CN109954167B - 一种骨修复材料及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种骨修复材料。所述骨修复材料的分子结构及钙磷含量比例与天然骨非常相似，具有优异的生物相容性。所述骨修复材料植入骨缺损时，骨组织与修复材料中的羟基磷灰石之间无纤维组织界面，植入体内后表面可形成类骨磷灰石矿物材料，并动态参与骨组织吸收与重建和钙离子、磷离子代谢过程。同时，本发明所述骨修复材料具有优异的骨传导性和骨诱导性，三维结构允许血管长入、细胞渗透和附着、新骨形成、组织沉积和钙化等作用，仿生微观结构有利于骨形态发生蛋白(BMP)的聚集，进而发生骨诱导性。

Description

一种骨修复材料及其应用
技术领域
本发明属于医用生物材料、医疗器械领域，具体涉及一种骨修复材料、制备方法及其应用。
背景技术
长期以来，骨缺损的修复主要采用自体骨移植结合同种异体骨移植的方法。自体骨有较高的骨诱导活性，无免疫原性，但自体骨的来源有限。同种异体骨移植有引起机体免疫反应的问题，并可能引起交叉感染。这些生物源性材料有不可避免的缺陷，人工合成或天然材料便成为骨缺损修复材料有希望的替代物。
一种良好的诱导型人工骨材料应具有以下特性：①良好的生物相容性及生物降解性；②骨传导及与其他活性分子复合共同诱导骨发生；③能负载大量细胞，支持骨细胞生长和分化；④合适的机械强度与可塑形性；⑤原料来源广，生产价格廉，便于消毒保存。
对骨来说，其强度和韧性最佳匹配的综合力学性能，与有机和无机组份的微结构特征及在分子水平上的独特组装密不可分；骨中的有机基质模板(胶原)，限定了矿物晶体形核的位置和生长空间，而含量极微的某些非胶原性蛋白如骨涎蛋白则可作为形核的引物并规范矿物的取向，这使得骨中具有磷灰石结构的矿物相晶体大部分处在原胶原分子的间隙区，晶体的轴择优取向平行于胶原纤维；骨中各组份的形成及组装是在细胞的调控下完成的，而这些组份及由它们构成的复杂结构反过来又会影响细胞的活动和功能；模仿天然骨的成分及结构特征制造的骨替代材料，可为细胞提供与天然骨相类似的微环境，因而有望成为优异的骨组织工程载体材料。
异种骨材料的优势是不受来源的限制，可大量获取，所面临的主要问题是如何能降低其免疫原性，降低植骨后受体患者的免疫排斥反应，以达到能与同种骨相近的治疗效果。人工合成骨的优势是来源广泛，晶体尺寸更小，更好的调控钙磷的释放，所面临的主要问题是机械性能较差。
发明内容
为解决现有技术中存在的免疫原性强和机械性能较差的问题，本发明提供了一种骨修复材料。本发明所述骨修复材料的分子结构及钙磷含量比例与天然骨非常相似，具有优异的生物相容性。所述骨修复材料植入骨缺损时，骨组织与修复材料中的羟基磷灰石之间无纤维组织界面，植入体内后表面可形成类骨磷灰石矿物材料，并动态参与骨组织吸收与重建和钙离子、磷离子代谢过程。同时，本发明所述骨修复材料具有优异的骨传导性和骨诱导性，三维结构允许血管长入、细胞渗透和附着、新骨形成、组织沉积和钙化等作用，仿生微观结构有利于骨形态发生蛋白(BMP)的聚集，进而发生骨诱导性。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
本发明提供了一种骨修复材料的制备方法，所述方法包含以下步骤：
1)天然羟基磷灰石的制备：离体松质骨经强碱、强氧化剂、热水浸泡，脱脂、脱蛋白、脱细胞，脱水后经高温煅烧，灭活可能存在的病毒，研磨后过筛，调节pH至中性，得到天然羟基磷灰石；
