KR101902198B1

KR101902198B1 - 오리발 유래 콜라겐이 함유된 하이브리드 골 이식재와 그 제조방법

Info

Publication number: KR101902198B1
Application number: KR1020160180681A
Authority: KR
Inventors: 강길선; 송정은; 이대훈; 차재근
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2018-09-28
Also published as: KR20180076478A

Abstract

본 발명은 오리발 유래 콜라겐이 함유된 하이브리드 골 이식재와 그 제조방법에 관한 것으로서, 천연고분자인 오리발 유래 콜라겐(Duck's feet-derived collagen)을 생체합성 고분자인 Poly(lactic-coglycolic acid) (PLGA), 바이오세라믹 계열의 골 유도물질인 Hydroxyapatite(HAp)과 혼합하여, 기계적 물성 개선하고, 염증 반응을 크게 감소시킨 골 이식재와 그의 제조방법에 관한 것이다.

Description

오리발 유래 콜라겐이 함유된 하이브리드 골 이식재와 그 제조방법 {PLGA/Hydroxyapatite hybrid bone graft containing duck's feet-derived collagen and a fabrication method of it}

본 발명은 오리발 유래 콜라겐이 함유된 하이브리드 골 이식재와 그 제조방법에 관한 것으로서, 천연고분자인 오리발 유래 콜라겐 (Duck's feet-derived collagen)을 생체합성 고분자인 Poly(lactic-coglycolic acid) (PLGA), 바이오세라믹 계열의 골 유도물질인 Hydroxyapatite(HAp)과 혼합하여, 기계적 물성 개선하고, 염증 반응을 크게 감소시킨 골 이식재와 그의 제조방법에 관한 것이다.

골 결함은 관절염, 골다공증과 같은 질병뿐만 아니라 부상, 골절에 의해 일어나는 경우가 많고, 기능을 유지하기 위해서 대체 가능한 골 이식재가 요구되어지고 있다. 골 결함은 기능적, 사회적 그리고 정신적인 문제를 유발하게 된다. [S. Bhumiratana, J.C. Bernhard, D.M. Alfi, K. Yeager, R.E. Eton, J. Bova, F. Shah, J.M. Gimble, M.J. Lopez, S.B.Eisig, G. Vunjak-Novakovic, et al., Tissue-engineered autologous grafts for facial bone reconstruction, Science translational medicine, 8(343), 343ra83, 2016]

골 결함 치료 방법으로는 다양한 골 이식술이 사용된다. 자가 골 이식의 경우, 골 전도와 골 유도능이 좋으나, 채취하는데 있어 제한이 있으며, 동종 골의 경우 많은 양의 골을 얻을 수 있지만, 감염의 위험이 높다는 단점이 있다.

따라서 최근에 조직공학적 치료방법으로 생체 적합한 생체 고분자를 이용한 이식술에 대한 필요성이 제기되고 있다. 생체 재료는 앞서 언급한 바와 같이, 사용 기간 또한 사용 후에 인체에 독성이 없어야 하며, 이식시 생체 거부 반응으로 인한 인체 내 부작용을 최소화하는 재료를 사용하여야 된다.

뼈의 유기물중 80%를 차지하는 콜라겐은 결합조직을 이루는 주요 단백질로, 낮은 항원성과, 세포부착능이 우수하며, 생분해성 등의 특징을 갖는다. 콜라겐은 주로 소나 돼지의 뼈와 피부에서 추출되는데, 구제역, 광우병 등의 질환으로 인해 인수공동 감염병의 안정성에 문제를 갖게 된다.

따라서 이런 감염질병의 안정성 문제를 해결하기 위하여, 한국등록특허 제10-1489916호(강길선 외)에서는 이러한 감염질병이 비교적 적은 오리발 유래 콜라겐을 사용하여 골 이식재로 사용하는 기술이 최초로 제안되어 있다. 이 특허발명에서는 오리발에서 추출한 콜라겐은 뼈의 탄성과 유연성을 유지하는 제 1형 콜라겐을 함유하고 있으며, 낮은 염증을 갖는 것을 확인하였으므로, 이를 골 이식재로 최적화된 조건의 지지체를 제작하는 기술을 제시하고 있다.

또한, 한국등록특허 제10-1629204호에서는 오리발 유래 콜라겐은 사용한 실크피브로인/콜라겐 복합 이식체에 관한 기술이 제안되어 있다.

그러나 상기 특허발명들은 오리발 유래 콜라겐의 우수한 효과에도 불구하고, 낮은 기계적 물성으로 인하여, 이식재로 사용하는데 제한적인 문제가 있어서, 보다 개선된 골 이식재의 개발이 시급한 실정이다.

따라서 골 이식재의 연구개발 분야에서는 상기 언급한 문제인 감염질병 문제 발생을 해결함과 동시에 기계적 물성도 우수한 새로운 골 이식재의 개발 필요성이 크게 대두되고 있다.

