KR101667245B1 - 소수성 소재 간 상호 작용을 이용한 4-헥실레조르시놀의 이식재 내 투입 기술 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인체 내에서 이식재료의 이물반응을 억제시키는 4-헥실레조르시놀을 보다 효율적으로 이식재에 투입하기 위한 방법으로, 4-헥실레조르시놀 복합 골 이식재를 보다 효율적으로 제조하는 방법을 제공할 수 있다.

Description

소수성 소재 간 상호 작용을 이용한 4-헥실레조르시놀의 이식재 내 투입 기술{4-hexylresorcinol incorporation technique using hydrophobic interaction}

본 발명은 4-헥실레조르시놀(hexylresorcinol)의 골 이식재 내 투입을 통한 골 이식재의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조되는 골 이식재에 관한 것이다.

인체의 일부가 결손된 경우, 이를 재건하는 방법은 다양하다. 자가 조직의 이식이 면역 반응을 감안하면 가장 바람직한 방법이기는 하지만 이용할 수 있는 조직의 양과 종류가 한계가 있다(비특허문헌 1). 이러한 이유에서 다양한 이식재가 개발되어 왔다(비특허문헌 2). 자기 조직 이외의 이식재의 종류는 크게 동종 이식재, 이종 이식재, 합성 이식재로 나누어 볼 수 있다. 이들 이식재 중에서 상당 수는 인체 내 대응 조직과 거의 유사한 물리적 성격을 가지는 것으로 보고되고 있으나 이식재 거부 반응과 같은 다양한 정도의 면역 반응이 여전히 문제가 되고 있다(비특허문헌 3). 면역 반응과 함께 또 다른 문제가 되는 변수는 이색재의 생체 내 분해속도이다. 이식재가 생체 내에서 너무 느리게 흡수되거나 흡수되지 않는다면 이식재가 점유하고 있는 공간이 자가 재생 조직으로 대체되는 것에 심각한 문제를 초래할 것이다(비특허문헌 4). 특히 골 이식재의 경우 흡수되면서 자가골로 대체되지 않는다면 골 조직 기능에 문제를 초래할 우려가 있다. 예를 들면 악골과 같은 부위에 이식한 뼈 이식재가 자가 골로 대체되지 않는다면 해당 이식재가 점유하고 있는 공간에 인공 치아 임플란트 시술은 불가능하게 된다.

많은 단일 소재 이식재는 위와 같은 문제점들을 보이므로 이식재에 소량의 생체 활성물질을 첨가하여 이러한 단점을 극복할 수 있다. 예를 들어, 실크 소재의 생체 재료의 경우 생체 내에서 완전히 분해되는 데에 약 2년의 시간이 걸린다(비특허문헌 5). 따라서 이를 소재로 이용한 뼈 이식재의 개발은 상당히 어렵다. 만약 실크 소재의 뼈 이식재가 8주 이내에 대부분 분해될 수 있다면 이를 이용한 뼈 이식재의 개발은 훨씬 쉬울 것이다. 또한 소뼈의 경우 이미 다양한 가공을 통하여 뼈 이식재로 사용되고 있다(비특허문헌 6). 하지만 복잡한 가공 과정에 많은 비용이 소요되고 가공하지 않을 경우 소뼈 내에 존재하는 여러 종류의 단백질들이 사람 몸에서 심각한 이물 반응을 유도할 수 있다.

4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)은 박테리아 기원의 다양한 활성을 가지는 유기화합물이다. 4-헥실레조르시놀은 1970년 이전까지는 4-헥실레조르시놀의 항균 작용을 활용한 소독약으로 많이 사용되어 왔다(비특허문헌 7). 최근에 4-헥실레조르시놀은 암 세포에서 NF-kB pathway를 억제하여 암 세포의 활성을 억제하는 것으로 보고되었다(비특허문헌 8). NF-kB pathway는 파골세포의 활성에도 기여하기 때문에(비특허문헌 9) 4-헥실레조르시놀은 파골 세포의 활성을 억제하여 골밀도를 증가시킬 수도 있다. 또한 4-헥실레조르시놀은 diacylglycerol kinase를 억제하여 이물반응 거대세포의 형성을 억제할 수 있다(비특허문헌 3). 이러한 작용은 실크 소재 이식재의 이물 반응을 억제하여 뼈 형성을 촉진할 수 있다.

위의 연구결과에서 4-헥실레조르시놀을 다양한 이식재에 첨가하는 것이 이식재의 성공에 기여할 것으로 기대할 수 있다. 하지만 4-헥실레조르시놀을 이식재에 첨가하는 기술에 대한 개발은 미미한 실정이다. 4-헥실레조르시놀을 식품에 첨가할 때에는 4-헥실레조르시놀 용액에 식품을 담구는 침적법으로 처리한다(비특허문헌 10). 4-헥실레조르시놀은 물에 대한 용해도가 낮기 때문에 상기 4-헥실레조르시놀을 식품에 첨가하는 경우에는 다른 용매가 필요하다(비특허문헌 11). 실크 이식재에 4-헥실레조르시놀을 첨가하는 방법은 서로 다른 용매에 실크 피브로인과 4-헥실레조르시놀을 용해시킨 다음 혼합하여 용액을 증발시키는 방법을 이용하였다. 인공 치아 임플란트 표면에 4-헥실레조르시놀을 첨가할 때에는 수산화인회석 분말과 4-헥실레조르시놀 분말을 서로 혼합하여 표면에 분사하였다(비특허문헌 12). 4-헥실레조르시놀은 고온에서 변성되기 때문에 고온을 이용한 혼합법은 사용할 수 없다(비특허문헌 13). 또한, 녹는점은 69℃ 정도이고 끓는 점은 대기업 하에서 335℃ 정도이므로, 상온에서 임플란트 표면 처리 시에는 3% 이상의 4-헥실레조르시놀 분말이 혼합되는 경우 표면 결합 강도가 급격히 약화되어 3% 이상의 4-헥실레조르시놀을 표면에 투입할 수 없었다.

