KR20100047412A - 탈회골의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 탈회골 제조방법은 공여자로부터 적출된 뼈 조직을 세척하고 연조직을 제거하는 단계; 뼈조직의 저속 냉동 및 해동을 통한 세포의 불활화 단계; 세포 불활화된 뼈조직을 유기 용매에 침지하여 교반하는 1차 탈지질 및 탈면역항원 단계; 1차 탈지질 및 탈면역원 처리된 뼈조직을 분쇄하여 다양한 크기의 뼈조각을 만들고 크기별로 분리, 선별하는 단계; 분리, 선별된 뼈 조각을 산 처리하여 탈회하는 단계; 및 탈회된 뼈 조각을 중화용액에 침지시켜 중화시키는 단계;를 포함한다. 또한 1차 탈지질 및 탈면역항원 단계 이후 분리, 선별된 뼈 조각을 유기 용매에 침지하여 교반하는 2차 탈지질 및 탈면역항원 단계를 더 포함할 수도 있다.

본 발명의 제조방법으로 제작된 탈회골(DBM)은 이식시 염증반응을 일으킬 수 있는 연조직 및 지질을 제거하여 염증반응을 저하시키며, 유기용매를 이용한 탈지질 및 탈면역화 단계는 지질을 제거함으로써 칼슘포스페이트의 유리를 더 효과적으로 진행시킬 수 있어 탈회를 용이하게 한다.

탈회골, 탈지질, 세포 불활성화.

Description

탈회골의 제조방법{MANUFACTURING METHOD FOR DEMINERALIZED BONE MATRIX}

본 발명은 골이식재로 사용되는 탈회골의 제조에 관한 것이다.

치료를 목적으로 하는 골이식은 손실된 뼈의 재건을 주목적으로 하며 활액을 분비하는 관절 표면의 재건을 보조목적으로 하고 있다. 실제로 임상에서 사용하게 되는 분야는 무유합골절의 치료, 관절고정, 골강의 충진, 뼈 및 관절부위 소실분에 대한 대체, 관골구와 두개골의 강화, 성장판 연골의 융합, 인대손실분에 대한 뼈 및 근육의 이식 등 매우 다양하다(Giannoudis PV, Dinopoulos H and Tsilidis E : Bone substitutes: An update. Injury. 365:520-527, 2005). 이러한 골이식을 통한 뼈의 재건은 현재 공여부로부터 자신의 뼈 일부분을 채취하여 신체의 이식 부분에 위치시켜주는 자가 이식, 환자 본인이 아닌 다른 사람의 뼈를 이용하는 동종 이식, 다른 동물의 뼈를 이용하는 이종 이식이 있다.

가장 효과가 좋은 것은 자가골 이식이지만 공여부위가 한정되어있고 2차적 수술이 따른다는 단점이 쉽게 해결할 수 없는 문제이기 때문에 아직까지는 동종 혹은 이종골 이식은 자가골 이식에 비해 골 결손부위의 회복세가 다소 떨어짐에도 명실 공히 자가골 이식의 대체수단으로 부상하고 있다. 특히 탈회골(탈미네랄 된 골 입자, 탈염된 골 기질(Demineralized Bone Matrix) 이하 DBM이라 칭함)은 및 골 형태형성 단백질(Bone Morphogenetic Protein; BMP)은 골 재생, 성장을 증대시키기 위해 사용해온 대표적인 물질이다.

일반적으로 DBM은 산에 침지시킴으로써 칼슘포스페이트를 제거하였는데 이는 사용하는 산 용매의 종류와 농도, 시간, 온도에 따라 다양한 방법이 있을 수 있다. 생성된 DBM은 주로 콜라겐으로 구성되어지며 비 콜라겐성 단백질에는 TGF-β, PDGF, 오스테오폰틴, 오스테오넥틴, BMP 등과 같은 단백질이 포함된다. 골유도는 DBM 주위의 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)가 DBM 중 성장인자, BMP의 영향에 의해 골모세포로 분화 및 증식을 통해 골을 형성하는 것을 의미한다. 탈회(탈염)하지 않은 일반골은 골전도 능력은 가지고 있으나, 골유도 능력은 미비하여 골형성 능력이 떨어진다. 이렇게 미비한 골유도 능력은 골 성분중의 성장인자인 BMP가 무기질 골성분인 칼슘포스페이트에 의해 갇혀 있어 BMP의 작용을 방해하고 있기 때문이다. 따라서 골의 탈회공정은 BMP의 작용을 방해하고 있는 칼슘포스페이트를 제거함으로써 BMP의 골유도 능력을 향상시킬 수 있다. 따라서 오랜 기간 동안 BMP 손상 없이, BMP의 활성을 극대화하며 칼슘포스페이트를 제거하는방법이 요구되어져 왔다.

