-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-222-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-365b-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-3960、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-485-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-655-3p、hsa-miR-6087、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-7-1-3p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-miR-3605-3p、hsa-miR-130a-3p，以及其組合。
表5：本發明的miRNA
Figure 109141731-A0202-12-0061-15
Figure 109141731-A0202-12-0062-16
在一些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下之群組：hsa-let-7a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-30e-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-154-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-664a-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR- 320b、hsa-miR-1291、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-103b、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-3609、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-let-7i-3p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-4461、hsa-miR-196a-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-127-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-99b-3p、hsa-miR-663b、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-454-3p，以及其組合。
表6：本發明的miRNA
Figure 109141731-A0202-12-0063-17
Figure 109141731-A0202-12-0064-18
Figure 109141731-A0202-12-0065-19
在一些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下或由其組成之群組：hsa-let-7a-5p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-151a-3p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-320a、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-23a-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-3613-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-4461、hsa-miR-191-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-6724-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-103b、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-1291、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-320b、hsa-miR-22-5p、 hsa-miR-3609、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-411-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-let-7i-3p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-4485-3p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-3184-3p，以及其組合。
表7：本發明的miRNA
Figure 109141731-A0202-12-0066-20
在一些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下之群組：hsa-miR-3687、hsa-miR-619-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-4449、 hsa-let-7a-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-3651、hsa-miR-4454、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-663a、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-6723-5p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-6516-5p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-3648、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-4485-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-221-3p，以及其組合。
表8：本發明的miRNA
Figure 109141731-A0202-12-0067-21
Figure 109141731-A0202-12-0068-22
在某些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下或由其組成之群組：hsa-miR-210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-219、hsa-miR-29b、hsa-miR-4454、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-299-5p、has-miR-140-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-3609、hsa-miR-302b、hsa-miR-31、hsa-miR-1246、hsa-miR-663a、has-miR-221、hsa-miR-30、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-155、hsa-miR-30e、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-3651、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-17、hsa-miR-6832-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-181a、hsa-miR-433、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-486-5p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-335、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-34a、hsa-miR-106a、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-378、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-4449、hsa-346、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-10a、let-7a-5p、hsa-miR-374b-5p、let-7a、hsa-125b、hsa-miR-10a、hsa-miR-3687、hsa-miR-199b、hsa-miR-322、hsa-miR-148-a、hsa-miR-3653- 5p、hsa-miR-218、hsa-miR-21、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-148a、hsa-miR-96、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-135b、hsa-miR-22、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-203、hsa-miR-27、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-4485-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-6723-5p、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-154-5p，以及其組合。
表9：本發明的miRNA
Figure 109141731-A0202-12-0069-23
在一些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下之群組：hsa-miR-210-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-4454、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-342-3p，以及其組合。
表10：本發明的miRNA
Figure 109141731-A0202-12-0069-24
Figure 109141731-A0202-12-0070-25
在某些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下或由其組成之群組：hsa-miR-210-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-219、hsa-miR-21、hsa-miR-4454、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-299-5p、hsa-miR-96、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-302b、hsa-miR-22、hsa-miR-1246、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-548d-5p、hsa-miR-27、hsa-miR-222-3p、let-7a、hsa-miR-34a、hsa-miR-29b、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-199b、hsa-miR-378、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-6832-3p、hsa-miR-218、hsa-346、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-148a、hsa-10a、hsa-miR-3074-5p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-135b、hsa-125b、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-203、hsa-miR-322，以及其組合。
表11：本發明的miRNA
Figure 109141731-A0202-12-0070-26
Figure 109141731-A0202-12-0071-27
在一些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下之群組：hsa-miR-3687、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-6516-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-4485-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-3648、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-6723-5p、hsa-miR-3687、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-6516-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-221-3p，以及其組合。
表12：本發明的miRNA
Figure 109141731-A0202-12-0071-28
Figure 109141731-A0202-12-0072-29
在某些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下或由其組成之群組：hsa-miR-3687、hsa-miR-19a-3p、has-miR-221、hsa-miR-17、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-3651、hsa-miR-155、hsa-miR-433、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-885-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-181a、hsa-miR-335、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-320c、hsa-miR-106a、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-485-5p、has-miR-140-5p、hsa-miR-4485-3p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-31、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-3609、hsa-miR-4449、hsa-miR-30、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-30e、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-6723-5p，以及其組合。
在某些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下之群組：hsa-miR-210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-4485-3p、hsa-miR-6723-5p，以及其組合。
在一些實施例中，該至少一種miRNA係選自包含以下之群組：hsa-miR210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-4485-3p、，以及其組合。在某些實施例中，該至少一種miRNA係選自包含以下之群組：hsa-miR210-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-382-5p，以及其組合。
在某些實施例中，該至少一種miRNA係hsa-miR210-3p和/或hsa-miR-409-3p。
在一種實施例中，本發明的醫藥組成物包含至少兩種miRNA的治療有效量，miRNA係選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12。在另一實施例中，本發明的醫藥組成物包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20種miRNA的治療有效量，miRNA係選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12。
在一些實施例中，該組成物包含hsa-miR-210-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-3607-5p的組合。
在一些實施例中，該RNA內容物包含以下或由其組成：hsa-miR210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-382-5p、以及hsa-miR-4485-3p。在一些較佳的實施例中，該RNA內容物包含以下或由其組成：hsa-miR210-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-93-5p和hsa-miR-382-5p。
在一些實施例中，該組成物包含hsa-miR210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-382-5p，以及hsa-miR-4485-3p的組合。
在一些較佳的實施例中，該組成物包含hsa-miR210-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-93-5p和hsa-miR-382-5p的組合。在一些較佳的實施例中，該組成物至少包含hsa-miR210-3p。
在某些實施例中，miRNA的組合可以稱為miRNA摻混物。