2)胶原凝胶的制备：在胶原乙酸溶胀液中加入硫酸软骨素乙酸溶液，得到胶原-硫酸软骨素浆液，冻干得到胶原膜，将胶原膜粉碎，加入乙酸溶液溶胀，搅拌均匀得到胶原凝胶；
3)胶原凝胶与天然羟基磷灰石的物理共混：在胶原凝胶中加入天然羟基磷灰石，机械搅拌至混合均匀，没有骨粉颗粒及胶原纤维团聚，得到注射型骨修复材料；
4)(可选步骤)将注射型骨修复材料注射进模具内，冷冻后拆除模具进行冻干，得到块状，根据需要进行粉碎得到粉状；
5)灭菌。
本发明所述的离体松质骨来源于中国境内3岁以下健康牛，切割为边长不超过2cm的骨块。
本发明所述强碱为NaOH、KOH、Ca(OH)2中的一种或几种；所述强碱的浓度为0.05～5M，优选0.5～2M；所述强碱浸泡时间为1～48h，优选12～24h。
本发明所述强氧化剂为过氧化氢；所述强氧化剂的浓度为3％～30％，优选10～30％；所述强氧化剂浸泡时间为1～48h，优选12～24h。
本发明所述热水浸泡所使用的热水的温度为50～100℃；所述热水处理时间为每次0.5～2h，处理3～5次，优选80～100℃，每次0.5～1h，处理4～5次。
本发明所述高温煅烧为分阶段煅烧：
阶段1：煅烧温度300℃，煅烧时间1h；
阶段2：煅烧温度600℃，煅烧时间1h，保温1h；
阶段3：煅烧温度900℃，煅烧时间1h，保温1h。
本发明所述骨修复材料的制备方法步骤2)中，所述在胶原乙酸溶胀液中加入硫酸软骨素乙酸溶液，具体如下：将200-500毫升硫酸软骨素乙酸溶液缓慢加入到500毫升胶原乙酸溶胀液中，搅拌速度为15000-20000转/分，搅拌时间为1-2小时，将溶液抽真空，得到胶原-硫酸软骨素浆液；所述胶原膜由如下方法制备：将胶原-硫酸软骨素浆液倒在不锈钢冻干盘中，轻轻摇晃使其分布均匀，控制其厚度在2～5毫米，在温度为–50-30℃，压力≤0.2兆帕条件下进行真空冷冻干燥。
本发明还提供一种使用上述方法制备的骨修复材料。
本发明所述骨修复材料中胶原与天然羟基磷灰石的质量比为1:10～10:1，优选胶原：羟基磷灰石＝10:90～40:60(质量比)。
本发明所述骨修复材料中硫酸软骨素的添加量为0.5％～3.6％(质量比)，优选0.8％～3.3％。
本发明所述骨修复材料为可为注射型或固体形态。所述固体形态优选片状、块状、颗粒状、粉末状，其中粉末状粒径500nm～250μm，孔隙100nm～10μm，优选粒径1μm～10μm，孔隙200nm～2μm。
本发明所述骨修复材料可使用辐照灭菌、环氧乙烷灭菌、高压蒸汽灭菌方式灭菌，辐照方式优选钴-60辐照，优选的辐照剂量为15～25kGy。
本发明还提供了所述骨修复材料在在骨折、骨缺损后的骨修复中作为骨填充物应用。尤其适用于：
1)口腔科：拔牙后的位点保留；种植体周围的骨缺损填充修复；牙槽骨缺损的修复；上颌窦提升；口腔颌面的良性肿瘤切除后的骨缺损修复；
2)神经外科：开颅钻孔的缺损修复；开颅铣刀刀口的骨缝填充；经鼻蝶垂体瘤切除后的颅底填充修复；
3)骨科：非承重部位的骨缺损填充修复。
本发明的有益效果是：
1、本发明制备而得的骨修复材料为注射型，也可注入模具，经过冻干得到固体形态。注射型骨修复材料在使用上更为方便，可以填充任何骨缺损形状，固体型的存放更为方便，对于保存条件要求较低。
2、本发明制备而得的骨修复材料使用后未见炎症、感染现象，无不良反应、异物反应，动物精神状态良好，产品安全可靠。