본 발명의 목적은 공여자로부터 적출 된 모든 뼈 조직을 탈회시켜 골유도능이 있는 BMP를 노출시켜 탈회골(DBM)로 가공하는 것이다.

또한 향상된 골유도능을 지닌 DBM을 만들기 위해서 BMP의 파괴를 최소화함을 목적으로 한다.

또한 이종골 이식재가 가지고 있지 못하는 골유도능을 가지면서 미네랄을 동시에 제공하는 골이식재를 제조함을 목적으로 한다.

본 발명의 탈회골 제조방법은 공여자로부터 적출된 뼈 조직을 세척하고 연조직을 제거하는 단계; 상기 뼈조직의 저속 냉동 및 해동을 통한 세포의 불활화 단계; 상기 세포 불활화된 뼈조직을 유기 용매에 침지하여 교반하는 1차 탈지질 및 탈면역항원 단계; 상기 1차 탈지질 및 탈면역원 처리된 뼈조직을 분쇄하여 다양한 크기의 뼈조각을 만들고 크기별로 분리, 선별하는 단계; 상기 분리, 선별된 뼈 조각을 산 처리하여 탈회하는 단계; 및 상기 탈회된 뼈 조각을 중화용액에 침지시켜 중화시키는 단계;를 포함한다.

또한 중화된 뼈 조직을 분쇄하여 다양한 크기의 뼈 조각을 만들고 크기별로 분리, 선별하는 단계; 및 상기 중화 된 뼈 조각을 세척 후 동결건조하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하에서는 본 발명의 BMP의 손상을 최소화시키면서 칼슘포스페이트를 제거 함으로써 향상된 골유도능을 가진 DBM으로 제작하는 가공공정을 단계별로 나누어 설명한다.

1. 뼈조직 채취 및 운반(S1),

공여자로부터 뼈조직을 채취하여 운반한다. 본 발명의 DBM을 만드는데 적합한 뼈(골)는 자가, 동종 또는 이종골이 사용될 수 있다. 이종조직의 유용한 공급원은 돼지, 말 또는 소일 수 있다. 상기 골은 피질, 망상 또는 망상피질일 수 있다. 바람직한 골은 대퇴골, 경골, 요골, 척골 같은 피질동종골이다. 여기서 사용되는 용어 뼈(골) 조각은 규칙적이거나 불규칙한 섬유, 칩, 파편, 파우더등과 같은 비교적 작은 골 조각을 나타낸다.

여기서 사용되는 용어 DBM은 골의 원래 광물 함유량의 약 10% 보다 적게 포함하는 뼈을 나타낸다.

2. 세척 및 연조직 제거 단계(S2)

상기 뼈 조직을 항생제 처리, 세척하고 연조직 제거를 한 다음(S2) 여러 단계에 걸쳐 DBM 가공공정을 거치게 된다.

3. 세포 불활화(S3)

상기 세척 및 연조직을 제거한 다음 면역거부 반응을 일으킬 수 있는 뼈 조직내 세포를 조직의 손상 없이 세포를 불활화하기 위해 저속 냉동시스템을 이용하여 뼈 조직을 얼렸다가 녹인다.

저속 냉동시스템은 액체질소를 사용하여 분당 1℃씩 하강하도록 프로그램 되어 조직 내 결정이 생기지 않고 냉동된다. 냉동이 됨으로써 살아있는 세포는 모두 불활화된다. 시작온도는 상온 4℃에서 시작하며 분당 1℃씩 하강시켜 -4℃까지 떨어뜨린다. -4℃에서 분당 20℃씩 하강시켜 -45℃까지 떨어뜨린다. -45℃에서 분당 15℃씩 상승시켜 -10℃까지 올린다. -10℃에서 분당 0.5℃씩 하강시켜 -20℃까지 떨어뜨린다. -20℃에서 분당 1℃씩 하강시켜 -80℃까지 떨어뜨린다. 보관을 할 경우 초저온 냉동고(-70℃)에서 보관하며 사용할 경우 4℃에서 2시간, 실온에서 2시간 녹여 다음 단계를 진행한다. 특히 1차 탈지질만 한 뒤 골 조직을 사용하는 경우에 있어서 세포의 불활화가 필요하다.

4. 1차 탈지질(지방) 및 탈면역항원(S4)

탈회 단계의 효율을 높이고 탈면역항원을 시키기 위해 탈 지질(지방) 단계를 거친다.