在實施中，本發明的生物材料的RNA內容物可以藉由本領域已 知的任何合適的方法或從其適調的任何方法來評估。闡釋性地，RNA可透過商業試劑盒(例如來自Qiagen®的miRNeasy試劑盒)萃取；並進一步測序，例如借助高通量測序系統(例如Illumina®的NextSeq 500系統)。闡釋性地，可以使用Qiazol裂解試劑(德國Hilden的Qiagen®)和Precellys均質機(法國Bertin® instruments的Montigny-le-Bretonneux)。可以使用Rneasy mini試劑盒(德國Hilden的Qiagen®)純化RNA，並根據製造商的說明進行額外的管柱DNase消化。RNA的品質和數量可以使用分光光度計(Spectramax 190，Molecular Devices，California，USA)確定。可以使用用於基因表達輪廓的RT2RNA第一鏈試劑盒(德國Hilden的Qiagen®)透過訂製的PCR陣列(訂製的人類成骨和血管生成RT2Profiler分析-德國Hilden的Qiagen®)，自0.5μg的總RNA中合成cDNA。可以使用ABI Quantstudio 5系統(Applied Biosystems®)和SYBR Green ROX Mastermix(德國Hilden的Qiagen®)檢測擴增產物。可以根據△△CT方法進行定量。每個樣品的最終結果可以被標準化為三個持家基因(例如ACTB、B2M和GAPDH)表現量。
在某些實施例中，包括蛋白質和核酸在內的因子內容物係源自細胞。
在一些實施例中，至少一部分因子內容物是細胞的。在一些實施例中，至少一部分因子內容物是細胞miRNA。
在實施中，細胞miRNA可以藉由現有技術中已知的任何合適方法或由其適調的方法分離。例如，可以參考第7章：從分子複製的真核細胞中萃取，純化和分析mRNA：實驗室手冊(Russell and Sambrook；2001；Cold Spring Harbor Laboratory)。說明性地，可以按照製造商的指示透過商業試劑 盒來分離miRNA，例如，RNeasy Mini試劑盒(Qiagen®)或MagMax mirVana總RNA分離試劑盒(AppliedBiosystems®)。RNA濃度可以透過Nanodrop(ThermoFisher®,Waltham,Massachusetts,USA)確定。
在某些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下之群組：hsa-let-7a-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-30e-3p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-154-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-664a-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-320b、hsa-miR-1291、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-103b、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-3609、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-let-7i-3p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-660-5p、 hsa-miR-425-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-4461、hsa-miR-196a-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-127-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-99b-3p、hsa-miR-663b、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-454-3p，以及其組合。
在某些實施例中，至少一種miRNA係選自包含以下之群組：hsa-miR-210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-663a、hsa-miR-4485-3p、hsa-miR-6723-5p，以及其組合。
在一種實施例中，細胞miRNA係選自包含以下之群組：hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-let-7i-5p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-1273g-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-34a- 5p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-3074-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-320b、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-320a、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-3651、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-664b-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-103b、hsa-miR-1291、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-let-7i-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-1271-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-4461、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-6724-5p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-3609、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-4485-3p以及其混和物。
在某些實施例中，細胞miRNA係選自包含以下之群組：hsa-miR210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-4485-3p及其組合。
在某些實施例中，至少一部分因子的內容物由細胞分泌，較佳為胞外體或類胞外體囊泡的形式。在該實施例中，至少部分因子內容物包含在 胞外體或類胞外體囊泡中。在一些實施例中，至少一部分因子內容物是胞外體miRNA。
如本文所用，術語「胞外體」係指由體內幾乎所有細胞類型分泌的胞吞衍生的奈米囊泡。胞外體包含蛋白質、核酸，特別是miRNA和脂質。在實施中，胞外體可以根據現有技術中已知的任何合適方法或由其適調的方法分離和/或純化。說明性地，可以藉由差速離心自培養基分離胞外體級分、藉由聚合物沉澱、藉由高效液相層析(HPLC)。自培養基(分離胞外體級分)的差速離心法的非限制性實例可以包括以下步驟：
-以約300×g至約500×g的速度離心10-20分鐘，以去除細胞；
-以約1,500×g至約3,000×g的速度離心10-20分鐘，以去除死細胞；
-以約7,500×g至約15,000×g的速度離心20-45分鐘，以去除細胞碎片；
-以約100,000×g至約200,000×g的速度一次或多次超高速離心30-120分鐘，以使胞外體沉澱。
分離胞外體的替代方法，可以利用市售試劑盒，例如exoEasy Maxi Kit(Qiagen®)或Total Exosome Isolation Kit(ThermoFisherScientific®)。
在一些實施例中，胞外體或類胞外體囊泡的平均直徑為約25nm至約150nm，較佳為約30nm至120nm。在本發明的範圍內，表述「約25nm至約150nm」包括25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145和150nm。
在一種實施例中，胞外體miRNA係選自包含以下之群組：hsa-let-7a-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-let-7b- 5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-miR-98-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-1273a、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-505-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-34b-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-495-3p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-2053、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-320b、hsa-miR-5096、hsa-miR-378a-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-505-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-199b-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-377-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-590-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-26b-3p、 hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-miR-376c-3p、hsa-miR-99b-3p、hsa-miR-3651、hsa-miR-222-3p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-374a-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-485-5p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-3605-3p、hsa-miR-103b、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-126-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-4454、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-7847-3p、hsa-miR-6724-5p、hsa-miR-369-5p，以及其組合。
在一些實施例中，胞外體miRNA係選自包含以下之群組：hsa-miR-210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-4454、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-let7e-5p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-663a、hsa-miR-25-3p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-6516-3p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-3648、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-6516-5p、hsa-miR-3651、hsa-miR-3687、hsa-miR-664-5p、hsa-miR-664-3p，以及其組合。
在一種實施例中，胞外體miRNA係選自包含以下之群組：hsa-let-7a-5p、hsa-let-7b-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa- miR-574-3p、hsa-miR-23b-3p、hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-221-3p、hsa-miR-222-3p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-424-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-let-7d-3p、hsa-miR-4454、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-3184-3p、hsa-let-7c-5p、hsa-miR-337-3p、hsa-let-7d-5p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-130a-3p、hsa-let-7i-5p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-210-3p、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-320b、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-320a、hsa-miR-3074-5p、hsa-miR-376c-3p、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-625-3p、hsa-miR-99b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-5096、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-22-3p、hsa-miR-151a-3p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-193b-5p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-4449、hsa-miR-27a-3p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-98-5p、hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-374b-5p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-374c-3p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-196b-5p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-4668-5p、hsa-miR-660-5p、hsa-miR-664a-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-3651、hsa-miR-495-3p、hsa-let-7a-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-99b-3p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-2053、hsa-miR-29b-1-5p、hsa-miR-3648、hsa-miR-374a-3p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-136-3p、hsa-miR-361- 3p、hsa-miR-1246、hsa-miR-130b-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-154-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-576-5p、hsa-miR-874-3p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-103b、hsa-miR-1273a、hsa-miR-1306-5p、hsa-miR-138-5p、hsa-miR-15b-3p、hsa-miR-26b-3p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-655-3p、hsa-miR-7-1-3p、hsa-miR-23a-5p、hsa-miR-24-2-5p、hsa-miR-3605-3p、hsa-miR-6832-3p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-16-2-3p、hsa-miR-181b-5p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-376a-3p、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-708-5p、hsa-miR-98-3p、hsa-miR-1237-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-542-3p、hsa-miR-663a、hsa-miR-101-3p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-26a-5p、hsa-miR-27a-5p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-409-5p、hsa-miR-543、hsa-miR-5787、hsa-miR-6089、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-149-5p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-222-5p、hsa-miR-3613-5p、hsa-miR-365b-3p、hsa-miR-3960、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-6087、hsa-miR-92a-1-5p，以及其混合物。
在一些實施例中，胞外體miRNA係選自包含以下之群組：hsa-miR210-3p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-4454、hsa-miR-619-5p、hsa-miR-3607-5p、hsa-miR-3613-3p、hsa-miR-664b-5p、hsa-miR-3687、hsa-miR-3653-5p、hsa-miR-664b-3p，以及其組合。