3、本发明所述方法制备的骨修复材料具有更加显著的骨缺损修复效果，仅仅使用该修复材料的效果已经优于天然骨粉+口腔生物膜实验组，并且与修复骨粉+口腔生物膜实验组效果相当。使用本发明所述修复骨粉，在达到相同治疗效果的情况下，可以简化手术中口腔生物膜的使用和相关操作，也为患者降低手术费用负担。
附图说明
图1.天然骨粉XRD图谱。
图2.天然骨粉SEM照片：1mm，500μm，100μm，10μm，由图片可看出，晶体颗粒大小均在250μm以下，并且可以观察到很多在500nm左右。
图3.骨修复材料(块状)SEM照片：1mm，500μm，100μm，10μm。
图4.骨修复材料的元素分布照片：a.骨修复材料SEM照片，b.各元素总体分布图示，c.碳元素分布图示，d.氧元素分布图示，e.钙元素分布图示，f.磷元素分布图示。
图5.修复骨粉SEM照片：1mm，500μm，100μm，10μm。
图6.Beagle犬动物实验手术过程：a.拔牙，b.拔牙创面，c.填充修复骨粉，d.加盖口腔生物膜，e.闭合创口，f.拔除的前磨牙。
图7.手术部位观察：a.处死前手术部位观察软组织；b.处死打开手术部位观察硬组织。
图8.CT观察照片。
图9.修复骨粉修复骨缺损量化比较：a.骨增量的高度值，b.骨增量的宽度值，以4周的空白对照数据为1进行标准化；A：空白对照，只造骨缺损；B：骨缺损+口腔生物膜；C：骨缺损+骨粉+口腔生物膜；D：骨缺损+含10％胶原蛋白修复骨粉；E：骨缺损+含10％胶原蛋白修复骨粉+口腔生物膜；F：骨缺损+含30％胶原蛋白修复骨粉+口腔生物膜；*：表明数据有统计学差异，P<0.05。
图10.D组(骨缺损+含10％胶原蛋白修复骨粉)术后16周病理切片结果：HE染色，a.局部放大40倍；b.局部放大200倍；c.局部放大200倍。
图11.A组(骨缺损)术后16周病理切片结果：HE染色，a.局部放大40倍；b.局部放大100倍；c.局部放大100倍；d.局部放大200倍。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细描述，但应理解本发明并不受以下内容所限制。
实施例1：评价以牛骨为原料制备骨粉的物相组成与成分
选择牛骨样品(离体松质骨)经强碱、强氧化剂、热水浸泡，脱脂、脱蛋白、脱细胞，脱水后经高温煅烧，灭活可能存在的病毒，研磨后过筛，调节pH至中性，得到天然骨粉。
1)离体松质骨来源于中国境内3岁以下健康牛，切割为边长不超过2cm的骨块，冲洗掉骨块上的血迹。
2)碱化目的是脱脂、脱细胞，配制碱液：1M的NaOH溶液。
一次碱化：骨块与碱液的质量体积之比1：2，浸泡24h。
除杂：剥离骨块上的杂质。
二次碱化：骨块与碱液的质量体积之比1：2，浸泡24h。
3)氧化目的是脱蛋白：
一次氧化：30％双氧水淹没骨块，浸泡24h。
二次氧化：30％双氧水淹没骨块，浸泡24h。
4)经强碱和强氧化剂处理后，使用热水浸泡骨块，所使用的热水的温度为80～100℃，每次0.5～1h，处理4～5次。
5)将热水浸泡后的骨块脱水后高温煅烧，所述高温煅烧为分阶段煅烧：
阶段1：煅烧温度300℃，煅烧时间1h；
阶段2：煅烧温度600℃，煅烧时间1h，保温1h；
阶段3：煅烧温度900℃，煅烧时间1h，保温1h。
6)研磨后过筛，调节pH至中性，获得天然骨粉。
用X射线衍射仪(XRD，Rigaku，D/Max 2500)测试天然骨粉产品，设置步进长度0.02°/s，Cu靶电压40kV，电流250mA，扫描范围为20-70°，并对测试结果图谱进行分析。