한국등록특허 제10-1489916호 한국등록특허 제10-1629204호

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 오리발 유래 콜라겐은 낮은 항원성, 생분해성, 생체 적합성 등과 같은 장점으로 인해 감염질병의 문제가 없는 효과는 그대로 살리면서 오리발 유래 콜라겐을 이용하여 단독으로 지지체를 제작하였을 때 기계적 강도가 떨어지는 단점을 보완하여 골 이식재의 물성을 개선하는 것을 해결과제로 한다.

따라서 본 발명의 목적은 오리발 유래 콜라겐(Duck's feet-derived collagen)을 사용하되 PLGA(Poly(lactic-coglycolic acid))과 HAp(Hydroxyapatite)를 이용하여, 기존 오리발 유래 콜라겐이 가지는 장점을 그대로 유지하면서도 높은 기계적 강도를 가지는 골 대체제로 적용 가능한 새로운 구성의 골 이식재를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 골 이식 후의 알칼리 인산가수분해효소의 활성과, 세포의 증식, 그리고 골 미네랄화가 더욱더 증대되고 염증반응이 현저하게 감소하여 감염질병의 염려가 없이 골 재생효과가 우수한 하이브리드 골 이식재를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 보다 우수한 인체 적용성을 가지도록 상기와 같은 새로운 골 이식재에 골수유래 간엽줄기세포가 함유된 하이브리드 골 이식재 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같은 새로운 조성의 하이브리드 골 이식재를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 본 발명의 과제해결을 위해, 본 발명은 오리발 유래 콜라겐에 PLGA(Poly(lactic-coglycolic acid))과 HAp(Hydroxyapatite)가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 하이브리드 골 이식재를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 오리발 유래 콜라겐에 PLGA와 HAp가 포함된 하이브리드 골 이식재에 추가적으로 골수유래 간엽줄기세포가 함유되어 이루어진 하이브리드 골 이식재를 제공한다.

또한, 본 발명은 PLGA 용액을 준비하는 단계;

PLGA 용액에 파우더 형태의 HAp와 파우더 형태의 오리발 유래 콜라겐을 혼합하는 단계; 및

상기 혼합물을 용매 캐스팅법 또는 염 추출법을 이용하여 골 이식재를 제조하는 단계;

를 포함하는 오리발 유래 콜라겐을 함유하는 하이브리드 골 이식재를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기와 같은 새로운 조성으로 구성함으로써, 기존의 골 이식재나 오리발 유래 콜라겐(DC)이 함유되지 않은 PLGA/HAp 만으로 이루어진 골 이식재 또는 DC와 PLGA 단독만 함유된 골 이식재에 비하여 골 재생 효과에 탁월한 효과가 있다.

특히, 본 발명에 따른 새로운 구성의 골 이식재에 골수유래 줄기세포를 제조된 골 이식재를 파종한 골 이식재 조성물의 경우 기존의 PLGA/HAp 골 이식재보다 알칼리 인산가수분해효소의 활성과, 세포의 증식, 그리고 골 미네랄화가 현저하게 증대된 것을 확인할 수 있었으며, 오리발 유래 콜라겐의 장점은 그대로 가지면서도 염증반응이 크게 감소하기 때문에 감염질병으로 인한 문제가 거의 발생하지 않는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따라 제조된 것으로서, PLGA/HAp 골 이식재를 포함하여, 각각 10, 20, 40, 60 그리고 80wt% DC/PLGA/HAp 의 골 이식재에 대한 육안 이미지를 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명에서 특성 비교를 위해 제조한 PLGA/HAp 골 이식재, 각 DC 함량별 DC/PLGA/HAp 골 이식재들, 오리발 유래 콜라겐, PLGA 그리고 HAp에 대하여 각각 FT-IR을 통해 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 DC/PLGA/HAp 골 이식재들의 압축강도를 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 DC/PLGA/HAp 골 이식재들의 공극률을 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 DC/PLGA/HAp 골 이식재들의 다공의 크기와 형태를 확인한 SEM 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 DC/PLGA/HAp 골 이식재들의 세포증식능력 평가를 나타낸 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 DC/PLGA/HAp 골 이식재들에서 골수유래간엽줄기세포의 알칼리 인산가수분해효소 활성 평가를 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 DC/PLGA/HAp 골 이식재들에 대하여 각 골 이식재 내에서 (a) 세포의 골 특정 유전자 발현을 나타낸 사진과 (b) 세포의 유전자 발현을 정량화하여 나타낸 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 DC/PLGA/HAp 골 이식재들 내에서 세포들의 부착과 이동을 나타낸 SEM 사진이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 DC/PLGA/HAp 골 이식재들을 각각 골 결함모델에 이식한 후 각 골 이식재에서의 미네랄화 정도를 (a) 이차원 사진과 (b) 삼차원 사진을 통해 나타낸 결과이다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 DC/PLGA/HAp 골 이식재들을 각각 골 결함모델에 이식한 후 각 골 이식재를 (a) Bone mineral density, (b) Bone volume 그리고 (c) Percent bone volume으로 정량적으로 평가한 결과이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 DC/PLGA/HAp 골 이식재들을 각각 골 결함모델에 이식한 후 각 골 이식재에 대하여 H&E염색, Masson's trichrome staining, 그리고 ED-1염색을 통하여 조직과 콜라겐 형성 및 염증반응을 확인한 사진이다.

