CN114209883B - 一种异种骨修复材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种异种骨修复材料的制备方法，本发明的异种骨修复材料的制备方法采用两次脱蛋白和两次脱脂处理，不使用有机试剂，并且可以更好的将脂类组织和蛋白组织清洗干净，彻底去除可以引发免疫原反应的脂类和蛋白质，本发明采用低温煅烧可以保存骨组织中部分碳酸根，保证其具有一定的降解性能，可以更好地促进骨组织的修复。

Description

一种异种骨修复材料的制备方法
技术领域
本发明属于生物医学工程材料技术领域，具体涉及一种异种骨修复材料的制备方法。
背景技术
骨移植修复材料在口腔手术中经常用于牙槽骨的扩大或再造，下颚牙槽骨缺损部位的充填，为保护牙槽骨而在拔牙窝内进行的充填，种植体周围骨组织缺失部位的充填及上颌窦提升术。前用于临床的骨移植修复材料主要有自体骨、同种异体骨、异种骨和人工合成材料。自体骨是唯一同时具有成骨性，骨诱导性和骨传导性的骨移植材料，因此，一直以来自体骨被视为骨组织移植材料的黄标准。然而，自体骨的稀缺性导致其无法广泛应用。同种异体骨组织库供量有限，并且也具有免疫原性和传播传染病的风险。人工合成的材料通常以羟基磷灰石和β-磷酸三钙为主，其降解速度较快，无法在相对较长的时间内维持形态。因此来源广泛的异种骨是最为常见的骨移植修复材料。在骨移植手术中，对异种骨修复材料要求很高，需要异种骨修复材料具备以下特点：(1)不含引发免疫反应的脂肪和蛋白质；(2)能够制备成一定的尺寸，便于填充；(3)具有骨诱导性和骨传导性；(4)良好的生物相容性和适度的生物降解性，降解速度需和骨组织的再生速度相匹配，在人体内的降解产物对人体无害；(5)具有支持骨细胞生长和功能分化的表面化学性质和微结构；(6)易于加工、消毒、存储。
现有技术中的异种骨修复材料的制备工艺通常为高温煅烧，目的是能更好的除去其中的有机组织的残留，并且可以更好地病毒灭活。但是据研究表明，高温煅烧后的异种骨几乎无法在体内降解。此外，现有技术中脱脂脱蛋白处理使用大量的有机溶剂，会造成有毒溶剂的残留。
鉴于以上原因，特提出本发明。
发明内容
为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种异种骨修复材料的制备方法，本发明的方法通过多步脱脂脱蛋白处理，可以确保在不使用有机试剂的情况将脂类组织和蛋白质组织清洗干净，低温煅烧可以保留部分碳酸根，可以更好的促进骨组织修复。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种异种骨修复材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将牛腿骨除去皮质骨部分和其他软组织，再用纯化水清洗，切成薄片；
(2)第一次脱蛋白处理：将切割好的骨片加入到碱溶液中，第一次超声清洗，再用纯化水清洗干净；
(3)第一次脱脂处理：将步骤(2)处理后的骨片中加入体积分数为70-80％的酒精溶液，第二次超声清洗，更换一次酒精溶液，在震荡仪中震荡清洗1-3d，再用纯化水清洗干净；
(4)第二次脱蛋白处理：将步骤(3)处理后的骨片加入到碱溶液中，第三次超声清洗，再用纯化水清洗干净；
(5)第二次脱脂处理：将步骤(4)处理后的骨片加入体积分数为70-80％的酒精溶液，第四次超声清洗，更换一次酒精溶液，在震荡仪中震荡清洗1-3d，再用纯化水清洗干净；
(6)漂白处理：将步骤(5)处理后的骨片加入到浓度为25-35％的过氧化氢溶液中进行震荡漂白处理，纯化水清洗后，烘干处理，将烘干后的骨片粉碎；
(7)低温煅烧：将粉碎后的颗粒进行低温煅烧，过筛，得到异种骨修复材料。
进一步的，步骤(2)和(4)中的碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或几种。
本发明中的薄片大小为50mm×50mm×5mm，本发明中先进行脱蛋白再进行脱脂处理，这样可以在脱脂中进一步的去除碱溶液，以保证碱溶液可以完全去除。漂白处理的目的是进一步清除残留的蛋白质。
进一步的，碱溶液的浓度为0.5-1M，碱溶液与骨片的体积质量比为5～20mL:1g。
进一步的，步骤(2)和(4)中第一次超声清洗和第三次超声清洗的条件均为在45-55℃的水浴中超声清洗30-120min，超声频率35-45KHz。
