KR101229435B1

KR101229435B1 - 바이러스 불활화된 골이식용 골분의 제조방법

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Publication number: KR101229435B1
Application number: KR1020100079006A
Authority: KR
Inventors: 전성현; 채지화; 허재원; 이은정; 강계원; 김인섭; 배정은; 황호찬
Original assignee: 한스바이오메드 주식회사
Priority date: 2010-08-16
Filing date: 2010-08-16
Publication date: 2013-02-05
Also published as: KR20120016548A

Abstract

본 발명은 에탄올, 과산화수소, 염산 및 E-beam처리를 포함하는 공정을 통해 바이러스가 불활화된 골이식용 골분을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 사람유래 바이러스 및 모델 바이러스인 인간 후천성 면역결핍증 바이러스 (Human immunodeficiency virus), 소의 헤르페스 바이러스(Bovine herpes virus), 소의 바이러스성 설사 바이러스 (Bovine viral diarrhea virus), A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus) 및 돼지의 파보바이러스(Porcine parvovirus)의 불활화 공정을 포함하는 골이식재의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, HIV 1 및 2, HTLV 타입 1 및 타입 2를 포함하는 인간 후천성 면역결핍증 바이러스(Human immuno deficiency virus), 인간 헤르페스 바이러스(Human herpes virus), HCV, HGV를 포함하는 단일가닥 ssRNA 바이러스 및 A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus), B19 인간 파보바이러스(B19 human parvovirus) 등이 불활화된 안전한 골이식용 골분을 얻을 수 있다.

Description

바이러스 불활화된 골이식용 골분의 제조방법{Manufacturing Method of Virus Inactivated Bone Powder for Grafting}

본 발명은 에탄올, 과산화수소, 염산 및 E-beam처리를 포함하는 공정을 통해 바이러스가 불활화된 골이식용 골분을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 사람유래 바이러스 및 모델 바이러스인 인간 후천성 면역결핍증 바이러스 (Human immunodeficiency virus), 소의 헤르페스 바이러스(Bovine herpes virus), 소의 바이러스성 설사 바이러스 (Bovine viral diarrhea virus), A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus) 및 돼지의 파보바이러스(Porcine parvovirus)의 불활화 공정을 포함하는 골이식용 골분의 제조방법에 관한 것이다.

외상, 종양, 기형 혹은 생리학적 현상 등에 의해 뼈조직이 손상된 경우. 골 결손부의 회복을 위한 가장 보편적인 방법은 다른 부위의 자신의 골을 일부 채취하여 이식하는 자가 이식방법(autograft), 다른 사람의 뼈를 화학 처리하여 이식하는 동종 이식방법(allograft), 동물의 뼈를 화학 처리하여 이식하는 이종 이식방법(xenograft) 등이 있다. 일반적으로 가장 좋은 이식 방법인 자가 이식방법은 이차적인 수술이 필요하고 그에 따른 감염 및 혈액 손실의 위험을 증가시키고, 필요한 만큼의 양을 얻기가 힘들다는 단점이 있다. 동종 이식방법은 질환 전달 및 면역반응이 일어날 수 있는 위험이 있다. 이종 이식방법 역시 면역반응이 일어날 수 있는 확률은 낮지만 광우병 등의 문제가 발생할 수 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 충분한 양의 골을 쉽게 얻을 수 있으며, 질병에 대한 전염 가능성이 없고, 기존 이식재를 대체할만한 성능을 갖는 생체친화성이 우수하고 이식시 적절히 흡수되어 재생골로 치환될 수 있는 생분해성 골이식재가 요구되고 있다.

그러나 일반 의약품과는 달리 골이식재는 그 생물학적 특성으로 인해 내인성 또는 외래성 오염물질의 생리적 활성과 바이러스와 같은 감염성 병원 인자로 인한 원료의 오염 가능성 때문에 안전성에 관한 논란이 오래전부터 있어 왔다.