이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 DC는 ‘오리발 유래 콜라겐’을 의미하며, PLGA는 ‘Poly(lactic-coglycolic acid)’를 의미하고, HAp는 ‘Hydroxyapatite’를 의미한다. 또한, 예컨대 DC/PLGA/HAp 또는 PLGA/HAp 등의 표현은 각 성분이 목적에 따라 다양한 조건과 사용량으로 혼합 또는 적용된 것을 의미하는 것으로 표현한 것이다.

본 발명에서 ‘오리발 유래 콜라겐 (DC)’의 의미는 단순하게 오리발로부터 유래되어 정제된 살균처리 또는 살균처리 되지 않은 콜라겐은 물론이고, 이와 동일한 조건을 가지는 콜라겐 성분, 예컨대 오리나 다른 축산 폐기물 등에서 유래되는 것으로서 오리발 유래 콜라겐과 실질적으로 동일하거나 유사한 성질을 가지는 콜라겐을 모두 포함하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명에서 ‘골 이식재’는 골 이식을 위해 사용되는 원료의 총칭으로서, 골 이식을 통해 인체 내에서 뼈를 구성하거나 뼈의 대용으로 사용하기 위한 원료를 의미하며, 골 이식을 하기 위한 전단계의 원료들의 조성물 형태, 결합체, 혼합체, 반죽물, 성형체, 발포구조체, 줄기세포 함유 이식재 등이나 이들 중에서 어느 하나 이상을 포함하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 기존에 오리발 유래 콜라겐을 이용한 골 이식재를 보다 상업적으로 유리하게 적용할 수 있도록 하고, 특히 오리발 유래 콜라겐을 함유하는 골 이식재에서 나타나는 각종 장점은 그대로 간직하면서도 골 이식 이후에 감염질병이 발생하지 않도록 하는 매우 중요한 문제 해결을 위해 새로운 기술을 제공하는 것이다.

본 발명은 바람직하게도 본질적으로는 오리발 유래 콜라겐에 PLGA(Poly(lactic-coglycolic acid))와 HAp(Hydroxyapatite)가 포함되어 있는 것을 특징으로 한다. 이러한 형태는 오리발 유래 콜라겐을 함유하는 특수한 골 이식재 형태로서 이러한 형태는 하이브리드 골 이식재라고 한다.

여기서, 하이브리드 골 이식재라고 명명한 것은 2가지 이상의 생체 재료를 포함하고 있기 때문이다.

본 발명에 사용되는 오리발 유래 콜라겐은 예컨대, 본 발명자에 의해 개발된 한국등록특허 제10-1489916호에 제안된 방법을 수정하여 제조하였다. 보다 구체적으로는, 예컨대 질병으로 오염되지 않은 오리발을 선별 세척하고 그대로 절단하여 절단 조직을 준비하는 단계; 절단 조직을 0.5 M의 NaOH용액과 유기용매 내(메탄올과 클로로포름을 3:1로 혼합한 용액을 세척하고, 추가적으로 알코올과 아세톤을 이용하여 세척)에서 지방을 제거하는 지방제거 단계; 지방이 제거된 절단 조직에 유기산 용액(조직양의 5% 시트르산을 8배수 (w/v) 첨가)을 가하고 교반하여 콜라겐을 추출하는 콜라겐 추출단계; 콜라겐 추출단계에서 얻어진 콜라겐 용액을 필터(2.0 ㎛ 필터페이터, 0.22 ㎛ 멤브레인)를 통과시킨 후, 원심분리하여 불순물을 제거하는 단계; 불순물이 제거된 콜라겐 용액을 세척하고 동결건조하여 콜라겐 분말을 얻는 단계를 포함하는 고순도 콜라겐의 추출방법과 같은 방법으로 오리발 유래 콜라겐(DC)을 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 이러한 DC는 분말상태로 제조된 것이 적용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, DC/PLGA/HAp 골 이식재에서 DC는 전체 구성의 5-45중량%로 함유할 수 있다. 더욱 바람직하게는 DC는 25-42중량%로, 가장 좋기로는 35-42중량%로 함유할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 DC/PLGA/HAp 골 이식재에서 PLGA은 전체 구성에서 50-90중량%로 함유될 수 있다. 더욱 바람직하게는 50-70중량%, 가장 좋기로는 50-60중량%, 특히 55중량%로 함유할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, DC/PLGA/HAp 골 이식재의 바람직한 조성은 상기와 같은 각각의 바람직한 조성 함량을 고려할 때 DC/PLGA/HAp = 5-45중량%/50-90중량%/1-10중량%인 경우이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 전체 조성물에서 DC가 PLGA 함량의 70-85중량%로 함유될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 상기와 같은 오리발 유래 콜라겐에 PLGA와 HAp가 포함된 하이브리드 골 이식재는 골수유래간엽줄기세포가 함유되어 바람직하게 인체에 적용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, DC/PLGA/HAp 골 이식재 100중량부에 대하여 골수유래간엽줄기세포는 0.1-20중량부, 더욱 좋기로는 1-10중량부로 함유될 수 있다.