进一步的，步骤(3)中(5)中酒精溶液与骨片的体积质量比为5～20mL:1g。
进一步的，步骤(3)和(5)中第二次超声清洗和第四次超声清洗的条件均为在45-55℃的水浴中超声清洗30-120min，超声频率35-45KHz。
进一步的，步骤(6)中过氧化氢溶液与骨片的体积质量比为5～20mL:1g，震荡漂白的温度为35-39℃，漂白时间为20-28h。
进一步的，步骤(6)中烘干的温度为45-55℃，粉碎粒径为1-2mm。
进一步的，步骤(7)中低温煅烧的温度为350-550℃，升温速率为8-12℃/min，煅烧时间为48-72h。
进一步的，步骤(7)中过筛为分别使用0.25mm、1mm和2mm的筛网过滤，分别筛选出粒径为0.25-1mm和1-2mm的骨粉。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的异种骨修复材料的制备方法采用两次脱蛋白和两次脱脂处理，不使用有机试剂，并且可以更好的将脂类组织和蛋白组织清洗干净，彻底去除可以引发免疫原反应的脂类和蛋白质，本发明采用低温煅烧可以保存骨组织中部分碳酸根，保证其具有一定的降解性能，可以更好地促进骨组织的修复。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例2制备的异种骨修复材料的XRD图；
图2是本发明实施例2制备的异种骨修复材料的红外图谱。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
一种异种骨修复材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将牛腿骨除去皮质骨部分和其他软组织，再用纯化水清洗，用电动骨锯切成50mm×50mm×5mm的薄片；
(2)第一次脱蛋白处理：将切割好的骨片加入到氢氧化钾溶液中，氢氧化钾溶液的浓度为0.5M，氢氧化钾溶液与骨片的体积质量比为5mL:1g，第一次超声清洗，超声清洗的条件为在45℃的水浴中超声清洗120min，超声频率35KHz，再用纯化水清洗干净；
(3)第一次脱脂处理：将步骤(2)处理后的骨片中加入体积分数为70-80％的酒精溶液，酒精溶液与骨片的体积质量比为5mL:1g，第二次超声清洗，超声清洗的条件为在45℃的水浴中超声清洗120min，超声频率35KHz，更换一次酒精，在震荡仪中震荡清洗1d，再用纯化水清洗干净；
(4)第二次脱蛋白处理：将步骤(3)处理后的骨片加入到氢氧化钾溶液中，氢氧化钾溶液的浓度为0.5M，氢氧化钾溶液与骨片的体积质量比为5mL:1g，第三次超声清洗，超声清洗的条件为在45℃的水浴中超声清洗120min，超声频率35KHz，再用纯化水清洗干净；
(5)第二次脱脂处理：将步骤(4)处理后的骨片加入体积分数为70％的酒精溶液，酒精溶液与骨片的体积质量比为5mL:1g，第四次超声清洗，超声清洗的条件为在45℃的水浴中超声清洗120min，超声频率35KHz，更换一次酒精，在震荡仪中震荡清洗1d，再用纯化水清洗干净；
(6)漂白处理：将步骤(5)处理后的骨片加入到过浓度为25％的过氧化氢溶液中进行震荡漂白处理，过氧化氢与骨片的体积质量比为5mL:1g，震荡漂白的温度为35℃，漂白时间为20h，纯化水清洗后，45℃下烘干处理，将烘干后的骨片粉碎，粉碎粒径为1-2mm；
(7)低温煅烧：将粉碎后的颗粒进行低温煅烧，低温煅烧的温度为350℃，升温速率为12℃/min，煅烧时间为72h，别使用0.25mm、1mm和2mm的筛网过滤，分别筛选出粒径为0.25-1mm和1-2mm的骨粉，得到异种骨修复材料。
实施例2
一种异种骨修复材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将牛腿骨除去皮质骨部分和其他软组织，再用纯化水清洗，用电动骨锯切成50mm×50mm×5mm的薄片；
(2)第一次脱蛋白处理：将切割好的骨片加入到氢氧化钠溶液中，氢氧化钠溶液的浓度为0.75M，氢氧化钠溶液与骨片的体积质量比为12.5mL:1g，第一次超声清洗，超声清洗的条件为在50℃的水浴中超声清洗75min，超声频率40KHz，再用纯化水清洗干净；