인체유래 조직의 안전성 측면에서 특히 강조되어지는 감염성 바이러스는 인간후천성 면역 결핍증 바이러스(human immunodeficiency virus (HIV)), B형 간염바이러스(Hepatitis B virus (HBV)), C형 간염바이러스(Hepatitis C virus (HCV)), 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus (CMV)) 등이다. 또한 인간 파보바이러스(Human parvovirus B19 (B19))도 혈장에서 자주 발견되며 감염 가능성이 있는 바이러스이다. 그 중 HAV는 지금까지 상대적으로 발견 빈도가 적은 혈장 유래 바이러스이다.

가장 인간에게 치명적인 HIV, HBV, HCV와 같은 바이러스는 지질피막형 바이러스(lipid-enveloped virus)들로 알콜분획(alcohol fractionation), S/D 처리, 열처리(heat-treatment), 저 pH배양(low pH incubation) 과정들을 거치면 대부분 사멸되는 것으로 보고되고 있지만, B19과 HAV는 크기가 작은 (15-30nm) 비-피막 바이러스(non-enveloped virus)로 열처리와 화학적 처리에 상대적으로 저항성을 나타내는 것으로 보고되고 있다.

골이식재에 있어서 이러한 내열성 및 내화학성을 갖는 바이러스의 오염을 실질적으로 없애기 위한 처리공정에 대한 연구가 많지는 않은 편이다. 특히 인간을 대상으로하는 골이식재의 경우 골조직의 피이식자에게 전이될 수 있는 공여자의 바이러스의 활성을 제거하는 기술은 골이식재의 신뢰도를 높이데 매우 중요하므로, 이러한 공정의 개발이 무엇보다 필요한 시점이다.

이와 같은 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 동종이식용 골이식재의 안전성을 개선시키기 위해 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

결국, 본 발명의 목적은 바이러스가 불활화되어 감염의 위험성이 매우 낮은 골이식용 골분의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명의 일 측면에 따르면, 골이식용 뼈를 분쇄하여 골이식용 골분을 제조하는 방법에 있어서, 뼈를 분쇄하기 전에 에탄올을 처리하는 공정, 뼈를 분쇄하는 공정, 뼈를 분쇄한 이후 에탄올을 처리하는 공정, 뼈를 분쇄한 이후 과산화수소를 처리하는 공정 및 E-beam을 처리하는 공정으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 공정을 거치는 것을 특징으로 하는 바이러스 불활화된 골이식용 골분의 제조방법이 제공될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 골이식용 뼈를 에탄올에 처리하는 단계; 뼈를 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 뼈를 에탄올에 처리하는 단계, 상기 에탄올 처리된 뼈를 과산화수소에 처리하는 단계; 상기 과산화수소 처리된 뼈를 염산에 처리하는 단계 및 상기 염산에 처리된 뼈를 E-beam에 조사하는 단계를 포함하는 바이러스 불활화된 골이식용 골분의 제조방법이 제공될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 골이식용 뼈를 분쇄하기 전에 1회 이상 냉동 및 해동시키는 공정을 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 에탄올 처리는 70% 에탄올에 0.5~2시간 동안 뼈를 침지하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 과산화수소 처리는 3% 과산화수소에 0.5~2시간 동안 뼈를 침지하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 염산 처리는 0.5N 염산을 20ml/g 농도로 1~3시간 처리하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 E-beam에 조사하는 단계는 10~20kGy의 E-beam을 조사하는 것일 수 있다.

본 발명에 따르면, 사람유래 바이러스 및 모델 바이러스인 인간 후천성 면역결핍증 바이러스 (Human immunodeficiency virus), 소의 헤르페스 바이러스(Bovine herpes virus), 소의 바이러스성 설사 바이러스 (Bovine viral diarrhea virus), A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus) 및 돼지의 파보바이러스(Porcine parvovirus)의 불활화 공정을 포함하는 골이식재의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, HIV 1 및 2, HTLV 타입 1 및 타입 2를 포함하는 인간 후천성 면역결핍증 바이러스 (Human immunodeficiency virus), 인간 헤르페스 바이러스(Human herpes virus), HCV, HGV를 포함하는 단일가닥 ssRNA 바이러스 및 A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus), B19 인간 파보바이러스(B19 human parvovirus) 등이 불활화된 안전한 골이식용 골분을 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 약자로 지칭하는 바이러스의 명칭 중, HIV는 인간 후천성 면역결핍증 바이러스(Human immunodeficiency virus), BHV는 소의 헤르페스 바이러스(Bovine herpes virus), BVDV는 소의 바이러스성 설사 바이러스 (Bovine viral diarrhea virus), HAV는 A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus)를 나타내며, PPV는 돼지의 파보바이러스(Porcine parvovirus)를 지칭한다.