根据图1中牛骨骨粉XRD图谱数据显示，制备骨粉的XRD图谱三强峰分别为31.8°、32.2°、32.9°。查阅并对照PDF卡片，显示制备的牛骨骨粉具有国际衍射数据委员会(ICDD)，USA的粉末衍射卡PDF 9-432所表征的晶体结构，化学式应为Ca5(PO4)3(OH)。对照标准样品图谱，未见骨粉中存在其他晶体杂峰，可以推测骨粉中主要成分即为羟基磷灰石(Ca5(PO4)3(OH))晶体。
由图2可看出，使用本发明所述方法制备的天然骨粉的晶体颗粒大小均在250μm以下，并且可以观察到很多在500nm左右。市面上在售的骨粉产品的主要成分为β-TCP或羟基磷灰石。本产品的优势在于无机盐尺寸更小(市售骨粉产品的无机盐尺寸一般＞250μm)，更有利于骨诱导和降解吸收，且本产品经过多次脱脂脱蛋白，免疫原性更低，更安全。
实施例2：骨修复材料的制备
1、天然羟基磷灰石的制备：根据实施例1所述方法制备天然羟基磷灰石(天然骨粉)；
2、胶原凝胶的制备：
1)将500毫升硫酸软骨素乙酸溶液缓慢加入到500毫升胶原乙酸溶胀液中，搅拌速度为15000-20000转/分，搅拌时间为1-2小时，将溶液抽真空，得到胶原-硫酸软骨素浆液；
硫酸软骨素乙酸溶液配置：
将2-4克硫酸软骨素加入到500毫升浓度为0.4-0.6％乙酸溶液中，在0-10℃温度条件下溶解，过滤得到。
胶原乙酸溶胀液配置：
将3-5克I型胶原蛋白加入到500毫升浓度为0.3-0.6％乙酸溶液中，混合搅拌，搅拌速度为15000-20000转/分，搅拌温度为0-10℃，搅拌时间为1-2小时。
2)将胶原-硫酸软骨素浆液倒在不锈钢冻干盘中，轻轻摇晃使其分布均匀，控制其厚度在2～5毫米，在温度为-50～-30℃，压力≤0.2兆帕条件下进行真空冷冻干燥，得到胶原膜。
将胶原膜粉碎，加入质量分数3％乙酸溶液溶胀，搅拌均匀得到胶原凝胶。
3、胶原凝胶与天然羟基磷灰石的物理共混：
在质量体积比为5％的胶原凝胶中加入天然羟基磷灰石，I型胶原(纯度不小于99％)：天然羟基磷灰石＝1:9～4:6，搅拌速度为80-120转/分，搅拌温度为0-10℃，机械搅拌至混合均匀、没有骨粉颗粒及胶原纤维团聚。注入模具。
4、速冻干燥包括如下步骤：
冷冻阶段，温度：-36℃，时间：40分钟；
抽空干燥阶段，温度：-18℃，时间：100分钟，真空度：0.2bar；
第一干燥阶段，温度：-8℃，时间：660分钟，真空度：0.2bar；
第二干燥阶段，温度：0℃，时间：420分钟，真空度：0.2bar；
第三干燥阶段，温度：10℃，时间：180℃，真空度：0.2bar；
第四干燥阶段，温度：24℃，时间：110分钟，真空度：0.2bar。
5、使用钴-60对上述骨修复材料进行辐照灭菌。
实施例3：骨修复材料与骨粉形貌及成分分析
将实施例2制备好的骨修复材料通过扫描电子显微镜(SEM,S4800,HATICHI)进行形貌观察，并通过附带EDS进行元素分布分析。
图3为骨修复材料的SEM照片，从中可以看出骨修复材料中磷酸盐颗粒小于250μm，由胶原蛋白粘连形成整体，胶原蛋白与磷酸盐颗粒相间分布，胶原蛋白呈光滑膜状，而磷酸盐颗粒进一步放大可观察到大量500nm左右的羟基磷灰石晶体，纳米晶体间形成微纳米级的孔结构，此结构保留自天然骨微观结构，使骨修复材料具备吸水性与对生长因子等蛋白的吸附性作用。进一步对骨修复材料进行元素分析如图4所示，可观察到胶原蛋白富集区的碳元素较多，而钙、磷元素较少，而磷酸盐颗粒则大量出现钙、磷元素的富集，同时碳元素也有分布，说明胶原蛋白均匀分布于整个骨修复材料。