동물 기원의 뼈나 곤충 기원의 단백질의 경우 천연물 상태 그대로 유지하여 주는 것이 생체 재료로서 활용 가능성을 더 높일 수 있는 경우가 많이 있다. 그런데 기존의 혼합 제조법의 경우 재료를 일단 분말 상태로 만든 후에 4-헥실레조르시놀과 혼합하여 제조해야 하므로 성분 비율을 정확하게 조절할 수 있지만 재료 고유의 물리적인 특징은 많이 소실될 우려가 있다. 이에 인체에 비교적 무해한 에탄올을 용매로 이용하여 4-헥실레조르시놀을 녹인 다음에 침적법으로 처리하는 방법이 그 동안 많이 이용되었다. 하지만 이는 통상적인 침적법의 단점과 동일하게 표적 재료 내에 원하는 성분이 확산에 의하여 침적되므로 많은 성분을 효과적으로 침적시키는 것에는 그 효율면에서 한계를 가지고 있다. 또한, 용매가 물인 경우 물 1L에 500 mg 밖에는 녹지 않는다(비특허문헌 13). 글리세롤에는 잘 녹지만 글리세롤을 침적법의 용매로 사용하기에는 부적절하다.

1. Laurie SW, Kaban LB, Mulliken JB, et al.: Donor-site morbidity after harvesting rib and iliac bone. Plast Reconstr Surg 73: 933, 1984. 2. Dumas JE, Davis T, Holt GE, et al.: Synthesis, characterization, and remodeling of weight-bearing allograft bone/polyurethane composites in the rabbit. Acta Biomater 6: 2394, 2010. 3. Kweon H, Kim SG, Choi JY: Inhibition of foreign body giant cell formation by 4- hexylresorcinol through suppression of diacylglycerol kinase delta gene expression. Biomaterials 35: 8576, 2014. 4. Park KY, Choi KH, Park YJ, et al.: Silk fibroin and substance P combination Graft for the reconstruction of a bone defect. J Korean Assoc Maxillofac Plast Reconstr Surg 33: 293, 2011. 5. Cao Y, Wang B: Biodegradation of silk biomaterials. Int J Mol Sci 10: 1514, 2009. 6. Spector M: Anorganic bovine bone and ceramic analogs of bone mineral as implants to facilitate bone regeneration. Clin Plast Surg 21: 437, 1994. 7. Kraal JH, Hussain AA, Gregorio SB, Akaho E: Exposure time and the effect of hexylresorcinol on bacterial aggregates. J Dent Res 58 : 2125, 1979. 8. Kim SG, Lee SW, Park YW, Jeong JH, Choi JY: 4-hexylresorcinol inhibits NF-κB phosphorylation and has a synergistic effect with cisplatin in KB cells. Oncol Rep 26: 1527, 2011. 9. Abu-Amer Y: NF-κB signaling and bone resorption. Osteoporos Int 24: 2377, 2013. 10. Frankos VH, Schmitt DF, Haws LC, et al.: Generally recognized as safe (GRAS) evaluation of 4-hexylresorcinol for use as a processing aid for prevention of melanosis in shrimp. Regul Toxicol Pharmacol 14:202, 1991. 11. Olivares SP, Risso S, Gutierrez MI: Solvent effects on the spectroscopic properties of 4-hexylresorcinol. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc 71: 336, 2008. 12. Kim SG, Hahn BD, Park DS, et al.: Aerosol deposition of hydroxyapatite and 4-hexylresorcinol coatings on titanium alloys for dental implants. J Oral Maxillofac Surg 69: e354, 2011. 13. http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov

본 발명의 목적은 인체 내에서 이식재료의 이물반응을 억제시키는 4-헥실레조르시놀을 보다 효율적으로 이식재에 투입하기 위한 방법으로, 4-헥실레조르시놀 복합 골 이식재를 보다 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명에서는 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)이 용해된 무수 또는 물을 10 부피% 이하로 함유하는 함수 에탄올을 증류수 또는 염이 용해된 수용액과 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 단계; 및
상기 단계에서 혼합된 혼합 용액에 골 이식재를 침전시켜 소수성 상호작용에 의해 4-헥실레조르시놀을 골 이식재로 투입시키는 단계를 포함하며,
상기 무수 또는 물을 10 부피% 이하로 함유하는 함수 에탄올과 증류수 또는 염이 용해된 수용액의 비율은 0.1:10 내지 5:10인 골 이식재의 제조 방법을 제공한다.