(3)第一次脱脂处理：将步骤(2)处理后的骨片中加入体积分数为75％的酒精溶液，酒精溶液与骨片的体积质量比为12.5mL:1g，第二次超声清洗，超声清洗的条件为在50℃的水浴中超声清洗75min，超声频率40KHz，更换一次酒精，在震荡仪中震荡清洗2d，再用纯化水清洗干净；
(4)第二次脱蛋白处理：将步骤(3)处理后的骨片加入到氢氧化钠溶液中，氢氧化钠溶液的浓度为0.75M，氢氧化钠溶液与骨片的体积质量比为12.5mL:1g，第三次超声清洗，超声清洗的条件为在50℃的水浴中超声清洗75min，超声频率40KHz，再用纯化水清洗干净；
(5)第二次脱脂处理：将步骤(4)处理后的骨片加入体积分数为75％的酒精溶液，酒精溶液与骨片的体积质量比为12.5mL:1g，第四次超声清洗，超声清洗的条件为在50℃的水浴中超声清洗75min，超声频率40KHz，更换一次酒精，在震荡仪中震荡清洗2d，再用纯化水清洗干净；
(6)漂白处理：将步骤(5)处理后的骨片加入到过浓度为30％的过氧化氢溶液中进行震荡漂白处理，过氧化氢溶液与骨片的体积质量比为12.5mL:1g，震荡漂白的温度为37℃，漂白时间为24h，纯化水清洗后，50℃下烘干处理，将烘干后的骨片粉碎，粉碎粒径为1-2mm；
(7)低温煅烧：将粉碎后的颗粒进行低温煅烧，低温煅烧的温度为500℃，升温速率为10℃/min，煅烧时间为60h，别使用0.25mm、1mm和2mm的筛网过滤，分别筛选出粒径为0.25-1mm和1-2mm的骨粉，得到异种骨修复材料。
实施例3
一种异种骨修复材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将牛腿骨除去皮质骨部分和其他软组织，再用纯化水清洗，用电动骨锯切成50mm×50mm×5mm的薄片；
(2)第一次脱蛋白处理：将切割好的骨片加入到碳酸钠溶液中，碳酸钠溶液的浓度为1M，碳酸钠溶液与骨片的体积质量比为20mL:1g，第一次超声清洗，超声清洗的条件为在55℃的水浴中超声清洗30min，超声频率45KHz，再用纯化水清洗干净；
(3)第一次脱脂处理：将步骤(2)处理后的骨片中加入体积分数为80％的酒精溶液，酒精溶液与骨片的体积质量比为1mL:g，第二次超声清洗，超声清洗的条件为在55℃的水浴中超声清洗30min，超声频率45KHz，更换一次酒精，在震荡仪中震荡清洗3d，再用纯化水清洗干净；
(4)第二次脱蛋白处理：将步骤(3)处理后的骨片加入到碳酸钠溶液中，碳酸钠溶液的浓度为1M，碳酸钠溶液与骨片的体积质量比为20mL:1g，第三次超声清洗，超声清洗的条件为在55℃的水浴中超声清洗30min，超声频率45KHz，再用纯化水清洗干净；
(5)第二次脱脂处理：将步骤(4)处理后的骨片加入体积分数为80％的酒精溶液，酒精溶液与骨片的体积质量比为20mL:1g，第四次超声清洗，超声清洗的条件为在55℃的水浴中超声清洗30min，超声频率45KHz，更换一次酒精，在震荡仪中震荡清洗1d，再用纯化水清洗干净；
(6)漂白处理：将步骤(5)处理后的骨片加入到过浓度为35％的过氧化氢溶液中进行震荡漂白处理，过氧化氢溶液与骨片的体积质量比为20mL:1g，震荡漂白的温度为39℃，漂白时间为28h，纯化水清洗后，55℃下烘干处理，将烘干后的骨片粉碎，粉碎粒径为1-2mm；
(7)低温煅烧：将粉碎后的颗粒进行低温煅烧，低温煅烧的温度为550℃，升温速率为8℃/min，煅烧时间为48h，别使用0.25mm、1mm和2mm的筛网过滤，分别筛选出粒径为0.25-1mm和1-2mm的骨粉，得到异种骨修复材料。
对比例1
本对比例的异种骨修复材料的制备方法与实施例2相同，不同之处在于，去掉步骤(3)和(4)，只采用一次脱蛋白和一次脱脂处理。
试验例1
测试实施例2制备的异种骨修复材料的XRD，如图1所示，红外测试如图2所示。
从图1中可以看出，10°-80°的所有特征峰符合羟基磷灰石的特征峰。因此，其主要成分可以断定为羟基磷灰石。
从图2中可以看出，不同波长下的官能团如表1所示。
表1
波长(cm<sup>-1</sup>) 官能团
3578 -OH
3447 -OH
1635 H<sub>2</sub>O
1454 CO<sub>3</sub><sup>2-</sup>
1414 PO<sub>4</sub><sup>3-</sup>(900-1200)