在某些實施例中，與自相應的活的分化細胞(包括骨分化和/或軟骨分化細胞)獲得的因子和RNA內容物相比，該生物材料包含改變的因子和/或RNA內容物。
在某些實施例中，本發明的生物材料是多維生物材料，特別是以顆粒組成物、粉末、珠粒的形式。在一些實施例中，多維生物材料包含或由顆粒所組成，其中較佳為明膠、DBM或陶瓷顆粒，該顆粒被細胞和胞外基質所包覆。
在一些實施例中，利用該發明所屬技術領域中具有通常知識者可用之技術方法，將本發明的多維生物材料添加至或者被含有於至預定的3D形狀或支架，例如一塊凍乾的人類骨組織。在一些實施例中，利用該發明所屬技術領域中具有通常知識者可用之技術方法，將本發明的多維生物材料建構形成預定的3D形狀或支架，例如立方體。
在一些實施例中，多維生物材料為具有平均直徑約100μm至約1.5mm，較佳為約500μm至約1mm的顆粒形式。在本發明的範圍內，表述「約100μm至約1.5mm」涵蓋100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm和1.5mm。
在實施中，顆粒的平均尺寸的測量可以藉由現有技術中已知的任何合適的方法或由其適調的方法來進行。此類方法的非限制性實例包括原子力顯微術(AFM)、穿透電子顯微術(TEM)、掃描電子顯微術(SEM)、動態光散射(DLS)。
在一些實施例中，該乾燥的生物材料是藉由冷凍乾燥獲得的。
冷凍乾燥(Freeze-drying)，否則稱為凍乾(lyophilization)，可以根據任何一種現有技術所揭露的方法進行，或由其適調的方法進行。
在一些實施例中，生物材料的冷凍乾燥是在約-80℃的溫度和真空下進行的。
在實施中，滅菌可以藉由現有技術中已知的任何合適的方法或由其適調的方法來進行。合適方法的非限制性實例包括照射，例如電子束照射、X射線照射、γ射線照射或紫外線照射。
在某些實施例中，該無菌生物材料是藉由γ射線照射獲得的，其劑量較佳為約7kGy至約45kGy，更佳為室溫下。
在本發明的範圍內，表述「約7kGy至約45KGy」涵蓋7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44和45kGy。
在一些實施例中，生物材料係藉由約10kGy至約40kGy的劑量的γ射線照射獲得。
在本發明的範圍內，術語「室溫」係指稱包括約18℃至約22℃的溫度，其涵蓋18℃、19℃、20℃、21℃和22℃。在一些實施例中，室溫是大約20℃的溫度。
發明人觀察到，儘管經歷γ射線照射的樣品通常具有過熱並且有價值成分可能受到破壞的傾向，但是可以在室溫對本發明的生物材料進行γ射線照射而實質上不受過熱的影響。。
在一些實施例中，可以在低於約10℃的溫度進行γ射線照射，以在冰上(約0℃)較佳。在本發明的範圍內，低於約10℃的溫度涵蓋9.5℃、8℃、8.5℃、8℃、7.5℃、7℃、6.5℃、6℃、5℃、4℃、3℃、2℃、1℃、0℃、-1° C、-2℃、-3℃、-4℃、-5℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃和-80℃。
在實施中，可以對要進行滅菌的生物材料進行持續的γ射線照射，持續的時間取決於要滅菌的生物材料的大小(例如，以mm3或cm3表示)和/或量(例如，以mg或g表示)和/或給藥劑量。
在某些實施例中，γ射線照射可以進行約10秒至約24小時，較佳約5分鐘(300秒)至約12小時，更佳約10分鐘(600秒)至約3小時(10,800sec秒)。在本發明的範圍內，表述「約10秒至約24小時」涵蓋10秒、12秒、14秒、16秒、18秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分鐘、1分鐘30秒、2分鐘、2分鐘30秒、3分鐘、3分鐘30秒、4分鐘、4分鐘30秒、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、12分鐘、14分鐘、16分鐘、18分鐘、20分鐘、22分鐘、24分鐘、26分鐘、28分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、1小時30秒、2小時、2小時30秒、3小時、3小時30秒、4小時、4小時30秒、5小時、5小時30秒、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時和24小時。
在某些實施例中，該乾燥且無菌的生物材料是藉由冷凍乾燥和γ射線照射獲得的。
在某些實施例中，該生物材料是自體的。在某些實施例中，該生物材料是同種異體的。
在某些實施例中，該生物材料是異種的。在一種實施例中，該生物材料源自動物，例如脊椎動物、非人類哺乳動物或人類。
本發明涉及一種產生無菌和乾燥的生物材料的方法，該生物材料包含失活的分化細胞和顆粒材料，這些細胞和顆粒材料被埋入胞外基質，該方法包含以下步驟：
-(1)使(i)能夠經歷分化的活細胞與(ii)顆粒材料接觸，以獲得第一組合；
-(2)在培養基中培養步驟(1)中獲得的第一組合，使得細胞分泌胞外基質並合成因子內容物，以獲得組織再生和/或修復特性，並且其中細胞和顆粒材料埋入胞外基質，以形成多維結構。
-(3)將在步驟(2)中獲得的多維結構進行乾燥，以獲得乾燥的生物材料；
-(4)將步驟(3)中獲得的乾燥的生物材料進行滅菌以獲得無菌的乾燥的生物材料，較佳為藉由γ射線照射。
在一些實施例中，失活的分化細胞具有再生和/或修復特性。
本發明亦涉及一種方法，係用於產生無菌和乾燥的生物材料。該生物材料包含具有組織再生和/或修復特性的失活的分化細胞和明膠，該細胞和明膠被埋入胞外基質，該方法包含以下步驟：
-(1)使(i)能夠經歷分化的活細胞與(ii)明膠接觸，以獲得第一組合；
-(2)在培養基中培養步驟(1)中獲得的第一組合，以使細胞分泌胞外基質並合成因子內容物，以獲得組織再生和/或修復特性，其中細胞和明膠被埋入胞外基質，形成多維結構。
-(3)將步驟(2)中獲得的多維結構進行乾燥，以獲得乾燥的 生物材料；
-(4)將步驟(3)中獲得的乾燥的生物材料進行滅菌以獲得無菌的乾燥的生物材料，較佳為藉由γ射線照射。
如本文所用，表述「能夠經歷分化的活細胞」旨在指可以分化成具有組織再生和/或修復特性的細胞群的細胞。
本發明亦涉及一種方法，係用於產生無菌和乾燥的生物材料。該生物材料包含失活的骨分化的和/或軟骨分化的細胞和顆粒材料，該細胞和顆粒材料被埋入胞外基質，該方法包括以下步驟的：
-(1)使(i)能夠經歷骨原性和/或軟骨原性分化的活細胞與(ii)顆粒材料接觸，以獲得第一組合；
-(2)在培養基中培養步驟(1)獲得的第一組合，以使細胞分泌胞外基質並合成因子內容物，從而獲得骨原性和/或軟骨原性特性，並且其中細胞和顆粒材料埋入胞外基質，從而形成多維結構。
-(3)將在步驟(2)中獲得的多維結構進行乾燥，以獲得乾燥的生物材料；
-(4)將步驟(3)中獲得的乾燥的生物材料進行滅菌以獲得無菌的乾燥的生物材料，較佳為藉由γ射線照射。
如本文所用，表述「能夠經歷骨原性和/或軟骨原性分化的活細胞」旨在指可以在具有骨原性和/或軟骨原性特性的細胞中分化的細胞群。
如本文所使用的，術語「埋入」旨在表示「緊密地被包圍」或「成為的整體的一部分」。換言之，藉由「細胞和顆粒材料被埋入胞外基質」的文句，可以理解細胞、顆粒材料和胞外基質彼此緊密地連接在一起，並且三 種成分構成一個獨特的結構。
在一些實施例中，能夠經歷分化的活細胞選自包含以下的群組：初代細胞；幹細胞，特別是來自脂肪組織或骨髓、臍帶血的幹細胞；基因改造細胞；及其混合物。
在一些實施例中，初代細胞可以培養在適於允許細胞增殖或維持的培養基。
在某些實施例中，幹細胞和/或基因改造的細胞可以培養在允許細胞分化成具有組織再生和/或修復特性的細胞群的培養基。
在某些實施例中，幹細胞和/或基因改造的細胞可以培養在允許細胞分化成具有骨原性和/或軟骨原性特性的細胞群的培養基。
在某些實施例中，生物材料每克生物材料包含約102至約1016個細胞，較佳每克生物材料包含約106至約1012個細胞。在本發明的範圍內，表述「從102至約1016單細胞」涵蓋102、5x102、103、5x103、104、5x104、105、5x105、106、5x106、107、5x107、108、5x108、109、5x109、1010、5x1010、1011、5x1011、1012、5x1012、1013、5x1013、1014、5x1014、1015、5x1015以及1016個細胞。
如本文所用，「培養基」係指細胞生物學領域中普遍接受的定義，即，適於促進目的細胞生長的任何培養基。
在一些實施例中，合適的培養基可以包括化學成分確定的培養基，即僅含有特定組分的營養性培養基，較佳為已知化學結構的組分。
在某些實施例中，化學成分確定的培養基可以是無血清和/或無餵養細胞的培養基。如本文所用，「無血清」培養基係指不含添加的血清的培 養基。如本文所用，「無鍡養細胞」培養基係不含添加的餵養細胞的培養基。
本發明使用的培養基可以是水性培養基，其可以包括物質的組合，例如一種或多種鹽、碳源、胺基酸、維生素、礦物質、還原劑、緩衝劑、脂質、核苷、抗生素、細胞介素和生長因子。
合適的培養基的實例包括但不限於RPMI培養基、William's E培養基、Basal培養基Eagle(BME)、Eagle's最低必需培養基(EMEM)、最低必需培養基(MEM)、Dulbecco's改良的Eagles培養基(DMEM)、Ham's F-10、Ham's F-12培養基、Kaighn's改良的Ham's F-12培養基、DMEM/F-12培養基和McCoy's 5A培養基，可以進一步補充前述任何一種物質。
在一些實施例中，本發明的培養基可以是合成培養基，例如RPMI(羅斯威爾公園紀念學院培養基，Roswell Park Memorial Institute medium)或CMRL-1066(康諾特醫藥研究實驗室，Connaught Medical Research Laboratory)。
在實施中，兩種培養基可補充本領域常用的額外添加劑。在一些實施例中，額外添加劑可能旨在促進成骨、軟骨形成、肌肉生成、血管生成、神經生成、上皮生成、內皮生成、脂肪生成。在一些實施例中，額外添加劑可以旨在促進骨原性和/或軟骨原性。合適的額外添加劑的非限制性實例包括生長因子、轉錄因子、骨細胞活化劑、成骨細胞活化劑、破骨細胞抑制劑、軟骨細胞活化劑等及其混合物。
在實施中，培養參數如溫度、pH值、鹽度以及O2和CO2的量級係根據現有技術中建立的標準進行調節。說明性地，用於培養本發明的細胞的溫度可以為約30℃至約42℃，較佳約35℃至約40℃，並且更佳約36℃至約38℃。 在本發明的範圍內，表述「約30℃至約42℃」涵蓋30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃和42℃。
在一些實施例中，培養過程中CO2的量級保持恆定，範圍為約1%至約10%，較佳約2.5%至約7.5%。在本發明的範圍內，表述「約1%至約10%」涵蓋1、2、3、4、5、6、7、8、9和10%。
在某些實施例中，步驟(2)在一種或多種外源因子的存在下進行，外源因子係選自包含以下之群組：生長因子、轉錄因子、骨原性和/或軟骨原性因子、及其混合物。
在實施中，在合適的培養條件下，細胞分泌胞外基質並合成促進骨原性和/或軟骨原性的多肽和核酸。該多肽和核酸可以被認為是骨原性和/或軟骨原性特性的生物標記，並且可以透過前述提及的方法在多肽層級和/或核酸層級進行監測。
在某些實施例中，該生物材料還包含一種或多種具有骨原性和/或軟骨原性特性的外源因子，該外源因子選自包含以下之群組：生長因子、轉錄因子、骨原性和/或軟骨原性因子、成骨誘導或軟骨形成誘導核酸、及其混合物。
如本文所用，本發明的生物材料具有骨原性和/或軟骨原性特性。在實施中，向個體施用生物材料後，該生物材料的骨原性和/或軟骨原性特性得以本領域中可用的任何合適方法評估。說明性地，在向個體施用本發明的生物材料時，可以測量骨誘導性的生物標記。此類生物標記的非限制性實例包括BMPR-1A、BMPR-2、CSF-1、IGF-1R、RUNX2、SMAD-2、SMAD-3、SMAD-4、SMAD-5和TWIST-1。
本發明的一個方面涉及一種無菌且乾燥的生物材料，可藉由本發明的方法獲得。本發明的另一方面涉及一種醫藥組成物，其包含本發明的生物材料和藥學上可接受的載體。
如本文所用，「藥學上可接受的載體」係指任何溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和/或抗真菌劑、等滲透以及吸收延遲劑等。
在實施中，藥學上可接受的載體可包含選自以下群組之一種或多種成分：添加劑多肽；胺基酸；脂質和碳水化合物。在碳水化合物中，可以列舉糖，包括單醣、二醣、三醣、四醣和寡醣；衍生糖，例如醣醇，醛醣酸，酯化醣等；以及多醣或醣聚合物。
合適的藥學上可接受的載體的實例可包括多肽，例如明膠，酪蛋白等。
在一些實施例中，醫藥組成物為糊劑或膜的形式。
在某些實施例中，該糊劑是可模製的糊劑。在某些實施例中，可模製的糊劑或膜可以容易地處理、操作和移植。
本發明的另一方面涉及一種藥物，其包含本發明的生物材料。
本發明的另一方面涉及一種醫療器材，其包含本發明的生物材料或醫藥組成物。
在某些實施例中，醫療器材係用於局部應用的敷料。在一些實施例中，敷料可以包含織物或非織物。在一些實施例中，該醫療器材被本發明的組成物塗覆或與本發明的組成物塗覆。在某些實施例中，本發明的醫療器材被配置為容許醫藥組成物的受控釋放。在某些實施例中，醫療器材是糊劑的形式。
在一些實施例中，醫療器材係植入物。在一些實施例中，植入物可以是有機或無機支架的形式。在某些實施例中，植入物是可被吸收的。
本發明進一步涉及一種植入物，其包含本公開的多維生物材料。在某些實施例中，植入物是同種異體的。在某些實施例中，植入物是自體的。在某些實施例中，植入物是異種的。在某些實施例中，植入物被凍乾並滅菌，較佳藉由γ射線照射滅菌。
用途和方法可以在體內或離體進行。
一方面，本發明涉及一種本發明的生物材料或醫藥組成物，用於作為藥物。
在一些實施例中，本發明涉及一種本發明的生物材料或醫藥組成物，用於預防和/或治療組織疾病。
在一些實施例中，本發明的生物材料或醫藥組成物作為預防和/或治療骨疾病和/或軟骨疾病的用途。
本發明進一步涉及本發明的生物材料或醫藥組成物於生產或製備藥物中的用途，特別是在預防和/或治療組織疾病的用途。
本發明進一步涉及本發明的生物材料或醫藥組成物於生產或製備藥物的用途，以及本發明的生物材料或醫藥組成物於預防和/或治療骨疾病和/或軟骨疾病的用途。
本發明亦涉及一種於有需要的個體預防和/或治療組織疾病的方法，包括給予治療有效量的本發明的生物材料或醫藥組成物。
本發明亦涉及一種於有需要的個體預防和/或治療骨疾病和/或軟骨疾病的方法，包括給予治療有效量的本發明的生物材料或醫藥組成物。
在某些實施例中，該組織選自包含以下之群組：骨組織、軟骨組織、皮膚組織、肌肉組織、上皮組織、內皮組織、神經組織、結締組織和脂肪組織。
在一種實施例中，術語「組織」包括或由骨骼、軟骨、皮膚、肌肉、內皮、上皮、神經、結締組織和脂肪組織缺陷組成。
在某些實施例中，該組織疾病選自包含以下之群組：先天性皮膚形成不全；燒痕；癌症，包括乳癌，皮膚癌和骨癌；腔室症候群(CS)；水疱性表皮鬆解症；巨大先天性痣；下肢缺血性肌肉損傷；肌肉挫傷、破裂或拉傷；放射後病變；以及潰瘍，包括糖尿病性潰瘍，較佳糖尿病性足潰瘍；關節炎；骨折；骨脆弱；卡費氏症；先天性假關節；顱骨變形；顱骨畸形；骨折癒合延遲；骨浸潤性疾病；骨肥大；骨礦物質密度流失；代謝性骨質流失；骨發生不全；骨軟化症；骨壞死；骨量減少；骨質疏鬆症；佩吉特氏病(Paget’s disease)；假關節；硬化性病灶；脊柱裂；脊髓滑脫症；椎弓斷裂；軟骨發育不全；肋軟骨炎；內生軟骨瘤；拇指僵硬；髖關節內軟骨破裂；剝離性骨軟骨炎；骨軟骨發育異常；多發性軟骨炎；以及類似疾病。
在一些實施例中，該組織疾病選自包含以下之群組先天性皮膚形成不全；燒痕；癌症，包括乳癌，皮膚癌和骨癌；腔室症候群(CS)；水疱性表皮鬆解症；巨大先天性痣；下肢缺血性肌肉損傷；肌肉挫傷、破裂或拉傷；放射後病變；以及潰瘍，包括糖尿病性潰瘍，較佳糖尿病性足潰瘍。
如本文所用，術語「癌症」涵蓋實體癌，特別是選自包含以下或由其組成之群組：骨癌、腦癌、皮膚癌、乳癌、中樞神經系統癌、子宮頸癌、上消化道癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌、生殖細胞癌、膀胱癌、腎臟癌、 喉癌、肝癌、肺癌、神經母細胞瘤、食道癌、卵巢癌、胰臟癌、胸膜癌、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、小腸癌、軟組織肉瘤、胃癌、睾丸癌和甲狀腺癌。
在一些實施例中，骨疾病選自包含以下之群組：關節炎、骨癌、骨折、骨脆弱、卡費氏症(Caffey’s disease)、先天性假關節、顱骨變形、顱骨畸形、骨折癒合延遲、骨浸潤疾病、骨肥大、骨礦物質密度流失、代謝性骨質流失、骨發生不全、骨軟化症、骨壞死、骨量減少、骨質疏鬆症、佩吉特氏病(Paget’s disease)、假關節、硬化性病灶、脊柱裂、脊髓滑脫症以及椎弓斷裂。
在某些實施例中，軟骨疾病選自包含以下之群組：關節炎、軟骨發育不全、肋軟骨炎、內生軟骨瘤、拇趾僵硬、髖關節內軟骨破裂、剝離性骨軟骨炎、骨軟骨發育異常和多發性軟骨炎。
在一種實施例中，該生物材料或醫藥組成物係用於組織重建的用途。
在一種實施例中，組織重建選自包含以下或者由其組成的群組：骨重建、軟骨重建、真皮重建、肌肉或肌原重建、內皮重建、上皮重建、結締組織重建、神經重建和脂肪形成重建。
骨和皮膚重建的實例包括但不限於皮膚和/或表皮重建、傷口癒合、糖尿病性潰瘍治療(例如糖尿病足潰瘍)、燒傷後病變重建、輻照後病變重建、乳癌術後的重建或乳房畸形。
軟骨重建的實例包括但不限於膝軟骨重建、鼻子或耳朵重建、肋骨或胸骨重建。
肌原性重建的實例包括但不限於骨骼肌重建、腹壁破裂後重 建、下肢缺血性肌肉損傷後重建及腔室症候群(CS)相關的重建。
內皮重建的實例包括但不限於用於血管吻合術(例如靜脈動脈硬化分流術)的血管補片的再細胞化。
脂肪形成重建的實例包括但不限於美容手術、回春、脂質填充重建。
在一些方面，本發明涉及一種將本發明的生物材料或醫藥組成物用於皮膚重建的用途，以用於治療皮膚傷口較佳。
本發明亦涉及一種用於皮膚重建的方法，較佳用於治療皮膚傷口，該方法包含在有需要的個體中給予治療有效量的本發明的生物材料或醫藥組成物。
在一種實施例中，將本發明的生物材料、醫藥組成物或醫療器材用於治療皮膚組織疾病的用途。在一實施例中，將本發明的生物材料、醫藥組成物或醫療器材用於皮膚重建，包括真皮和/或表皮重建的用途。在一種實施例中，將本發明的生物材料、醫藥組成物或醫療器材用於皮膚和/或表皮的重建、傷口癒合、糖尿病潰瘍的治療，例如糖尿病足潰瘍、燒傷後病變的重建、輻照後病變的重建、乳癌後重建或乳房畸形。在一個特定的實施例中，將本發明的生物材料、醫藥組成物或醫療器材用於治療皮膚傷口的用途，較佳糖尿病皮膚傷口。在一種實施例中，本發明的生物材料、醫藥組成物或醫療器材用於促進傷口閉合。在一種實施例中，本發明的生物材料、醫藥組成物或醫療器材用於減小傷口的厚度，特別是在傷口癒合期間。
在特定的實施例中，本發明的生物材料、醫藥組成物或醫療器材用於治療水疱性表皮鬆解症、巨大先天性痣和/或先天性皮膚形成不全。
在另一方面，本發明涉及一種本發明的生物材料、醫藥組成物或醫療器材用於重建和/或美容手術的用途。