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또한, 본 발명에서는 전술한 제조 방법에 의해 제조되며, 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)을 포함하는 골 이식재를 제공한다.

본 발명에서는 인체 내에서 골 이식재의 이물반응을 줄이고, 항균효과를 얻을 수 있는 4-헥실레조르시놀을 골 이식재에 보다 효율적으로 투입시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 이식재에 4-헥실레조르시놀이 결합하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2 내지 4은 실시예 1의 제조 과정의 사진으로, 100% 에탄올에 4-헥실레조르시놀이 용해된 사진(도 2), 4-헥실레조르시놀이 용해된 에탄올을 증류슈와 1:10의 비율로 희석한 사진(도 3) 및 희석 용액을 혼합한 사진(도 4)이다.
도 5는 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3에서 제조된 4-헥실레조르시놀 복합 재료에 대하여 감수성 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 실시예 3 및 비교예 4에서 제조된 4-헥실레조르시놀 복합 재료에 대하여 감수성 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 실시예 3 및 비교예 4 에서 제조된 4-헥실레조르시놀 복합 재료의 주사전자 현미경 사진이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol, 4HR)은 골 이식재에 혼합하여 이용할 수 있는 기능성 물질(생체활성 물질)로서, 상기 4-헥실레조르시놀이 첨가된 골 이식재는 항균성 및 조골세포에서의 알칼리성 인산분해효소의 활성 증가, 이식재 표면에 조골세포의 부착력 및 부착속도의 증가, 및 뼈와의 접착을 유의성 있게 개선시킬 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “골 이식재”는 다양한 질환에 의해 뼈 조직의 결손부가 생긴 경우, 이를 대체하여 뼈 조직 내의 공간을 충진시키고 신생골의 형성을 촉진시키기 위하여 사용하는 이식재를 의미한다.

본 발명의 골 이식재에 첨가물로서 포함되는 4-헥실레조르시놀의 IUPAC 명은 4-헥실벤젠-1,3-디올(4-hexylbenzene-1,3-diol)이고 다음 화학식 1을 가지는 화합물이다.

[화학식 1]

많은 경우 기능성 물질(생체 활성 물질)의 효능은 국소적으로 유리되는 양에 비례하고, 국소적으로 유리되는 생체 활성 물질의 양은 지지체(이식재)가 얼마만큼 많은 양의 생체 활성 물질을 담지하고 있는가에 의해 좌우될 수 있다.

본 발명의 기능성 물질로 사용되는 4-헥실레조르시놀의 경우 물에 잘 용해되지 않으므로, 이식재로 사용되는 양친매성 고분자 물질과 혼합하는 것이 쉽지 않다.

특히, 4-헥실레조르시놀과 같은 천연 고분자 물질을 물리적 형상의 손상 없이 첨가하고자 하는 경우 침매법 이외에 다른 방법이 거의 없는데, 침매법의 경우 (1) 4-헥실레조르시놀이 적절한 용매에 용해되어야 하고, (2) 4-헥실레조르시놀의 침매 후에 잔존 용매가 이식재 내에 남아있으면 안되며, (3) 4-헥실레조르시놀의 이식재 첨가에 따른 기대 효과를 충족시킬 수 있을 정도로 충분한 농도의 생체 활성 물질이 이식재 내에 투입될 수 있어야 한다.

에탄올은 그 농도에 따라서 다양한 물질의 침적에 사용될 수 있다. DNA의 경우에는 13.8% 에탄올을 사용하고 콘드로이틴 설페이트 (chondroitin sulfate)의 경우 80%의 에탄올을 이용한다(Scott JE, Orford CR, Hughes EW: Proteoglycan-collagen arrangements in developing rat tail tendon. An electron microscopical and biochemical investigation. Biochem J 195: 573, 1981.). 에탄올은 표적 물질에서 물을 빼앗아 하이드록시기에 강하게 음전하를 걸어주어 용액 내에 포함된 양전하를 띤 이온과 결합하게 하여 침적물을 만든다. 다른 용매에 비하여 건조법을 통하여 잔존 에탄올을 쉽게 제거할 수 있고, 미세하게 남아있는 경우에도 심각한 독작용이 없으므로, 생체 재료 제조에서 용매로 에탄올이 널리 사용되고 있다. 이러한 에탄올의 특징을 이용한 침적법은 다양하게 소개되어 있다. Phosphate buffered saline에 1% 실크 피브로인을 용해한 다음에 이를 적절한 양의 BMP-2와 혼합하고 이를 100% 에탄올과 1:2로 혼합한 용액에 -20℃에 8 시간 이상 두어 BMP-2와 결합된 실크 피브로인 입자를 제조하는 방법이 소개된 바 있다(Bessa PC, Balmayor ER, Azevedo HS, et al .: Silk fibroin microparticles as carriers for delivery of human recombinant BMPs. Physical characterization and drug release. J Tissue Eng Regen Med 4: 349, 2010.). BMP-2는 물에 잘 녹는 친수성 단백질이므로 단일 용매에 약제 전달물질과 같이 혼합하여 용해시킨 다음에 침적시키는 방법으로 간단하게 복합 제재를 제조할 수 있다. 하지만 상기와 같은 제조법으로는 4-헥실레조르시놀과 같이 물에 거의 용해되지 않는 재료를 사용하는 것이 불가능하다. 수산화인회석으로 처리된 치과용 임플란트 표면에 파미드로네이트(pamidronate)라는 골다공증 치료제를 투입하는 기술도 0.5 mg/ml의 농도로 파미드로네이트가 용해된 수용액에 시편을 15 분에서 60 분 정도 담구어 두는 방법을 사용하였다(Aberg J, Brohede U, Mihranyan A, Strømme M, Engqvist H: Bisphosphonate incorporation in surgical implant coatings by fast loading and co-precipitation at low drug concentrations. J Mater Sci Mater Med 20: 2053, 2009.). 이러한 방법은 간단하지만 표면에 전달할 수 있는 약제의 농도에 한계가 있다.