본 발명에 따른 상기와 같은 DC/PLGA/HAp 구성의 하이브리드 골 이식재를 제조하는 방법은 다음과 같은 과정으로 이루어질 수 있다.

우선, PLGA 용액을 준비하는 단계를 거친다, 이러한 PLGA 용액의 준비는, 예컨대 PLGA를 메틸클로라이드에 녹여서 용액화하는 방법으로 이루어질 수 있다.

본 발명에서는 이렇게 제조되는 PLGA 용액에 파우더 형태의 HAp와 파우더 형태의 오리발 유래 콜라겐(DC)을 혼합하는 단계를 거친다. 여기서 사용되는 DC는 상기에서 설명한 종래의 방법에 의해 얻어진 것이 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 오리발 유래 콜라겐 추출과정에서, 오리발 세척에 사용되는 메탄올, 클로로포름 혼합용액은 각각 3:0.5-2, 가장 바람직하게는 3:0.8-1.2의 부피비로 이루어진 것이 사용될 수 있다.

이렇게 혼합된 혼합물은 용매 캐스팅법 또는 염 추출법을 이용하여 골 이식재를 제조할 수 있다.

본 발명에 따르면 상기와 같은 골 이식재에는 추가적으로 다공 형성을 위하여 기공 유도물질인 NaCl 입자를 함유할 수 있다. 그 함유량은 전체 조성에 대해 70-85중량%의 비율로 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 기공 유도물질인 NaCl은 그 입자크기(최대직경)가 250~355μm인 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 이러한 기공 유도물질을 사용함으로써, 골 이식재 성형물 제조 후에 기공 유도물질로 인하여 골과 유사한 형태의 기공을 가지는 골 이식재가 제조될 수 있다.

본 발명에 따르면, DC/PLGA/HAp 골 이식재는 각 성분이 혼합된 형태의 조성물이거나, 또는 이러한 조성물을 40-80 kgf/cm² 의 압력을 가하여 이루어진 성형체인 것을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기와 같이 제조된 DC/PLGA/HAp 골 이식재를 제조한 후에 이를 에탄올, 더욱 바람직하게는 70% 에탄올을 사용한 멸균과정을 거치고, PBS로 세척 후, 골수유래 간엽줄기세포를 파종하여 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 골 이식재는 기존의 골 이식재와는 달리 DC/PLGA/HAp 등 3개 성분이 혼합된 것으로 인하여 우수한 기계적 물성을 나타낸다.

본 발명에서는 오리발 유래 콜라겐의 낮은 항원성, 생분해성, 생체 적합성 등과 같은 장점에도 불구하고, 단독으로 지지체를 제작하였을 때 기계적 강도가 떨어지는 단점을 보완하기 위하여 기존에 전혀 생각하지 못했던 방법으로 PLGA과 HAp을 혼합하여 사용함으로써, 높은 기계적 강도를 가지는 골대체재를 제공할 수 있게 된 것이다.

또한, 골 이식 후에 발생할 수 있는 감염질병의 위험성을 크게 감소시켜서 골 이식재로 매우 유용하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 상세하게 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조실시예 1: 오리발 유래 콜라겐 제조 방법

핏물을 제거한 오리발을 증류수로 세척한 후, 압력을 가하여 조직을 연하게 한다. 조직의 지방제거를 위하여 0.5 M의 NaOH에 24시간 동안 250 rpm으로 교반하였으며 증류수로 세척하였다. 이후 메탄올과 클로로포름을 3:1로 혼합한 용액을 세척 하고, 추가적으로 알코올과 아세톤을 이용하여 세척한다, 세척한 조직은 5%의 시트르산을 8배수 (w/v) 첨가하여 48시간 4℃에서 250 rpm으로 교반하고, 조직을 믹서기로 분쇄하였다.

상등액을 수거하여 2.0 ㎛ 필터페이터, 0.22 ㎛ 멤브레인에 차례로 통과시켜 남아있는 불순물을 제거하고, 산을 첨가하여 pH 로 조정한 후에 원심분리(12,000 rpm, 15분, 4℃)한다. 수거한 콜라겐은 100% 알코올로 2회 세척하고, 원심분리(3,500 rpm, 5분, 4℃)한 뒤 동결 건조, 분쇄과정을 거쳐 분말 형태로 얻었다.