在一種實施例中，本發明的生物材料、醫藥組成物或醫療器材可以用於作為同種異體植入物或自體植入物。在一種實施例中，本發明的生物材料、醫藥組成物或醫療器材可以用於組織移植。
在一種實施例中，已經對該受試者的組織缺陷進行治療。在另一實施例中，尚未對該受試者的組織缺陷進行治療。
在一種實施例中，受試者對組織缺陷的至少一種其他治療無反應。
在一種實施例中，該受試者是糖尿病患者。在一種實施例中，該受試者患有糖尿病傷口。
在另一方面，本發明涉及一種將本發明生物材料或醫藥組成物，用於補償組織疾病的初級治療的副作用，和/或用於增強組織疾病的初級治療的用途。
本發明進一步涉及一種在有需要的個體補償組織疾病的初級治療的副作用，和/或用於增強組織疾病的初級治療的方法。該方法包含給予治療有效量的本發明的生物材料或醫藥組成物。
在某些實施例中，初級治療可以選自包含以下的群組：抗發炎治療、癌症治療、潰瘍治療、燒傷治療等及其組合。
在實施中，本發明的生物材料或醫藥組成物可以在初級治療之前、期間或之後給予。
一方面，本發明涉及一種本發明使用的生物材料或醫藥組成物 用於補償已知對組織具有有害作用的治療方法的副作用，該組織特別是骨組織、軟骨組織、皮膚組織、肌肉組織、上皮組織、內皮組織、神經組織、結締組織和脂肪組織。
在某些實施例中，該治療方法可以選自包含以下之群組：抗發炎治療、癌症治療、抗生素治療、免疫療法、化學療法等及其組合。
在另一方面，本發明還涉及一種本發明的生物材料或醫藥組成物用於促進成骨和/或減少破骨細胞生成和/或促進軟骨形成和/或減少軟骨破細胞(chondroclastogenesis)生成之用途。
在某些實施例中，該生物材料可以進一步用於促進血管生成之用途。
本發明進一步涉及一種在有需要的個體中促進成骨和/或減少破骨細胞生成和/或促進軟骨形成和/或減少軟骨破細胞形成的方法，該方法包括給予治療有效量的本發明的生物材料或醫藥組成物。
本發明的另一方面亦涉及本發明的生物材料或醫藥組成物用於降低異常或功能障礙的骨原性和/或軟骨原性的用途。在一些實施例中，本發明的生物材料或醫藥組成物用於回復異常或功能障礙的骨原性和/或軟骨原性之用途。
在一些實施例中，有需要的個體是患有或易患有骨骼疾病的個體，該骨骼疾病選自包含以下之群組：關節炎、骨癌、骨折、骨脆弱、卡費氏症(Caffey’s disease)、先天性假關節、顱骨變形、顱骨畸形、骨折癒合延遲、骨浸潤疾病、骨肥大、骨礦物質密度流失、代謝性骨質流失、骨發生不全、骨軟化症、骨壞死、骨量減少、骨質疏鬆症、佩吉特氏病(Paget’s disease)、假關 節、硬化性病灶、脊柱裂、脊髓滑脫症及椎弓斷裂。
在某些實施例中，有需要的個體是患有或易患有軟骨疾病的個體，該軟骨疾病包含選自以下之群組：關節炎、軟骨發育不全、肋軟骨炎、內生軟骨瘤、拇指僵硬、髖關節內軟骨破裂、剝離性骨軟骨炎、骨軟骨發育異常及多發性軟骨炎。
本發明的另一方面亦涉及本發明的生物材料或醫藥組成物用於補償骨骼疾病和/或軟骨疾病的初級治療的副作用，和/或用於增強骨骼疾病和/或軟骨疾病的初級治療之用途。
本發明進一步涉及一種在有需要的個體中補償骨疾病和/或軟骨疾病的初級治療的副作用，和/或增強骨疾病和/或軟骨疾病的初級治療的方法。其包含給予治療有效量的本發明的生物材料或醫藥組成物。
在某些實施例中，初級治療可以選自包含抗發炎治療、骨癌治療等及其組合之群組。
在實施中，本發明的生物材料或醫藥組成物可以在初級治療之前、期間或之後施用。
本發明的另一方面還涉及本發明的生物材料或醫藥組成物用於補償已知對骨骼和/或軟骨具有有害作用的治療方法的副作用。
在某些實施例中，該治療方法可以選自包含以下之群組：抗發炎治療、癌症治療、抗生素治療、免疫療法、化學療法等及其組合。
在某些實施例中，本發明的生物材料或醫藥組成物在使用前與下述任一種混合：等滲水溶液；支架材料；另一種醫藥組成物；醫療器材；生物來源的材料；及其任何組合。
在一些實施例中，本發明的生物材料或醫藥組成物可以以本領域現有技術所涵蓋的任何合適形式配製，例如以可注射溶液或懸浮液、錠劑、包衣錠劑、膠囊、糖漿、栓劑、乳膏、軟膏、乳液、凝膠等。
在某些實施例中，本發明的生物材料可以在給藥前被再水合化。說明性地，本發明的生物材料可以用無菌鹽水組合物再水合化，特別是包含約0.75%至約1.25%NaCl的無菌鹽水組合物，更佳為約0.90%NaCl的無菌鹽水組合物。
在一些實施例中，本發明的生物材料或醫藥組成物將被配製為油灰、潤膚劑、乳膏、軟膏、乳液、凝膠、藥膏、控釋基質、脂質體或脂質顆粒製劑、微膠囊或奈米膠囊、栓劑、經皮遞送系統或其任何組合。
在一些實施例中，生物材料或醫藥組成物為半固體形式。在一些實施例中，醫藥組成物為糊劑、軟膏、乳膏、膏藥或凝膠形式。在一些實施例中，醫藥組成物可以是可模製的糊劑或膜的形式，可以被操作和移植。
在某些實施例中，本發明的生物材料或醫藥組成物可以與合適的賦形劑一起加工成半固體形式，以糊劑較佳。通常用於生產糊狀基質的賦形劑為特別合適的賦形劑。本發明特別合適的是通常用於生產凝膠狀糊劑基質的賦形劑，例如凝膠形成劑。凝膠形成劑是與分散劑(例如水)形成凝膠的物質。本發明的凝膠形成劑的實例是片狀矽酸鹽、鹿角菜膠、黃原膠、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、藻酸、果膠、修飾纖維素或泊洛沙姆(poloxamers)。
在一些實施例中，生物材料或醫藥組成物是半固體形式，較佳是糊劑形式，可直接使用。在另一實施例中，醫藥組成物是半固體形式，較佳為糊劑形式，必須即時製備。
在一些實施例中，本發明生物材料中所包含的因子內容物，包括miRNA，被包封在內部，即，被固定在囊泡系統中。在一種實施例中，該包封是雙層包封。在另一實施例中，該包封是單層包封。在另一實施例中，該包封是基質包封(matrix encapsulation)。
在某些實施例中，包封因子內容物的囊泡(包括miRNA)是由生物聚合物製成的。在另一種實施例中，包封因子內容物(包括miRNA)的囊泡是細胞外囊泡。在一種特定的實施例中，包封因子內容物的囊泡(包括miRNA)是胞外體。在一些實施例中，胞外體是細胞衍生的胞外體，較佳為衍生因子內容物(包括miRNA)的胞外體。在另一個具體的實施例中，胞外體是經工程化的胞外體。
胞外體工程化可以藉由現有技術中已知的任何合適的或由其適調的方法來執行。例如，可以參考「胞外體工程化：貨物裝載和目標交付的當前進展」(Fu et al.,NanoImplant,2020,Volume 20,100261).。
根據一種實施例，本發明的生物材料、醫藥組成物、藥物或醫療器材藉由任何合適的途徑施用，包括腸內(例如口服)、腸胃外、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、鞘內、皮下、心室內、經皮、真皮內、直腸、陰道內、腹膜內、局部、黏膜、鼻、頰、舌下；藉由氣管內滴注、支氣管滴注和/或吸入；和/或作為口服噴霧劑、鼻噴霧劑和/或氣化噴霧劑使用。
根據一種實施例，本發明的生物材料、醫藥組成物、藥物或醫療器材是局部施用或藉由手術植入施用。
在一種實施例中，生物材料、醫藥組成物、藥物或醫療器材在組織疾病的部位施用。
在一種實施例中，將生物材料、醫藥組成物、藥物或醫療器材施用於骨骼和/或軟骨疾病的部位。
在某些實施例中，本發明的生物材料或醫療器材與一種或多種成分組合以生物列印該生物材料或醫療器材。
如本文所用，術語「生物列印」是指能夠製造模仿天然組織和/或器官的三維構造的技術。在一些實施例中，一種或多種成分包括天然聚合物，例如纖維素、明膠、藻酸鹽和幾丁聚醣；以及合成聚合物，例如聚乙烯聚合物、聚乙二醇聚合物。
對於合適的生物列印過程的實例，可以參考Aljohani等人(Internat.J.Biol.Macromol.,Volume 107,Part A,2018,p 261-275),Daly et al.(Adv Healthc Mater.2017 Nov；6(22))；Gu et al.(Adv Exp Med Biol.2018；1078：15-28),Matai et al.(Biomaterials.2020 Jan；226：119536)。本發明進一步涉及一種多維生物材料，其包括分化的人類間質幹細胞(MSC)、顆粒材料、胞外基質、血管內皮生長因子(VEGF)和類胰島素生長因子1(IGF-1)，其中分化的MSCs是失活的，其中失活的MSCs和顆粒材料被埋入胞外基質，並且其中多維生物材料富含胞外體或類胞外體的囊泡，該胞外體或該類胞外體的囊泡包含一種或多種促進正常組織分化和/或抑制異常組織分化的核酸。
在一些實施例中，生物材料是三維的。在某些實施例中，間質幹細胞是脂肪組織衍生的幹細胞(ASC)。在某些實施例中，ASC是晚期繼代ASC。在某些實施例中，藉由凍乾使MSC失活。在一些實施例中，對生物材料進行滅菌，可選擇藉由γ射線照射滅菌。在某些實施例中，凍乾和滅菌的生物材料保留其三維結構。在一些實施例中，VEGF和IGF-1具有生物活性。在某些 實施例中，生物材料每g包含至少10ng VEGF。在一些實施例中，生物材料每g包含至少60ng的VEGF。在某些實施例中，生物材料每克包含至少20ng IGF-1。在一些實施例中，生物材料每g包含至少40ng的IGF-1。在某些實施例中，胞外基質係由分化的MSC分泌，並包含一種或多種對軟組織或鈣化組織具有特異性的基質蛋白(matrisomal protein)。在一些實施例中，軟組織是真皮組織。在某些實施例中，鈣化組織是骨。在某些實施例中，胞外基質由分化的MSC分泌並包含膠原蛋白。在一些實施例中，顆粒材料選自由去礦質骨顆粒、明膠顆粒和陶瓷顆粒組成的群組。在某些實施例中，顆粒材料是去礦質的骨顆粒。在一些實施例中，顆粒材料是明膠顆粒。在某些實施例中，顆粒材料是陶瓷顆粒。在一些實施例中，陶瓷顆粒是磷酸鈣顆粒。在某些實施例中，磷酸鈣顆粒是羥磷灰石(HA)和/或β-磷酸三鈣(β-TCP)的顆粒。在一些實施例中，一種或多種核酸是一種或多種微RNA(miR)。在某些實施例中，一個或多個miR選自由miR-210-3p和hsa-miR-361-3p組成的群組。在一些實施例中，一個或多個miR是miR-210-3p。在某些實施例中，miR-210-3p促進成骨作用。在一些實施例中，一個或多個miR是hsa-miR-361-3p。
本發明的另一方面還涉及一種本公開用於生產多維生物材料的方法，該方法包含：
(a)以增殖培養基培養分離的人類MSC；
(b)以分化培養基分化MSC；
(c)向分化的MSC中添加顆粒物質，並以分化培養基進一步培養MSC，以產生多維組織；以及
(d)凍乾多維組織以產生多維生物材料。
在一些實施例中，該方法進一步包括(e)對多維生物材料任選地藉由γ射線照射進行滅菌。在某些實施例中，MSC是脂肪組織衍生的幹細胞(ASC)。在一些實施例中，步驟(c)將MSC分化為選自由成骨細胞、軟骨細胞、角質形成細胞、肌纖維母細胞、內皮細胞和脂肪細胞所組成的群組。在某些實施例中，顆粒材料選自由脫礦質骨顆粒、明膠顆粒和陶瓷顆粒所組成的群組。
本發明進一步涉及一種可藉由本公開的方法獲得的多維生物材料。
本發明的另一方面亦涉及一種醫療器材，其包含本公開的多維生物材料或本公開的植入物。
本發明亦涉及一種試劑盒，該試劑盒包含本發明的多維生物材料或本發明的植入物，以及合適的固定裝置。
本發明的另一方面涉及一種醫藥組成物，其包含本發明的多維生物材料和藥學上可接受的載體。
圖1A及圖1B是一組圖，顯示了在不同細胞濃度1%、10%、50%和100%(Tukey測試，n=3-6)的ASCs下，NVDX2(A)和NVDX3(B)的細胞生存力(以螢光度(RLU)表示)的比較。NVDX2的平均RLU 3.5，NVDX3的平均RLU-91.9、10%的ASC為6820.3和1%的ASC為2235。**p<0.01和***p<0.001；n.s=不顯著。
圖2A及圖2B是一組圖，顯示了在不同細胞濃度1%、10%、50% 和100%的ASC下，NVDX2(A)和NVDX3(B)的葡萄糖消耗(以毫莫耳(mmol)表示)的比較。(Fisher的LSD測試，n=3-6)。NVDX2的平均值為-0.0031mmol，ASC的平均值為0.0020mmol，NVDX3的平均值為-0.0011mmol，10%的ASC為0.0018mmol，1%的ASC為0.0020mmol。*p<0.05；**p<0.01和***p<0.001。
圖3A及圖3B是一組圖，顯示了在不同細胞濃度，1%、10%、50%和100%的ASC下，NVDX2(A)和NVDX3(B)的乳酸產量(以毫莫耳表示)的比較。(Fisher的LSD測試，n=3-6)。***p<0.001；****p<0.0001；n.s=不顯著。
圖4A至圖4D是一組作圖，顯示了NVD002(A)、NVDX2(A和B)、NVD003(C)、NVDX3(C和D)的水分含量(以%表示)。
圖5是顯示在明膠存在下自3D誘導獲得的生物材料NVD002(新鮮)、NVD002 lyo(凍乾)和NVDX2(凍乾和滅菌)中VEFG(以生物材料ng/g表示)的量的圖。
圖6是顯示在明膠存在下自3D誘導獲得的生物材料NVD002(新鮮)、NVD002 lyo(凍乾)和NVDX2(凍乾和滅菌)中IGF-1(以生物材料ng/g表示)的量的圖。
圖7是顯示在明膠存在下自3D誘導獲得的生物材料NVD002(新鮮)、NVD002 lyo(凍乾)和NVDX2(凍乾和滅菌)中SDF-1α(以ng/g生物材料表示)的量的圖。
圖8是顯示在明膠存在下自3D誘導獲得的生物材料NVD002(新鮮)、NVD002 lyo(凍乾)和NVDX2(凍乾和滅菌)中的總蛋白質量(以任意 單位表示)的圖。
圖9A及圖9B是一組圖，顯示了在NVD00X2(凍乾的NVD002)和NVDX2(凍乾並經γ射線照射的NVD002)中miR-199-5p(A)和miR-361-3p(B)的相對表現。
圖10A及圖10B是一組圖，顯示在缺血性和非缺血性肢體中CD3召集。平均值±SD包括總體上接受1次和2次NVDX2治療的大鼠(二「治療」組之間無差異)。A：缺血性肢體中CD3召集。B：非缺血性肢體中的CD3召集。該平均值係藉由數次HE染色的組織玻片獲得，於傷口區域的外圍和核心進行並混合在一起(CD3+細胞數/mm2)。
圖11A及圖11B是一組圖，顯示在缺血性和非缺血性肢體中的CD68召集。平均值±SD包含總體上接受1次和2次NVDX2治療的大鼠(二「治療」組之間無差異)。A：缺血性肢體中CD68召集。B：非缺血性肢體中的CD68召集。該平均值係藉由數次HE染色的組織玻片獲得，於傷口區域的外圍和核心進行並混合在一起(CD68+細胞數/mm2)。
圖12A及圖12B是一組照片，係藉由掃描電子顯微鏡所獲得，其顯示如實施例1中詳細描述在HA//β-TCP存在下3D誘導後獲得的新鮮的(NVD003)(A)和冷凍乾燥的、未經輻射照射的(NVDX3)(B)生物材料的微觀結構。上方區代表透過25放大倍數獲得的顯微視圖。下方區代表放大倍數為1200-1,300的顯微視圖。圖13A及圖13B是一組圖，顯示與HA/β-TCP相比，基因VEGFA(A)、VEGFB(B)在生物材料NVD003和NVD003lyo中的表現概況。*p<0.05。
圖14A至圖14D是一組圖，顯示與HA/β-TCP相比，基因SMAD2 (A)、SMAD3(B)、SMAD4(C)和SMAD5(D)在生物材料NVD003和NVD003lyo中的表現概況。*p<0.05；**p<0.01。
圖15A至圖15C是一組圖，顯示與HA/β-TCP相比，基因ITGAV(A)、ITGB1(B)和VCAM1(C)在生物材料NVD003和NVD003lyo中的表現概況。*p<0.05。
圖16A至圖16K是一組圖，顯示在HA//β-TCP存在下，基因ACVR1(A)、BMPR1A(B)、BMPR1B(C)、BMPR2(D)、CSF1(E)、EGFR(F)、FGFR1(G)、IGF1R(H)、RUNX2(I)、TGFBR1(J)和TWIST1(K)在自3D誘導獲得的生物材料NVD003和NVD003lyo中的表現概況。
圖17A及圖17B是一圖，顯示在新鮮的NVD003(a)和凍乾的NVD003(b)生物材料中miRNA子集合相對miRNA表現概況(A：hsa-miR-4485-3p；Let-7i-5p；hsa-miR-24-3p；hsa-miR-210-3p；B：miR-4454；miR-619-5p；miR-3607-5p；miR-3653-5p)。
圖18A及圖18B是一組圖，顯示在新鮮的NVD003以及凍乾和經γ射線照射的NVD003(NVDX3)的miR-210-3p(A)和miR-24-3p(B)的相對表現。
圖19是一圖，顯示凍乾的NVD003生物材料在12kGy或25kGy的輻照、室溫(RT)或-80℃(-80)條件下，OPG、IGF1和VEGF(以生物材料ng/g表示)的含量。
圖20是一圖，顯示在NVD003 lyo和NVDX3生物材料(經γ射線照射的凍乾的NVD003生物材料)中hsa-miR-210-3p的相對表現的圖。
圖21A及圖21B是一組圖，顯示在HA//β-TCP存在下，相對於自 3D誘導獲得的NVD003生物材料的劑量(mg)，獲得的破骨細胞形成的抑制量級(A)或成熟破骨細胞的抑制量級(B)。
圖22A及圖22B是一組圖，顯示相對於HA/β-TCP的劑量(mg)，獲得的破骨細胞形成的抑制量級(A)或成熟破骨細胞的抑制量級(B)。
圖23A及圖23B是一組圖，顯示在HA//β-TCP存在下，相對於自3D誘導獲得的NVDX3生物材料的劑量(mg)，獲得的破骨細胞形成的抑制量級(A)或成熟破骨細胞的抑制量級(B)。
圖24A及圖24B是一組圖，顯示在殼硬蛋白(SCL)存在10天下以及NVDX3生物材料存在或不存在的情況下，在骨原性分化培養基(「MD」；對照組)中，以脂肪幹細胞獲得的BGLAP(骨鈣化素)(A)或SPP-1(骨橋蛋白)(B)的相對誘導。
圖25是一圖，顯示在10ng/ml(SCL10)或100ng/ml(SCL100)殼硬蛋白存在或不存在的情況下以及NVDX3生物材料存在或不存在的情況下，骨原性分化培養基中脂肪幹細胞生存力的圖。與補充了0.5%人血小板溶解產物的骨原性分化培養基中的脂肪幹細胞的生存力相比，生存力以百分比表示(%vs MD 0.5%)。
圖26A至圖26X是一組圖，顯示RUNX-2(A)、BGLAP(B)、BMPR1A(C)、SMAD5(D)、SMAD2(E)、SPP-1(F)、CSF-1(G)、EGFR(H)、TWIST1(I)、TGFB-1(J)、TGFB2(K)、SMAD4(L)、ITGA1(M)、ITGA3(N)、ICAM1(O)、HIF1a(P)、THBS1(Q)、Leptine(R)、MMP-2(S)、EDN1(T)、ENG(U)、EFNA1(V)、VEGFA (W)和EFNB2(X)的相對量級(以誘導倍數表示)，作為生物材料NVDX3的時間(7天(7J)或14天(14J))和劑量(5mg、20mg或100mg)的變因。控制條件(C或CTL)在不存在NVDX3生物材料但存在分化培養基的情況下進行。
圖27A至圖27D是一組作圖，顯示10、20、40、100、200mg NVDX3或200mg HA/βTCP、Triton或分化培養基(MD)的細胞毒性(A)、生存力(B)、LDH含量(C)和DNA含量(D)，以百分比表示。
圖28A至圖28H是一組圖，顯示在HA/TCP、NVD003或NVDX3生物材料移植後的1個月(該生物材料係在HA//β-TCP存在下自3D誘導所獲得的)，BMPR1A(A)、CSF-1(B)、IGF1R(C)、TWIST1(D)、SMAD2(E)、SMAD3(F)、SMAD4(G)和SMAD5(H)的相對水準(以誘導倍數表示)。
圖29A及圖29B是一組圖，顯示隨著時間(植入後1、3、7、7、15和30天)推移，植入的雌性Wistar的血清中抗HLA IgM(A)或IgG(B)抗體量級的中值變化。植入係以HA/β-TCP、NVD003或NVDX3生物材料進行，該生物材料是在HA//β-TCP存在下自3D誘導獲得的。
