PL232501B1 - Sposób otrzymywania przeszczepu do regeneracji tkanki kostnej, zwłaszcza ludzkiej oraz przeszczep do regeneracji tkanki kostnej, zwłaszcza ludzkiej - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania przeszczepu do regeneracji tkanki kostnej, zwłaszcza ludzkiej oraz przeszczep do regeneracji tkanki kostnej, zwłaszcza ludzkiej.

Rozwiązania według wynalazku znajdują zastosowanie w klinice człowieka np. ortopedii, stomatologii, chirurgii onkologicznej do wypełniania ubytków kostnych - cyst, nowotworów, przetok, a także w zabiegach rewizyjnych endoprotezoplastyki stawu biodrowego.

Współczesna ortopedia odczuwa brak wystarczającej podaży allogenicznych przeszczepów tkanki kostnej gąbczastej. Pobranie tkanki własnej chorego nie zawsze jest możliwe (np. u dzieci), a u dorosłych występuje konieczność pobrania podczas tej samej operacji i przeszczepienia jej, co wydłuża czas zabiegu oraz zwiększa ryzyko np. zakażenia ze względu na dwa pola operacyjne (miejsce pobrania i przeszczepienia).

Obecnie niewystarczająca liczba dawców tkanek ludzkich powoduje, że dostępne przeszczepy tkanki kostnej gąbczastej nie są w stanie zabezpieczyć wszystkich potencjalnych odbiorców, stąd poszukiwanie metod wytwarzania materiałów kościozastępczych lub od zwierząt - przeszczepy ksenogeniczne, bądź pozyskiwania materiału tkankowego od chorego - przeszczepy autologiczne (bardzo często brak możliwości pobrania od chorego).

Żaden z tych materiałów i substytutów nie jest jednak tak efektywny w działaniu jak natywna kość ludzka.

Tkanka kostna to rodzaj tkanki łącznej zbudowanej z komórek - osteoblastów, osteocytów, osteoklastów, które stanowią ok. 5% masy tkanki oraz istoty międzykomórkowej.

Istota międzykomórkowa stanowiąca ok. 25% masy tkanki składa się z części organicznej tzw. osteoidu i części nieorganicznej, która stanowi 60%-70% masy tkanki. Osteoid w skład którego wchodzi kolagen, osteonektyna, osteokalcyna, proteoglikany i mukopolisacharydy, nadaje tkance kostnej sprężystość i wytrzymałość, natomiast składniki nieorganiczne, którymi są sole wapnia, magnezu i fosforu, odpowiedzialne są za jej twardość. Tkanka kostna ma charakterystyczną organizację przestrzenną tworząc kość.

Wyróżnia się tkankę kostną zbitą, która znajduje się w zewnętrznej części kości oraz tkankę kostną gąbczastą. Najwięcej tkanki kostnej gąbczastej, występuje przy nasadach kości długich.

Na rynku dostępne są granulaty kostne wprowadzane do obrotu jako wyrób medyczny lub produkt leczniczy.

Przykładowo z publikacji P. Myciński, J. Zarzecka: Przegląd materiałów do rekonstrukcji kości stosowanych w chirurgii jamy ustnej, Poradnik Stomatologiczny, 2011,XI,10; 426-431, znane są materiały ksenogenne (heterogenne), które są często stosowanymi w stomatologii wszczepami kostnymi. Materiały te pozyskiwane są z kości wołowych i wieprzowych i są praktycznie nieresorbowalne, biokompatybilne i bezpieczne w stosowaniu. Są przygotowywane w formie bloków lub granulatu zarówno kości gąbczastej, jak i zbitej, czasami z domieszką kolagenu. Przygotowanie takiego materiału polega na całkowitym odbiałczaniu pod wpływem wysokiej temperatury i promieniowania jonizującego. Pozostała matryca nieorganiczna stanowi rusztowanie dla nowej kości. W wyniku tego procesu dochodzi do usunięcia czynników wzrostowych, a tym samym właściwości osteoindukcyjnych. Odbiałczone kości zwierzęce stosowane do przeszczepów mają strukturę i powierzchnię zbliżoną do kości i dlatego wykazują potencjał osteokondukcyjny. Możliwe jest też otrzymywanie materiałów z wapniejących korali i alg, jednak są one rzadko stosowane ze względu na ryzyko późnych powikłań i gorsze właściwości osteokondukcyjne.

Na rynku znany jest preparat kostny pochodzenia bydlęcego produkowany przez firmę Geistlich Pharma AG z Wolhusen w Szwajcarii, który wykazuje bardzo wysoki stopień podobieństwa do ludzkiej kości, zarówno pod względem powierzchni, składu chemicznego jak i struktury materiału. Stanowi on jeden z najczęściej stosowanych obecnie substytutów kostnych w stomatologii. Preparat ten produkuje się ze specjalnie dobranego materiału w postaci kości kończyn bydlęcych, które spełniają konieczne wymogi dotyczące struktury i dojrzałości tkanki kostnej, jak również umożliwiają uzyskanie odpowiedniej ilości surowca. Przetwarzanie obejmuje kilka etapów, które wykazują wysoką skuteczność w zakresie inaktywacji prionów 10: produkt poddawany jest między innymi działaniu wysokich temperatur przez okres ponad 15 godzin, a także specyficznym procesom oczyszczania chemicznego, które obejmują poddawanie produktu działaniu roztworów silnych zasad przez okres kilku godzin. Zróżnicowane procesy chemiczne, jak również działanie wysokich temperatur wywierają silny efekt na inaktywację prionów, osiągając wysoką skuteczność usuwania potencjalnych czynników patogenetycznych.

PL 232 501 B1

Znaną metodą oczyszczania kości zwierząt jest odbiałczanie, polegające na pozbawieniu kości wszystkich substancji biologicznych występujących pomiędzy tzw. beleczkami kostnymi (szpik, naczynia, system nerwowy), jak też komórek kostnych obecnych w jamkach kostnych (osteoblasty, osteoklasty i osteocyty). W efekcie odbiałczania kości otrzymuje się produkt w postaci szk ieletu kolagenowoapatytowego, z którego wykonuje się kształtki nadające się do wszczepiania operacyjnego w miejsce ubytków kostnych. Obróbce i późniejszemu wszczepianiu podlega wyłącznie tak zwana kość gąbczasta.

Z dokumentacji zgłoszeniowej polskiego wynalazku P.403805 znany jest sposób odbiałczania kości zwierzęcych, zwłaszcza z cieląt lub młodych świń w wieku około jednego roku, pobranych korzystnie z miednicy, charakteryzujący się tym, że w pierwszym etapie oczyszcza się pobraną kość z przylegających tkanek zewnętrznych, w tym przede wszystkim z pozostałości mięsa, a następnie w dowolnej kolejności kość tnie się mechanicznie, korzystnie za pomocą piły diamentowej, na plastry o grubości od 1 do 10 cm oraz mechanicznie pozbawia się ją zewnętrznej kości korowej, korzystnie poprzez jej odcięcie za pomocą piły diamentowej, otrzymując plastry kości gąbczastej, natomiast w drugim, korzystnie równolegle prowadzonym etapie przygotowuje się od 1,0 N do 0,5 N roztwór NaOH lub KOH oraz wodny roztwór perhydrolu w proporcji od 1:1 do 1:5 do wody destylowanej, po czym z tak otrzymanych roztworów wykonuje się mieszaninę do odbiałczania kości, o proporcjach objętościowych 20-50%, korzystnie 35% NaOH lub KOH, 20-30%, korzystnie 25% wodnego roztworu perhydrolu i 20-60%, korzystnie 40% wody destylowanej, następnie w trzecim etapie, w naczyniach, korzystnie szklanych prowadzi się zasadniczy proces odbiałczania kości polegający na tym, że przygotowane w pierwszym etapie plastry kości gąbczastej zanurza się w przygotowanej w drugim etapie mieszaninie roztworów, po czym naczynia umieszcza się na podgrzewanych mieszadłach, korzystnie magnetycznych, w których mieszaninę roztworów z zanurzonymi w niej plastrami kości gąbczastej miesza się intensywnie i podgrzewa stopniowo od temperatury około 20°C do temperatury nie przekraczającej 60°C, w czasie niezbędnym do zupełnego odbiałczenia kości i otrzymania wyłącznie czystego szkieletu kolagenowo-apatytowego, przy czym czas ten kontroluje się poprzez obserwację odbiałczanej kości, prowadzoną korzystnie za pomocą lupy binokularnej lub mikroskopu skaningowego. Przed zanurzeniem plastrów kości gąbczastej w mieszaninie roztworów, zawiesza się je na uchwytach, korzystnie na hakach wykonanych z drutu miedzianego izolowanego poliuretanem lub PCV. Po zakończeniu zasadniczego procesu odbiałczania, plastry kości przemywa się kilkukrotnie, korzystnie pięciokrotnie wodą destylowaną i kilkukrotnie, korzystnie trzykrotnie spirytusem, zwłaszcza etanolem 99%-owym.