실시예 1-5, 비교예 : DC/PLGA/HAp 골 이식재 제조방법

골 이식재의 제조 및 성능 탐색을 위하여 골 이식재를 지지체 형태로 제작하였다. 제조된 지지체는 대조군(비교예 1)인 PLGA/HAp와 실험군인 DC를 함유한 PLGA/HAp 지지체(실시예 1-5)를 용매 캐스팅/염 추출법을 이용하여 제조하였다. PLGA 1 g을 Methyl Chloride 4 mL에 녹인 후, 오리발에서 추출한 고순도 콜라겐을 PLGA 함량의 0 (비교예), 10, 20, 40, 60, 80 wt% (각 실시예 직경 7 mm, 높이 3 mm의 실리콘 몰드에 넣은 후 24 시간 동안 60 kgf/cm²의 압력을 가한다. 24 시간 후 NaCl을 제거하기 위하여 제조한 지지체를 48 시간 동안 증류수에 담가 놓으며 증류수는 6 시간 마다 교체한다. NaCl을 제거한 지지체는 냉각시킨 후 24 시간 동안 동결건조 시킨다. )로 하여 하기 표 1과 같이 제조하였다.

	DC	PLGA	HAp	전체 중량(g)
PLGA/HAp	0	1	0.1	1.1
10 wt% DC/PLGA/HAp	0.1	1	0.1	1.2
20 wt% DC/PLGA/HAp	0.2	1	0.1	1.3
40 wt% DC/PLGA/HAp	0.4	1	0.1	1.5
60 wt% DC/PLGA/HAp	0.6	1	0.1	1.7
80 wt% DC/PLGA/HAp	0.8	1	0.1	1.9

이렇게 제조된 각 지지체 형태의 골 이식재는 도 1에 비교하여 나타내었다.

도 1은 PLGA/HAp 골 이식재를 포함하여, 각각 10, 20, 40, 60 그리고 80wt% DC/PLGA/HAp 의 골 이식재에 대한 육안 이미지를 나타낸 사진이다.

제조실시예 2 : 세포 배양

골 이식재에 적용할 골수유래 줄기세포를 배양하였다, 이때 사용된 골수유래줄기세포 (BMSC)는 4 주령 암컷 흰색 뉴질랜드 토끼의 대퇴부에서 분리하여 사용하였다.

토끼 다리부분의 뼈를 채취한 후 절단하여 18 게이지 실린지를 사용해 골수를 채취하였다. 채취한 골수는 층분리 배양법을 사용하여 배양용기에 1×10^5- cell/mL의 농도로 5% CO₂, 37℃의 인큐베이터에서 배양 하였으며 20% FBS 및 100 unit/mL의 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 α-MEM(Lonza, USA) 기본 배양액을 사용하여 실험 하였다. 세포들이 배양용기에 부착되면 배양액을 교환한 후, 2일 마다 배양액을 교환하였으며, 80~90% 정도 배양용기의 바닥을 채우면 0.25% trypsin/1 mM EDTA를 이용하여 세포를 채취한 후 사용하였다.

실험예 1: 이식재 특성 평가

1-1. FT-IR 분석

이식재의 화학적 변화를 확인하기 위하여 적외선 분광 광도계 (FT-IR, GX, Perkin Elmer, USA)을 이용하여 4,000~500 cm^-1파장에서 분석하였다. 본 평가를 통하여, 각각의 골 이식재들에서 PLGA, DC, 그리고 HAp의 고유 피크가 나타남을 알 수 있었다. 대부분의 DC/PLGA/HAp 지지체들은 DC에서 나타나는 N-H 피크가 대략 3750 ~ 3500 cm^-1 사이그리고 amide I 및 amide II의 피크가 2000 ~ 1500 cm^-1사이에서 나타났으며, 그리고 HAp에서 인산기 (PO₄ ^3-)의 P-O bending mode와 관련된 피크가 1250 ~ 1000 cm^-1사이에서 나타난 것을 확인할 수 있었다. PLGA의 IR 스펙트럼에서 1750 ~ 1500 cm^-1 및 1250 ~ 1000 cm^-1에 나타나는 고유의 피크들이 DC/PLGA/HAp 지지체들에서도 나타남을 확인할 수 있었다. FT-IR 측정 결과를 보았을 때, DC/PLGA/HAp 지지체의 IR 스펙트럼에서 DC, PLGA 및 HAp가 가지는 고유의 IR 피크가 모두 나타남을 알 수 있었고, 이를 통하여, 지지체 내에 DC, PLGA 및 HAp가 물리화학적으로 잘 혼합되어 있음을 확인하였다.

도 2는 특성 비교를 위해 제조한 PLGA/HAp 골 이식재, 각 DC 함량별 DC/PLGA/HAp 골 이식재들, 오리발 유래 콜라겐, PLGA 그리고 HAp에 대하여 각각 FT-IR을 통해 나타낸 그래프이다.

1-2. 압축 강도 평가

함량별 DC/PLGA/HAp 이식재의 압축강도 측정하기 위하여 만능 물성 측정기 (TMS-pro, Food Technoogy Corporation, Sterling, Virginia, USA) 를 이용하였으며, 설정값으로 측정거리는 1.5mm, 측정 스피드는 10mm/min, 측정힘은 1N으로 하였다. 본 평가를 통해서 오리발 유래 콜라겐의 함량이 증가함에 따라 압축강도가 증가함을 알 수 있었고, 그 중에서도 80wt% DC/PLGA/HAp 골 이식재에서 가장 높은 압축강도를 나타내었다.