4-헥실레조르시놀과 같은 약제를 위와 같은 방법으로 처리한다면 100% 에탄올에 용해된 4-헥실레조르시놀 용액에 임플란트를 적정 시간 담구어 두면 되지만 이러한 기술로는 이식재 내에 침투되는 4-헥실레조르시놀의 농도가 낮다는 문제가 있었다.

따라서, 본 발명에서는 4-헥실레조르시놀을 이식재 내에 고농도로 침투시키기 위한 방법을 제공한다.

일 구체예에서 골 이식재는 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)이 용해된 무수 또는 물을 10 부피% 이하로 함유하는 함수 에탄올을 증류수 또는 염이 용해된 수용액과 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 단계; 및
상기 단계에서 혼합된 혼합 용액에 골 이식재를 침전시켜 소수성 상호작용에 의해 4-헥실레조르시놀을 골 이식재로 투입시키는 단계를 통해 제조할 수 있다.

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즉, 4-헥실레조르시놀을 에탄올에 용해시키고, 용매로 희석 및 혼합한 후, 소수성 상호작용을 이용하여 골 이식재 내에 상기 4-헥실레조르시놀을 고농도로 투입시킬 수 있다.

본 발명에서 골 이식재는 수산화인회석(hydroxyapatite), 모노칼슘인산, 트리칼슘인산 및 실리카로 구성된 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 수산화인회석(hydroxyapatite) 및 트리칼슘인산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며, 구체적으로 수산화인회석(hydroxyapatite)을 포함할 수 있다.

상기 수산화인회석은 사람의 뼈 및 치아의 에나멜질과 동일한 성분으로 치아의 에나멜질의 결손부분에 대한 수복에 큰 효과가 있으며, 이 수복 효과로 인해 치아의 원래 빛깔을 회복시켜주므로 최근 치아 미백제로도 각광을 받고 있다.

본 발명의 골 이식재는 압착, 압축, 가압접촉, 패킹, 압박 또는 굳힘 등의 방법을 사용하여, 퍼티, 페이스트, 주형 가능한 스트립, 블록 또는 칩 등의 형태로 성형하여 사용할 수 있고, 화학적 첨가물을 이용하여 겔, 분말, 페이스트, 정제 또는 펠렛 등의 형태로 제형하여 사용할 수 있으며, 분말 형태 그대로 사용할 수도 있다.

상기와 같이 골 이식재를 제형하여 사용할 경우에는 생물학적 활성물질을 첨가하여 사용할 수 있는데, 생물학적 활성물질로 골 성장을 촉진하는 성장인자, 골 조직 형성 증진을 유도하는 펩타이드와 단백질, 피브린, 골 형태 형성인자, 골 성장제, 화학요법제, 항생제, 진통제, 비스포스포네이트, 스트론툼염, 불소염, 마그네슘염 및 나트륨염 등을 사용할 수 있다.

상기 성장인자로는 BMP(bone morphogenic protein), PDGF(Platelet-derived growth factor), TGFbeta(Transgenic growth factor), IGF-I(Insulin-like growth factor), IGF-II, FGF(Fibroblast growth factor) 및 BGDF-II(beta-2-microglobulin) 등을 사용할 수 있다.

상기 골 조직 형성 증진 펩타이드와 단백질로는 RGD 시퀀스를 포함하는 각종 펩타이드와 콜라겐 및 피브로노젠과 같은 각종 단백질 등을 사용할 수 있다.

상기 골 형태 형성인자로는 오스테오칼신(osteocalcin), 본사이알로프로테인(bonesialo protein), 오스테오제닌(osteogenin), BMP 등을 사용할 수 있다.

상기 골 성장제는 인체에 무해하고 골 성장을 촉진하는 물질이라면 제한 없이 사용이 가능하며, 골 형성을 증진시키는 핵산, 골 형성을 억제하는 물질의 길항제 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 골 이식재로 곤충 기원의 단백질, 포유류의 뼈, 조류의 뼈 또는 알 껍질, 또는 어패류의 석회화된 해부학적 구조물을 사용할 수 있다. 곤충 기원의 단백질은 실크 단백질, 구체적으로 실크 피브로인일 수 있고, 포유류의 뼈는 소뼈일 수 있으며, 조류의 뼈는 닭뼈일 수 있다. 상기 소뼈는 교원섬유의 함량이 30% 이내이며 무기질의 대부분이 친수성인 수산화인회석으로 구성될 수 있다. 상기 실크 피브로인이나 교원섬유와 같은 친수성기와 소수성기가 반복적으로 나타나는 양친매성을 보인다.