본 발명에서 불활성화의 대상이 되는 바이러스는 CPMP guideline 'Virus Validation Studies (Revised) (CPMP/BWP/268/95)'에 따라 선정하였다. 바이러스 선정 시 고려한 사항은 아래와 같다.

(i) 불활성화 검증을 위해 사용될 바이러스는 제품에 오염 가능성이 있는 바이러스 그 자체 또는 가장 유사한 바이러스이어야 한다. 또한 다양한 물리 화학적 성질의 바이러스를 선택하여 검증을 함으로써 유사한 종류의 모든 바이러스의 불활성화에 적용될 수 있다는 것을 보여 주어야 한다.

(ii) 선택된 바이러스는 되도록 물리 화학적 처리에 큰 저항성을 나타내는 것이어서 다른 미지의 또는 동정 되지 않은 바이러스의 제거(clearance)를 보장할 수 있어야 한다.

(iii) 바이러스는 되도록 쉽게 분석 가능하며 고농도로 배양할 수 있어야 한다.

(iv) 선택된 바이러스는 검증하는 실험 동안 실험자에게 감염의 위험이 적어야 한다. 대부분의 검증 연구는 쉽게 배양 가능하고 분석 가능한 실험실용 균주들을 사용한다. 하지만 실험실용 균주들은 많은 경우 자연 상태에 존재하는 균주들과 물리 화학적 성질들이 다를 수 있다.

본 발명에 따른 바이러스 불활화 실험을 위해 선택된 바이러스의 특성 및 이들 바이러스의 불활성화 결과를 적용시킬 수 있는 유사한 바이러스의 범위는 표 1 에 나타내었다.

바이러스	패밀리 (Family)	숙주 (Host)	형태 (Shape)	지질외피 (Lipid envelope)	게놈형태 (Genome)	크기 (nm)	물리화 학 처리 내성	불활화 적용범위
HIV	Retroviridae	인간	구형	있음	ss-RNA	120	낮음	HIV 1 & 2 HTLV type 1 & 2
BHV	Herpesviridae	소	구형	있음	Ds-DNA	130- 150	중간	human herpes virus
BVDV	Flaviviridae	소	구형	있음	ss-RNA	45-55	중간	HCV, HGV 및 기타 ssRNA viruses
HAV	Picornaviridae	인간	20면체	없음	ss-RNA	28-30	중간- 높음	Relevant virus
PPV	Parvoviridae	돼지	20면체	없음	ss-DNA	18-26	높음	B19 human parvovirus

본 발명에서는 골이식용 뼈를 분쇄하여 골이식용 골분을 제조하는 방법에 있어서, 뼈를 분쇄하기 전에 에탄올을 처리하는 공정, 뼈를 분쇄하는 공정, 뼈를 분쇄한 이후 에탄올을 처리하는 공정, 뼈를 분쇄한 이후 과산화수소를 처리하는 공정, 뼈를 분쇄한 이후 에탄올을 처리하는 공정 및 E-beam을 처리하는 공정으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 공정을 거치는 것을 특징으로 하는 바이러스 불활화된 골이식용 골분의 제조방법이 제공된다.

일 실시예에 따르면, 골이식용 뼈를 에탄올에 처리하는 단계, 상기 에탄올 처리된 뼈를 분쇄하는 단계, 상기 분쇄된 뼈를 에탄올에 처리하는 단계, 상기 에탄올 처리된 뼈를 과산화수소에 처리하는 단계, 상기 과산화수소 처리된 뼈를 염산에 처리하는 단계 및 상기 염산에 처리된 뼈를 E-beam에 조사하는 단계를 포함하는 바이러스 불활화된 골이식용 골분의 제조방법이 제공될 수 있다.