Niedogodnością powyższego sposobu jest to, że następujące po sobie procesy prowadzone są z zastosowaniem agresywnych substancji chemicznych - KOH lub NaOH oraz silnego roztworu perhydrolu, a także wygrzewaniu w podwyższonej temperaturze aż do +60°C, co powoduje uszkodzenie i usunięcie wszystkich biologicznych substancji stymulujących przebudowę tkanki kostnej.

W ortopedii i stomatologii, w przypadku braku dostępności przeszczepów ludzkich, stosowane są syntetyczne substytuty kości.

W piśmiennictwie przeważają kompozycje syntetyczne, które mogą być stosowane jako substytuty przeszczepów.

Z dokumentacji zgłoszeniowej wynalazku P.295638 znana jest bioaktywna kompozycja szklista na implanty kości, włókna i inne wyroby z niej wykonane lub ją zawierające oraz sposób wyciągania tej kompozycji do postaci włókienek.

Ze zgłoszenia wynalazku P.310793 znany jest sposób i zestaw do wytwarzania porowatych namiastek kości. Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania porowatych namiastek kości wykazujących częściowo lub całkowicie współpołączony układ porów o przypadającym udziale objętościowym rzędu 5%-60% oraz zestawu do wytwarzania porowatej namiastki kości wykazującej częściowo lub całkowicie współpołączony układ porów o przypadającym udziale objętościowym rzędu 5%-60% złożonego z odrębnych jednostek opakowaniowych. Cechą sposobu jest to, że (a) 0%-48% wagowych stałego składnika, składającego się z drobnocząsteczkowego polimeru estrów kwasu akrylowego i/lub metakrylowego oraz ewentualnie dalszych dodatków, takich jak katalizatory polimeryzacji, środki kontrastowe do zdjęć rentgenowskich, napełniacze i barwniki, b) 2%-50% wagowych ciekłego składnika, składającego się z monomeru estru kwasu akrylowego i/lub metakrylowego oraz ewentualnie dalszych dodatków, takich jak przyspieszacze polimeryzacji i stabilizatory i c) 50%-98% wagowych grubo cząsteczkowego granulatu z biokompatybilnego materiału o średnicy największej cząstki 0,5-10 mm miesza się ze sobą, ewentualnie przeprowadza w żądaną postać i następnie utwardza się. Cechą zestawu jest to, że zawiera on jednostki opakowaniowe ww. składników (a), (b) i (c).

PL 232 501 B1

Z dokumentacji zgłoszeniowej wynalazku P.320083 znany jest sposób wytwarzania ubogiej w tlenek wapniowy ceramiki z istoty gąbczastej kości. Wynalazek ten polega na tym, że między mineralizacją materiału kostnego, a spiekaniem na ceramikę, prowadzi się proces wymywania zdemineralizowaną wodą, dzięki któremu usuwa się udziały tlenku wapniowego ze zmineralizowanej matrycy kostnej.

Ze zgłoszenia wynalazku P.323448 znana jest substancja zastępująca kość i sposób jej wytwarzania. Przedmiotem tego wynalazku jest m.in. sposób przekształcania osadu standardowego obojętnego bezpostaciowego fosforanu wapnia w silnie reaktywne bezpostaciowe ciało stałe, które można wykorzystać do reakcji z innymi stałymi fosforanami wapnia z wytworzeniem słabo krystalicznego syntetycznego hydroksyapatytu, wykazującego bioaktywność i strukturalną integralność. Tę nową substancję bezpostaciową można poddać reakcji z innymi fosforanami wapnia w temperaturze +37°C lub niższej z wytworzeniem podobnej do kości substancji, zawierającej słabo krystaliczny hydroksyapatyt.

W zgłoszeniu wynalazku P.328226 ujawniono sztyft z warstwy korowej trzonu kości długiej. Zawiera on wewnętrzny kanał szpikowy, który można wypełnić dowolnym z wielu materiałów kościotwórczych.

Ze zgłoszenia wynalazku P.334303 znany jest sposób wytwarzania oczyszczonego, dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości, który charakteryzuje się tym, że obejmuje poddawanie ciałek wtrętowych czynnika morfogenetycznego kości, wytworzonego technologią inżynierii genetycznej, następującym etapom: a) traktowanie ciałka wtrętowego czynnika morfogenetycznego kości czynnikiem denaturującym w celu otrzymania rozpuszczonego monomeru, b) traktowanie rozpuszczonego monomeru roztworem do ponownego fałdowania w celu otrzymania dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości, c) poddanie dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości ultrafiltracji i zastąpienie rozpuszczalnika, d) poddanie dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości w zastępującym rozpuszczalniku precypitacji izoelektrycznej i e) poddanie tak precypitowanego dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości chromatografii z odwróconymi fazami.

Ze zgłoszenia wynalazku P.335103 znany jest materiał zastępujący kość, na bazie porowatego materiału polimerowego, o powierzchni pokrytej peptydami sekwencji aminokwasów RGD.

Z opisu patentowego PL191497 znana jest wielowarstwowa membrana użyteczna do stosowania w rekonstrukcji kości lub tkanki chrzęstnej in vivo, sposób jej wytwarzania oraz jej zastosowanie. Membrana ta charakteryzuje się tym, że zawiera warstwę macierzową o otwartej, gąbczastej budowie zbudowaną głównie z kolagenu typu II oraz co najmniej jedną warstwę graniczną o zamkniętej, względnie nieprzepuszczalnej budowie zbudowaną głównie z kolagenu typu I i III i stanowi warstwę graniczną z naniesioną i liofilizowaną zawiesiną kolagenu typu II tworzącą warstwę macierzową o otwartej, gąbczastej budowie stabilnie przytwierdzoną do tej warstwy. Korzystnie membrana charakteryzuje się tym, że obejmuje pojedynczą warstwę graniczną. Korzystnie warstwa macierzowa umieszczona jest pomiędzy dwiema warstwami granicznymi i utworzona jest z materiału zawierającego kolagen typu II pochodzącego z naturalnej chrząstki. Materiał zawierający kolagen typu II pochodzi z chrząstki szklistej świń. Materiał zawierający kolagen typu II jest usieciowany. Warstwa graniczna lub warstwy graniczne pochodzą z błony otrzewnowej cieląt lub świń. Warstwa macierzowa jest impregnowana chondrocytami wyizolowanymi z chrząstki stawowej, okostnej, tkanki okołochrzęstnej lub mezenchymalnymi komórkami macierzystymi ze szpiku kostnego. Warstwa macierzowa i/lub warstwa graniczna lub warstwy graniczne są impregnowane glikozoaminoglikanem. Glikozoaminoglikan jest kwasem hialuronowym, chondroityno-6-siarczanem, siarczanem keratyny lub siarczanem dermatanu. Warstwa macierzowa i warstwa graniczna lub warstwy graniczne są zasadniczo wolne od proteoglikanów. Warstwa macierzowa i/lub warstwa graniczna lub warstwy graniczne zawierają ponadto chondronektynę, lamininę, fibronektynę, alginian wapnia, anchorynę typu II, czynniki wzrostowe lub czynniki morfogenetyczne kości.