본 발명에 따른 골 이식재의 제조 방법에서는 4-헥실레조르시놀이 용해된 무수 또는 물을 10 부피% 이하로 함유하는 함수 에탄올을 용매(증류수 또는 염이 용해된 수용액)와 혼합한다. 상기 단계를 통해 4-헥실레조르시놀의 소수성 알킬부분이 안쪽으로 뭉쳐져 에멀젼이 형성되며, 후에 소수성 상호 작용을 통해 4-헥실레조르시놀은 고농도로 이식재 내에 투입될 수 있다.

본 발명에서 에탄올은 4-헥실레조르시놀이 용해된다면 특별히 제한되지 않으며, 무수 또는 물을 10 부피% 이하로 함유하는 함수 에탄올을 사용할 수 있다. 함수 에탄올의 경우 물의 부피가 10 부피%를 초과하면 4-헥실레조르시놀의 용해율이 낮아져 이식재 내에 상기 4-헥실레조르시놀을 고농도로 침투시키기 어렵다.

또한, 상기 에탄올에 용해되는 4-헥실레조르시놀의 함량은 에탄올, 즉 무수 또는 물을 10 부피% 이하로 함유하는 함수 에탄올 100 중량부 대비 1 내지 400 중량부, 10 내지 350 중량부, 또는 30 내지 300 중량부일 수 있다. 또는 에탄올 1 ml를 기준으로 4-헥실레조르시놀을 0.01 내지 4 g, 0.1 내지 3.5 g 또는 0.3 내지 3 g 사용할 수 있다.

본 발명에서 용매는 증류수 또는 염이 용해된 수용액을 사용할 수 있다. 이때, 염으로는 칼슘염 또는 마그네슘염을 사용할 수 있다. 상기 칼슘염 또는 마그네슘염은 염화물, 황산염, 질산염, 탄산염, 중탄산염 또는 인산염 등의 형태로 수용액 상에 용해되어 있을 수 있다.

상기 무수 또는 물을 10 부피% 이하로 함유하는 함수 에탄올과 증류수 또는 염이 용해된 수용액의 비율은 0.1:10 내지 5:10, 0.5:10 내지 3:10, 또는 1:10 내지 2:10일 수 있다. 상기 비율 범위에서 4-헥실레조르시놀의 에멀젼 형성이 용이하며, 소수성 상호 작용을 극대화 할 수 있다.

본 발명에서는 전술한 단계에서 혼합된 용액과 골 이식재를 반응시켜 4-헥실레조르시놀을 포함하는 골 이식재를 제조한다.

이때 반응은 혼합 용액에 골 이식재를 침전시키는 방법으로 수행할 수 있는데, 소수성 상호 작용에 의해 4-헥실레조르시놀이 골 이식재 내부에 침투될 수 있다.

본 발명에서 도 1은 이식재에 4-헥실레조르시놀이 결합하는 과정을 나타내는 모식도이다. 실크 피브로인이나 소뼈 내의 교원섬유와 같은 천연 고분자 물질은 친수성 아미노산과 소수성 아미노산이 교차로 나타나는데, 혼합 용액에 비누거품과 같은 형태로 존재하는 4-헥실레조르시놀의 알킬 그룹은 천연 고분자 내에 존재하는 소수성 아미노산과 서로 결합하게 된다. 혼합 용액에서는 물 분자의 OH기가 소수성 그룹인 4-헥실레조르시놀의 알킬 그룹을 강하게 밀어내게 되고 이는 더 많은 4-헥실레조르시놀이 천연 고분자 내에 존재하는 소수성 아미노산과 결합하게 되는 결과를 초래할 수 있다.

즉, 본 발명의 제조 방법은 4-헥실레조르시놀을 실크 피브로인이나 교원섬유와 같은 친수성기와 소수성기가 반복적으로 나타나는 양친매성을 보이는 고분자 재료에 첨가하고자 하는 경우, 수용액 내에서 소수성 물질의 상호 작용이 증가되는 특징을 이용하면 더욱 높은 효율로 4-헥실레조르시놀을 결합시킬 수 있는 원리를 이용하여 4-헥실레조르시놀 을 포함하는 골 지지체를 제조할 수 있다. 이를 통해 본 발명에서는 기존의 단일 용매 기반의 침적법(에탄올에 골 이식재를 침적시키는 방법)에 비하여 10배 이상 높은 효율로 4-헥실레조르시놀을 이식재 내부에 투입할 수 있다.

따라서 본 발명의 제조방법을 이용한다면 동일한 효과의 이식재를 제조하기 위하여 종래 기술보다 10분의 1 정도의 4-헥실레조르시놀만 사용하여도 된다. 또한, 본 발명의 방법을 이용하면 가공되지 않은 소뼈와 같이 친수성 물질이 다수 함유된 천연 고분자 물질에도 4-헥실레조르시놀이 충분히 투여될 수 있다. 따라서 본 기술을 활용한다면, 다양한 고분자 소재의 물질을 적은 양의 4-헥실레조르시놀이 용해된 용액을 사용하더라도 고효율의 4-헥실레조르시놀 복합 이식재로 제조 가능하다.