이때 공여자는 살아있는 사람, 시신(사체), 동물 등을 대상으로 한다.

탈지질 단계는 열수(뜨거운 물) 또는 클로로포름/메탄올, 95%에탄올, 70% 에탄올, diethyl ether등 다양한 유기용매를 사용하여 제거가 가능하다. 본 발명에서는 diethyl ether(이하 ether로 칭함)를 사용하여 지질을 제거한다. 골 조직 1g 당 약 5 내지 30ml ether를 사용된다. 15~25℃에서 약 3 ~ 24시간 진공상태에서 교반한다. 교반 후 16~18시간 건조한다.

5. 분쇄 및 선별(S5)

상기 탈지질을 거친 후의 뼈 조직을 다양한 크기로 분쇄시킨다. 분쇄 후 다양한 크기의 체를 사용하여 분쇄 된 뼈 조각을 채쳐 뼈 조직을 크기에 따라 분리, 선별한다.

여기서 뼈 조각은 규칙적이거나 불규칙한 섬유, 칩, 파편, 파우더등과 같은 비교적 작은 골 조각들을 포함하는 것이다.

6. 2차 탈지질(S6)

상기 1차 탈지질 단계에서 뼈 조직의 크기가 커서 미쳐 제거하지 못한 지질을 제거하기 위해 유기용매를 사용하여 2차적으로 지질을 제거한다. 탈지질 단계는 열수(뜨거운 물) 또는 클로로포름/메탄올, 95% 에탄올, 70% 에탄올, 에테르 등 다양한 유기용매를 사용하여 제거가 가능하다. 본 발명에서는 70% 에탄올 사용하여 지질을 제거한다. 골 조직 1g 당 약 5 내지 30ml 70% 에탄올이 사용된다. 15~25℃에서 약 1 내지 24시간 진공상태에서 교반한다. 교반 후 16~18시간 건조한다.

7. 탈회(S7)

탈회(탈 미네랄, 탈염; 이하 탈회라 칭함)방법은 뼈 조직에 존재하는 칼슘포스페이트를 제거함으로써 BMP등 골유도 단백질의 방출을 용이하게 하기 위한 방법이다. 칼슘포스페이트를 제거하기 위해 여러 가지 방법이 사용 될 수 있다. 탈 미네랄(염)은 HCl, EDTA, formic acid, citric acid, acetic acid, nitric acid, nitrous acid등 다양한 산성용액을 사용함으로써 가능하다. 본 발명에서는 0.5N~1N HCl을 사용하여 탈회할 수 있다. 상기 2차 탈지질 된 뼈 조직 1g 당 약 10 내지 25ml의 0.5N~1N HCl가 사용 된다. 15~25℃에서 약 10분 내지 6시간 진공상태에서 교반한다.

8. 중화(S8)

산성용액으로 탈회처리를 마친 탈회골(DBM)의 pH는 산성을 띄게 된다. 이를 중화시켜 pH 7까지 올리기 위해 여러 가지 용액을 사용해 pH를 중화시킬 수 있다. 간단하게는 NaOH를 사용하여 pH를 올릴 수 있으며 인산완충용액(phosphate buffered saline), 시중에 판매되는 생리식염수, 0.9% 염화나트륨 용액, 멸균 증류수 등을 사용해 여러 번 세척하거나 탈회 반응 중인 산성용액에 첨가하여 사용할 수 있다. 본 발명에서는 멸균 증류수와 인산완충용액을 사용하였다. 상기 산성용액으로 탈회처리를 마친 DBM 1g 당 10 내지 30ml의 멸균 증류수를 사용해 여러 번 세척한 뒤 인산완충용액을 DBM 1g 당 10 내지 30ml 사용하여 여러번 진공상태에서 세척한다.

9. 동결건조(S9)

상기 인산완충용액으로 pH를 7까지 올린 DBM을 오래 저장하기 위해 동결건조하여 보관한다.

이렇게 최종 생산된 탈회골은 추가로 멸균하여 보관할 수 있으며, 멸균방법 은 E.O. 가스 멸균, 감마선 멸균, E-beam 선 멸균에 의해 수행될 수 있다.

상기 방법으로 제작 된 탈회골(DBM)은 이식시 염증반응을 일으킬 수 있는 연조직 및 지질을 제거하여 염증반응을 저하시키며 유기용매를 이용한 탈지질 및 탈면역화 단계는 지질을 제거함으로써 칼슘포스페이트의 유리를 더 효과적으로 진행시킬 수 있어 탈회를 용이하게 한다.