Sposób wytwarzania określonej powyżej wielowarstwowej membrany charakteryzuje się tym, że zawiesinę kolagenu typu II nanosi się na powierzchnię warstwy granicznej, a następnie przeprowadza się liofilizację do uzyskania stabilnie przytwierdzonej warstwy macierzowej z kolagenu typu II o otwartej, gąbczastej strukturze.

Przedmiotem tego wynalazku jest również zastosowanie opisanej powyżej membrany, do wytwarzania wszczepu do kierowanej regeneracji tkanki.

Z opisu patentowego PL208538 znany jest produkt zawierający ziarnisty materiał kostny oraz zastosowanie produktu mineralnego kości. Wynalazek dotyczy produktu zawierającego ziarnisty materiał kostny do naprawy złożonego urazu chrząstki i kości, który zawiera porowate cząstki minerału kostnego pochodzące z naturalnej kości, o strukturze zasadniczo identycznej ze strukturą naturalnej kości i zasadniczo pozbawione endogennej substancji organicznej, przy czym cząstki mają na powierzchni możliwe do resorpcji, fizjologicznie zgodne włókna kolagenu II, przy czym stosunek wagowy włókien

PL 232 501 B1 kolagenowych do porowatego minerału kostnego wynosi przynajmniej 1:40. Korzystnie cząstki mają przeciętną średnicę w zakresie od 0,1 do 5 mm. Korzystnie produkt dalej obejmuje przynajmniej jedną adsorbowaną substancję farmaceutycznie albo biologicznie czynną. Bardziej korzystnie substancja biologicznie czynna jest wybrana z grupy obejmującej taurolidynę, tauraltam i ich mieszaniny. Bardziej korzystnie substancja farmaceutycznie czynna jest wybrana z grupy obejmującej białka morfogenetyczne kości (BMP), inne cząsteczki macierzy kostnej i peptydy sygnałowe, a najkorzystniej z grupy obejmującej BMP-2-8. TGF-β, TGF-βΤ VEGF, IGF, PTHrH i PDGF. Bardziej korzystnie produkt dalej obejmuje komórki macierzyste chrząstki albo kości. Korzystnie produkt dalej obejmuje żelatynę w fazie żelowej, przy czym włókna kolagenu II występują w tej fazie żelowej, zaś faza żelowa obejmuje od 2% do 20% wagowych materiału kostnego. Korzystnie kolagen pochodzi z chrząstki. Korzystnie stosunek wagowy włókien kolagenu wynosi około 1:20. Korzystnie produkt ponadto zawiera żelatynę w fazie żelu, przy czym włókna kolagenu II są obecne w fazie żelowej, która zawiera 2%-8% wagowych materiału kostnego. Korzystnie produkt obejmuje mezenchymalne komórki macierzyste o zdolności do różnicowania w komórki do regeneracji chrząstki lub kości.

W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie produktu mineralnego kości określonego powyżej, do wytwarzania wyrobu chirurgicznego do stosowania w sposobie leczenia ludzi lub osobnika zwierzęcego, u którego ten wyrób jest wszczepiany do połączonego ubytku chrząstki i kości u pacjenta. Korzystnie ubytek chrząstki i kości jest zlokalizowany na zakończeniu kości stawowej. Korzystnie obejmuje wprowadzenie wyrobu do ubytku kostnego, a następnie pokrycie produktu mineralnego i ubytku kostnego membraną kolagenową. Bardziej korzystnie membrana kolagenowa obejmuje warstwę kolagenu II. Korzystnie membrana obejmuje warstwę macierzy głównie z kolagenu II o otwartej, gąbczastej fakturze oraz przynajmniej jednej warstwie barierowej o zwartej, gładkiej powierzchni barierowej. Bardziej korzystnie warstwa barierowa jest głównie zbudowana z kolagenu I, kolagenu III albo ich mieszaniny. Korzystnie membrana obejmuje warstwę macierzy głównie z kolagenu II o otwartej, gąbczastej fakturze nałożonej na miękką, włóknistą warstwę błony kolagenu I/III o zwartej, gładkiej powierzchni barierowej przeciwległej do warstwy macierzy.

Ze zgłoszenia wynalazku P.358848 znany jest materiał do leczenia kości, obejmujący macierz niosącą hodowane komórki kościotwórcze, którymi mogą być osteocyty, osteoblasty, macierzyste komórki zrębu lub komórki macierzyste zdolne różnicowania w kościotwórcze osteoblasty. Macierz jest oczyszczonym materiałem macierzy kolagenu pochodzącym z naturalnej tkanki zwierzęcej zawierającej kolagen, porowatym materiałem mineralnej macierzy kości pochodzącym z naturalnej kości mającym strukturę krystaliczną zasadniczo taką jak naturalna kość i będącym zasadniczo wolnym od endogennego materiału organicznego lub kombinacją materiału oczyszczonej macierzy kolagenowej i porowatego materiału macierzy mineralnej.

Znany ze stanu techniki wynalazek PL216995 rozwiązuje problem otrzymywania kompozytowych materiałów implantacyjnych o podwyższonej wytrzymałości. W jednym z rozwiązań sposób polega na tym, że wyjściowy proszek składający się z półwodnego siarczanu wapnia (CSH) w ilości 40%-100% masowych z dodatkiem wysokoreaktywnego hydroksyapatytu korzystnie modyfikowanego jonami Mg, Ti, CO3 w ilości 0%-60% masowych zarabia się 0,5%-2,0% roztworem chitozanu w wodnym roztworze kwasu octowego o stężeniu 0,2%-2,0% w ilości 0,4-0,7 ml/g mieszaniny, uzyskując pastę typu cementowego o konsystencji plastycznej masy wiążącej w miejscu implantacji.

Z dokumentacji zgłoszeniowej wynalazku P.401954 znany jest wielowarstwowy materiał medyczny przeznaczony na implant do wypełnień kości. Materiał stanowi co najmniej jeden układ trzech warstw, z których środkową jest warstwa nanowłókien, zaś zewnętrzne warstwy są warstwami włókniny igłowanej z włókien klasycznych połączonymi z warstwą nanowłókien techniką igłowania. Materiał zawiera co najmniej jeden spośród dodatków ceramicznych, węglowych i metalicznych oraz czynnik wzrostu lub lek. Dodatek ceramiczny, węglowy lub metaliczny, w postaci nanododatku, jest zawarty w strukturze warstwy nanowłókien, zaś czynnik wzrostu lub lek, enkapsulowany w mikrosferach z biopolimeru, jest osadzony na powierzchni warstwy nanowłókien. W odmianie wynalazku wielowarstwowy materiał medyczny przeznaczony na implant do wypełnień kości stanowi także co najmniej jeden układ trzech warstw, z których środkową jest warstwa porowata z polimeru biodegradowalnego, w postaci pianki lub w postaci membrany, zaś zewnętrzne warstwy są warstwami włókniny igłowanej z włókien klasycznych, połączonymi z membraną lub pianką techniką klejenia lub prasowania. Materiał zawiera co najmniej jeden spośród dodatków ceramicznych, węglowych i metalicznych oraz czynnik wzrostu lub lek. Dodatek ceramiczny, węglowy lub metaliczny, w postaci nanododatku, jest zawarty w strukturze pianki lub

PL 232 501 B1 membrany, zaś czynnik wzrostu lub lek, enkapsulowany w mikrosferach z biopolimeru, jest osadzony na powierzchni warstwy pianki lub membrany.

Ze zgłoszenia wynalazku P.284988 znany jest sposób wytwarzania hydroksyapatytowego materiału implantacyjnego, przeznaczonego zwłaszcza do wypełniania ubytków w kościach.