圖30A及圖30B是一組作圖，顯示在10μM的地塞美松(GC，指糖皮質素)存在下，以3種不同劑量(20或50mg)的NVDX2或未含NVDX2培養48小時的HDFa(A)和ASC(B)的細胞生存力(以百分比表示)，並藉由代謝活性(CCK-8分析)進行測量，n=2，t檢定。
圖31A及圖31B是一組作圖，顯示在10μM地塞美松(GC，指糖皮質素)存在下，以2種不同劑量(20或50毫克)的NVDX2或未含NVDX2培養 48小時的HDFa(A)和ASC(B)的DNA定量(以百分比表示)，n=2，t檢定。
圖32A及圖32B是一組作圖，顯示在不存在(黑色曲線)NVD002-胞外體或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)和25μg/ml(淺灰色曲線)NVD002-胞外體時，人類骨肉瘤細胞H143B的增殖(A)和增殖損失的線性回歸(B)(灰色曲線)。(A)相對於細胞和胞外體的共培養時間，增殖以生存力(DO)表示。(B)結果以在每個時間點的活細胞與陰性對照(無胞外體)的百分比表示。**：p<0.01；***：p<0.005；****：p<0.0001；-：無統計差異。
圖33A及圖33B是一組作圖，顯示在不存在(黑色曲線)NVD003-胞外體或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)和25μg/ml(淺灰色曲線)NVD003-胞外體時，人類骨肉瘤細胞H143B的增殖(A)和增殖損失的線性回歸(B)(灰色曲線)。(A)相對於細胞和胞外體的共培養時間，增殖以生存力(DO)表示。(B)結果以在每個時間點的活細胞與陰性對照(無胞外體)的百分比表示。(*：p<0.05；**：p<0.01；-：無統計學差異。
圖34A及圖34B是一組作圖，顯示在不存在(黑色曲線)NVD002-胞外體或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)和25μg/ml(淺灰色曲線)NVD002-胞外體時，人類黑色素瘤細胞A375的增殖(A)和增殖損失的線性回歸(B)(灰色曲線)。(A)相對於細胞和胞外體的共培養時間，增殖以生存力(DO)表示。(B)結果以在每個時間點的活細胞與陰性對照(無胞外體)的百分比表示。*：p<0.05；**：p<0.01；****：p<0.0001；°°：p<0.01；°°°°：p<0.0001；-：無統計差異。
圖35A及圖35B是一組作圖，顯示在不存在(黑色曲線)NVD003-胞外體或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)和25μg/ml(淺灰色曲線)NVD003-胞外體時，人類黑色素瘤細胞A375的增殖(A)和增殖損失的線性回歸(B)(灰色曲線)。(A)相對於細胞和胞外體的共培養時間，增殖以生存力(DO)表示。(B)結果以在每個時間點的活細胞與陰性對照(無胞外體)的百分比表示。***：p<0.005；****：p<0.0001；°°°°：p<0.0001；-：無統計差異。
圖36A及圖36B是一組作圖，顯示在不存在(黑色曲線)NVD002-胞外體或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)和25μg/ml(淺灰色曲線)NVD002-胞外體時，人類神經膠質母細胞瘤細胞U87的增殖(A)和增殖損失的線性回歸(B)(灰色曲線)。(A)相對於細胞和胞外體的共培養時間，增殖以生存力(DO)表示。(B)結果以在每個時間點的活細胞與陰性對照(無胞外體)的百分比表示。*：p<0.05；****：p<0.0001；°°°°：p<0.0001；-：無統計差異。
圖37A及圖37B是一組作圖，顯示在不存在(黑色曲線)NVD002-胞外體或存在2.5μg/ml(深灰色曲線)和25μg/ml(淺灰色曲線)NVD002-胞外體時，人類神經膠質母細胞瘤細胞U87的增殖(A)和增殖損失的線性回歸(B)(灰色曲線)。(A)相對於細胞和胞外體的共培養時間，增殖以生存力(DO)表示。(B)結果以在每個時間點的活細胞與陰性對照(無胞外體)的百分比表示。***：p<0.005；****：p<0.0001；°°°°：p<0.0001；-：無統計差異。
藉由以下實施例進一步說明本發明。
實施例1：本發明的生物材料的生產
a)hASC的單離
遵循Coleman技術，在告知後同意和血清學篩檢後，在腹部透過脂肪抽吸(lipo-aspiration)收集人類皮下脂肪組織。
立即自收集的脂肪組織中分離出源自人類脂肪組織的幹細胞(hASC)。脂肪抽吸物(Lipoaspirate)可在+4℃保存24小時，或在-80℃保存更長時間。
首先，為了品質管控的目的，分離出一部分脂肪抽吸物，並測量脂肪抽吸物的剩餘體積。接著，以在HBSS中製備的膠原酶溶液(NB 1，德國海德堡的ServaElectrophoresis®GmbH)消化(最終濃度為~8U/mL)脂肪抽吸物。用於消化的酶溶液的體積是脂肪組織體積的兩倍。消化在37℃±1℃進行50-70分鐘。在15-25分鐘後進行第一次間歇搖動並在35-45分鐘後進行第二次間歇搖動。藉由添加MP培養基(增殖培養基或生長培養基)來停止消化。MP培養基包含DMEM培養基(4.5g/L葡萄糖和4mM Ala-Gln；德國哥廷根的Sartorius Stedim Biotech®)，添加了5%人類血小板裂解液(hPL)(v/v)。DMEM是一種標準的培養基，含有鹽、胺基酸、維生素、丙酮酸和葡萄糖，以碳酸鹽緩衝液緩衝，並且具有生理pH值(7.2-7.4)。所使用的DMEM包含Ala-Gln。人類血小板裂解物(hPL)是一種生長因子的富集來源，用於刺激間質幹細胞(例如hASCs)體外生長。
將消化的脂肪組織離心(500×g，10分鐘，20℃)並去除上清 液。再將沉澱的基質血管級分(SVF)重新懸浮在MP培養基中，並通過200-500μm的濾網。將過濾的細胞懸浮液第二次離心(500×g，10分鐘，20℃)。將含有hASC的沉澱重新懸浮在MP培養基中。可以保留一小部分細胞懸浮液用於細胞計數，並將全部剩餘的細胞懸浮液用於接種一個75平方公分的T燒瓶(下稱繼代P0)。進行細胞計數(僅供參考)，以估計接種細胞的數量。
分離步驟後的第二天(第1天)，自75平方公分的T瓶中取出生長培養基。以磷酸鹽緩衝液沖洗細胞3次，接著將新鮮製備的MP培養基加入燒瓶中。
b)人類脂肪組織衍生的幹細胞的生長和擴增
在增殖階段，將hASCs繼代4次(P1，P2，P3和P4)，以獲得足夠數量的細胞用於該程序的後續步驟。
在P0至第四繼代(P4)期間，將細胞培養在T燒瓶中，並加入新鮮的MP培養基。當匯合率
Figure 109141731-A0202-12-0112-177
70%和
Figure 109141731-A0202-12-0112-179
100%(目標匯合率：80-90%)時，將細胞繼代。將來自一批的所有細胞培養受體同時繼代。在每個繼代，以TrypLE(一種重組無動物的細胞解離酶)(選擇1X；75cm2燒瓶盛裝9mL、150cm2燒瓶盛裝12mL)自培養容器中分離細胞。在37℃±2℃進行TrypLe消化5-15分鐘，並藉由添加MP培養基終止。
接著將細胞離心(500×g，5分鐘，20℃)，並重新懸浮於MP培養基中。採集收穫的細胞並確保細胞懸浮液是均質的。重新懸浮後，計數細胞。
接著在繼代P1、P2和P3中，將剩餘的細胞懸浮液在MP培養基中稀釋至合適的細胞密度，並接種在較大的組織培養表面。在前述步驟期間，將 體積為15mL的細胞懸浮液接種至75cm2燒瓶，而體積為30mL的細胞懸浮液接種至150cm2燒瓶。在每個繼代中，細胞接種在0.5x104至0.8x104個細胞/cm2之間。在不同的繼代之間，每3-4天更換一次培養基。供體與另一供體之間的細胞行為和生長速率可能略有不同。因此，兩個繼代之間的持續時間以及繼代之間的培養基交換數量可以隨供體的不同而有異。
c)成骨分化
在繼代P4(即第四繼代)，將細胞第二次離心，並重新懸浮於MD培養基(分化培養基)中。重新懸浮後，第二次計數細胞，然後在MD培養基中稀釋至合適的細胞密度，接著將70mL細胞懸浮液接種在150cm2燒瓶中，並加入成骨MD培養基。根據該方法，在第四繼代之後，將細胞直接在成骨MD培養基中培養。因此，當細胞尚未達匯合時，將成骨MD培養基加入。
成骨MD培養基由補充有地塞美松(1μM)、抗壞血酸(0.25mM)和磷酸鈉(2.93mM)的增殖培養基(DMEM，Ala-Gln，hPL 5%)組成。
供體與另一供體之間的細胞行為和生長速率可能略有不同。因此，成骨分化步驟的持續時間和繼代之間的培養基交換數量可能因不同供體而有異。
d)細胞的多維誘導
如果在燒瓶中觀察到，當細胞匯合時出現形態學改變，並且如果至少一個類骨質結節(即在骨組織成熟之前形成的未礦化的骨基質有機部分)，開始對ASCs進行多維誘導。
-使用明膠顆粒的3D誘導
暴露於成骨MD培養基後，將含有匯合的單層黏附骨原細胞的培 養容器緩慢均勻地撒上明膠顆粒(Cultispher-S，Percell Biolytica，Astorp，瑞典)，濃度為1.5cm3/150cm2的容器。
將細胞維持在MD培養基中。在多維誘導過程中，每3至4天進行正常的培養基更換。以謹慎地防止明膠顆粒的去除和形成結構的方式進行培養基交換。
約15天後，無支架的3D培養物(NVD-002生物材料)已形成，將其與T燒瓶分離。加入顆粒後每隔3-4天更換一次培養基，維持培養5至8週。
-使用HA//β-TCP粒子(陶瓷粒子)的3D感應
-暴露於成骨MD培養基後，將含有匯合的單層黏附骨原細胞的培養容器緩慢均勻地撒上HA/β-TCP顆粒(比例為60/40)，3cc/cm2，150cm2燒瓶(Biomatlante®，法國)。
將細胞維持在MD培養基。在多維誘導過程中，每3至4天進行正常的培養基更換。以謹慎地防止明膠顆粒的去除和形成結構的方式進行培養基交換。
約15天後，無支架的3D培養物(NVD-003生物材料)已形成，將其與T燒瓶分離。加入顆粒後每隔3-4天更換一次培養基，維持培養5至8週。
e)冷凍乾燥和γ射線照射
將獲得的生物材料(下稱NVD002(明膠)和NVD003(HA/TCP))進一步冷凍乾燥(NVD002 lyo和NVD003 lyo))或冷凍乾燥並進一步滅菌以得到乾燥的無菌生物材料，以下分別稱為NVDX2和NVDX3。
冷凍乾燥係將新鮮的生物材料在-80℃和真空下昇華至少24小時(
Figure 109141731-A0202-12-0114-181
0.05mBar，-50°c，24-36小時)進行。
在約20℃至約-80℃的溫度使冷凍乾燥的生物材料達到約12kGy至約25kGy的劑量(持續730秒)進行滅菌。
實施例2：NVDX2和NVDX3生物材料中細胞的生存力
1.材料與方法
為了確定產物中活細胞的含量，將NVDX2或NVDX3的活體組織切片與已知濃度的ASC進行比較，ASC的濃度分別相當於活細胞的100%、50%、10%和1%。
將NVDX2和NVDX3置於2ml分化培養基(MD)中24小時。計算每個組織300mg中NVD003和NVD002活體組織切片的細胞數，估計為2.1×106細胞，此相當於100%的活細胞。ASC的增殖倍增時間為約30小時。
活細胞藉由兩種不同的方法確定：
1)培養24小時後，進行了細胞生存力測試(CellTiter-Glocell®生存力測定)，以評估ASC以及NVDX2和NVDX3活體組織切片中的活細胞。CellTiter-Glo®發光細胞生存力測定法是一種均質的方法，可基於對細胞內存在的ATP的定量來確定培養物中活細胞的數量，並表示存在代謝活性細胞。
2)培養24小時後，使用CedexBio®分析儀定量測定分化培養基中的葡萄糖或乳酸。葡萄糖的測定係基於NADPH的形成速率，並且與培養基中的葡萄糖濃度成正比。乳酸的測定是基於染料的產生，並且與培養基中L-乳酸的濃度成正比。
統計分析是由Prism GraphPad 2使用Tukey檢驗(所有成對比較)和Fisher的LSD檢驗(獨立比較)進行的多次比較所進行。*p值<0.05；**pvalue<0.01和***pvalue<0.001；n.s=不顯著。
2.結果
2.1 生存力
冷凍乾燥並進行γ射線照射後，藉由Cell Titer-GloCell®生存力測定法確定了活細胞的存在。該技術係基於對培養物中活細胞數量的估計，其係基於對細胞內存在的ATP的定量，此表示代謝活性細胞(=活細胞)存在。細胞是ATP的來源，所產生的發光與活細胞的數量成正比。如圖1A及圖1B所示，NVDX2和NVDX3中的活細胞百分比明顯小於10%。
2.2 葡萄糖消耗
冷凍乾燥並進行γ射線照射後，利用Cedex Bio分析儀測定培養基中的葡萄糖消耗，其反映活細胞消耗。該技術係基於對於培養基中活細胞消耗的葡萄糖的測定。
在己醣激酶(HK)存在下，葡萄糖被ATP磷酸化為6-磷酸葡萄糖(G-6-P)，其在6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PDH)存在下被NADPH氧化。NADPH的形成速率藉由紫外光度法測量，並且與葡萄糖濃度成正比。
葡萄糖+ATP→6-磷酸葡萄糖+ADP
6-磷酸葡萄糖+NADP+→6-磷酸葡萄糖脫氫酶+NADPH+H+
在NVDX2中，葡萄糖消耗量小於1%的活細胞消耗的葡萄糖(圖2A)，然而在NVDX3中小於10%活細胞消耗的葡萄糖(圖2B)。
2.3 乳酸生成
冷凍乾燥並進行γ射線照射後，利用Cedex Bio Analyzer測定培養基中乳酸的生成，其反映活細胞代謝的一部分。該技術的原理係基於測定活細胞在培養基中生成的乳酸。L-乳酸被乳酸氧化酶(LaOD)氧化為丙酮酸和 H2O2，在過氧化酶(POD)存在下生成染料。用光度法測量的染料吸收率與介質中L-乳酸的濃度成正比。
L-乳酸+O2→丙酮酸+H2O2
H2O2+H-供給者+4-AAP→H2O+色素原
NVDX2中的活細胞百分比顯示接近10%的ASC(圖3A)。然而，因為該值與(培養用的)孔的容積相關，該值可能無法反映乳酸的實際產量。NVDX2及其組成性明膠珠粒非常多孔並吸收介質中存在的液體，導致剩餘液體的體積少於2ml。與培養基+ASC中乳酸的存在相比，可用液體體積的減少對估計培養基中乳酸的存在有影響。乳酸被濃縮，導致剩餘活細胞的高估。因此可以推測，在NVDX2中剩餘的存活細胞百分比小於10%。對於10%的ASC，我們分別獲得了NVDX2(0.0037±0.0010mmol乳酸鹽)和0.0030(±0.0008mmol乳酸鹽)(圖3A)。
自10%的ASC中產生的乳酸鹽估計為0.0030mmol(±0.0008mmol)，卻只有0.0014mmol(±0.001mmol)(圖3B)。然而，由於樣本量小，差異不明顯。
2.4 結論
NVD002和NVD003是ASC和Cultispher-S或HA/βTCP顆粒分別包裹在胞外基質中的大型可模製結構化合物。冷凍乾燥和γ射線照射後，兩種3D移植物(分別為NVDX2和NVDX3)的結構均被強烈修飾。
考慮到研究可行性和關鍵細胞代謝物的平衡，我們的研究顯示，凍乾產物中的活細胞含量少於10%，在NVDX2和NVDX3產物中最多可能為1%。
實施例3：凍乾對於NVD002和NVD003生物材料的水分含量的影響
這項研究的目的是評估冷凍乾燥對NVD002和NVD003水分含量的影響。
1.材料與方法
a)活體組織切片
將NVD002和NVD003的活體組織切片分別與凍乾的NVD002(=NVD00X2)和凍乾的NVD003(NVD00X3)的活體組織切片進行比較，使用水分分析儀評估殘留水分含量。對於來自一位供體的NVD002和NVD00X2、一位供體的NVD003以及二位供體的NVD00X3進行分析。
b)水分分析
為了測定樣品的水分含量，我們使用了水分分析儀(Ohaus®，水分分析儀MB120)。此技術的原理是在開始時測定樣品的重量。樣品被乾燥器快速加熱並蒸發水分。在乾燥過程中，儀器會不斷測定樣品的重量。乾燥完成後，結果顯示為水分含量的百分比。
稱量NVD002、NVD003、NVD00X2和NVD00X3，接著將產物藉由紅外加熱，直到樣品不再失重並計算出水分。總重量損失係用於計算水分。
2.結果
NVD002是一種無支架、可延展和半透明的3D片狀結構。NVD003是無支架、可模製的白黃色3D結構。凍乾後的NVD00X2為如皮膚的粉紅褐色，乾燥為片狀；NVD00X3為白黃色乾粉。
凍乾後，藉由水分分析儀MB120 OHAUS ®測定水分。此技術的原理是在開始時測定樣品的重量。樣品被乾燥器快速加熱並蒸發水分。在乾燥過程中，儀器會不斷測定樣品的重量。乾燥完成後，結果顯示為水分含量%。
新鮮NVD002生物材料的水分含量約為90%(圖4A)，新鮮NVD003生物材料的水分含量約為55%(圖4C)。凍乾後，水分含量小於5%，即，NVD00X2小於2.5%(圖4A-B)；NVD00X3小於0.25%(圖4C-D)。我們觀察到良好的凍乾產物。
實施例4：生物材料NVD002、NVD002lyo和NVDX2的特徵；在明膠存在下3D誘導後獲得
1.材料與方法
a)從活體組織切片中分離出mRNA。按照製造商的流程使用miRNeasy試劑盒Mastermix(Qiagen®，Hilden，德國)萃取mRNA。RNA濃度藉由Nanodrop(ThermoFisher ®,Waltham，Massachusetts，USA)測定。
b)為了定量miRNA表現，使用qScript miRNA cDNA合成試劑盒(QuantaBiosciences®)將50ng RNA反轉錄為cDNA，並使用Perfecta SYBR Green Super Mix(QuantaBiosciences®)複製三份進行qRT-PCR。在Applied Biosystems 7900 HT檢測系統(AppliedBiosystems®)上進行熱循環。使用Delta-Delta Ct方法將數據標準化為miR-16-5p和U6核小RNA。
c)藉由差速離心自培養基分離胞外體，首先藉由提高離心速度沉澱出較大的「污染物」，接著再以很高的速度(~100,000×g)沉澱胞外體、小的細胞外囊泡甚至蛋白質聚集體。
2.結果
表13：來自純化胞外體的miRNA鑑定
Figure 109141731-A0202-12-0120-30
Figure 109141731-A0202-12-0121-31
表14：細胞miRNA的鑑定
Figure 109141731-A0202-12-0121-183
Figure 109141731-A0202-12-0122-33
表15：來自純化胞外體的miRNA與2D培養相比的水準
Figure 109141731-A0202-12-0122-34
Figure 109141731-A0202-12-0123-35
Figure 109141731-A0202-12-0124-36
表16：生物材料中細胞miRNA與2D培養相比的水準
Figure 109141731-A0202-12-0124-37
Figure 109141731-A0202-12-0125-38
與2D培養相比，自本發明的生物材料獲得的miRNA具有改變的miRNA內容物。例如，胞外體的和細胞的hsa-miR-210-3p和hsa-let-7i-5p均被上調，而胞外體的hsa-miR-664b-3p和hsa-miR-664b-5p以及細胞的hsa-miR-4485-3p和hsa-miR-6723-5p被下調。這顯示與新鮮的、非乾燥的、非凍乾的生物材料相比，凍乾和滅菌會影響生物材料NVDX2的性質。