도 3은 본 실험을 통하여 상기 제조된 DC/PLGA/HAp 골 이식재들의 압축강도를 나타낸 결과이다.

1-3 공극률 측정

골 이식재로 제조된 지지체 내의 공극을 측정하기 위해 다음 수학식 1을 이용하여 공극을 백분율로 측정하였다.

[수학식 1]

(여기서, V₁: 처음 증류수의 부피, V₂: 지지체를 넣은 후 증가한 증류수의 부피, V₃: 지지체를 제거한 후 줄어든 증류수의 부피)

본 평가를 통해서 오리발 유래 콜라겐의 함유량이 증가함에 따라서 골 이식재의 공극률이 감소함을 나타내었다.

도 4는 DC/PLGA/HAp 골 이식재들의 공극률을 나타낸 결과이다.

1-4. 이식재 내부 모폴로지 관찰 (주사전자현미경 관찰)

골 이식재로 제조된 지지체의 형태학적 특성을 확인하고자 전자주사현미경 (SEM, Hitachi, S-2250N, Japan)으로 관찰하였다. 제조된 각각의 샘플들은 카본테이프를 이용하여 금속판에 고정시키고 아르곤 가스 하에서 2분 동안 프라즈마 스퍼터(Model SC 500K, Emscope, UK)로 200 두께의 백금 코팅하였다. 이를 주사전자현미경(Hitachi Co, Model S-2250N, Japan)을 이용하여 DC/PLGA/HAp 이식재의 다공의 형태와 크기를 관찰하였다.

본 평가를 통하여, 제조된 모든 골 이식재는 사각형 형태의 다공의 형태를 나타내었고, 그리고 대부분 다공의 크기는 대략 250~355μm를 나타내었다.

도 5는 본 실험을 통해 측정한 DC/PLGA/HAp 골 이식재들의 다공의 크기와 형태를 확인한 SEM 사진이다.

실험예 2: 생체 외 거동 평가

2-1. 세포의 증식률 평가

세포의 성장률은 MTT 분석법을 이용하여 관찰하였다. 배양한 세포를 지지체당 1×10⁵ cells/scaffold의 농도로 파종한 후, 1, 7, 14, 21 및 28일째 샘플을 획득하여 50 mg/mL의 농도의 MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide, Sigma Co.) 용액을 100 ㎕ 첨가하고, 4시간 동안 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 보라색 결정이 생성되면 디메틸설폭사이드 (Sigma Co.) 용액을 1 mL씩 넣어 결정이 녹을 때까지 피펫팅을 하였다. 용해된 용액을 96 well 플레이트에 100 μL씩 분주하고, ELISA 플레이트 리더 (E-max, Molecular Device, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

본 평가를 통해서, 배양기간이 지남에 따라서 모든 골 이식재에서 세포가 점차 증식하였으며, 그 중에서도 80wt% DC/PLGA/HAp 골 이식재에서 가장 높은 세포 증식을 나타내었다.

도 6은 실시예에 따라 제조된 DC/PLGA/HAp 골 이식재들의 세포증식능력 평가를 나타낸 결과이다.

2-2. 알칼리 인산가수분해효소 활성 평가

상기 실시예에서 제조된 지지체에 골수유래 간엽줄기세포를 파종한 후 골 분화를 확인하기 위하여 알칼리 인산가수분해효소 (ALP)를 측정하였다. ALP 분석은 파종 1, 7, 14, 21 그리고 28일째에 시행하였다. 분석은 ALP activity Kit (Takara)를 사용하였다. 지지체에서 배양액 제거 후, PBS 1x로 1회 세척한 뒤, 5% Extraction solution으로 지지체에서 세포를 추출해 냈다. 이 추출액에 nNPP 용액을 넣은 뒤, 37℃에서 1시간 반응시키고 0.9N NaOH 수용액 50μL를 주입 후, 405nm의 흡광도를 이용하여 알칼리 인산가수분해효소의 활성정도를 분석하였다.

본 평가를 통하여, 배양기간에 따라서 점차 알칼리 인산가수분해효소의 활성이 증가하였고, 그 중에서 80wt% DC/PLGA/HAp 골 이식재에서 알칼리 인산가수분해효소의 활성이 가장 높게 증가하였다. 이를 통하여, 80wt% DC/PLGA/HAp 골 이식재에서 골수유래간엽줄기세포의 골분화가 가장 활발히 진행됨을 알 수 있었다.

도 7은 상기와 같은 DC/PLGA/HAp 골 이식재들에서 골수유래간엽줄기세포의 알칼리 인산가수분해효소 활성 평가를 나타낸 결과이다.