또한, 본 발명은 전술한 제조 방법에 의해 제조되며, 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)을 포함하는 골 이식재에 관한 것이다.

상기 4-헥실레조르시놀을 포함하는 골 이식재는 4-헥실레조르시놀 복합 이식재 또는 4-헥실레조르시놀 복합 재료라 할 수 있다.

본 발명에서 4-헥실레조르시놀의 함량은 골 이식재 100 중량부 대비 0.01 내지 40 중량부, 0.1 내지 35 중량부, 또는 3 내지 30 중량부 일 수 있다. 상기 함량 범위에서 우수한 항균 효과를 기대할 수 있는데, 상기 함량이 0.01 중량부 미만이면 항균 효과를 기대하기 어렵고, 40 중량부를 초과하면 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하며 제형상의 안정성이 확보되지 않아 임플란트 등으로의 형태적 안정성이 유지되지 않을 우려가 있다.

본 발명에 따른 골 이식재는 임플란트, 치과용 차폐막 안면 윤곽술용 또는 재건용 등으로 사용될 수 있다.

본 발명의 골 이식재를 임플란트 표면에 처리하는 경우에는 치과용 골 이식재를 다양한 제형, 예컨대 겔, 분말, 페이스트, 정제, 펠렛 등의 형태로 제형하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 분말 형태로 이용할 수 있다.

상기 “표면 처리”는 임플란트의 표면을 개선시키기 위해서 당업계에 공지된 다양한 코팅 처리를 의미한다.

본 발명의 골 이식재를 임플란트 표면에 박막형태로 코팅하는 것으로서, 공지의 물리적, 화학적 박막증 착법에 의해 코팅되며, 바람직하게는 펄스레이저증착법(PLD), 스파터링증착법(sputtering), 화학기상증착법(CVD), 딥코팅법(dip coating), 도금법(plating), 3차원 플라즈마건증착법(3D plasma gun deposition) 중에 하나의 방법에 의해 코팅될 수 있다. 상기 펄스레이저증착법(PLD), 스파터링증착법(sputtering), 화학기상증착법(CVD), 도금법(plating) 및 3차원 플라즈마건증착법(3D plasma gun deposition)에 의할 때는 임플란트를 회전 시키거나 레이저, 스파터링건, 도가니 또는 플라즈마건을 회전시키면서 외주면에 고르게 코팅되도록 하며, 딥코팅법에 의할 때는 임플란트를 소정 용액에 담금으로써 코팅이 이루어지도록 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 임플란트는 당업계에 공지된 다양한 재질의 임플란트를 포함하고, 보다 바람직하게는 티타늄 또는 티타늄 합금을 이용한다. 티타늄 합금으로는 Ti-6Al-4V, Ti-6Al-7Nb 또는 Ti-13Nb-13Zr일 수 있다.

실시예

실시예 1. 3% 4HR-10% EtOH(silk) 제조

100% 에탄올 1 ml에 0.3 g의 4-헥실레조르시놀(4HR)을 용해시켰다(도 2). 이어서 4-헥실레조르시놀이 용해된 에탄올을 증류수와 1:10의 비율로 희석시켰다(도 3). 희석한 용액은 혼합하면 4-헥실레조르시놀과 에탄올 에멀젼이 물 분자와 혼합되어 흰색의 탁한 용액으로 변하게 되다(도 4).

상기 용액에 직경 5.8 mm 누에고치 박편(디스크)을 넣은 후 10 분 동안 침적시키고, 상기 누에코치 박편을 꺼낸 다음 55℃의 건조기에서 12시간 동안 건조시켰다.

본 발명에 도 2는 100% 에탄올에 용해된 4-헥실레조르시놀의 사진이며, 도 3은 4-헥실레조르시놀이 용해된 에탄올을 증류수화 1:10의 비율로 희석한 사진이다. 도 3에 나타나듯이, 상층에는 4-헥실레조르시놀이 용해된 에탄올이 관찰되며, 하층에는 증류수가 위치한다.

또한, 도 4는 헥실레조르시놀이 용해된 에탄올 및 증류수를 희석한 후의 사진으로, 4-헥실레조르시놀과 에탄올 에멀젼(emulsion)이 물 분자와 혼합되어 흰색의 탁한 용액으로 변한 것을 확인할 수 있다.

실시예 2. 30% 4HR-10% EtOH(silk) 제조

100% 에탄올 1 ml에 3 g의 4-헥실레조르시놀을 용해시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.

비교예 1. 3% 4HR-100% EtOH(silk) 제조

100% 에탄올 10 ml에 0.3 g의 4-헥실레조르시놀(4HR)을 용해시켰다.

상기 용액에 누에고치 박편(디스크)을 넣은 후 10 분 동안 침적시키고, 상기 누에코치 박편을 꺼낸 다음 55℃의 건조기에서 12시간 동안 건조시켰다.

비교예 2. 30% 4HR-100% EtOH(silk) 제조

100% 에탄올 10 ml에 3 g의 4-헥실레조르시놀을 용해시킨 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.