實施例5：在明膠存在下由3D誘導獲得的組成物NVD002、NVD002 lyo和NVDX2的特徵
1.材料與方法
針對實施例1中在明膠存在下所獲得的「新鮮」生物材料樣品(NVD002)、乾燥的生物材料(NVD002 lyo)以及乾燥和滅菌的生物材料(NVDX2)進行處理以萃取蛋白質和miRNA。
a)蛋白質萃取
在24小時內於4℃自鹽酸胍[4M]、苯甲脒[5mM]、N-乙基馬來醯亞胺[10mM]、PMSF[1mM]中的未輻照和輻照樣品中萃取蛋白質，接著添加tris HCl[50mM]於pH 7.4的條件下處理5小時(均來自美國聖路易斯的Sigma-Aldrich®)，並透過脫鹽柱(美國芝加哥的PD10 de GEHealthcare®)純化。生長因子VEGF、IGF-1和SDF-1α含量的定量係藉由ELISA(人類VEGF定量ELISA試劑盒、人類SDE-1α定量ELISA試劑盒、人類IGF-1定量ELISA試劑盒；R & D Systems®，明尼亞波利斯，明尼蘇達州，美國)。
與新鮮的NVD002生物材料和乾燥的NVD002 lyo生物材料相比，在NVDX2生物材料中發現VEGF和SDF-1的蛋白質量級上調(分別參見圖5和圖7)。相反地，與NVD002 lyo生物材料相比，NVD002和NVDX2生物材料中IGF-1的蛋白質量級相當，並且被上調(見圖6)。總之，所有三種生物材料中的總蛋白質量級總體上相似(見圖8)。
b)miRNA萃取和RT-PCR
按照製造商的流程，使用miRNeasy試劑盒Mastermix(Qiagen®，Hilden，德國)萃取miRNA。RNA濃度藉由Nanodrop(ThermoFisher®,Waltham，Massachusetts，USA)測定。
為了定量miRNA表現，使用qScript miRNA cDNA合成試劑盒(QuantaBiosciences®)將50ng RNA反轉錄成cDNA，並使用Perfecta SYBR Green Super Mix(QuantaBiosciences®)複製三份進行qRT-PCR。在7900 HT檢測系統(AppliedBiosystems®)上進行熱循環。使用Delta-Delta Ct方法將數據標準化為miR-16-5p和U6核小RNA。
2.結果
如圖9A及圖9B所示，在NVD00X2(凍乾的NVD002)和NVDX2(凍乾並經γ射線照射的NVD002)之間，未觀察到miR-199-5p和miR-361-3p表現的顯著差異。
實施例6：NVDX2生物材料在高血糖和缺血模型中的功效
這項研究的目的係評估在Wistar大鼠模型中用作傷口包紮劑 NVDX2(來自人類)的生物粉末對於治療缺血/高血糖傷口中的功效。NVDX2是NVD002的冷凍乾燥、γ射線照射版本，它是一種無支架的3D移植物，由人類脂肪組織衍生的幹細胞(ASC)、豬明膠珠粒(Cultispher®S，Percell Biolytica ®，瑞典)混合所組成並埋入ASC產生的細胞外基質中。
1.材料與方法
a)實驗設計
NVDX2的功效係在高血糖Wistar大鼠(n=13)的局部缺血(相對於非局部缺血)傷口的異種(人對於大鼠)模型中評估。由13隻高血糖大鼠組成1實驗組，再根據傷口上NVDX2的使用次數分為2個亞組(僅在第1天使用，共1次(×1)，相對在第1天和第7天使用，共2次(×2))。
b)手術程序
這項體內研究已獲位於比利時B6900 AYE的生物技術部門CER-Groupe倫理委員會的批准。該程序係受到來自位於瑞士日內瓦的日內瓦大學醫學院「日內瓦高級大學」的整形、重建與美學手術部門開發的模型所啟發(André-Levigne et al.,Wound Repair and Regeneration.2016-Alizadeh et al.,Wound Repair and Regeneration.2007)。
這項研究使用了大約250-300g的13隻雄性Wistar大鼠。以腹膜內注射鏈佐黴素(STZ)[50mg/kg]誘發高血糖症，該大鼠的最小體重為250g。血糖超過9mM的動物被視為具有高血糖症並被納入研究。原13隻大鼠皆被納入研究。注射STZ後7至10天，對高血糖大鼠進行手術以誘導單側缺血模型。該模型係藉由切除大鼠左後肢的一部分股動脈(從腹股溝區域到膝蓋區域)而獲得的。該模型允許一隻大鼠在高血糖情況下出現缺血性(左後)和非缺血性(右 後)肢體。切除動脈部分後，縫合切口，將每小時輸送5μl丁丙諾啡[0.3mg/ml]的ALZET 2ML2泵以皮下放置在大鼠的背部。之後，藉由皮膚直到肌腱的切除在腳的後側造成1cm2的傷口並將測量工具放在一邊作為參考來拍照。接著將測試物施用於傷口。一隻老鼠在手術中死亡。
對於非缺血性肢體，將NVDX2倒在傷口覆蓋傷口。對於缺血肢體，滴入一些無菌生理溶液(2-3滴)以使NVDX2(粉末)「膠黏」在「乾傷口」。一旦將測試物放置在傷口，就形成了由一層Tegaderm®組成的繃帶，接著並置了另一層膠布，並在大鼠的脖子放置了特定的項圈。
c)後續
每天對動物進行臨床隨訪，並根據傷口的癒合進度，對大鼠實施安樂死、拍攝後肢的兩張照片，並將這些腳切開，置於10%的甲醛溶液中進行組織學分析。幾乎所有大鼠，在手術後第13天到第37天之間，每週拍攝三次中間照片。
d)終止程序
透過致死性腹膜內注射戊巴比妥犧牲動物。
e)傷口癒合的宏觀評估
透過測量自第0天到第37天拍攝的腳部照片的傷口面積，建立傷口癒合的動力學。
為了量化傷口閉合，由兩個獨立的操作員使用Image J軟體，藉由圖像分析來測量傷口面積。根據在D0和D37之間的每個時間點測量的傷口面積計算傷口的剩餘面積，並與定於100%的植入時間(D0)的傷口面積相比來表示。
為了描述傷口的收縮和上皮形成，將傷口區域分為傷口的不同組成部分：1)初始傷口(藍色區域)，2)無毛閉合傷口(白色；上皮化傷口)。藉由將無毛閉合傷口和未閉合傷口面積減去總傷口面積來計算收縮閉合的傷口。
f)組織病理學和2D組織形態分析
解剖腿以去除傷口組織，並以橫向方式定向該最新組織以獲得具有組織整個厚度的組織學玻片。製備5μm的組織學玻片，並用HE、TM、CD3、CD68、KU80和a-SMA染色。
進行CD3(T淋巴細胞)和CD68(巨噬細胞)免疫染色以評估免疫和發炎反應。使用NDPview2軟體手動計算CD3和CD68陽性細胞的數量。手動劃定感興趣的區域以定義該部分上「植入部位」的區域。
為了評估植入組織的促血管生成特性，對血管佔據的面積進行了定量(Masson's Trichrome染色)：根據組織特徵手動劃定了感興趣的區域，以定義該部分上「植入部位」的面積。手動描繪每個血管以量化感興趣區域中血管所佔據的面積。對應於血管的表面積及血管數量係呈現於「植入部位」的總面積。
進行KU80染色以標示人類細胞在植入部位的存在。進行aSMA免疫染色以量化導致傷口收縮的平滑肌纖維的存在。藉由在約2.9mm2的3個非重疊區域以放大倍數×10進行點計數來量化平滑肌纖維。在組織學玻片測量傷口的厚度以評估肥厚性瘢痕的形成。
g)圖像分析
使用NamView Photonics NDPView.2檢查組織玻片。圖像分析使用 NIH的ImageJ2進行。
2.結果
在接受鏈佐黴素注射的13隻大鼠中，所有鼠隻均為高血糖(血糖>9mM)並被選為研究對象，但是只有一隻發生手術的併發症，於手術過程中死亡，因此被排除在研究之外。
密切追蹤血糖和體重的演變以觀察高血糖狀態的維持並評估由於這種高血糖狀態而導致的體重減輕。藉由臨床血糖隨訪，可以觀察到所有大鼠在研究的整個體內階段都表現出
Figure 109141731-A0202-12-0130-182
9mM的血糖(直至安樂死)。
觀察到在STZ注射後(第一次或第二次)所有大鼠的體重略有下降，導致達到20%的臨界體重減輕(與首次STZ注射之前測量的體重相比)。
a)傷口癒合的宏觀評估
於隨訪期間和終點日拍攝傷口的宏觀照片。自手術後第15天(D15)開始，在接受NVDX2治療的非缺血性肢體中可以觀察到更好的傷口癒合，並且估計在手術後第22天和第23天(所有存活大鼠的平均值)達到傷口完全閉合。在接受NVDX2治療的缺血肢體中，自手術後第15天(D15)開始觀察到傷口癒合過程有所延遲，估計在手術後第31天(所有存活大鼠的平均值)達到傷口完全閉合。
在傷口照片上測量傷口閉合的動力學。在接受NVDX2治療的的最初7到8天內，傷口的表面保持不變，自第13到16天觀察到與傷口癒合相關的傷口的表面減少。非缺血性肢體的完全且不可逆的傷口閉合估計在接受NVDX2治療(1或2次NVDX2施用)後第22至23天之間達到。在缺血肢體中，在接受NVDX2治療後(第1或2次NVDX2施用)估計在第31天達到完全且不可逆的傷口 閉合(表17)。
表17：透過肉眼觀察完全閉合傷口所需的時間
Figure 109141731-A0202-12-0131-39
b)傷口癒合的微觀評估
在犧牲之日，觀察每隻動物蘇木精-曙紅染色後的組織學玻片。在兩隻早期犧牲的大鼠中，第2天可以觀察到全層傷口，而第15天發現了肉芽組織的發育。直到15天，測試物都清晰可見，但在稍後的時間點只能觀察到一些顆粒。
發現每個傷口在至多第36/37天完全癒合，並具有完整的上皮層(一隻大鼠的缺血性肢體(治療2倍)除外；一隻大鼠(治療1倍)第49天犧牲之後沒有的數據)。
在缺血性和非缺血性肢體中，在一隻大鼠的術後第28天(治療2次)和在術後第29天(一隻大鼠治療1次)觀察到完整的上皮層。與第29天的大鼠(治療1x1)的缺血肢體的上皮下層相比，在第28天，一隻大鼠的缺血肢體的上皮下層並未完全重組(治療2x)。
c)淋巴細胞CD3和巨噬細胞CD68的召集
圖10A及圖10B和圖11A及圖11B分別表示了在每個犧牲時間點非缺血性和缺血性傷口中CD3和CD68的召集。請注意每個「時間點」分析的大鼠 數量不同：第2天1隻大鼠的、第15天1隻大鼠、第28/29天2隻大鼠的和第36/37天7隻大鼠。
對於兩個接受治療的肢體，我們觀察到輕度和短暫的CD3+召集。第15天開始，非缺血性腿的CD3+召集(圖10A)在第28/29天達到峰值，接著在第36/37天出現明顯下降。缺血性肢體的CD3+召集(圖10B)則始於第28/29天達到峰值，接著在第36/37天略有下降。
區分不同的治療組，結果表示於表18和表19。平均值±SD，區分1次和2次接受NVDX2治療的大鼠。該平均值係透過在HE染色的組織玻片上計算數次所獲得，以在傷口區域的外圍和核心進行計數並混合(CD3+細胞/mm2)。
表18：缺血性腿中的CD3召集。
Figure 109141731-A0202-12-0132-40
表19：非缺血性腿中的CD3召集。
Figure 109141731-A0202-12-0132-41
從表19和表20中可以看出在兩個接受治療過的肢體中，以NVDX2治療一次的大鼠和以NVDX2治療二次的大鼠之間在第28/29天CD3+細胞召集的差異：29,4 CD3+細胞/mm2以及224,0 CD3+細胞/mm2和59,7 CD3+細胞/mm2與284,2 CD3+細胞/mm2(分別對應於缺血性肢體和非缺血性肢體)。
此差異可以藉由第一次施用後1週發生的第二次施用中針對NVDX2的免疫反應來解釋。免疫反應的誘發是由第二次NVDX2施用引起的，導致了經典的移植排斥反應。
在第28/29天觀察到的差異似乎在36/37天消除了，因為在兩個治療組中觀察到的CD3+細胞/mm2數量相近，在缺血性肢體和非缺血性肢體中分別為98,8±69,9(1×NVDX2)相對863±48,9(2x NVDX2)以及51,8±25,3(1x NVDX2)相對47,6±18,1(2x NVDX2)。第36/37天的數據係分別來自5隻和3隻大鼠的1x NVDX2和2x NVDX2的施用。
對於二個接受治療的肢體，從第15天開始觀察到，二個接受治療的肢體的CD68+召集增加(圖11A及圖11B)。缺血性肢體和非缺血性肢體的此種增加似乎將繼續或在隨後的幾天中維持，分別達到546,9±376,9 CD68+細胞/mm2和437,2±174,6 CD68+細胞/mm2。
表20和表21總結了區別不同治療組後獲得的結果。平均值±SD，區分1次和2次接受NVDX2治療的大鼠。該平均值係透過在HE染色的組織玻片上計算數次所獲得，以在傷口區域的外圍和核心進行計數並混合(CD68+細胞/mm2)。
表20：局部缺血性腿中的CD68召集。
Figure 109141731-A0202-12-0134-42
表21：非缺血性腿中的CD68召集。
Figure 109141731-A0202-12-0134-43
從表20和表21中可以看出，在二個接受治療的肢體中，在第28/29天接受一次NVDX2治療的大鼠和二次接受NVDX2治療的大鼠之間的CD68+細胞召集相似：缺血性和非缺血性肢體分別為477,1CD68+細胞/mm2相對413,2CD68+細胞/mm2以及404,0 CD68+細胞/mm2相對375,9 CD68+細胞/mm2。在第36/37天也觀察到CD68+細胞/mm2的相似性，缺血性和非缺血性腿分別為582,3±430,1(1×NVDX2)相對546,6±203,9(2×NVDX2)以及582,3±430,1(1×NVDX2)相對546,6±203,9(2×NVDX2)。
CD68召集可以藉由對異物的經典反應來解釋，二個治療組之間沒有任何區別(1x NVDX2與2x NVDX2)。
3.結論與討論
這項研究的目的是評估在Wistar大鼠模型中，凍乾和γ射線照射的生物繃帶NVDX2(源自人類)對於治療缺血/高血糖傷口的功效。
選擇這種公認的深層缺血/高血糖傷口模型係因為其係一種非常嚴格的缺氧傷口模型，與糖尿病患者的血管生成受損有關。實際上，在大多數情況下，慢性傷口是嚴重的組織缺血的結果，這在糖尿病患者或吸煙者中尤為常見。缺血已顯示會減少纖維母細胞複製、膠原蛋白產生、增加膠原蛋白降解並減少傷口收縮(Hunt et al.,Surg Gynecol Obstet 1972；Steinbrech et al.,J Surg Res 1999；Yamanaka et al.,J Dermatol Sci 2000；Alizadeh et al.,Wound Repair and Regeneration.2007).。
此外，高血糖會指數性地加劇局部缺血對傷口修復的負面影響，尤其是對傷口收縮和肌纖維母細胞分化的影響(Tobalem et al.,Plast Reconstr Surg Glob Open 2015)。類似地，體外缺氧抑制了肌纖維母細胞的分化(Modarressi et al.,J Invest Dermatol 2010)。
以NVDX2進行的這項研究，對13隻雄性Wistar大鼠進行了腹膜內注射[50mg/kg]STZ。血糖超過9mM證實了動物的高血糖狀態，並且在植入NVDX2之前藉由結紮一隻後肢的股動脈誘發局部缺血。
根據傷口的宏觀評估，在傷口的照片上測量傷口閉合的動力學。在接受NVDX2治療後的最初7到8天內，傷口的表面保持不變，自第13到16天觀察到與傷口癒合相關的傷口的表面減少。非缺血性肢體的完全且不可逆的傷口閉合估計在接受NVDX2治療(1或2次NVDX2施用)後第22至23天之間達到。在缺血性肢體中，在接受NVDX2治療後(第1或2次NVDX2施用)估計在第31天達到完全且不可逆的傷口閉合。
發現每個傷口至多在第36/37天完全癒合，並具有完整的上皮層。在缺血性和非缺血性肢體中，術後28天和術後29天觀察到完整的上皮層。
自植入後第15天至總傷口完全閉合時間的第36/37天，在NVDX2組(1x NVDX2和2x NVDX2)發現巨噬細胞浸潤。此種巨噬細胞召集被認為係對異物的典型反應，與短暫的T淋巴細胞召集有關，表示對植入產物的免疫反應，在某些情況下直至第37天才在真皮中發現。在第28/29天觀察到T淋巴細胞的召集高峰，一次或二次NVDX2施用的T淋巴細胞召集情況完全不同。此差異可以藉由第一次施用後1週發生的第二次施用中針對NVDX2的免疫反應來解釋。免疫反應的誘發是由第二次NVDX2施用引起，導致經典的移植排斥反應。這些數據顯示，NVDX2在嚴格的高血糖和缺血性深層傷口的異種模型中顯示出療效。
實施例7：藉由掃描電子顯微鏡對具有HA//β-TCP顆粒的實施例1中獲得的新鮮的(NVD003)和冷凍乾燥的、未輻照的(NVD003lyo)生物材料的比較分析。
NVD003和冷凍乾燥的NVD003(NVD003lyo)生物材料的樣品固定在2%的戊二醛中2小時內，接著在PBS中洗滌3次(3x10分鐘)。樣品在浴中以濃度不斷增加的乙醇脫水(10%、30%、50%、60%、70%、80%和100%)；每浴15分鐘。使用CPD臨界點乾燥儀乾燥樣品，並以金礦化。最後，使用SEM-FEG JEOL 7600F(JEOL®，日本)進行觀察。
圖12A表示NVD003生物材料的結構，而圖12B表示NVD003lyo生物材料的結構。NVD003lyo具有與NVD003相似的微觀結構，但以×25變焦觀察時，顆粒的平均尺寸明顯降低。此外，兩種材料皆貌似黏性顆粒，其中黏性係 由胞外基質和陶瓷材料展現。在NVD003生物材料中，所有顆粒似乎都由ECM連接。相反地，NVD003lyo生物材料似乎係藉由ECM連接的多個顆粒所組成。
實施例8：NVD003和NVD003lyo對體外骨髓MSCs基因表現的影響
這項研究的目的是評估NVD003和NVD003lyo生物材料誘導成骨細胞分化的能力。
1.材料與方法
骨髓間質幹細胞(BMSC)在含有或不含有100mg或500mg HA/bTCP；或100毫克或500毫克NVD003；或100毫克或500毫克NVD003lyo的基礎培養基(補充5%FBS的DMEM培養基)中培養。成骨細胞分化(MD)的陽性對照組係藉由在成骨細胞分化培養基(DMEM培養基中添加5%FBS、BMP-2(100ng/mL)、抗壞血酸(50μg/mL)和β-甘油磷酸(10mM))中培養MSCs進行。複製三份在6孔盤進行處理超過7或14天。在第7天和第14天，將細胞分離，冷凍在FBS 10%DMSO中。在培養基更新期間以及處理結束時亦收集上清液，保存在-20℃。
對每種經處理收集到的三份複製樣品中的一個複製樣品進行RNA萃取，以進行進一步分析。
首先在陽性和陰性對照樣品中對92個骨分化標記(使用Taqman®骨板陣列)進行基因表現圖譜分析。從該篩檢中，於存在骨分化培養基的情況下，在骨髓間質幹細胞(BMSC)中誘導的13個基因的表現似乎是2倍以上，(見以下表22、表23和表24)。每個樣品的mRNA表現量級標準化為在陰性對照中 測量的相應表現量級。
2.結果
更全面地，已經確定了三種基因的表現模式。第一種模式包括在NVD003和NVD003lyo生物材料經處理後誘導的基因(表22)。第二種模式包括在NVD003生物材料經處理後誘導的基因，但不包括NVD003lyo生物材料(表23)。最後，第三種模式包括在NVD003lyo生物材料經處理後誘導的基因，但不包括NVD003生物材料(表24)。
表22：在NVD003和NVD003lyo生物材料二者的處理後誘導的基因(MD：分化培養基)。
Figure 109141731-A0202-12-0138-44
Figure 109141731-A0202-12-0139-45
表23：在NVD003生物材料但無NVD003lyo生物材料的處理後誘導的基因。
Figure 109141731-A0202-12-0139-46
表24：在NVD003lyo生物材料但無NVD003生物材料的處理後誘導的基因。
Figure 109141731-A0202-12-0139-47
Figure 109141731-A0202-12-0140-48
這些結果證實了NVD003和NVD003lyo生物材料誘導的基因表現圖譜是不相同的。
實施例9：NVD003生物材料的冷凍乾燥對活體內生物活性的影響
1.材料與方法