또한 탈회를 용이하게 함으로써 BMP의 노출을 쉽게 만들어 골유도능을 증가시킨다.

또한 분쇄시 발생하는 열에 의한 BMP의 파괴를 냉매가 흐르는 분쇄기를 이용해 최소화 하였고, 2차 탈지질 단계를 거친 뼈 조각은 골전도 역할을 하는 미네랄을 가지는 구조를 가지고 있으며 골유도 역할을 하는 비 콜라겐성 단백질은 BMP도 포함하고 있어 이종골 이식재의 대체재로 사용이 가능하다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

국내외에서 공인된 조직은행으로부터 입수한 시체의 뼈(골) 조직을 멸균비닐에 올려놓고 연조직을 제거한다. 연조직을 제한 후 혈액, 골수 등을 제거 한다.

연조직 및 혈액을 제거한 골 조직을 멸균 된 비닐로 감싼 후 세포 저속 냉동시스템을 사용해 냉동하여 골 조직내에 포함되어 있는 세포를 불활화한다. 기기 작동을 위해 기기에 액체 질소를 연결시킨 후 기기 내부 온도를 상온 4℃까지 내린다. 골 조직을 기기 내부에 넣은 다음 분당 1℃씩 하강시켜 -4℃까지 떨어뜨린다. -4℃에서 분당 20℃씩 하강시켜 -45℃까지 떨어뜨린다. -45℃에서 분당 15℃씩 상승시켜 -10℃까지 올린다. -10℃에서 분당 0.5℃씩 하강시켜 -20℃까지 떨어뜨린다. -20℃에서 분당 1℃씩 하강시켜 -80℃까지 떨어뜨린다. 사용하기 위해서 꺼내어 4℃ 냉장고에서 2시간, 실온에서 2시간 녹여 다음 단계를 진행한다. 도 3은 분쇄시 냉매를 사용한 DBM과 냉매를 사용하지 않은 DBM의 골분화 마커인 Alkaine phosphatase (ALP) activity를 측정한 결과를 나타낸 그래프로서 냉매를 처리한 것의 ALP activity가 높은 것을 확인 할 수 있다.

실온에서 녹은 골 조직을 유리병에 담아 에테르(ether)를 넣고 15~25℃에서 6시간동안 교반기로 교반하여 1차 탈지질 과정을 거친다. 교반 후 14±2시간 동안 건조한다. 도 2에서와 같이 탈지질 전(a)과 후(b) SEM 사진을 비교하면 탈지질을 통해 뼈 조직에 존재하는 지질이 제거가 되었음을 확인하였다.

건조가 끝난 뼈 조직을 골 분쇄기(bone mill)들어 갈 수 있는 크기로 자른 다음 뼈 분쇄기에 넣고 분쇄한다. 분쇄의 경우 열이 많이 발생해 BMP가 파괴 될 수 있기 때문에 차가운 냉매가 흐르도록 설계 된 분쇄기를 이용해 BMP의 파괴를 최소화한다. 분쇄된 뼈 조각을 여러 가지 사이즈의 체가 놓여있는 체진동기 위에 붓는다. 체진동기를 작동시켜 원하는 사이즈의 골 조각을 얻는다. 이때 크기는 150um 이하, 150~300um, 300~500um, 500~710um, 150~1000um, 150~2000um, 710~1000um, 1000~2000um, 710~2000um, 2000um~이상 등 다양한 크기로 나누어질 수 있다.

원하는 사이즈의 뼈 조직을 회수해 다시 유리병에 담아 뼈 조직을 70% 에탄올을 넣고 15~25℃에서 3시간 동안 교반한다. 교반 후 용액을 모두 제거 한 뒤 14~16시간 동안 건조시킨다.

건조가 끝난 뼈 조직을 유리 비이커로 옮겨 놓고 0.5N HCl을 뼈 조직을 넣는다. 15~25℃에서 2시간 동안 교반한다. 교반이 끝나고 산 용액을 모두 제거 한 뒤 D.W.를 처리하여 세척한다. 세척 후 세척액을 모두 제거 한 뒤 DPBS 용액을 처리하여 여러번 세척한다. 이 때 pH meter를 사용해 pH가 7일 될 때까지 반복 세척한다. pH가 7에 맞춰지면 D.W.를 처리하여 세척한다. 세척 후 세척액을 모두 제거한다.

세척액이 모두 제거된 뼈 조직을 동결 건조하여 DBM(demineralized bone matrix)를 얻었다.