1067 PO<sub>4</sub><sup>3-</sup>(900-1200)
952 PO<sub>4</sub><sup>3-</sup>(900-1200)
870 CO<sub>3</sub><sup>2-</sup>
600 PO<sub>4</sub><sup>3-</sup>(O-P-O)
560 PO<sub>4</sub><sup>3-</sup>(O-P-O)
本发明人也对其他实施例制备的异种骨修复材料进行了上述试验，结果基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。
试验例2
将实施例1-3和对比例1制备的异种骨修复材料进行成分的检测，结果如表2所示。
表2
组别 粗蛋白含量(％) 脂肪含量(％)
实施例1 2.02 0.89
实施例2 2.39 0.56
实施例3 2.17 1.12
对比例1 27.45 12.36
其中，粗蛋白含量是按照药典4部2020版中0731蛋白质含量测定，使用凯氏定氮的方法进行检测，测得的结果在2％左右，证明蛋白质已基本去除干净，而对比例的结果明显偏高，说明对比方法并不能很好的去除蛋白质。
脂肪含量检测是按照GB5009.6-2016食品中脂肪的测定方法检测，得出的我们实施例中脂肪的含量很少，而对比例仍然含有部分脂肪残留。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种异种骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将牛腿骨除去皮质骨部分和其他软组织，再用纯化水清洗，切成薄片；
(2)第一次脱蛋白处理：将切割好的骨片加入到碱溶液中，第一次超声清洗，再用纯化水清洗干净；
(3)第一次脱脂处理：将步骤(2)处理后的骨片中加入体积分数为70-80％的酒精溶液，第二次超声清洗，更换一次酒精溶液，在震荡仪中震荡清洗1-3d，再用纯化水清洗干净；
(4)第二次脱蛋白处理：将步骤(3)处理后的骨片加入到碱溶液中，第三次超声清洗，再用纯化水清洗干净；
(5)第二次脱脂处理：将步骤(4)处理后的骨片加入体积分数为70-80％的酒精溶液，第四次超声清洗，更换一次酒精溶液，在震荡仪中震荡清洗1-3d，再用纯化水清洗干净；
(6)漂白处理：将步骤(5)处理后的骨片加入到浓度为25-35％的过氧化氢溶液中进行震荡漂白处理，过氧化氢溶液与骨片的体积质量比为5～20mL:1g，震荡漂白的温度为35-39℃，漂白时间为20-28h，纯化水清洗后，烘干处理，将烘干后的骨片粉碎，烘干的温度为45-55℃，粉碎粒径为1-2mm；
(7)低温煅烧：将粉碎后的颗粒进行低温煅烧，低温煅烧的温度为350-550℃，升温速率为8-12℃/min，煅烧时间为48-72h，过筛，得到异种骨修复材料；
其中，步骤(2)和(4)中第一次超声清洗和第三次超声清洗的条件均为在45-55℃的水浴中超声清洗30-120min，超声频率35-45KHz；
步骤(3)和(5)中第二次超声清洗和第四次超声清洗的条件均为在45-55℃的水浴中超声清洗30-120min，超声频率35-45KHz。
2.根据权利要求1所述的异种骨修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)和(4)中的碱溶液为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的异种骨修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)和(4)中碱溶液的浓度为0.5-1M，碱溶液与骨片的体积质量比为5～20mL:1g。
4.根据权利要求1所述的异种骨修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中(5)中酒精溶液与骨片的体积质量比为5～20mL:1g。
5.根据权利要求1所述的异种骨修复材料的制备方法，其特征在于，步骤(7)中过筛为分别使用0.25mm、1mm和2mm的筛网过滤，分别筛选出粒径为0.25-1mm和1-2mm的骨粉。
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