Celem twórców wynalazku było opracowanie nowej technologii otrzymywania przeszczepu do regeneracji tkanki kostnej, zwłaszcza ludzkiej, przy założeniu, że technologia ta znajdzie zastosowanie przede wszystkim w przypadku kości zbitej, ale również będzie mogła być stosowana w przypadku kości gąbczastej jak i korowo-gąbczastej. W wyniku nowej technologii uzyskano przeszczep do regeneracji tkanki kostnej, o unikalnych właściwościach, który może być stosowany do zaopatrywania ubytków tkanki kostnej, zwłaszcza ludzkiej.

Powyższy cel osiągnięto, łącząc w innowacyjny sposób dostępne metody cięcia, odtłuszczania, płukania, liofilizowania, mielenia i przesiewania w specjalnych warunkach i pod szczególnymi, standaryzowanymi parametrami poszczególnych procesów.

Istotą sposobu otrzymywania przeszczepu do regeneracji tkanki kostnej, zwłaszcza ludzkiej jest to, że składa się z następujących po sobie etapów: oczyszczania mechanicznego kości zbitej, gąbczastej lub korowo-gąbczastej, korzystnie pochodzenia ludzkiego z tkanek miękkich, dzielenia kości na fragmenty, korzystnie odłuszczania kości w C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%, odtłuszczania kości w H2O2 o stężeniu od 1% do 40%, co najmniej jednokrotnego płukania kości w NaCl o stężeniu od 0,1 % do 10%, doczyszczania mechanicznego kości, odsączania kości z resztek NaCl, zamrażania kości w temp. około -40°C, mielenia kości młynem mechanicznym, aż do uzyskania granulatu, przesiewania granulatu przez system sit w celu podziału na odpowiednie frakcje, korzystnie zamrażania granulatu w temp. około -40°C, i sterylizacji radiacyjnej granulatu, korzystnie w dawce 35 kGy.

W odmianie wynalazku, po etapie zamrażania kości lub po etapie zamrażania granulatu, następuje etap liofilizacji w temp. od -52°C do -50°C, pod ciśnieniem o wartości od 0,016 mBara do 0,018 mBara w czasie od 8 h do 96 h, najkorzystniej 72 h lub 48 h.

Korzystnie do oczyszczania i doczyszczania mechanicznego kości, stosuje się tnące narzędzia chirurgiczne.

Korzystnie kości dzieli się na fragmenty za pomocą piły mechanicznej.

Korzystnie fragmenty kości wynoszą ok. 3 cm.

Korzystnie odłuszczanie kości w C2H5OH prowadzi się w C2H5OH o stężeniu 70%, zachowując proporcje 3:1 (3 ml C2H5OH na 1 g kości).

Korzystnie odłuszczanie kości w C2H5OH prowadzi się w ten sposób, że kości zalewa się C2H5OH i odstawia na okres 24 h.

Korzystnie odtłuszczanie kości w H2O2 prowadzi się w H2O2 o stężeniu 3%, zachowując proporcje 2:1 (2 ml H2O2 na 1 g kości).

Korzystnie w czasie odtłuszczania w H2O2, kości wytrząsa się na wytrząsarce, najkorzystniej przez 15 min przy obrotach 200 obr./min.

Korzystnie płukanie kości w NaCl, prowadzi się w NaCl o stężeniu 0,9%, zachowując proporcje 2:1 (2 ml NaCl na 1 g kości), przy czym najlepiej etap płukania powtarza się dwukrotnie.

Korzystnie podczas płukania w NaCl, kości wytrząsa się na wytrząsarce, najkorzystniej przez 15 min przy obrotach 200 obr./min.

Korzystnie odsączanie kości z resztek NaCl, prowadzi się na papierze bezpyłowym.

Korzystnie zamrażanie kości po odsączaniu z resztek NaCl, prowadzi się w temp. od -80°C do -20°C, przez okres od 1 h do 48 h, najlepiej 24 h.

Korzystnie zamrażanie granulatu prowadzi się w temp. od -80°C do -20°C, przy czym w odmianie wynalazku, w której po zamrożeniu granulatu następuje liofilizacja, granulat zamraża się na okres od h do 48 h, najkorzystniej 24 h.

Korzystnie kości lub granulat, zamraża się w zamrażarce.

Korzystnie kości mieli się z zastosowaniem sita o wielkości oczek 6 mm lub 4 mm, najkorzystniej przez 3 min przy prędkości 1500 obr./min.

Korzystnie granulat przesiewa się przez system sit o wielkości oczek 4 mm, 2 mm, 1 mm, i 0,5 mm.

Korzystnie granulat różnicuje się na frakcje o wielkości ziaren: od 6 mm do 4 mm, od 3,9 mm do mm, od 1,9 mm do 1 mm, od 0,9 mm do 0,5 mm, poniżej 0,4 mm.

Istotą przeszczepu do regeneracji tkanki kostnej, zwłaszcza ludzkiej według wynalazku jest to, że stanowi go tkanka kostna zbita, korowo-gąbczasta lub gąbczasta, korzystnie pochodzenia ludzkiego, w postaci granulatu, oczyszczona mechanicznie z tkanek miękkich, dzielona na fragmenty, korzystnie

PL 232 501 B1 odłuszczana w C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%, odtłuszczana w H2O2 o stężeniu od 1% do 40%, co najmniej jednokrotnie płukana w NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%, doczyszczona mechanicznie, pozbawiona resztek NaCl, H2O2, korzystnie również C2H5OH, zamrożona w temp. około -40°C, mielona aż do uzyskania granulatu, przesiana przez system sit w celu podziału na odpowiednie frakcje, korzystnie ponownie zamrożona w temp. około -40°C, i sterylizowana radiacyjnie, korzystnie w dawce 35 kGy.

W odmianie wynalazku, przeszczep stanowi tkanka liofilizowana po pierwszym zamrożeniu lub po ponownym zamrożeniu, w temp. od -52°C do -50°C, pod ciśnieniem o wartości od 0,016 mBara do 0,018 mBara, w czasie od 8 h do 96 h, najkorzystniej 72 h lub 48 h.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę oczyszczoną i doczyszczoną mechanicznie, za pomocą tnących narzędzi chirurgicznych.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę podzieloną na fragmenty za pomocą piły mechanicznej, najlepiej na fragmenty o wielkości ok. 3 cm.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę odłuszczoną w C2H5OH o stężeniu 70%, z zachowaniem proporcji 3:1 (3 ml C2H5OH na 1 g kości).

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę zalaną C2H5OH i odstawioną na okres 24 h.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę odtłuszczoną w H2O2 o stężeniu 3%, z zachowaniem proporcji 2:1 (2 ml H2O2 na 1 g kości).

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę wytrząsaną w czasie odtłuszczania w H2O2 na wytrząsarce, najkorzystniej przez 15 min przy obrotach 200 obr./min.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę płukaną w NaCl o stężeniu 0,9%, z zachowaniem proporcji 2:1 (2 ml NaCl na 1 g kości), najlepiej płukaną dwukrotnie.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę wytrząsaną podczas płukania w NaCl na wytrząsarce, najkorzystniej przez 15 min przy obrotach 200 obr./min.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę odsączoną z resztek NaCl, na papierze bezpyłowym.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę zamrożoną po odsączaniu z resztek NaCl w temp. od -80°C do -20°C, przez okres od 1 h do 48 h, najlepiej 24 h.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę zamrożoną w temp. od -80°C do -20°C, przy czym w odmianie wynalazku, w której po zamrożeniu granulatu następuje liofilizacja, zawiera tkankę zamrożoną na okres od 1 h do 48 h, najkorzystniej 24 h.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę zamrożoną w zamrażarce.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę mieloną z zastosowaniem sita o wielkości oczek 6 mm lub 4 mm, najkorzystniej przez 3 min przy prędkości 1500 obr./min.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę przesianą przez system sit o wielkości oczek 4 mm, 2 mm, 1 mm, i 0,5 mm.