이 때, 상기 골이식용 뼈의 경우, 본 발명의 실시예에서는 Allosource사로부터 입수한 인간 공여자로부터 적출된 것을 사용하였으나, ESB사, TSC사, Hopital Erasme사, TBI사 및 Lifelink사로부터 입수할 수 있다. 그 외에도 공인된 조직은행에서 입수된 것이라면 어느 곳이든 무방하다.

이 과정은 공여자로부터 적출된 뼈조직에서 연조직 및 혈액을 제거하고 세포 저속 냉동시스템을 사용해 냉동하여 뼈조직 내에 포함되어 있는 세포를 불활화시키는 과정에 해당한다. 뼈 조직을 분당 1℃씩 하강시켜 -4℃까지 떨어뜨리고. -4℃에서 분당 20℃씩 하강시켜 -45℃까지 떨어뜨린 다음, -45℃에서 분당 15℃씩 상승시켜 -10℃까지 올린다. -10℃에서 분당 0.5℃씩 하강시켜 -20℃까지 떨어뜨린다. -20℃에서 분당 1℃씩 하강시켜 -80℃까지 떨어뜨린다. 사용하기 위해서 꺼내어 4℃ 냉장고에서 2시간, 실온에서 2시간 녹여 다음 단계를 진행하도록 할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 에탄올에 처리하는 단계에서는 70% 에탄올에 0.5~2시간 동안 뼈를 침지할 수 있다. 이 때, 에탄올을 0.5시간 미만으로 처리하게되면 에탄올이 뼈조직 내부로 충분히 침투할 수 없어 바이러스 불활화의 효과가 저해되고, 2시간 이상 처리하게 되면 바이러스 제거효과가 크지 않아 불필요하게 공정이 길어지게 되어 바람직하지 않다.

일 실시예에 따르면, 상기 과산화수소를 처리하는 단계는 3% 과산화수소에 0.5~2시간 동안 뼈를 침지하는 것일 수 있다. 이 때, 과산화수소를 0.5시간 미만으로 처리하게 되면, 바이러스 불활화가 충분히 진행되지 않아 바람직하지 않으며, 2시간 이상 처리할 경우 바이러스 제거 효과가 현저하게 증가되는 것은 아니어서 불필요하게 공정이 길어지게 되어 바람직하지 않다.

일 실시예에 따르면, 상기 염산에 처리하는 단계는 0.5N 염산을 20ml/g 농도로 1~3시간 처리하는 것일 수 있는데, 이 때, 처리시간이 1시간 미만인 경우에는 염산이 뼈에 충분히 침투할 수 없어 바이러스 제거효과가 불충분하며, 3시간 이상 처리할 경우에는 바이러스 제거 효과가 현저하게 증가되는 것은 아니어서 불필요하게 공정이 길어지게 되어 바람직하지 않다.

일 실시예에 따르면, 상기 E-beam에 조사하는 단계에서는 10~20kGy의 E-beam을 조사할 수 있는데, 10kGy 미만의 방사선량에서는 바이러스의 불활화가 충분하지 않으며, 20kGy을 초과하는 방사선량에서는 불필요하게 라디칼이 많이 발생하게 되어 생체적합성이 떨어지게 되어 바람직하지 않다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

본 실시예에서는 인체유래 골 이식재 제조공정 중 70%에탄올 처리, 3% H₂O₂처리, 0.5N HCl 처리공정 및 E-beam 조사 공정에서 바이러스 제거 및 불활화 효과를 시험하기 위해 사람 골유래 오염 가능성이 있는 바이러스 및 모델 바이러스(model virus)를 실험 대상으로 사용하였다.

실험은 미국 FDA의 'Guide to inspection of viral clearance processes for plasma derivatives'와 유럽 CPMP (Committee for Proprietary Medicinal Products)의 'Note for guidance on plasma-derived medicinal products'와 'Note for guidance on virus validation studies: The design, contribution and interpretation of studies validating the inactivation and removal of viruses'에 따라 수행하였다.