2-3. 유전자 발현 분석

본 유전자 발현 분석은 역전사 폴리메라아제 연쇄반응 (RT-PCR)을 통하여 골 특정 유전자 발현을 알아보았다. 공 이식재에 증식하던 세포들에게서 mRNA을 추출을 하였고, 골 특정 사이토카인인 Collagen type I (Col1), Osteocalcin (OCN), Runt-related transcription factor 2 (Runx2)의 primer를 통하여 cDNA를 증폭시켰고, 이렇게 생성된 DNA는 0.5% TAE 버퍼에 담겨져 있는 EtBr 용액이 포함된 1% 아가로스겔에 넣어, 100V, 30분으로 설정하여 전기영동을 실시하였고, 이를 360nm의 자외선 파장에서 유전자 발현을 관찰하였고, 이를 Image J 프로그램을 통하여 발현을 정량화하였다.

본 평가를 통하여, 모든 골 이식재의 세포들에게서 골 특정 유전자 발현이 나타나는 것을 알 수 있었고, 이러한 발현 값을 정량화한 결과 80wt% DC/PLGA/HAp 골 이식재에서 골 특정 유전자발현이 가장 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

도 8은 상기 실험결과 DC/PLGA/HAp 골 이식재들에 대하여 각 골 이식재 내에서 (a) 세포의 골 특정 유전자 발현을 나타낸 사진과 (b) 세포의 유전자 발현을 정량화하여 나타낸 결과이다.

2-4. 이식재 내부의 세포의 부착과 이동 관찰 (주사전자현미경 관찰)

제조된 골 이식재에서 골수유래간엽줄기세포의 부착양상을 확인하고자 전자주사현미경 (SEM, Hitachi, S-2250N, Japan)으로 관찰하였다. 제조된 지지체에 BMSCs를 1×10⁵ 세포/지지체의 농도로 파종하여, 1 및 28일 동안 배양한 후 배양액을 제거 하고 PBS로 세척하였다. 이를 2.5% 글루타알데하이드(Sigma)으로 24시간 동안 고정시키고, 알코올 구배용액 (50, 60, 70, 80, 90, 100%)를 이용하여 각 20분씩 탈수과정을 진행하였다. 지지체는 표면을 자른 후 단면을 관찰 하였다. 각 샘플들은 카본데이프를 이용하여 금속판에 고정시키고 아르곤 가스 하에서 2분 동안 프라즈마 스퍼터(Model SC 500K, Emscope, UK)로 200 두께의 백금 코팅하였다. 이를 주사전자현미경(Hitachi Co, Model S-2250N, Japan)을 이용하여 DC/PLGA/HAp 이식재에서의 세포 부착정도와 형태를 관찰하였다.

본 평가를 통해서, DC/PLGA/HAp 골 이식재들에서 세포의 부착과 이동이 나타남을 알 수 있었고, 그 중에서도 80wt% DC/PLGA/HAp 골 이식재에서 세포의 부착과 이동이 활발하게 나타남을 알 수 있었다.

도 9는 상기 실험결과 DC/PLGA/HAp 골 이식재들 내에서 세포들의 부착과 이동을 나타낸 SEM 사진이다.

실험예 3 : 생체 내 거동 평가

백서(Sprague Dawley rat, 암컷, 6주령)를 한일실험동물에서 구입하였다. 전신 마취 시킨 후, 두부 제모를 시행하고, povidone iodine으로 소독하였다. 백서의 전두골 전방부에서 후방부까지 정중부를 따라 두피를 절개하여 두개골의 상면을 노출시켰다. 노출된 두개골의 상면에 내경 4mm trephine bur를 이용하여, 지름 4mm의 원형결손을 형성하였다.

대조군에는 아무 처치도 하지 않은 군을 대조군으로 하고, 실험군으로는 PLGA/HAp 이식재와 80wt% PLGA/DC/HAp 이식재를 각각 넣은 군이며, 이들은 모두 지지체에 rBMSCs를 파종하였고, 각 지지체들은 결손부위에 삽입하였다.

3-1. Micro-CT 평가

Micro-CT (Skyscan 1076, Optoscan, Belgium)를 이용하여, Micro-CT (관전압 101 관전류 98, Filteration 0.5mm Aluminium) 촬영을 통하여, CTAn 프로그램을 이용하여 Bone mineral density (BMD), Bone volume (BV), Percent bone volume (BV/TV)에 대한 수치를 분석을 시행하였고, CTvox 프로그램을 이용하여 두개골 결손모델에 대한 삼차원 이미지를 얻었다.

본 평가를 통해서, 이차원 그리고 삼차원 두개골 결손 모델의 사진을 확인하였을 때, 80wt% DC/PLGA/HAp 골 이식재에서 골 미네랄화가 가장 많이 나타남을 확인하였고, 이를 정량적으로 평가하였을 때, PLGA/HAp 골 이식재 보다 80wt% DC/PLGA/HAp 골 이식재에서 Bone mineral density, Bone volume 그리고 Percent bone volume가 가장 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

도 10은 상기 실험에서 DC/PLGA/HAp 골 이식재들을 각각 골 결함모델에 이식한 후 각 골 이식재에서의 미네랄화 정도를 (a) 이차원 사진과 (b) 삼차원 사진을 통해 나타낸 결과이다.