對56隻雄性裸鼠進行了股骨臨界大小骨缺損(NVD003)的植入，該研究僅納入了42隻，分析：組織學、μCT掃描和q-RT-PCR(大鼠引子)。
植入後1個月，使用Qiazol裂解試劑(Qiagen®，Hilden，德國)和Precellys均質機(Bertin instrumcnts®，Montigny-le-Bretonneux，法國)從外植體中萃取總RNA。根據製造商的說明，使用Rneasy mini試劑盒(Qiagen®，Hilden，德國)純化RNA，並另外進行柱上DNase消化。RNA的品質和數量可以使用分光光度計(Spectramax 190，Molecular Devices，California，USA)確定。可以使用用於基因表達輪廓的RT2RNA第一鏈試劑盒(德國Hilden的Qiagen®)透過訂製的PCR陣列(訂製的人類成骨和血管生成RT2Profiler分析-德國Hilden的Qiagen®)，自0.5μg的總RNA中合成cDNA。可以使用ABI Quantstudio 5系統(Applied Biosystems®)和SYBR Green ROX Mastermix(德國Hilden的Qiagen®)檢測擴增產物。可以根據△△CT方法進行定量。每個樣品的最終結果可以被標準 化為三個持家基因(例如ACTB、B2M和GAPDH)表現量的平均值。
在植入後1個月，比較自本發明的生物材料獲得的外植體之間的成骨基因表現，接著測試八十四個成骨基因的外植體。
為了定量miRNA表現，使用qScript miRNA cDNA合成試劑盒(Quanta Biosciences®)將50ng RNA反轉錄為cDNA，並使用Perfecta SYBR Green Super Mix(Quanta Biosciences®)複製三份進行qRT-PCR。在Applied Biosystems 7900 HT檢測系統(AppliedBiosystems®)上進行熱循環。使用Delta-Delta Ct方法將數據標準化為miR-16-5p和U6核小RNA。
移植的1個月後外植移植物，以分子等級進行骨誘導。骨誘導的生物標記如下：VEGFA、VEGFB、IGF-1；SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5；ITGAV、ITGB1、VCAM1。
2.結果
對於新鮮的NVD003和NVD003lyo，在分子層級顯示出與整體相似的骨誘導曲線，當測定VEGF-A(圖13A)，SMAD-2至SMAD-5(圖14A至圖14D)ITGAV，ITGB-1和VCAM-1(圖15A至圖15C)時，與僅使用HA/βTCP顆粒相較更為優勢，。另一方面，與NVD003生物材料相比，NVD003lyo生物材料中VEGF-B的相對量顯著增加(圖13B)，而與NVD003生物材料相比，NVD003lyo生物材料中IGF-1的相對量顯著降低。
藉由對軟骨內骨化的阿新藍染色在組織學上證實了骨誘導作用(*)。
實施例10：與新鮮的NVD003生物材料相比，新鮮的NVD003生物材料的冷凍乾燥對成骨基因穩定性和miR細胞含量的影響
1.成骨基因的穩定性
如實施例3中所揭示的萃取總RNA。
當在NVD003和NVD003lyo生物材料中評估了骨骼發育的生物標記時，這些生物標記的量級具有總體上改變(圖16A至圖16K)。例如，與NVD003生物材料相比，NVD003lyo生物材料中因子ACVR-1、CSF-1、EGFR、FGFR-1、IGF-1R的平均相對量總體地增加。另一方面，與NVD003生物材料相比，NVD003lyo生物材料中的因子BMPR-1A、BMPR-1B、BMPR-2、RUNX2、TGFBR-2和TWIST-1的平均相對量總體地下降。新鮮生物材料NVD003的冷凍乾燥對ASC所表達的因子內容物具有整體上的影響。
2. miRNA內容物
2.1. RNA萃取
自NVD003、凍乾的NVD003(NVD003lyo)和凍乾/輻照的NVD003(NVDX3)的活體組織切片中進行mRNA分離。按照製造商的流程，使用miRNeasy試劑盒Mastermix(Qiagen®，Hilden，德國)萃取mRNA。RNA濃度藉由Nanodrop(ThermoFiSher®,Waltham，Massachusetts，USA)測定。
2.2.定量RT-PCR(qRT-PCR)
如實施例3中所揭露的方法定量miRNA表現。
2.3.胞外體純化
胞外體已藉由差速離心自培養基分離，在此之前，先藉由增加離心速度藉由沉澱以排除較大的「污染物」，其後再以極高的速度(~100,000×g)沉澱出胞外體、小的胞外囊泡甚至蛋白質聚集體。
2.4.結果
表25：來自純化胞外體的miRNA鑑定
Figure 109141731-A0202-12-0143-49
Figure 109141731-A0202-12-0144-53
表26：細胞miRNA的鑑定
Figure 109141731-A0202-12-0144-54
Figure 109141731-A0202-12-0145-55
Figure 109141731-A0202-12-0146-56
表27：與2D培養相比，NVD003生物材料中胞外體miRNA的量級
Figure 109141731-A0202-12-0146-57
Figure 109141731-A0202-12-0147-58
表28：與2D培養相比，NVD003生物材料中細胞miRNA的量級
Figure 109141731-A0202-12-0147-60
Figure 109141731-A0202-12-0148-61
NVD003和NVDX3生物材料之間的比較顯示，細胞miRNA內容物總體地發生了變化，單個miRNA的平均量增加或單個miRNA的平均量減少(圖17A及圖17B和圖18A及圖18B)。這些數據提示，新鮮的NVD003生物材料的冷凍乾燥對於由ASC分別合成和分泌的miRNA細胞和胞外體的含量具有總體的影響。
實施例11：對NVD003冷凍乾燥和γ射線照射對於新鮮NVD003和凍乾NVD003(NVD003lyo)之間的成骨基因穩定性和細胞miR圖譜的影響
在4種不同條件下(劑量(12kGy與25kGy)和溫度(20℃與-80°C))對來自3個供體的凍乾NVD003的活體組織切片進行了γ射線輻照照射，並與未經輻照的組織比較其生長因子以及mRNA表現。
將來自每個供體的約350mg的NVD003lyo生物材料的15個樣品稱重並置於玻璃瓶中。將三個樣品用作陰性對照組、未經輻照的樣品，並將12個樣品送至Sterigenics進行照射。陰性對照組的樣品亦被送至Sterigenics，並在與輻照樣品相同的條件下保存。
經過滅菌程序後，將樣品藉由ELISA進行蛋白質萃取和生長因子定量，以及透過q-RT-PCR和細胞miR-210-3p表現進行mRNA表現。
在24小時內於4℃自鹽酸胍[4M]、苯甲脒[5mM]、N-乙基馬來醯 亞胺[10mM]、PMSF[1mM]中的未輻照和輻照樣品中萃取蛋白質，接著添加tris HCl[50mM]於pH 7.4的條件下處理5小時(均來自美國聖路易斯的Sigma-Aldrich®)，並透過脫鹽柱(美國芝加哥的PD10 de GEHealthcare®)純化。生長因子VEGF、IGF-1和SDF-1α、OPG含量的定量係藉由ELISA(人類VEGF定量ELISA試劑盒、人類SDF-1α定量ELISA試劑盒、人類IGF-1定量ELISA試劑盒、OPG Duo Set Elisa、R & D Systems®，明尼亞波利斯，明尼蘇達州，美國)。
如實施例3中所揭露的方法萃取總RNA並定量。
在室溫或-80℃，以2種測試劑量(12kGy和25kGy)照射後，OPG、IGF-1和VEGF因子受到整體保存(圖19)。同樣地，生物材料的輻照對hsa-miR-210-3p的含量也沒有負面影響(圖20)。
雖然γ射線照射一般被認為會對多肽和核酸的結構產生顯著的負面影響，但實驗數據顯示，來自新鮮NVD003生物材料的因子內容物(多肽)和miRNA的細胞含量似乎都是保持不被γ射線照射降解。
實施例12：破骨細胞生成的抑制作用的體外評估
1.凍乾和γ射線照射對NVD003抑制破骨細胞成熟和活性的影響
1.1. NVDX3對破骨細胞前體分化的影響
自健康志願者的周邊血液中分離出人類CD14+單核細胞，並與「法蘭西．桑(EtablissementFrançaisdu Sang)」協議一致。
分離出周邊血液單核細胞後，將新鮮分離的前體接種並在補充有1%FBS、25ng/mL人類MCSF +/- 100ng/mL人類RANKL的培養基中於24孔培養盤中培養2小時(最短的細胞附著時間)。將5、20和100mg/孔的NVD003(n=3個供體)、HA/β-TCP(n=4個不同批次)以及NVDX3(n=3個供體)添加 到transwell中，於第4天更換培養基。
當存在多核細胞時，在5天或6天後(取決於CD14+細胞的供體)進行TRAP染色。在每個孔測定包含三個以上核的TRAP陽性細胞的數目。
1.2. NVDX3對成熟破骨細胞的影響(細胞毒性)
自周邊血液中分離出破骨細胞的前體細胞。藉由Ficoll-Hypaque離心分離周邊血液單核細胞後，對單核細胞(CD14+細胞)進行分選(MACS®，MiltenyiBiotec)。將新鮮分離的前體在M-CSF和RANKL(「加RANKL」對照)存在下分化5至6天(取決於CD14+細胞的供體)。沒有RANKL的培養基中的細胞作為陰性對照組(「無RANKL」對照)。當在陽性對照中觀察到多核細胞時，以5、20和100mg/孔的量加入NVD003(n=3個供體)、HA/βTCP(n=4個不同批次)和NVDX3(n=3個供體)。
加入NVD003、HA/β-TCP或NVDX3 48小時後，進行TRAP染色。在每個孔中測定包含三個以上核的TRAP陽性細胞的數目。
在新鮮的NVD003(圖21A及圖21B)和凍乾/輻照的NVD003(NVDX3；圖23A及圖23B)之間，劑量反應在破骨細胞成熟的抑制和破骨細胞活性的抑制得以維持，與單獨HA/β-TCP顆粒相比(圖22A及圖22B)，對破骨細胞成熟的抑制作用顯然更佳(功能測試分析了生物材料對破骨細胞生存力的影響)。當按劑量比較每種產品時，對破骨細胞生成和成熟破骨細胞的抑制作用沒有顯著差異。
2.凍乾和γ射線照射對NVD003促進成骨生成的影響
2.1.抵消殼硬蛋白的負面影響
將繼代4的脂肪幹細胞(ASC)置於12孔盤中2天，接著在骨分化 培養基(MD=陽性對照組)，MD+硬質蛋白(SCL)100mg/ml或者MD+硬質蛋白(SCL)100毫克/毫升+NVDX3 100毫克/孔，培養持續10天，其中在5天後更換培養基。另外，將細胞置於增殖培養基(MP)中作為陰性對照組。
培養10天後，將細胞置於Qiazol裂解試劑((Qiagen®，Hilden，德國)中進行RNA分離、萃取和定量，如實施例3所揭示。
在另一個實驗中，將繼代4的脂肪幹細胞置於骨分化培養基中的12個孔中以0.5%HPL(MD=陽性對照組)MD et 0.5%HPL+殼硬蛋白(SCL)10或者100mg/ml或者以0.5%HPL MD+殼硬蛋白(SCL)10或者100mg/ml+ NVDX3 400mg/孔連續11天。此外，將細胞置於5%的HPL的骨分化培養基中。透過RealTime Glo MT細胞生存力測定(Promega®G9711)在9天中的48小時追蹤生存力。實驗以二重複進行。
NVDX3中的miRNA內容物(凍乾和γ射線輻照後)顯示體外間質幹細胞(衍生自脂肪幹細胞)的成骨生成作用的促進。
如圖24A及圖24B所示，NVDX3生物材料抵消了殼硬蛋白在骨鈣蛋白(BGLAP)和骨橋蛋白(SPP-1)的成骨特性方面的負面影響。
此外，NVDX3(凍乾和輻照後)顯示在生存力方面具有拮抗硬化素對脂肪幹細胞作用的能力(圖25)。
2.2. NVDX3對成骨細胞前體分化的影響
評估了NVDX3的骨誘導作用。使用來自人類間質幹細胞的成骨細胞生成模型。根據供應商的建議融化間質幹細胞，將細胞接種並在燒瓶中培養基培養，培養基係供應商推薦用於細胞增殖的培養基(RoosterBio，KT-001)。
解凍後四天，用胰蛋白酶-EDTA將人類MSC分離並計數。將細胞以每孔2.104個細胞單層接種在24孔盤，其中該24孔盤係補充有1%FBS的DMEM培養基，培養4天(接種的日子指定為第4天)。在DMEM培養基中培養4天後，將細胞置於基礎培養基(DMEM 1%FBS+抗壞血酸(50μg/mL)和b-甘油磷酸酯(10mM))、分化培養基(陽性對照組)(DMEM 1%FBS+抗壞血酸(50μg/mL)和b-甘油磷酸(10mM)、地塞美松(10-8M)以及維生素D3(10-8M))或基礎培養基和NVDX3(n=2供體)，以5、20以及100mg/孔在transwell中(處理的第一天為「第0天」)。在第4天、第7天和第11天更換培養基及對其的處理。所有處理和對照組均以二重複進行。
在第7天和第14天使用Qiazol裂解試劑((Qiagen®，Hilden，德國)裂解細胞。如實施例8中所揭露的方式自細胞裂解物中萃取總RNA並定量。
成骨和血管生成基因的表現因評估時間(7天與14天)和所用測試項目的劑量而異。然而，如陽性對照組(分化培養基)中發現的，與陰性對照組(基礎培養基，設置為1)相比，經NVDX3處理後，大多數檢測基因在每種檢測劑量下至少是暫時的過度表現。這些結果顯示，NVDX3具有骨誘導特性，並且可以促進成骨細胞前體的骨分化(圖26A至圖26X)。此外，這些結果表示，NVDX3生物材料的成骨/血管生成作用是非接觸依賴性(contact-independent)的，並由可溶性因子介導。
2.3. NVDX3對成熟成骨細胞的影響(細胞毒性)
將SaOS2細胞接種於Mc Coy's培養基+10%FBS、1%P/S和0.1%雙性黴素B的12孔盤中2-3天，接著置於Mc Coy's 1%FBS和NVDX3(n=3)或將 HA/βTCP添加至transwell(帶有0.4μm孔聚酯膜插入物的12mm Transwell)中。將以下條件以三重複進行：
-細胞+含1%FBS+2%Triton「對照」的培養基
-細胞+含1%FBS「對照」的培養基
-細胞+含1%FBS+10mg NVDX3的培養基
-細胞+含1%FBS+20mg NVDX3的培養基
-細胞+含1%FBS+40mg NVDX3的培養基
-細胞+含1%FBS+100mgNVDX3的培養基
-細胞+含1%FBS+200mg NVDX3的培養基
-細胞+含1%FBS+200mg HA/βTCP(Biomatlante)的培養基
透過生存力測定細胞毒性測定在24h時評價細胞毒性，並評價LDH的產生。
陽性對照組(Triton)快速地顯示細胞毒性(圖27A)，無生存力(圖27B)、無與低DNA含量相關的細胞更新、「游離DNA」染色程度低(細胞毒性；圖27D))、無LDH產生(圖27C)。
基礎條件(MD)顯示出低細胞毒性(圖27A)，因此細胞更新率低。此與24小時低累積粒線體活性(低生存力；圖27B)、高DNA含量(圖27D)和中等LDH活性(圖27C)有關。
陰性對照組(HA/βTCP)顯示出低細胞毒性(圖27A)、高生存力(圖27B)，與高DNA含量(圖27D)以及中等的LDH活性(圖27C)有關。
自10mg/孔(12孔盤；圖27A)發現，劑量反應的細胞毒性作用 隨著NVDX3劑量的增加。與在MD中的細胞相比，在100和200mg的NVDX3發現了明顯更高的細胞毒性(p<0.01；圖27A)。反之，在200mg HA/βTCP未觀察到細胞毒性(圖27A)。然而，對高至200mg/孔的測試的NVDX3和HA/βTCP，測量到了相似的生存力(圖27B)、DNA含量(圖27D)和LDH產生(圖27C)。
3.結論與討論
這項研究的目的係描述NVDX3的抗吸收和成骨特性。使用人類破骨細胞生成的體外模型評估這些產品對人類破骨細胞形成和生存力的影響。此外，使用人類成骨細胞生成的體外模型研究NVDX3對人類成骨細胞的形成和生存力的影響。
於這項研究中，NVDX3在三種測試劑量(5mg、20mg和100mg)下顯示出對破骨細胞分化總體的抑制作用。該抑制作用在低劑量(5mg和20mg)NVDX3處理下的抑制作用與NVD00X、NVD003和HA/βTCP相比更為重要。
NVDX3亦顯示出對成熟破骨細胞的抑制作用，在5mg的化合物存在下，抑制破骨細胞35%生存力；在20mg的化合物存在下，抑制破骨細胞30%生存力，在100mg的化合物存在下，抑制80%生存力。
這些結果顯示，NVD003的抗吸收性能在冷凍乾燥和γ輻射照射後得以保持。
此外，已顯示NVDX3可以促進成骨細胞前體的骨分化，並且，儘管注意到成熟的成骨細胞具有細胞毒性作用，但它與快速的細胞更新有關，對細胞含量或細胞生存力沒有影響。
總之，NVDX3在體外具有抗吸收和成骨特性係與成骨細胞不具有細胞毒性相關。
實施例13：體內NVDX3的成骨作用的促進
1.骨誘導
單獨HA/βTCP和新鮮的NVD003相比，NVDX3(凍乾和γ射線照射後)在移植後1個月的分子層級顯示出明顯更高的骨誘導性(圖28A至圖28H)。
2.免疫反應-抗HLA1(抗人類白細胞抗原1)抗體檢測
就抗體產生(抗HLA)而言，這種顯著較高的骨誘導(在分子層級)與顯著較低的免疫反應有關，顯示凍乾輻照的NVD003(NVDX3)具有耐受性。
為了評估Wistar大鼠在臨界尺寸骨缺損情況下NVD003(或HA/β-TCP或NVDX3)植入後的體液反應，我們使用FlowPRATM I類篩選測試技術。根據我們調查的Ig類型，該流程相當不同。
a)抗HLA1 IgG檢測
在適當的試管中，根據製造商的指示，將血清樣品與FlowPRATM I類篩選測試珠粒(One Lambda®，美國-FL1-30)混合。在黑暗中於20℃培養30分鐘。以9,000×g、2分鐘的離心步驟進行0.5%PBS-BSA的兩次洗滌。加入生物素化的抗IgG(BioLegend®，美國-405428)後在黑暗中於20℃培養30分鐘。以9,000×g、2分鍾的離心步驟進行0.5%PBS-BSA的兩次洗滌。加入PE-鏈黴親和素(BD Biosciences®，美國-554061)後在黑暗中於20℃培養30分鐘。以9,000×g、2分鐘的離心步驟進行0.5%PBS-BSA的兩次洗滌。加入0.5%的 PFA，轉移到讀板(reading plate)中，並以細胞儀(Beckman Coulter)計數獲得5,000至10,000珠。
b)抗HLA1 IgM檢測
在與特定珠粒混合之前，必須將血清樣品中的IgG消耗掉。藉由添加生物素化的抗IgG(BioLegend®，美國-405428)至樣品進行消耗，接著在4℃的黑暗中培養20分鐘。加入磁珠粒與鏈黴素(streptavidin)(Streptavidin Particles Plus-DM-BD Biosciences®，美國-557812)，並放置在電磁工作檯上7分鐘、20℃。將上清液移轉到新試管中。根據製造商的指示，將血清樣品與FlowPRATM I類篩選測試珠粒(美國La One，FL1-30)混合。在黑暗中於20℃培養60分鐘。以9,000×g、2分鐘的離心步驟進行0.5%PBS-BSA的兩次洗滌。加入生物素化的抗IgM(BioLegend®，美國-408903)，接著在黑暗中於20℃培養30分鐘。以9,000×g、2分鐘的離心步驟進行0.5%PBS-BSA的兩次洗滌。加入PE-鏈黴素(BDBiosciences®，美國-554061)，接著在黑暗中於20℃培養30分鐘。以9,000×g、2分鐘的離心步驟進行0.5%PBS-BSA的兩次洗滌。加入0.5%的三聚甲醛，轉移到讀板中，並用細胞儀(BeckmanCoulter®)計數獲得5,000至10,000個珠。