실시예 1. 골이식용 뼈의 준비

Allosource사로부터 입수한 공여자의 뼈(골) 조직을 멸균비닐에 올려놓고 연조직, 혈액, 골수 등을 제거하였다. 그런 다음, 세포 저속 냉동시스템 (CryoMed, Forma Scientific사)을 사용해 -80℃까지 떨어뜨린다. 상기 냉동된 골조직을 다시 꺼내어 4℃ 냉장고에서 2시간, 실온에서 2시간 동안 해동시켰다. 그런 다음, 디에틸에테르(diethyl ether)를 처리하여 탈지질 및 탈면역항원시킨 후, 약 2000μm크기 이하로 분쇄하였다.

실시예 2. 70% 에탄올 처리를 통한 바이러스 불활화

바이러스 불활화 정도를 측정하기 위해 HIV, BHV, BVDV, HAV 및 PPV 바이러스 응축액(stock solution) 0.5 ml을 실시예 1의 과정을 거친 골조직에 스파이킹(spiking)시키고, 10분 동안 흡착시킨 후, 에탄올 처리가 배제된 시료 및 70% 에탄올에 0.5~2시간 동안 15~25℃에서 교반시킨 골조직을 회수하여 적정 분석(titration assay)을 수행하였다.

이와 같은 70% 에탄올 처리과정을 독립적으로 2차례 수행한 다음, 에탄올을 처리한 샘플과 대조군을 비교하여 바이러스의 역가를 측정한 평균치를 하기 표에 나타내었다.

70% 에탄올 처리	바이러스 제거 지수(Log10)	바이러스 감소 지수(Log10)
HIV	4.22	4.41
BHV	5.22	5.26
BVDV	5.61	5.52
HAV	6.11	5.80
PPV	2.62	3.15

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 70% 에탄올을 처리한 샘플은 바이러스 제거 지수에 있어서는 2~6을, 바이러스 감소 지수에 있어서는 3~6을 나타내고 있어, 월등한 바이러스 불활화 결과를 나타냄을 알 수 있다.

실시예 3. 3% 과산화수소 처리 공정을 통한 바이러스 불활화

실시예 1과 같은 과정으로 준비된 분쇄된 골분 1g에 HIV, BHV, BVDV, HAV 및 PPV 바이러스 응축액(stock solution) 0.5 ml을 각각 스파이킹(spiking)하고, 10분 동안 흡착시킨 후 3% 과산화수소 처리가 배제된 시료를 회수하였다. 또한 바이러스를 스파이킹한 각각의 샘플에 4.5 ml의 3% 과산화수소를 처리하여 10분, 30분, 60분 동안 실온에서 100 rpm으로 교반시키면서 반응시킨 후 0.2 mg/ml의 카탈라제(catalase)를 삽입하여 3% 과산화수소의 반응을 종결시키고 즉시 적정분석을 수행하였다. 이렇게 수행된 결과를 토대로 3% 과산화수소 처리공정에 의한 바이러스 불활화 정도를 처리 시간에 따라 측정 및 계산하였다.

상기와 같은 과정을 각각 2회씩 독립적으로 수행한 결과 바이러스 역가는 3% 과산화수소를 10분, 30분, 60분 동안 처리함에 따라 점진적으로 감소하였으며, 60분 동안 처리한 시료에서는 각각의 시료에서 바이러스가 검출되지 않았다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