비교예 3. 100% EtOH(silk) 제조

100% 에탄올 10 ml에 누에고치 박편(디스크)을 넣은 후 10 분 동안 침적시키고, 상기 누에코치 박편을 꺼낸 다음 55℃의 건조기에서 12시간 동안 건조시켰다.

실시예 3. 3% 4HR-10% EtOH(소뼈) 제조

100% 에탄올 1 ml에 0.3 g의 4-헥실레조르시놀(4HR)을 용해시켰다. 이어서 4-헥실레조르시놀이 용해된 에탄올을 증류수와 1:10의 비율로 희석시켰다. 희석한 용액은 혼합하면 4-헥실레조르시놀과 에탄올 에멀젼이 물 분자와 혼합되어 흰색의 탁한 용액으로 변하게 되다.

상기 용액에 직경 8 mm의 소뼈의 원형 박편(디스크)을 넣은 후 12 시간 동안 침적시키고, 박편을 꺼낸 다음 55℃의 건조기에서 12시간 동안 건조시켰다.

이때, 소뼈는 정육점에서 구매한 것을 트레핀바로 잘라 사용하였다.

비교예 4. 10% EtOH(소뼈) 제조

10% 에탄올 10 ml에 소뼈의 원형 박편(디스크)을 넣은 후 12 시간 동안 침적시키고, 박편을 꺼낸 다음 55℃의 건조기에서 12시간 동안 건조시켰다.

실험예. 4-헥실레조르시놀 복합 재료의 성능 평가

통상적인 항균시험법을 이용하여 이식재 내 4-헥실레조르시놀이 성공적으로 투입되었는지 평가하였다.

Bacterial strain and cultivation

박테리아인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus , S. aureus , ATCC 225932) 및 aggregatibacter actinomycetemcomitans(A. actinomycetemcomitans , ATCC 33384)를 nutrient broth(BD bioscience, San jose, CA, USA)에서 배양하였다. trypticase soy broth(TSB; BD bioscience, San jose, CA, USA)에 박테리아를 접종하고, 37℃ 및 하루 동안 배양하였다.

4 HR - EtOH 의 감수성( susceptibility ) 분석

S. aureus 및 A. actinomycetemcomitans에 대한 4HR-EtOH의 감수성 분석은 clinical and laboratory standards institute(CLSI, formerly NCCLS)에 따른 커비 바우어(Kirby-Bauer) 디스크 확산 테스트를 이용하여 수행되었다.

두 박테리아는 TBS에서 37℃ 및 하룻밤 동안 배양되었다. 그 후 McFarland standard를 사용하여 박테리아 농도를 조절하고, 박테리아 용액을 뮬러 힌톤 아가(Mulle hinton agar) 상에 분포시켰으며, 샘플 디스크(박편)를 아가 상에 위치시켰다.

아가 플레이트는 37℃에서 12시간 동안 인큐베이트되었다. 4HR 또는 양성 대조군에 의한 박테리아 클리어 존(clear zone)의 지름을 측정하였다.

주사전자 현미경 시험

주사전자현미경용 샘플로는 소뼈를 10% 에탄올로 처리한 시편(비교예 4)과 10% 에탄올에 3% 4-헥실레조르시놀로 처리한 시편(실시예 3)을 사용하였다. 시편을 플레이트에 고정한 후에 각 샘플을 금으로 코팅한 다음 주사전자현미경(H-800, Hitachi, 일본)으로 분석하였다.

실험결과

1. 누에코치 박편(디스크)에서의 감수성 분석

실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3에서 제조된 4-헥실레조르시놀 복합 재료에 대하여 감수성 분석을 수행하였다. 분석은 전술한 방법을 통해 수행했으며, 박테리아로 S. aureus를 이용하였다. 또한, 양성 대조군으로 30 ㎍의 암피실린(ampicilin)을 포함하는 종이 디스크를 이용하였다.

감수성 분석 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

	S. aureus
비교예 3(EtOH (Control))	0
비교예 1(3% 4HR-100% EtOH)	10.74 ± 1.64
비교예 2(30% 4HR-100% EtOH)	20.75 ± 2.21
실시예 1(3% 4HR-10% EtOH)	20.80 ± 0.83
실시예 2(30% 4HR-10% EtOH)	24.60 ± 0.54
Ampicillin (30 ug)	39.25 ± 1.70

상기 표 1의 데이터는 클리어 존의 지름(mm) 및 standard deviation 나타낸다.

또한, 도 5는 상기 실험결과의 사진으로, con은 약물을 첨부하지 않은 종이 디스크, AM은 암피실린(ampicillin)이 탑재된 종이 디스크, 1은 처리하지 않은 누에고치 원형 박편, 2는 3% 4HR-10% EtOH(실시예 1), 3은 30% 4HR-10% EtOH(실시예 2), 4는 100% EtOH only(비교예 3), 5는 3% 4HR-100% EtOH(비교예 1) 및 6은 30% 4HR-100% EtOH(비교예 2)를 나타낸다.