Korzystnie granulat zróżnicowany jest na frakcje o wielkości ziaren: od 6 mm do 4 mm, od 3,9 mm do 2 mm, od 1,9 mm do 1 mm, od 0,9 mm do 0,5 mm, poniżej 0,4 mm.

Korzystnym skutkiem wynalazku jest to, że pozwala on wykorzystać pozyskane kości zbite, oraz kości gąbczaste i korowo-gąbczaste, zwłaszcza kości ludzkie oraz odpady takich kości, powstałe przy ich wykorzystaniu w innych procedurach medycznych. Sposób według wynalazku może być również stosowany w przypadku kości pochodzących od zwierząt. Nowy sposób otrzymywania oznacza łatwość przygotowania przeszczepu, niskie w porównaniu do preparatów syntetycznych koszty uzyskania przeszczepu, bardzo duży, bezpieczny dla potencjalnego biorcy, przebadany laboratoryjnie magazyn dostępnego surowca do przetwarzania granulatu oraz udokumentowana skuteczność przeszczepów kostnych.

Rozwiązanie zwiększa dostępność przeszczepów kostnych, i pozwala wykorzystać odpady powstałe na salach operacyjnych oraz w innych procesach przygotowywania przeszczepów kostnych.

Przeszczep według wynalazku charakteryzuje się unikalnymi właściwościami przykładowo: jest biologicznie zgodny, oczyszczony z komórek szpiku o silnych właściwościach immunogennych oraz odznacza się standaryzowaną granulacją. Dzięki starannie dobranym czynnościom i parametrom przygotowania, przeszczep jest niezwykle bezpieczny dla potencjalnego biorcy, i może być stosowany do zaopatrywania ubytków tkanki kostnej u ludzi.

Wynalazek przedstawiono w poniższych przykładach realizacji.

P r z y k ł a d 1

Kość ludzka (zbita, gąbczasta lub korowo-gąbczasta), przykładowo kość zbita w postaci trzonu o długości ok. 15 cm, przebadana pod kątem chorób zakaźnych, w pierwszym etapie, oczyszczana jest przy użyciu tnących narzędzi chirurgicznych z tkanek miękkich i szpiku kostnego. Trzon o długości ok. 15 cm ważony jest na wadze laboratoryjnej, po czym, przy użyciu piły mechanicznej przycinany jest na

PL 232 501 B1 fragmenty ok. 3 cm. Przygotowane fragmenty w celu odtłuszczenia umieszcza się w naczynie z zakrętką o pojemności 1000 ml, zalewa się nadtlenkiem wodoru - H2O2 - o stężeniu 3% w ilości ok. 250 ml, zachowując proporcję 2:1 (2 ml H2O2 na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce przez 15 min przy obrotach 200 obr./min. Dopuszcza się również stosowanie H2O2 o stężeniu od 1% do 40%. Po wytrząsaniu, H2O2 odlewa się, po czym fragmenty trzonu płucze się w celu usunięcia resztek szpiku kostnego żółtego i szpiku kostnego czerwonego oraz wymycia H2O2, zalewając chlorkiem sodu - NaCI - o stężeniu 0,9% w ilości ok. 250 ml, zachowując proporcję 2:1 (2 ml NaCl na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce przez 15 min przy obrotach 200 obr./min. Czynność płukania w 0,9% NaCl powtarza się dwukrotnie. Dopuszcza się również stosowanie NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%. Po dwukrotnym płukaniu, fragmenty trzonu doczyszcza się z ewentualnych pozostałych tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych. Tak przygotowaną kość odsącza się z resztek NaCl na papierze bezpyłowym i zamraża w temp. ok. -40°C na okres 24 h, przy czym są to wartości korzystne, gdyż zamrażanie może się odbywać w temp. od -80°C do -20°C na okres od 1 h do 48 h. Po wyjęciu z zamrażarki, przygotowane fragmenty kości zbitej, liofilizuje się w temp. od -52°C do -50°C, w próżni od 0,016 mBara do 0,018 mBara przez okres 72 h, przy czym jest to wartość korzystna, gdyż liofilizację można prowadzić w czasie od 8 h do 96 h. Po liofilizacji, materiał mieli się młynem mechanicznym z zastosowaniem sita o wielkości oczek 6 mm lub 4 mm przez 3 min przy 1500 obr./min. Zmielony materiał przesiewa się przez sita o wielkości oczek 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,5 mm. W ten sposób, różnicuje się uzyskany granulat kości na pięć frakcji o wielkości ziaren: od 6 mm do 4 mm, od 3,9 mm do 2 mm, od 1,9 mm do 1 mm, od 0,9 mm do 0,5 mm, poniżej 0,4 mm. Granulat porcjuje się, pakuje w szczelnie zamknięte pojemniki, okleja etykietą identyfikacyjną, a następnie sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Po kontroli całego procesu kwalifikacji, przetwarzania, pakowania i sterylizacji, przeszczep granulatu kości dopuszczany jest do użytku klinicznego i może być przechowywany w temperaturze pokojowej.

P r z y k ł a d 2

Kość ludzka (zbita, gąbczasta lub korowo-gąbczasta), przykładowo kość zbita w postaci trzonu o długości ok. 15 cm, przebadana pod kątem chorób zakaźnych, w pierwszym etapie, oczyszczana jest przy użyciu tnących narzędzi chirurgicznych z tkanek miękkich i szpiku kostnego. Trzon o długości ok. 15 cm ważony jest na wadze laboratoryjnej, po czym, przy użyciu piły mechanicznej przycinany jest na fragmenty ok. 3 cm. Przygotowane fragmenty w celu odtłuszczenia umieszcza się w naczyniu z zakrętką pojemności 1000 ml, zalewa się nadtlenkiem wodoru - H2O2 - o stężeniu 3% w ilości ok. 250 ml, zachowując proporcję 2:1 (2 ml H2O2 na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce przez 15 min przy obrotach 200 obr./min. Dopuszcza się również stosowanie H2O2 o stężeniu od 1% do 40%. Po wytrząsaniu, H2O2 odlewa się, po czym fragmenty trzonu płucze się w celu usunięcia resztek szpiku kostnego żółtego i szpiku kostnego czerwonego oraz wymycia H2O2, zalewając chlorkiem sodu - NaCl - o stężeniu 0,9% w ilości ok. 250 ml, zachowując proporcję 2:1 (2 ml NaCl na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce przez 15 min przy obrotach 200 obr./min. Czynność płukania w 0,9% NaCl powtarza się dwukrotnie. Dopuszcza się również stosowanie NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%. Po dwukrotnym płukaniu fragmenty trzonu doczyszcza się z ewentualnych pozostałych tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych. Tak przygotowaną kość odsącza się z resztek NaCl na papierze bezpyłowym i zamraża w temp. około -40°C na okres 24 h, przy czym są to wartości korzystne, gdyż zamrażanie może się odbywać w temperaturze od -80°C do -20°C na okres od 1 h do 48 h. Po zamrożeniu, materiał mieli się młynem mechanicznym z zastosowaniem sita o wielkości oczek 6 mm lub 4 mm przez 3 min przy 1500 obr./min. Zmielony materiał przesiewa się przez sita o wielkości oczek 4 mm, 2 mm, 1 mm, i 0,5 mm. W ten sposób różnicuje się uzyskany granulat kości na pięć frakcji o wielkości ziaren: od 6 mm do 4 mm, od 3,9 mm do 2 mm, od 1,9 mm do 1 mm, od 0,9 mm do 0,5 mm, poniżej 0,4 mm. Uzyskane frakcje ponownie zamraża się w temp. około -40°C na okres 24 h, przy czym są to wartości korzystne, gdyż zamrażanie może się odbywać w temperaturze od -80°C do -20°C na okres od 1 h do 48 h. Następnie granulat liofilizuje się przy parametrach temp. od -52°C do -50°C, próżni od 0,016 mBara do 0,018 mBara przez okres 48 h, przy czym jest to wartość korzystna, gdyż liofilizację można prowadzić w czasie od 8 h do 96 h. Po liofilizacji granulat porcjuje się, pakuje w szczelnie zamknięte pojemniki, okleja etykietą identyfikacyjną, a następnie sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Po kontroli całego procesu kwalifikacji, przetwarzania, pakowania i sterylizacji, przeszczep granulatu kości dopuszczany jest do użytku klinicznego i może być przechowywany w temperaturze pokojowej.