바이러스 종류	샘플 종류	Virus titer (Log10 TCID50/ml)	Total virus (Log10 TCID50)
HIV	스파이킹 직후	6.01±0.40	6.56
	3% H2O2 처리 후 10 min	3.05±0.36	3.63
	3% H2O2 처리 후 30 min	2.10±0.37	2.67
	3% H2O2 처리 후 60 min	≤0.83*	≤1.23
	대조군	5.90±0.45	6.45
BHV	스파이킹 직후	6.64±0.40	7.21
	3% H2O2 처리 후 10 min	6.32±0.43	6.88
	3% H2O2 처리 후 30 min	4.00±0.43	4.56
	3% H2O2 처리 후 60 min	≤0.83*	≤1.37
	대조군	6.96±0.32	7.40
BVDV	스파이킹 직후	7.28±0.44	7.86
	3% H2O2 처리 후 10 min	6.32±0.43	6.87
	3% H2O2 처리 후 30 min	3.90±0.44	4.43
	3% H2O2 처리 후 60 min	≤0.83*	≤1.36
	대조군	7.06±0.44	7.59
HAV	스파이킹 직후	6.11±0.32	6.68
	3% H2O2 처리 후 10 min	5.69±0.32	6.25
	3% H2O2 처리 후 30 min	5.59±0.44	6.16
	3% H2O2 처리 후 60 min	4.32±0.40	4.88
	대조군	6.01±0.25	6.57
PPV	스파이킹 직후	8.23±0.49	8.83
	3% H2O2 처리 후 10 min	7.91±0.36	8.47
	3% H2O2 처리 후 30 min	5.48±0.43	6.04
	3% H2O2 처리 후 60 min	4.11±0.48	4.64
	대조군	8.23±0.43	8.80

표 3을 참조하면 3% 과산화수소 처리공정에서 HIV, BHV, BVDV가 점진적으로 감소하여 검출한계 이하로 불활화되었음을 알 수 있었다. 표 4를 참조하면 PPV의 경우 10분 처리한 시료, 30분 처리한 시료, 60분 처리한 시료의 바이러스 역가가 점진적으로 감소하여 43 Log₁₀ TCID₅₀ 이상 불활화되었으며, HAV는 10분 처리한 시료, 30분 처리한 시료, 60분 처리한 시료의 바이러스 역가가 점진적으로 감소하여 1 Log₁₀ TCID₅₀ 이상 불활화되는 것을 알 수 있다.

각각 2회의 독립적인 실험을 통해 평균값을 도출한 결과, 3% 과산화수소 처리공정에 의한 HIV 로그 감소 지수(log reduction factor)는 5.34, BHV는 5.73, BVDV는 6.50, HAV는 1.58이었으며, PPV는 4.21로 현저한 불활화가 진행된 것을 알 수 있다. 2차례 실험에 따른 측정치의 평균을 계산하여 바이러스 제거 지수(log clearance factor) 및 바이러스 감소지수(log reduction factor)로 표 4에 나타내었다.

3% 과산화수소 처리	바이러스 제거 지수(Log10)	바이러스 감소 지수 (Log10)
HIV	4.75	5.34
BHV	6.35	5.73
BVDV	6.25	6.50
HAV	1.94	1.58
PPV	4.22	4.21

실시예 4. 0.5N HCl 처리를 통한 바이러스 불활화

실시예 1과 같은 과정으로 준비된 뼈에 HIV, BHV, BVDV, HAV 및 PPV 바이러스 용액 2ml을 스파이킹하고 10분 동안 흡착시킨 후 시료를 회수하여 대조군으로 삼고, 바이러스를 스파이킹 한 각각의 샘플에 0.5 N HCl을 20ml/g 농도로 10분, 30분, 60분, 120분 동안 반응시킨 후 1.75 ml의 5 N NaOH를 삽입하여 0.5 N HCl의 반응을 종결시키고 즉시 적정분석(titration assay)을 수행하였다. 이렇게 수행된 결과를 토대로 0.5 N HCl 처리공정에 의한 바이러스 불활화 정도를 처리 시간에 따라 계산하여 표 5에 나타내었다.