또한, 도 11은 살기 실험에서 DC/PLGA/HAp 골 이식재들을 각각 골 결함모델에 이식한 후 각 골 이식재를 (a) Bone mineral density, (b) Bone volume 그리고 (c) Percent bone volume으로 정량적으로 평가한 결과이다.

3-2. 조직학적 분석

이식 후 2, 4, 8주 후에 조직을 절제한 후 4% 중성 포르말린 (Sigma, USA) 용액으로 24시간 고정한 후 탈회용액으로 1일간 탈회하고, 알코올로 탈수한 다음 파라핀에 포매하였다. 7 μm의 두께로 박절하여 PLL 코팅 슬라이드에 고정하였다. 조직 절편은 탈 파라핀 과정을 거친 후 조직학적 평가를 위하여 H&E, Masson's trichrome staining, ED-1 staining을 실시하였다. 현미경 사진(Nikon TE-2000, Japan)은 40, 100배에서 촬영하였다.

본 평가를 통해서, PLGA/HAp 골 이식재보다 80wt% DC/PLGA/HAp 골 이식재에서 조직과 콜라겐 형성이 가장 높게 나타났다. 그리고 염증반응도 PLGA/HAp 골이식재와 비교하였을 때, 80wt% DC/PLGA/HAp 골 이식재에서 염증반응이 확연히 감소함을 확인할 수 있었다.

도 12는 상기 실험결과 DC/PLGA/HAp 골 이식재들을 각각 골 결함모델에 이식한 후 각 골 이식재에 대하여 H&E염색, Masson's trichrome staining, 그리고 ED-1염색을 통하여 조직과 콜라겐 형성 및 염증반응을 확인한 사진이다.

본 발명에 따른 골 재생용 DC/PLGA/HAp 골 이식재는 기존의 골 이식재와는 달리 감염질병을 크게 경감시키고, 특히 기계적 물성이 무 우수하여 골 부분의 손상의 조직 재생에 매우 유용하게 적용될 수 있으며, 조직공학 및 재생의학 분야에 널리 이용 가능하다.

Claims

오리발 유래 콜라겐(DC)에 PLGA(Poly(lactic-coglycolic acid))과 HAp(Hydroxyapatite)가 포함되어 있되 DC/PLGA/HAp가 5-45중량%/50-90중량%/1-10중량%로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 오리발 유래 콜라겐이 함유된 하이브리드 골 이식재.
삭제
청구항 1에 있어서, DC는 전체 구성의 35-42중량%로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 오리발 유래 콜라겐이 함유된 하이브리드 골 이식재.
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청구항 1에 있어서, 전체 조성물에서 DC가 PLGA 함량의 70-85중량%로 함유된 것을 특징으로 하는 오리발 유래 콜라겐이 함유된 하이브리드 골 이식재.
청구항 1에 있어서, 전체 조성물에서 PLGA가 50-60중량%로 함유된 것을 특징으로 하는 오리발 유래 콜라겐이 함유된 하이브리드 골 이식재.
청구항 1에 있어서, 추가적으로 골수유래간엽줄기세포가 함유되어 이루어진 것을 특징으로 하는 오리발 유래 콜라겐이 함유된 하이브리드 골 이식재.
PLGA(Poly(lactic-coglycolic acid)) 용액을 준비하는 단계;
PLGA 용액에 파우더 형태의 HAp(Hydroxyapatite)와 파우더 형태의 오리발 유래 콜라겐(DC)을 혼합하되 DC/PLGA/HAp가 5-45중량%/50-90중량%/1-10중량%로 혼합하는 단계; 및
상기 혼합물을 용매 캐스팅법 또는 염 추출법을 이용하여 골 이식재를 제조하는 단계;
를 포함하는 오리발 유래 콜라겐을 함유하는 하이브리드 골 이식재의 제조방법.
청구항 9에 있어서, PLGA 용액을 준비하는 단계는 PLGA를 메틸클로라이드에 녹여서 용액화하는 방법을 포함하는 것을 특징으로 하는 오리발 유래 콜라겐을 함유하는 하이브리드 골 이식재의 제조방법.
청구항 9에 있어서, 상기 혼합물에 추가적으로 다공 형성을 위한 기공 유도물질로 입자크기(최대직경)가 250~355μm인 NaCl을 사용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 오리발 유래 콜라겐을 함유하는 하이브리드 골 이식재의 제조방법.
청구항 9에 있어서, 상기 혼합물을 40-80 kgf/cm² 의 압력을 가하여 성형체로 제조하는 것을 특징으로 하는 오리발 유래 콜라겐을 함유하는 하이브리드 골 이식재의 제조방법.
청구항 9에 있어서, 상기 오리발 유래 콜라겐(DC)은 오리발로부터 추출하는 과정에서 오리발 세척에 메탄올 : 클로로포름이 3 : 0.5-2의 부피비로 이루어진 혼합용액을 이용하여 세척하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 오리발 유래 콜라겐을 함유하는 하이브리드 골 이식재의 제조방법.