P r z y k ł a d 3

Kość ludzka (zbita, gąbczasta lub korowo-gąbczasta), przykładowo kość zbita w postaci trzonu o długości ok. 15 cm, przebadana pod kątem chorób zakaźnych, w pierwszym etapie, oczyszczana jest

PL 232 501 B1 przy użyciu tnących narzędzi chirurgicznych z tkanek miękkich i szpiku kostnego. Trzon o długości ok. 15 cm ważony jest na wadze laboratoryjnej, po czym, przy użyciu piły mechanicznej przycinany jest na fragmenty ok. 3 cm. Przygotowane fragmenty w celu odtłuszczenia umieszcza się w naczyniu z zakrętką o pojemności 1000 ml, zalewa się nadtlenkiem wodoru - H2O2 - o stężeniu 3% w ilości ok. 250 ml, zachowując proporcję 2:1 (2 ml H2O2 na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce przez 15 min przy obrotach 200 obr./min. Dopuszcza się również stosowanie H2O2 o stężeniu od 1% do 40%. Po wytrząsaniu, H2O2 odlewa się, po czym fragmenty trzonu płucze się w celu usunięcia resztek szpiku kostnego żółtego i szpiku kostnego czerwonego oraz wymycia H2O2, zalewając chlorkiem sodu - NaCI - o stężeniu 0,9% w ilości ok. 250 ml, zachowując proporcję 2:1 (2 ml NaCl na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce przez 15 min przy obrotach 200 obr./min. Czynność płukania w 0,9% NaCl powtarza się dwukrotnie. Dopuszcza się również stosowanie NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%. Po dwukrotnym płukaniu fragmenty trzonu doczyszcza się z ewentualnych pozostałych tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych. Tak przygotowaną kość zbitą odsącza się z resztek NaCl na papierze bezpyłowym i zamraża w temp. około -40°C na okres 24 h, przy czym są to wartości korzystne, gdyż zamrażanie może się odbywać w temp. od -80°C do -20°C na okres od 1 h do 48 h. Po zamrożeniu materiał mieli się młynem mechanicznym z zastosowaniem sita o wielkości oczek 6 mm lub 4 mm przez 3 min przy 1500 obr./min. Zmielony materiał przesiewa się przez sita o wielkości oczek 4 mm, 2 mm, 1 mm, i 0,5 mm. W ten sposób różnicuje się uzyskany granulat kości na pięć frakcji o wielkości ziaren: od 10 mm do 4 mm, od 3,9 mm do 2 mm, od 1,9 mm do 1 mm, od 0,9 mm do 0,5 mm, poniżej 0,4 mm. Uzyskane frakcje zamraża się w odpowiednio oznakowanych pojemnikach w temp. około -40°C, przy czym jest to wartość korzystna, gdyż zamrażanie może się odbywać w temp. od -80°C do -20°C. Zamrożony granulat porcjuje się, pakuje w szczelnie zamknięte pojemniki, okleja etykietą identyfikacyjną, a następnie sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Po kontroli całego procesu kwalifikacji, przetwarzania, pakowania i sterylizacji, przeszczep granulatu kości dopuszczany jest do użytku klinicznego i może być przechowywany w temp. około -40°C, przy czym jest to wartość korzystna, gdyż zakres temperatur może wynosić od -80°C do -20°C.

P r z y k ł a d 4

Kość ludzka (zbita, gąbczasta lub korowo-gąbczasta), przykładowo kość zbita w postaci trzonu o długości ok. 15 cm, przebadana pod kątem chorób zakaźnych, w pierwszym etapie, oczyszczana jest przy użyciu tnących narzędzi chirurgicznych z tkanek miękkich i szpiku kostnego. Trzon o długości ok. 15 cm ważony jest na wadze laboratoryjnej, po czym, przy użyciu piły mechanicznej przycinany jest na fragmenty ok. 3 cm. Przygotowane fragmenty w celu odtłuszczenia umieszcza się w zlewce o pojemności 1000 ml i zalewa się alkoholem etylowym - C2H5OH - o stężeniu 70%, zachowując proporcję 3:1 (3 ml C2H5OH na 1 g kości) i odstawia na 24 h w temp. pokojowej. Dopuszcza się również stosowanie C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%. Po upływie wskazanego czasu, C2H5OH odlewa się, a fragmenty trzonu ponownie odtłuszcza się, zalewając nadtlenkiem wodoru - H2O2 - o stężeniu 3% w ilości ok. 250 ml, zachowując proporcję 2:1 (2 ml H2O2 na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce przez 15 min przy obrotach 200 obr./min. Dopuszcza się również stosowanie H2O2 o stężeniu od 1% do 40%. Po wytrząsaniu, H2O2 odlewa się, po czym fragmenty trzonu płucze się w celu usunięcia resztek szpiku kostnego żółtego i szpiku kostnego czerwonego oraz wymycia H2O2, zalewając chlorkiem sodu - NaCl - o stężeniu 0,9% w ilości ok. 250 ml, zachowując proporcję 2:1 (2 ml NaCl na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce przez 15 min przy obrotach 200 obr./min. Czynność płukania w 0,9% NaCl powtarza się dwukrotnie. Dopuszcza się również stosowanie NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%. Po dwukrotnym płukaniu, fragmenty trzonu doczyszcza się z ewentualnych pozostałych tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych. Tak przygotowaną kość odsącza się z resztek NaCl na papierze bezpyłowym i zamraża w temperaturze ok. -40°C na okres 24 h, przy czym są to wartości korzystne, gdyż zamrażanie może się odbywać w temp. od -80°C do -20°C na okres od 1 h do 48 h. Po wyjęciu z zamrażarki, przygotowane fragmenty kości, liofilizuje się w temp. od -52°C do -50°C, w próżni od 0,016 mBara do 0,018 mBara przez okres 72 h, przy czym jest to wartość korzystna, gdyż liofilizację można prowadzić w czasie od 8 h do 96 h. Po liofilizacji materiał mieli się młynem mechanicznym z zastosowaniem sita o wielkości oczek 6 mm lub 4 mm przez 3 min przy 1500 obrotów/min. Zmielony materiał przesiewa się przez sita o wielkości oczek 4 mm, 2 mm, 1 mm, 0,5 mm. W ten sposób różnicuje się uzyskany granulat kości zbitej na 5 frakcji o wielkości ziaren: od 6 mm do 4 mm, od 3,9 mm do 2 mm, od 1,9 mm do 1 mm, od 0,9 do 0,5 mm, poniżej 0,4 mm. Granulat porcjuje się, pakuje w szczelnie zamknięte pojemniki, okleja etykietą identyfikacyjną, a następnie sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Po kontroli całego procesu kwalifikacji, przetwarzania, pakowania i sterylizacji, przeszczep granulatu kości dopuszczany jest do użytku klinicznego i może być przechowywany w temp. pokojowej.