바이러스 종류	샘플 종류	Virus titer (Log10 TCID50/ml)	Total virus (Log10 TCID50)
HIV	스파이킹 직후	5.80±0.25	7.09
	0.5N HCl 10 min 처리	≤1.34*	2.40
	0.5N HCl 30 min 처리	≤1.34*	2.37
	0.5N HCl 60 min 처리	≤1.34*	2.40
	0.5N HCl 120 min 처리	≤1.34*	2.37
	대조군	5.59±0.50	6.63
BHV	스파이킹 직후	7.17±0.37	8.41
	0.5N HCl 10 min 처리	≤0.83*	≤1.90
	0.5N HCl 30 min 처리	≤0.83*	≤1.85
	0.5N HCl 60 min 처리	≤0.83*	≤1.87
	0.5N HCl 120 min 처리	≤0.83*	≤1.89
	대조군	7.06±0.44	8.30
BVDV	스파이킹 직후	7.38±0.43	8.67
	0.5N HCl 10 min 처리	≤1.34*	≤2.41
	0.5N HCl 30 min 처리	≤1.34*	≤2.41
	0.5N HCl 60 min 처리	≤1.34*	≤2.34
	0.5N HCl 120 min 처리	≤1.34*	≤2.34
	대조군	7.49±0.25	8.78
HAV	스파이킹 직후	6.75±0.51	7.98
	0.5N HCl 10 min 처리	3.79±0.37	4.88
	0.5N HCl 30 min 처리	3.16±0.32	4.25
	0.5N HCl 60 min 처리	2.73±0.32	3.79
	0.5N HCl 120 min 처리	1.99±0.36	3.03
	대조군	6.54±0.43	7.79
PPV	스파이킹 직후	8.31±0.35	9.50
	0.5N HCl 10 min 처리	≤1.34	≤2.31
	0.5N HCl 30 min 처리	≤1.34	≤2.33
	0.5N HCl 60 min 처리	≤1.34	≤2.34
	0.5N HCl 120 min 처리	≤1.34	≤2.30
	대조군	8.42±0.36	9.95

상기와 같은 과정을 수행한 결과, 바이러스 역가는 0.5N 염산을 10분, 30분, 60분 및 120분 동안 처리함에 따라 점진적으로 감소하였으며, 60분 동안 처리한 시료에서는 각각의 시료에서 바이러스가 검출되지 않았다.

각각 2회의 독립적인 실험을 통해 0.5N 염산의 처리공정에 의한 바이러스 제거 지수(log clearance factor) 및 바이러스 감소지수(log reduction factor)의 평균을 표 6에 나타내었다. 표 6을 참조하면 0.5N 염산의 처리에 의해 바이러스가 현저하게 불활화되었음을 알 수 있다.

0.5N 염산 처리	바이러스 제거 지수(Log10)	바이러스 감소 지수(Log10)
HIV	4.47	4.72
BHV	6.67	6.51
BVDV	6.48	6.39
HAV	4.65	4.58
PPV	7.50	7.46

실시예 5. E- beam 조사공정을 통한 바이러스 불활화

실시예 3과 같은 방법으로 제조된 인체 유래 골조직을 -80℃로 동결건조시킨 다음, 이를 실온에서 해동시켜 1.5 ml의 바이러스를 스파이킹(spiking)하여 E-beam을 5 KGy, 10 KGy, 15 KGy로 조사한 후 각각의 바이러스 역가를 측정하였다.

상기 조건으로 E-beam 조사공정 거친 결과, HAV의 경우 5 KGy, 10 KGy, 15 KGy로 조사한 시료의 바이러스 역가가 점진적으로 감소하여 4 Log₁₀ TCID₅₀ 이상 불활화되는 것을 확인할 수 있었다. PPV 또한 5 KGy, 10 KGy, 15 KGy로 조사한 시료의 바이러스 역가가 점진적으로 감소하여 3 Log₁₀ TCID₅₀ 이상 불활화되는 것을 확인할 수 있었다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.

바이러스 종류	샘플 종류	Virus titer (Log10 TCID50/ml)	Total virus (Log10 TCID50)
HIV	스파이킹 직후	4.85±0.32	6.23
	5 KGy 처리	≤0.83*	≤2.21
	10 KGy 처리	≤0.83*	≤2.19
	15 KGy 처리	≤0.83*	≤2.18
BHV	스파이킹 직후	6.32±0.51	7.70
	5 KGy 처리	≤0.83*	≤2.19
	10 KGy 처리	≤0.83*	≤2.21
	15 KGy 처리	≤0.83*	≤2.21
BVDV	스파이킹 직후	6.32±0.37	7.61
	5 KGy 처리	≤0.83*	≤2.20
	10 KGy 처리	≤0.83*	≤2.13
	15 KGy 처리	≤0.83*	≤2.15
HAV	스파이킹 직후	6.01±0.40	7.37
	5 KGy 처리	3.54±0.49	4.93
	10 KGy 처리	1.99±0.36	3.37
	15 KGy 처리	1.04±0.32	2.43
PPV	스파이킹 직후	7.28±0.36	8.67
	5 KGy 처리	4.95±0.40	6.32
	10 KGy 처리	3.05±0.44	4.43
	15 KGy 처리	1.47±0.32	2.83