如圖29A及圖29B所示，NVDX3生物材料的移植不會導致抗HLAIgM免疫反應的誘發(圖29A)，並且導致抗HLA IgG免疫反應的誘發較差(圖29B)。這些實驗數據顯示，NVDX3生物材料可能適用於同種異體移植。相較之下，NVD003生物材料在移植時促進抗HLA IgM和IgG免疫反應兩者，其證實了僅能用該生物材料進行自體移植。
實施例14：NVDX2對糖皮質激素暴露的ASC和HDFa的影響
1.材料與方法
根據實施例1(n=2，來自2個不同的供體)生產NVDX2生物材料。在DMEM+1%FBS和DMEM+1%hPL中，將地塞美松((Aacidexam®，注射用5mg/mL溶液，批號09169TB24)稀釋至最終濃度10μM。
將人類真皮纖維母細胞(HDFa；Cell Applications®，目錄號：106-05a)以12,000個細胞/cm 2的密度接種在12孔盤中，並在DMEM+10%FBS中培養。ASC(在P5)亦以12,000個細胞/平方公分的密度接種在12孔盤中，並在DMEM+10%hPL中培養。培養24小時後，將HDFa的培養基更改為DMEM+1%FBS，將ASC的培養基更改為DMEM+1%hPL，暴露於0或10μM地塞美松，並放置於存在NVDX2(20mg或50mg)或不存在NVDX2的Transwells中。暴露後48小時，藉由CCK-8(SigmaAldrich®，細胞計數試劑盒-8)測量增殖細胞的代謝活性。隨後，藉由TE緩衝液(1x)裂解細胞並將裂解液以12,000xg離心5分鐘來進行DNA萃取。根據製造商的說明，藉由Quant iT PicoGreen® dsDNA試劑盒測定上清液中的dsDNA含量。
2.結果
根據代謝活性(圖30A及圖30B)和DNA定量(圖31A及圖31B)，HDFa和ASCs暴露於糖皮質素(地塞美松)48h後會降低細胞的細胞生存力。但是，NVDX2的存在會在暴露時間內增加HDFa和ASC的細胞生存力，這表示NVDX2可以補償糖皮質素對細胞增殖的抑制作用。在兩種劑量(20mg和50mg)下均可觀察到這種效果，並藉由DNA定量證實。
對於ASC，在GC存在下幾乎觀察不到DNA量的減少(圖31B)。然而，NVDX2的存在會增加暴露時間和兩種劑量下ASC培養物中的DNA量。
3.結論
這些數據顯示NVDX2對HDFa和ASC的糖皮質素(地塞美松)副作用的補償。
實施例15：源自NVDX2和源自NVDX3胞外體的抗增殖特性
1.材料與方法
1.1.癌細胞系
將三種腫瘤細胞系用作靶細胞：H143B人類骨肉瘤細胞獲自ATCC®(CRL-8303TM)；A375人類黑色素瘤細胞獲自ATCC®(CRL-1619TM)；U87人類膠質母細胞瘤細胞獲自ATCC®(HTB-14TM)。
1.2.方法
a)NVD002生物材料的製備
在知情後同意以及進行血清學篩檢後，藉由吸脂術(遵循腹部區域的Coleman技術)收集人體皮下脂肪組織。
接著，於37℃±1℃的漢克斯平衡鹽溶液(Hanks’Balanced Salt Solution)中，用膠原酶溶液(ServaElectrophoresis®GmbH，海德堡，德國)消化脂肪抽吸物50-70分鐘。藉由添加MP培養基(增殖培養基由Dulbecco’s modified Eagle’s medium，4.5g/L葡萄糖/Ala-Gln(UltraGlutamine(Lonza®)或Glutamax®(Gibco®)組成)，並添加5%人類血小板裂解液、1%的青黴素/鏈黴素來終止消化。將消化的脂肪組織離心(500×g，在室溫放置10分鐘)，棄去上清液。將沉澱的基質血管級分(SVF)重新懸浮於MP培養基中並通過一個200-500μm的濾網。將過濾後的細胞懸浮液離心(500×g，10分鐘，20℃)。將含有hASC的沉澱重新懸浮於MP培養基中。將細胞懸浮液的樣品用於接種75cm2 T型燒瓶(繼代P0)。
在P0和第四繼代(P3/P4)之間，將細胞培養在T瓶中，並加入新鮮的增殖性培養基(MP)。該培養基由DMEM培養基(4.5g/L葡萄糖和4mM Ala-Gln)組成，並添加了5%hPL(v/v)，pH為7.2-7.4。當達到約80-90%的細胞匯合率時，對細胞進行繼代。在每個繼代中，使用TrypLE®(選擇1X)將細胞從培養容器中分離出。在37℃±2℃進行TrypLE消化5-15分鐘，並藉由添加MP培養基(增殖性培養基)停止。然後將細胞離心(500×g，5分鐘，室溫)，並重新懸浮於MP培養基(增殖性培養基)中。
在第四繼代(P3/P4)，將細胞接種在可重新封閉的細胞培養瓶(150cm2)中，並添加骨原性分化培養基(MD)，該培養基係由補充有地塞美松(1μM)、抗壞血酸(0.25mM)和磷酸鈉(2.93mM)所組成的增殖性培養基(DMEM、Ala-Gln、hPL 5%)。對於分化階段(MD培養基)，細胞懸浮液的體積標準化為每150cm270ml。
當細胞達到匯合狀態，並且如果出現形態變化，並且如果在每個燒瓶中觀察到至少一個類骨結節(在骨組織成熟之前形成的未礦化的骨基質有機部分)時，則可以開始3-D誘導。
在裝有匯合的單層附著的骨原細胞的培養容器中撒上Cultispher顆粒(150平方公分容器中1.5cc)。加入「Cultispher」後的幾天，骨原細胞和分散的顆粒逐漸包埋在礦化的胞外基質中。
幾日後，骨原細胞和Cultispher顆粒開始形成一個大的三維斑塊(或幾個較小的斑塊)，部分礦化的半透明和可延展的膜從每個培養容器中分離出來。在3D誘導過程中，每3至4天進行正常的培養基更換。小心地防止去除 培養物顆粒和形成一個或多個結構進行介質交換。
約15天後，形成無支架的3D培養物(NVD-002)，並將其與T燒瓶分離。加入顆粒後每隔3-4天更換一次培養基，維持培養5至8週。
b)NVD003生物材料的製備
除了細胞的3-D誘導外，該方法與NVD002生物材料的製備相同(請參閱上文a))。
暴露於骨原性分化培養基(MD)後，將含有匯合的單層附著骨原細胞的撒上HA/β-TCP顆粒(150平方公分容器中3cc)。
加入HA/β-TCP的幾天後，骨原細胞和分散的顆粒逐漸包埋在礦化的胞外基質中。幾日後，骨原細胞和HA/β-TCP顆粒開始形成一個大的三維斑塊(或少量小斑塊)，其部分礦化的棕黃色可模製油灰自各個培養容器中脫落。在3D誘導過程中，每3至4天進行正常的培養基更換。小心地防止HA/β-TCP顆粒的去除和一個或多個結構的形成進行介質交換。
約15天後，無支架的3D結構(NVD003生物材料)形成並與T瓶分離。加入顆粒後每隔3-4天更換一次培養基，維持培養5至8週。
c)胞外體的單離
在添加顆粒後8週，將NVD002和NVD003生物材料用PBS漂洗3次，將其置於無hPL+5%FBS在胞外體中耗盡的MD中72小時。然後收集上清液，並以400×g離心5分鐘，然後在4℃以2,000×g離心20分鐘。將上清液保持在2/8℃以便直接分離胞外體。然後將分離的胞外體儲存在-80℃。
胞外體已藉由差速離心自培養基單離，在此之前，先藉由增加離心速度藉由沉澱以排除較大的「污染物」，其後再以極高的速度(~ 100,000×g)沉澱出胞外體、小的胞外囊泡甚至蛋白質聚集體。
d)增殖測定
將來自3個供體的源自NVD003和NVD002的胞外體與該三個細胞系在2.5和25μg/ml的96孔盤中於37℃、5%CO2下共培養長達72h。共培養30分鐘至48小時後，至少在5個不同的時間點進行細胞生存力測試(使用PROMEGA®的CellTiter-Glo®細胞生存力測定法)以評估靶細胞的增殖。來自PROMEGA®的CellTiter-Glo®發光細胞生存力測定法是一種均質方法，可根據存在的ATP定量確定培養物中的活細胞數量，這表示存在代謝活性細胞。實驗以三重複進行。
e)統計分析
透過配對試驗和Bonferroni post hoc試驗進行單因子變異數分析，試驗組之間(具有常態分佈)的統計學顯著性差異。使用Kruskal-Wallis試驗分析數據的非常態分佈。使用Prism GraphPad 2(NIH)進行統計測試。統計學顯著性如下：*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.005；****：p<0.0001。
2.結果
2.1.胞外體對人骨肉瘤細胞(H143B)的體外作用
a)NVD002-胞外體的作用
以胞外體培養的H143B細胞的增殖曲線顯示，其生存力水準略低於不使用胞外體培養的對照組細胞。此外，在最高劑量的胞外體中觀察到了更明顯的效果(25μg/ml對比2.5μg/ml)(圖32A)。
計算增殖曲線的線性回歸。發現以胞外體培養的細胞增殖率較低，分別為2.5和25μg/ml。在與胞外體2.5μg/ml共培養6、24、32和48h以及25μg/僅共培養24h和48h的細胞中發現了明顯較低的生存力信號(p<0.01)(圖 32B)。
儘管在沒有外來體的情況下發現細胞的斜率較高，但與較高的生存力水準相關。
b)NVD003-胞外體的作用
以胞外體培養的H143B細胞的增殖曲線顯示，其生存力水準略低於不使用胞外體培養的對照組細胞(圖33A)。
計算增殖曲線的線性回歸。發現以胞外體培養的細胞增殖率較低，分別為2.5和25μg/ml。在與胞外體2.5μg/ml共培養6、24、32和48h以及25μg/僅共培養24h和48h的細胞中發現了明顯較低的生存力信號(p<0.01)(圖33B)
儘管在沒有外來體的情況下發現細胞的斜率較高，但與較高的生存力量級相關。
c)結論
總之，源自NVD002和NVD003的外來體可以在體外減少人類骨肉瘤細胞系的增殖。有觀察到劑量反應作用。
2.2 胞外體對人類黑色素瘤細胞的體外效用(A375)
a)NVD002-胞外體的作用
儘管在沒有胞外體的細胞與2.5μg/ml胞外體的細胞之間發現了相似的特徵，但與沒有胞外體的對照組細胞相比，以25μg/ml的胞外體培養的A375細胞的增殖曲線顯示出較低的生存力(圖34A)。
計算增殖曲線的線性回歸。發現以胞外體培養的細胞增殖率較低，分別為2.5和25μg/ml。在與胞外體25μg/ml共培養6、24、32和48h的細胞 中發現了明顯較低的生存力信號(p<0.01)。此外，在用25μg/ml NVD002-Exo處理的細胞中，在24、32和48h時發現的生存力信號明顯低於2.5μg/ml(p<0.01)(圖34B)。
儘管在沒有外來體的情況下發現細胞的斜率較高，但與較高的生存力量級相關。
b)NVD003-胞外體的作用
與不含胞外體的對照組細胞相比，以2.5和25μg/ml胞外體培養的A375細胞的增殖曲線顯示出較低的生存力。25μg/ml的胞外體比2.5μg/ml的這種作用更為明顯(圖35A)。
計算增殖曲線的線性回歸。發現用胞外體培養的細胞增殖率較低，分別為2.5和25μg/ml。在每個培養時間點，以25μg/ml胞外體共培養的細胞中均發現了顯著較低的生存力信號(p<0.01)。在6、24、32和48h與胞外體以2.5μg/ml共培養的細胞中發現顯著較低的生存力信號(p<0.05)。在1、24、32、48h與胞外體25μg/ml與2.5μg/ml NVD003-Exo共培養的細胞中發現明顯較低的生存力信號(p<0.05)(圖35B)。
儘管在沒有外來體的情況下發現細胞的斜率較高，但與較高的生存力量級相關。
c)結論
總之，源自NVD002和NVD003的外來體可以減少體外人類黑色素瘤細胞系的增殖。有觀察到劑量反應作用。
2.3.胞外體對人類膠質母細胞瘤細胞(U87)的體外效用
a)NVD002-胞外體的作用
儘管在沒有胞外體的細胞與2.5μg/ml胞外體的細胞之間發現了相似的特徵，但與沒有胞外體的對照細胞相比，培養有25μg/ml胞外體的U87細胞的增殖曲線顯示出較低的生存力(圖36A)。
計算增殖曲線的線性回歸。發現以胞外體培養的細胞的增殖速率較低，分別為2.5和25μg/ml，以25的作用比2.5μg/ml更為明顯。在每次培養時，僅在6和32h(p<0.05)和與25μg/ml胞外體共培養的細胞中，在2.5發現了明顯較低的生存力信號(p<0.0001)。此外，發現在每個測試時間點，用25μg/ml NVD002-Exo培養的U87與2.5μg/ml相比，U87的生存力信號顯著降低(p<0.0001)(圖36B)。
儘管在沒有外來體的情況下發現細胞的斜率較高，但與較高的生存力量級相關。
b)NVD003-胞外體的作用
與不含胞外體的對照細胞相比，以2.5和25μg/ml胞外體培養的U87細胞的增殖曲線顯示出較低的生存力。25μg/ml的胞外體比2.5μg/ml的該作用更為顯著(圖37A)。
計算增殖曲線的線性回歸。發現用胞外體培養的細胞增殖率較低，分別為2.5和25μg/ml。在6、24、32和48h與胞外體以2.5μg/ml共培養的細胞中發現了明顯較低的生存力信號(p<0.0001)。此外，發現在每個測試時間點，以25μg/ml NVD003-Exo培養的U87與2.5μg/ml相比，U87的生存力信號顯著降低(p<0.0001)。(圖37B)。
儘管在沒有外來體的情況下發現細胞的斜率較高，但與較高的生存力量級相關。
c)結論
總之，源自NVD002和NVD003的外來體可以減少體外人類膠質母細胞瘤細胞系的增殖。

Claims (25)

  1. 一種無菌且乾燥的生物材料，其包含具有組織再生和/或修復特性的失活的分化細胞以及顆粒材料，該細胞和該顆粒材料被埋入胞外基質。
  2. 如請求項1所述之生物材料，其中該細胞選自包含初代細胞、幹細胞、基因改造細胞以及其組合的群組。
  3. 如請求項1或2所述之生物材料，其中至多10%的該細胞是活的，較佳為至多1%。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之生物材料，其中該顆粒材料選自包含以下或者由其組成的群組：
    -有機物質、包括去礦質骨基質(DBM)、明膠、瓊脂/瓊脂糖、藻酸鹽幾丁聚醣、硫酸軟骨素、膠原蛋白、彈性蛋白或類彈性蛋白肽(ELP)、纖維蛋白原、纖維蛋白、纖維接合素、蛋白聚醣、硫酸乙醯肝素蛋白聚醣(Heparan sulfate proteoglycan)、玻尿酸、多醣、層連結蛋白和纖維素衍生物；
    -陶瓷材料，包括磷酸鈣(CaP)、碳酸鈣(CaCO3)、硫酸鈣(CaSO4)或氫氧化鈣(Ca(OH)2)的顆粒或其組合；
    -聚合物，包括聚酐、聚乳酸(PLA)、聚乳酸甘醇酸共聚物(PLGA)、聚氧化乙烯/聚乙二醇(PEO/PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、富馬酸系聚合物，例如聚(富馬酸伸丙酯)(PPF)或聚(富馬酸伸丙酯-共-乙二醇)(P(PF-co-EG))、寡(聚(乙二醇)富馬酸)(OPF)、聚(N-異丙基丙烯醯胺)(PNIPPAAm)、聚(醛古羅糖醛酸酯)(PAG)、聚(n-乙烯吡咯酮)(PNVP)，或其組合；
    -凝膠，包括自組裝化的寡肽凝膠、微凝膠、奈米凝膠、顆粒凝膠、水凝膠、觸變凝膠、乾凝膠、響應性凝膠(responsive gel)或其組合；
    -奶精；
    及其任何組合。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之生物材料，其中該生物材料與從相應之新鮮的、非無菌的、非乾燥的生物材料獲得的因子內容物相比，該生物材料包含改變的因子內容物。
  6. 如請求項5所述之生物材料，其中因子內容物包括生長因子和/或轉錄因子。
  7. 如請求項5或6所述之生物材料，其中因子內容物包括IGF-1和/或VEGF和/或SDF-1α和/或OPG。
  8. 如請求項5所述之生物材料，其中該因子內容物包括RNA內容物。
  9. 如請求項8所述之生物材料，其中該RNA內容物包含選自表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10、表11或表12的任何一項中的至少一種miRNA。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之生物材料，其中該乾燥的生物材料係藉由冷凍乾燥所獲得。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之生物材料，其中該無菌生物材料係藉由γ-射線照射所獲得，較佳約7kGy至約45kGy的劑量，更佳在室溫。
  12. 一種用於產生無菌和乾燥的生物材料的方法，該生物材料包含失活的分化細胞和顆粒材料，其中該細胞和該顆粒材料被埋入胞外基質中，該方法包括以下步驟：
    -(1)使(i)能夠分化的活細胞與(ii)顆粒物質接觸，以獲得第一組合；
    -(2)在培養基中培養步驟(1)中獲得的第一組合，使得細胞分泌胞外基質並合成因子內容物，以獲得組織再生和/或修復特性，其中，細胞和顆粒材料埋入胞外基質中，形成多維結構；
    -(3)將在步驟(2)中獲得的多維結構進行乾燥，以獲得乾燥的生物材料；
    -(4)將在步驟(3)中獲得的乾燥的生物材料進行滅菌，獲得無菌、乾燥的生物材料，較佳藉由γ-射線照射。
  13. 如請求項12所述之方法，其中能夠經歷分化的活細胞選自包含以下之群組；初代細胞、幹細胞，特別是來自脂肪組織、骨髓或臍帶血的幹細胞、基因改造細胞，以及其混合物。
  14. 一種乾燥和無菌的生物材料，係以請求項12至13之任一項所述之方法所獲得。
  15. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至11中任一項所述之生物材料，或者如請求項14所述之生物材料，以及藥學上可接受的載體。
  16. 如請求項15所述之醫藥組成物，其中該組成物為糊劑或膜的形式。
  17. 一種醫療器材，其包含如請求項1至11中任一項所述之生物材料，或者如請求項14所述之生物材料，或者如請求項15或16所述之醫藥組成物。
  18. 一種如請求項1至11中任一項所述之生物材料、或者如請求項14所述之生物材料、或者如請求項15或16所述之醫藥組成物之用途，其用於藥物。
  19. 如請求項18所述之生物材料或醫藥組成物之用途，其用於預防和/或治療組織疾病。
  20. 如請求項19所述之生物材料或醫藥組成物的用途，其中該組織係選自包含以下之群組：骨組織、軟骨組織、皮膚組織、肌肉組織、上皮組織、內皮組織、神經組織、結締組織和脂肪組織。
  21. 如請求項19所述之生物材料或醫藥組成物的用途，其中該組織疾病選自包含以下之群組：先天性皮膚形成不全、燒痕、癌症，包括乳癌，皮膚癌和骨癌、腔室症候群(CS)、水疱性表皮鬆解症、巨大先天性痣、下肢缺血性肌肉損傷、肌肉挫傷、破裂或拉傷、放射後病變、潰瘍，包括糖尿病性潰瘍，以糖尿病性足潰瘍較佳、關節炎、骨折、骨脆弱、卡費氏症(Caffey’s disease)、先天性假關節、顱骨變形、顱骨畸形、骨折癒合延遲、骨浸潤疾病、骨肥大、骨礦物質密度流失、代謝性骨質流失、骨發生不全、骨軟化症、骨壞死、骨量減少、骨質疏鬆症、佩吉特氏病(Paget’s disease)、假關節、硬化性病灶、脊柱裂、脊髓滑脫症、椎弓斷裂、軟骨發育不全、肋軟骨炎、內生軟骨瘤、拇指僵硬、髖關節內軟骨破裂、剝離性骨軟骨炎、骨軟骨發育異常、多發性軟骨炎、以及此等相類疾病。
  22. 如請求項18或19所述之生物材料或醫藥組成物的用途，係用於預防和/或治療骨疾病和/或軟骨疾病。
  23. 如請求項18所述之生物材料或醫藥組成物的用途，係用於組織重建。
  24. 如請求項18或19所述之生物材料或醫藥組成物的用途，係用於補償組織疾病的初級治療的副作用，和/或用於增強組織疾病的初級治療。
  25. 如請求項18或19所述之生物材料或醫藥組成物的用途，係用於補償已知對組織具有有害作用的治療方法的副作用，該組織特別是骨組織、軟骨組織、皮膚組織、肌肉組織、上皮組織、內皮組織、神經組織、結締組織和脂肪組織。
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