PL 232 501 B1

P r z y k ł a d 5

Kość ludzka (zbita, gąbczasta lub korowo-gąbczasta), przykładowo kość zbita w postaci trzonu o długości ok. 15 cm, przebadana pod kątem chorób zakaźnych, w pierwszym etapie, oczyszczana jest przy użyciu tnących narzędzi chirurgicznych z tkanek miękkich i szpiku kostnego. Trzon o długości ok. 15 cm ważony jest na wadze laboratoryjnej, po czym, przy użyciu piły mechanicznej przycinany jest na fragmenty ok. 3 cm. Przygotowane fragmenty w celu odtłuszczenia umieszcza się w naczyniu z zakrętką, o pojemności 1000 ml i zalewa się alkoholem etylowym - C2H5OH - o stężeniu 70%, zachowując proporcję 3:1 (3 ml C2H5OH na 1 g kości) i odstawia na 24 h w temp. pokojowej. Dopuszcza się również stosowanie C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%. Po upływie wskazanego czasu, C2H5OH odlewa się, a fragmenty trzonu ponownie odtłuszcza się, zalewając nadtlenkiem wodoru - H2O2 - o stężeniu 3% w ilości ok. 250 ml, zachowując proporcję 2:1 (2 ml H2O2 na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce przez 15 min przy obrotach 200 obr./min. Dopuszcza się również stosowanie H2O2 o stężeniu od 1% do 40%. Po wytrząsaniu, H2O2 odlewa się, po czym fragmenty trzonu płucze się w celu usunięcia resztek szpiku kostnego żółtego i szpiku kostnego czerwonego oraz wymycia H2O2, zalewając chlorkiem sodu - NaCl

- o stężeniu 0,9% w ilości ok. 250 ml, zachowując proporcję 2:1 (2 ml NaCl na 1 g kości) i wytrząsa się na wytrząsarce przez 15 min przy obrotach 200 obr./min. Czynność płukania w 0,9% NaCl powtarza się dwukrotnie. Dopuszcza się również stosowanie NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%. Po dwukrotnym płukaniu fragmenty trzonu doczyszcza się z ewentualnych pozostałych tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych. Tak przygotowaną kość odsącza się z resztek NaCl na papierze bezpyłowym i zamraża w temp. ok. -40°C na okres 24 h, przy czym są to wartości korzystne, gdyż zamrażanie może się odbywać w temp. od -80°C do -20°C na okres od 1 h do 48 h. Po zamrożeniu materiał mieli się młynem mechanicznym z zastosowaniem sita o wielkości oczek 6 mm lub 4 mm przez 3 min przy 1500 obr./min. Zmielony materiał przesiewa się przez sita o wielkości oczek 4 mm, 2 mm, 1 mm, i 0,5 mm. W ten sposób różnicuje się uzyskany granulat kości na 5 frakcji o wielkości ziaren: od 6 mm do 4 mm, od 3,9 mm do 2 mm, od 1,9 mm do 1 mm, od 0,9 do 0,5 mm, poniżej 0,4 mm. Uzyskane frakcje ponownie zamraża się w temp. ok. -40°C na okres 24 h, przy czym są to wartości korzystne, gdyż zamrażanie może się odbywać w temp. od -80°C do -20°C na okres od 1 h do 48 h. Po wyjęciu z zamrażarki, uzyskane frakcje liofilizuje się w temp. od -52°C do -50°C, próżni od 0,016 mBara do 0,018 mBara przez okres 48 h, przy czym jest to wartość korzystna, gdyż liofilizację można prowadzić w czasie od 8 h do 96 h. Po liofilizacji granulat porcjuje się, pakuje w szczelnie zamknięte pojemniki, okleja etykietą identyfikacyjną, a następnie sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Po kontroli całego procesu kwalifikacji, przetwarzania, pakowania i sterylizacji, przeszczep granulatu kości dopuszczany jest do użytku klinicznego i może być przechowywany w temp. pokojowej.

P r z y k ł a d 6

Kość ludzka (zbita, gąbczasta lub korowo-gąbczasta), przykładowo kość zbita w postaci trzonu o długości ok. 15 cm, przebadana pod kątem chorób zakaźnych, w pierwszym etapie, oczyszczana jest przy użyciu tnących narzędzi chirurgicznych z tkanek miękkich i szpiku kostnego. Trzon o długości ok. 15 cm ważony jest na wadze laboratoryjnej, po czym, przy użyciu piły mechanicznej przycinany jest na fragmenty ok. 3 cm. Przygotowane fragmenty w celu odtłuszczenia umieszcza się w naczyniu z zakrętką o pojemności 1000 ml, zalewa się alkoholem etylowym - C2H5OH - o stężeniu 70%, zachowując proporcję 3:1 (3 ml C2H5OH na 1 g kości) i odstawia na 24 h w temp. pokojowej. Dopuszcza sie również stosowanie C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%. Po upływie wskazanego czasu, C2H5OH odlewa się, a fragmenty trzonu ponownie odtłuszcza się, zalewając nadtlenkiem wodoru - H2O2 - o stężeniu 3% w ilości ok. 250 ml, zachowując proporcję 2:1 (2 ml H2O2 na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce przez 15 min przy obrotach 200 obr./min. Dopuszcza się również stosowanie H2O2 o stężeniu od 1% do 40%. Po wytrząsaniu, H2O2 odlewa się, po czym fragmenty trzonu płuka się w celu usunięcia resztek szpiku kostnego żółtego i szpiku kostnego czerwonego oraz wymycia H2O2, zalewając chlorkiem sodu - NaCl

- o stężeniu 0,9% w ilości ok. 250 ml, zachowując proporcję 2:1 (2 ml NaCl na 1 g kości) i wytrząsa się na wytrząsarce przez 15 min przy obrotach 200 obr./min. Czynność płukania w 0,9% NaCl powtarza się dwukrotnie. Dopuszcza się również stosowanie NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%. Po dwukrotnym płukaniu fragmenty trzonu doczyszcza się z ewentualnych pozostałych tkanek miękkich przy użyciu narzędzi chirurgicznych. Tak przygotowaną kość zbitą odsącza się z resztek NaCl na papierze bezpyło wym i zamraża w temp. około -40°C na okres 24 h, przy czym są to wartości korzystne, gdyż zamrażanie może się odbywać w temp. od -80°C do -20°C na okres od 1 h do 48 h. Po zamrożeniu materiał mieli się młynem mechanicznym z zastosowaniem sita o wielkości oczek 6 mm lub 4 mm przez 3 min przy 1500 obr./min. Zmielony materiał przesiewa się przez sita o wielkości oczek 4 mm, 2 mm, 1 mm,

PL 232 501 B1 i 0,5 mm. W ten sposób różnicuje się uzyskany granulat kości na 5 frakcji o wielkości ziaren: od 6 mm do 4 mm, od 3,9 mm do 2 mm, od 1,9 mm do 1 mm, od 0,9 do 0,5 mm, poniżej 0,4 mm. Uzyskane frakcje zamraża się w odpowiednio oznakowanych pojemnikach w temp. około -40°C, przy czym jest to wartość korzystna, gdyż zamrażanie może się odbywać w temp. od -80°C do -20°C. Zamrożony granulat porcjuje się, pakuje w szczelnie zamknięte pojemniki, okleja etykietą identyfikacyjną, a następnie sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Po kontroli całego procesu kwalifikacji, przetwarzania, pakowania i sterylizacji, przeszczep granulatu kości dopuszczany jest do użytku klinicznego i jest przechowywany w temp. około -40°C, przy czym jest to wartość korzystna, gdyż zakres temp. może wynosić od -80°C do -20°C.