상기와 같은 방법으로 2 회의 독립적인 실험을 수행하여, 평균값을 확인한 결과 E-beam 조사공정에 의한 HIV 바이러스 로그 감소 지수(log reduction factor)는 4.06이었으며, BHV는 5.68, BVDV는 5.81이였다. HAV는 4.74이었으며 PPV는 4.86으로 나타나 E-beam 조사공정에 의해 바이러스가 효과적으로 불활화되었음을 확인하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었다.

E-beam 처리	바이러스 제거 지수 (Log10)	바이러스 감소 지수 (Log10)
HIV	4.31	4.06
BHV	6.36	5.68
BVDV	6.54	5.81
HAV	5.18	4.74
PPV	4.22	4.86

결론적으로, 70% 에탄올 처리 및 3% 과산화수소 처리를 통해 HIV, BHV 및 BVDV는 모두 검출한계 이하로 불활화되었다. 3% 과산화수소 처리에 따른 HIV, BHV, BVDV의 평균 log reduction factor는 각각 5.34, 5.73, 6.50 Log₁₀ TCID₅₀ 인 것으로 나타나 불활화 효과가 매우 큰 것으로 나타났다. 또한, 0.5 N HCl 처리를 통해 HIV, BHV, BVDV 및 PPV는 모두 검출한계 이하로 불활화된 것으로 나타났다. HIV, BHV, BVDV 및 PPV의 평균 바이러스 감소 지수(log reduction factor)는 각각 4.72, 6.51, 6.39, 7.46 Log₁₀ TCID₅₀로서, 현저한 바이러스 불활화 효과를 나타내었다.

E-beam 조사를 통해서는 HIV, BHV, BVDV는 모두 검출한계 이하로 불활화되었다. HIV, BHV, BVDV의 평균 바이러스 감소 지수(log reduction factor)는 각각 4.00, 5.45, 5.77 Log₁₀ TCID₅₀ 이었다. HAV와 PPV의 경우에는 평균 log reduction factor는 각 각 4.91 Log₁₀ TCID₅₀와 5.73 Log₁₀ TCID₅₀ 이었다.

이와 같은 결과를 통해 골 이식재의 제조에 있어서, 70% 에탄올 처리, 0.5 N HCl 처리공정 및 E-beam 조사공정의 조합을 통해 지질외피를 갖는(enveloped) 바이러스가 효과적으로 불활화되는 것으로 나타났으며, 지질외피를 갖지 않는 (Non-enveloped) 바이러스의 경우 0.5 N HCl 처리공정과 E-beam 조사공정에 의한 전체 바이러스 감소 지수(total log reduction factor)가 9 Log₁₀ TCID₅₀ 이상인 것으로 나타나, 바이러스 불활화에 있어서 0.5 N HCl 처리공정과 E-beam 조사공정이 매우 효과적인 것으로 나타났다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

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골이식용 뼈를 70% 에탄올에 0.5~2시간 처리하는 단계;
상기 에탄올 처리된 뼈를 분쇄하는 단계;
상기 분쇄된 뼈를 70% 에탄올에 0.5~2시간 처리하는 단계;
상기 에탄올 처리된 뼈를 3% 과산화수소에 0.5~2시간 처리하는 단계;
상기 과산화수소 처리된 뼈를 0.5N 염산을 20ml/g 농도로 1~3시간 처리하는 단계; 및
상기 염산에 처리된 뼈를 10~20kGy의 E-beam으로 조사하는 단계;
를 거쳐 이루어지는 것을 특징으로 하는 바이러스 불활화된 골이식용 골분의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 골이식용 뼈를 분쇄하기 전에 1회 이상 냉동 및 해동시키는 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 불활화된 골이식용 골분의 제조방법.
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