도 4의 사진에 나타낸 바와 같이 이종골 이식재(a)와 동종골 탈 지질 뼈 조각(b)을 동물실험한 X-ray 결과 동종골 탈 지질 뼈 조각을 이식한 동물의 골 결손 부위 중앙부분에 골이 형성된 것을 확인 할 수 있으나 이종골을 이식한 동물의 골 결손 부위의 경우 골 형성이 일어나지 않았다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 설명하였으나 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형실시가 가능할 것이며, 이러한 변형실시는 본원발명의 보호범위에 속하는 것으로서 본원발명의 보호범위는 특허청구범위에 기재된 바에 따라 해석되어야 할 것이다.

도 1은 본 발명의 탈회골 제조 공정을 나타낸 흐름도,

도 2는 탈지질 전(a)과 후(b) SEM 사진,

도 3은 분쇄시 냉매를 사용한 DBM과 냉매를 사용하지 않은 DBM의 골분화 마커인 Alkaine phosphatase (ALP) activity를 측정한 결과를 나타낸 그래프,

도 4는 이종골 이식재(a)와 동종골 탈 지질 뼈 조각(b)을 동물실험한 X-ray 결과를 나태낸 사진이다.

Claims (14)

1. 공여자로부터 적출된 뼈 조직을 세척하고 연조직을 제거하는 단계;

   상기 뼈조직의 저속 냉동 및 해동을 통한 세포의 불활화 단계;

   상기 세포 불활화된 뼈조직을 유기 용매에 침지하여 교반하는 1차 탈지질 및 탈면역항원 단계;

   상기 1차 탈지질 및 탈면역원 처리된 뼈조직을 분쇄하여 다양한 크기의 뼈조각을 만들고 크기별로 분리, 선별하는 단계;

   상기 분리, 선별된 뼈 조각을 산 처리하여 탈회하는 단계; 및

   상기 탈회된 뼈 조각을 중화용액에 침지시켜 중화시키는 단계;

   를 포함하는 것을 특징으로 하는 탈회골의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 1차 탈지질 및 탈면역항원 단계 이후 분리, 선별된 뼈 조각을 유기 용매에 침지하여 교반하는 2차 탈지질 및 탈면역항원 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 탈회골의 제조방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 중화된 뼈 조직을 분쇄하여 다양한 크기의 뼈 조각을 만들고 크기별로 분리, 선별하는 단계; 및

   상기 중화된 뼈 조각을 세척 후 동결건조하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 탈회골의 제조방법.
4. 제1항에 있어서,

   상기 뼈는 피질(cortical), 망상(cancellous), 망상피질(corticocancellous), 대퇴골(femur), 경골(fibula), 요골(radius), 척골(ulna)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 탈회골의 제조방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 제1차 탈지질 및 탈면역원 단계 및 제2차 탈지질 및 탈면역원 단계에서 유기용매는 클로로포름/메탄올, 95% 에탄올, 70% 에탄올, 에틸에테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 탈회골의 제조방법.
6. 제5항에 있어서,

   상기 제1차 탈지질 및 탈면역원 단계에서 에틸에테르를 5~30ml을 처리해 3~24시간 동안 침지하는 것을 특징으로 하는 탈회골의 제조방법.
7. 제5항에 있어서,

   상기 제2차 탈지질 및 탈면역원 단계에서 70~95% 에탄올을 5~30ml 처리해 1~24시간 침지하는 것을 특징으로 하는 탈회골의 제조방법.
8. 제3항에 있어서,

   상기 산은 HCl, EDTA, formic acid, citric acid, acetic acid, nitric acid, nitrous acid로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 탈회골의 제조방법.
9. 제8항에 있어서, 0.1N~2N HCl을 10~25ml 처리해 10분 ~ 6시간 침지하는 것을 특징으로 하는 탈회골의 제조 방법.
10. 제1항에 있어서,

    상기 중화 단계에서 중화 용액은 NaOH, 인산완충용액(phosphate buffered saline), 생리식염수, 0.9% 염화나트륨 용액, 멸균 증류수, 멸균 주사용수로부터 선택되는 1이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 탈회골의 제조 방법.
11. 제10항에 있어서,

    상기 인산완충용액(phosphate buffered saline)을 10~30ml처리하는 것을 특징으로 하는 탈회골의 제조 방법.
12. 제1항 내지 제3항에 있어서 최종 생산된 탈회골을 멸균하는 단계를 더 포함 하는 것을 특징으로 하는 탈회골의 제조 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 멸균방법은 E.O. 가스 멸균, 감마선 멸균, E-beam 선 멸균에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 탈회골의 제조 방법.
14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 탈지질, 탈회 및 중화 단계는 진공 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 탈회골의 제조 방법.

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