Claims (35)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania przeszczepu do regeneracji tkanki kostnej, zwłaszcza ludzkiej, znamienny tym, że składa się z następujących po sobie etapów: oczyszczania mechanicznego kości zbitej, gąbczastej lub korowo-gąbczastej, korzystnie pochodzenia ludzkiego z tkanek miękkich, dzielenia kości na fragmenty, korzystnie odłuszczania kości w C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%, odtłuszczania kości w H2O2 o stężeniu od 1% do 40%, co najmniej jednokrotnego płukania kości w NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%, doczyszczania mechanicznego kości, odsączania kości z resztek NaCl, zamrażania kości w temp. około -40°C, mielenia kości młynem mechanicznym, aż do uzyskania granulatu, przesiewania granulatu przez system sit w celu podziału na odpowiednie frakcje, korzystnie zamrażania granulatu w temp. około -40°C, i sterylizacji radiacyjnej granulatu, korzystnie w dawce 35 kGy.
2. 2. Sposób według zastrz. 1 , znamienny tym, że w odmianie wynalazku, po etapie zamrażania kości lub po etapie zamrażania granulatu, następuje etap liofilizacji w temp. od -52°C do -50°C, pod ciśnieniem o wartości od 0,016 mBara do 0,018 mBara w czasie od 8 h do 96 h, najkorzystniej 72 h lub 48 h.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że do oczyszczania i doczyszczania mechanicznego kości, stosuje się tnące narzędzia chirurgiczne.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że kości dzieli się na fragmenty za pomocą piły mechanicznej.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że fragmenty kości wynoszą ok. 3 cm.
6. 6. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że odłuszczanie kości w C2H5OH prowadzi się w C2H5OH o stężeniu 70%, zachowując proporcje 3:1 (3 ml C2H5OH na 1 g kości).
7. 7. Sposób według zastrz. 1 lub 2, albo 6, znamienny tym, że odłuszczanie kości w C2H5OH prowadzi się w ten sposób, że kości zalewa się C2H5OH i odstawia na okres 24 h.
8. 8. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że odtłuszczanie kości w H2O2 prowadzi się w H2O2 o stężeniu 3%, zachowując proporcje 2:1 (2 ml H2O2 na 1 g kości).
9. 9. Sposób według zastrz. 1 lub 2, albo 8, znamienny tym, że w czasie odtłuszczania w H2O2, kości wytrząsa się na wytrząsarce, najkorzystniej przez 15 min przy obrotach 200 obr./min.
10. 10. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że płukanie kości w NaCl prowadzi się w NaCl o stężeniu 0,9%, zachowując proporcje 2:1 (2 ml NaCl na 1 g kości), przy czym najlepiej etap płukania powtarza się dwukrotnie.
11. 11. Sposób według zastrz. 1 lub 2, albo 10, znamienny tym, że podczas płukania w NaCl, kości wytrząsa się na wytrząsarce, najkorzystniej przez 15 min przy obrotach 200 obr./min.
12. 12. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że odsączanie kości z resztek NaCl, prowadzi się na papierze bezpyłowym.
13. 13. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że zamrażanie kości po odsączaniu z resztek NaCl, prowadzi się w temp. od -80°C do -20°C, przez okres od 1 h do 48 h, najlepiej 24 h.
14. 14. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że zamrażanie granulatu prowadzi się w temp. od -80°C do -20°C, przy czym w odmianie wynalazku, w której po zamrożeniu granulatu następuje liofilizacja, granulat zamraża się na okres od 1 h do 48 h, najkorzystniej 24 h.
15. 15. Sposób według zastrz. 1 lub 2, albo 13 lub 14, znamienny tym, że kości lub granulat, zamraża się w zamrażarce.
16. 16. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że kości mieli się z zastosowaniem sita o wielkości oczek 6 mm lub 4 mm, najkorzystniej przez 3 min przy prędkości 1500 obr./min.

    PL 232 501 B1
17. 17. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że granulat przesiewa się przez system sit o wielkości oczek 4 mm, 2 mm, 1 mm, i 0,5 mm.
18. 18. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że granulat różnicuje się na frakcje o wielkości ziaren: od 6 mm do 4 mm, od 3,9 mm do 2 mm, od 1,9 mm do 1 mm, od 0,9 mm do 0,5 mm, poniżej 0,4 mm.
19. 19. Przeszczep do regeneracji tkanki kostnej, zwłaszcza ludzkiej, znamienny tym, że stanowi go tkanka kostna zbita, korowo-gąbczasta lub gąbczasta, korzystnie pochodzenia ludzkiego, w postaci granulatu, oczyszczona mechanicznie z tkanek miękkich, dzielona na fragmenty, korzystnie odłuszczana w C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%, odtłuszczana w H2O2 o stężeniu od 1% do 40%, co najmniej jednokrotnie płukana w NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%, doczyszczona mechanicznie, pozbawiona resztek NaCl, H2O2, korzystnie również C2H5OH, zamrożona w temp. około -40°C, mielona aż do uzyskania granulatu, przesiana przez system sit w celu podziału na odpowiednie frakcje, korzystnie ponownie zamrożona w temp. około -40°C, i sterylizowana radiacyjnie, korzystnie w dawce 35 kGy.
20. 20. Przeszczep według zastrz. 19, znamienny tym, że w odmianie wynalazku, stanowi go tkanka liofilizowana po pierwszym zamrożeniu lub po ponownym zamrożeniu, w temp. od -52°C do -50°C, pod ciśnieniem o wartości od 0,016 mBara do 0,018 mBara, w czasie od 8 h do 96 h, najkorzystniej 72 h lub 48 h.
21. 21. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, znamienny tym, że zawiera tkankę oczyszczoną i doczyszczoną mechanicznie, za pomocą tnących narzędzi chirurgicznych.
22. 22. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, znamienny tym, że zawiera tkankę podzieloną na fragmenty za pomocą piły mechanicznej, najlepiej na fragmenty o wielkości ok. 3 cm.
23. 23. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, znamienny tym, że zawiera tkankę odłuszczoną w C2H5OH o stężeniu 70%, z zachowaniem proporcji 3:1 (3 ml C2H5OH na 1 g kości).
24. 24. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, albo 23, znamienny tym, że zawiera tkankę zalaną C2H5OH i odstawioną na okres 24 h.
25. 25. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, znamienny tym, że zawiera tkankę odtłuszczoną w H2O2 o stężeniu 3%, z zachowaniem proporcji 2:1 (2 ml H2O2 na 1 g kości).
26. 26. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, albo 25, znamienny tym, że zawiera tkankę wytrząsaną w czasie odtłuszczania w H2O2 na wytrząsarce, najkorzystniej przez 15 min przy obrotach 200 obr./min.
27. 27. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, znamienny tym, że zawiera tkankę płukaną w NaCl o stężeniu 0,9%, z zachowaniem proporcji 2:1 (2 ml NaCl na 1 g kości), najlepiej płukaną dwukrotnie.
28. 28. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, albo 27, znamienny tym, że zawiera tkankę wytrząsaną podczas płukania w NaCl na wytrząsarce, najkorzystniej przez 15 min przy obrotach 200 obr./min.
29. 29. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, znamienny tym, że zawiera tkankę odsączoną z resztek NaCl, na papierze bezpyłowym.
30. 30. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, znamienny tym, że zawiera tkankę zamrożoną po odsączaniu z resztek NaCl w temp. od -80°C do -20°C, przez okres od 1 h do 48 h, najlepiej 24 h.
31. 31. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, znamienny tym, że zawiera tkankę zamrożoną w temp. od -80°C do -20°C, przy czym w odmianie wynalazku, w której po zamrożeniu granulatu następuje liofilizacja, zawiera tkankę zamrożoną na okres od 1 h do 48 h, najkorzystniej 24 h.
32. 32. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, albo 30 lub 31, znamienny tym, że zawiera tkankę zamrożoną w zamrażarce.
33. 33. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, znamienny tym, że zawiera tkankę mieloną z zastosowaniem sita o wielkości oczek 6 mm lub 4 mm, najkorzystniej przez 3 min przy prędkości 1500 obr./min.
34. 34. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, znamienny tym, że zawiera tkankę przesianą przez system sit o wielkości oczek 4 mm, 2 mm, 1 mm, i 0,5 mm.
35. 35. Przeszczep według zastrz. 19 lub 20, znamienny tym, że granulat zróżnicowany jest na frakcje o wielkości ziaren: od 6 mm do 4 mm, od 3,9 mm do 2 mm, od 1,9 mm do 1 mm, od 0,9 mm do 0,5 mm, poniżej 0,4 mm.