상기 표 1 및 도 5에 나타난 바와 같이, S. aureus에 대한 4HR-EtOH의 감수성 분석 결과, 100% EtOH(control)는 안타박테리아 활성을 나타내지 않으나, 양성 대조군인 암피실린은 강한 안티박테리아 활성을 나타내었다. 4HR을 포함하는 복합재료(이식재)는 안티박테리아 활성을 가지는데, 100% 에탄올에 용해시킨 후 증류수로 희석하여 제조한 실시예의 복합재료가 희석과정을 거치지 않은 비교예 보다 안티박테리아 활성이 우수함을 확인할 수 있다. 또한, 30% 4HR-100% EtOH가 30% 4HR-100% EtOH 보다 클리어 존이 넓게 나타나므로, 4HR의 함량이 높을수록 안티박테리아 활성이 우수함을 확인할 수 있다.

2. 소뼈 박편(디스크)에서의 감수성 분석

실시예 3 및 비교예 4에서 제조된 4-헥실레조르시놀 복합 재료에 대하여 감수성 분석을 수행하였다. 분석은 전술한 방법을 통해 수행했으며, 박테리아로 A. actinomycetemcomitans를 이용하였다. 또한, 양성 대조군으로 30 ㎍의 반코마이신(vancomycin) 및 암피실린(ampicilin)을 포함하는 종이 디스크를 이용하였다.

본 발명에서 도 6은 상기 실험결과의 사진으로, 좌상은 10% EtOH(비교예 4), 우상은 3% 4HR-10% EtOH(실시예 3), 우하는 반코마이신이 탑재된 종이 디스크, 좌하는 암피실린이 탑재된 종이 디스크를 나타낸다.

A. actinomycetemcomitans는 반코마이신에 저항성을 보여서 우하의 디스크에서 클리어 존(clear zone)이 관찰되지 않았다. 이는 10% EtOH로만 처리한 소뼈에서도 마찬가지였다. 하지만 암피실린 디스크 및 3% 4HR-10% EtOH에서는 광범위한 클리어 존이 관찰되었다.

즉, 소뼈에 결합된 4-헥실레조르시놀은 A. actinomycetemcomitans 균주가 배양된 배지에 올려 놓았을 때 클리어 존이 형성되며, 소수성 소재 간 상호 작용을 이용한 4-헥실레조르시놀의 이식재 내 투입 기술로 처리한 소뼈에 투입된 4-헥실레조르시놀은 여전히 고유의 항균 작용을 가지는 것을 확인할 수 있다.

3. 주사전자 현미경 시험 결과

도 7에서 왼쪽은 10% EtOH(비교예 4), 오른쪽은 3% 4HR-10% EtOH(실시예 3) 복합 재료(시편)의 주사전자 현미경 사진이다.

10% 에탄올로만 처리한 시편에 비하여 오른쪽 시편에서는 소뼈의 교원 섬유 부분에 결합한 4-헥실레조르시놀에서 외부로 노출된 친수성 부분인 하이드록시(-OH)기가 알코올에 의하여 탈수 반응되면서 뼈에서 유래된 칼슘과 결합하여 특징적인 결정형 구조를 이루는 것을 확인할 수 있다.

구체적으로, 10% 에탄올 내에 용해되어 있는 4-헥실레조르시놀(3% 4HR-10% EtOH)은 표적 물질인 소뼈에 결합하는데, 이는 소뼈 내의 교원섬유에 존재하는 소수성기와 상호작용에 의한 것으로 보인다. 용액측으로 노출된 –OH기는 알코올에 의하여 탈수되면서 용액 내 이온과 결합하려는 힘이 발생하는데, 이에 소뼈의 표면에서 용출되는 유리 칼슘이 이 부분에 결합하여 대조군에서 관찰되지 않는 특징적인 결정 소견을 보이는 것으로 예측된다.

Claims (9)

1. 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)이 용해된 무수 또는 물을 10 부피% 이하로 함유하는 함수 에탄올을 증류수 또는 염이 용해된 수용액과 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 단계; 및
   상기 단계에서 혼합된 혼합 용액에 골 이식재를 침전시켜 소수성 상호작용에 의해 4-헥실레조르시놀을 골 이식재로 투입시키는 단계를 포함하며,
   상기 무수 또는 물을 10 부피% 이하로 함유하는 함수 에탄올과 증류수 또는 염이 용해된 수용액의 비율은 0.1:10 내지 5:10인 골 이식재의 제조 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   골 이식재는 수산화인회석(hydroxyapatite), 모노칼슘인산, 트리칼슘인산 및 실리카로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 골 이식재의 제조 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   골 이식재는 곤충 기원의 단백질, 포유류의 뼈, 조류의 뼈 또는 알 껍질, 또는 어패류의 석회화된 해부학적 구조물인 골 이식재의 제조 방법.
   
4. 제 3 항에 있어서,
   골 이식재는 실크 단백질, 소뼈 또는 닭뼈인 골 이식재의 제조 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서,
   4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)의 함량은 무수 또는 물을 10 부피% 이하로 함유하는 함수 에탄올 100 중량부 대비 1 내지 400 중량부인 골 이식재의 제조 방법.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   염이 용해된 수용액은 칼슘염 또는 마그네슘염이 용해된 수용액인 골 이식재의 제조 방법.
   
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