将所述骨修复材料粉碎制备为修复骨粉：将冻干材料切成小块，放入粉碎机中进行粉碎，转速28000转/分，过60目筛。同样进行扫描电子显微镜(SEM,S4800,HATICHI)形貌观察分析。
图2天然骨粉的SEM照片中可以看出骨粉中磷酸盐颗粒小于250μm，颗粒表面为粗糙，进一步放大可观察到大量500nm左右的羟基磷灰石晶体，纳米晶体间形成微纳米级的孔结构，此结构保留自天然骨微观结构。图5为修复骨粉的形貌SEM照片，修复骨粉颗粒均小于250μm，颗粒表面附有微米级胶原蛋白膜。根据SEM照片统计颗粒尺寸粒径大小，修复骨粉粒径(粒径指磷酸盐颗粒)主要集中于10μm以下，该范围粒径颗粒占总数的71.35％，大尺寸颗粒均小于250μm，并且100μm以上颗粒所占比例小于0.5％；构成磷酸盐聚集体的纳米羟基磷灰石之间的孔隙为100nm～10μm。
实施例4：修复骨粉动物试验
1、动物试验
动物与手术部位：Beagle犬双侧下颌骨前磨牙
缺损尺寸：下颌骨拔牙创
1)数量：2只
2)时间：种植修复中，二期手术需待种植体完成骨整合以后才能进行，一般上颌24周，下颌12周，因此观察时间点选择4周、8周、12周、16周。
3)实验分组：
A：只造骨缺损，作为空白对照样；
B：骨缺损+本公司口腔生物膜(下同)；
C：骨缺损+天然骨粉+口腔生物膜；(所述天然骨粉采用实施例1所述方法制备)
D：骨缺损+含10％(质量比)胶原蛋白修复骨粉；
E：骨缺损+含10％(质量比)胶原蛋白修复骨粉+口腔生物膜；
F：骨缺损+含30％(质量比)胶原蛋白修复骨粉+口腔生物膜；
4)实验方法：
a.选取Beagle犬，在两侧下颌骨磨牙，拔牙造成两处骨缺损，按实验分组计划分别作为实验组、空白组。
b.在无菌环境下，打开修复骨粉、骨粉、口腔生物膜包装，适当用生理盐水润湿。
c.按照分组动物实验模型设计实施，先将含10％胶原蛋白修复骨粉、含30％胶原蛋白修复骨粉及骨粉填充牙槽窝，充填器挤压，充填紧实，直至骨粉与牙槽嵴顶平齐，并选择性使用口腔生物膜覆盖；空白组只作骨缺损，不使用口腔生物膜，不填充骨代材料。
d.缝合所有伤口，术后给予庆大霉素肌注，预防感染。手术过程参见图6。
2、试验结果
1)术后16周处死动物前肉眼观察动物口腔牙周情况，各组实验部位均未见明显的牙石和软垢，牙龈附着愈合良好，软组织色、形、质正常，无组织肿胀，未发现有炎症表现或牙周袋的形成，也未发现有感染、化脓现象。切开牙龈软组织，暴露下颌骨，可见下颌牙槽牙几乎恢复正常，未见明显骨缺损(参见图7)。
使用修复骨粉、骨粉、口腔生物膜产品未见炎症、感染现象，无不良反应、异物反应，动物精神状态良好，说明修复骨粉产品安全可靠。
2)图8为CT观察整体照片，通过比对图片上手术位置骨缺损的高度与宽度的变化跟踪记录修复骨粉修复骨缺损部位的治疗效果(数据见表1、表2)。
表1颌骨CT检查高度量化数据(以4周为基线，mean±SD)
Figure BDA0001980720420000081
表2颌骨CT检查宽度量化数据(以4周为基线，mean±SD)
Figure BDA0001980720420000082
图9为修复骨粉修复骨缺损CT结果的量化分析，a图为骨增量的高度值，b图为骨增量的宽度值，从图中可以看出经过12周时间，含10％胶原蛋白修复骨粉组(D、E组)骨增量高度逐步增高，为基线值的1.30±0.02倍、1.30±0.04倍，空白组(A组)只增加1.06±0.09倍，在16周时10％胶原蛋白修复骨粉组(D、E组)为基线值的1.30±0.02倍、1.31±0.10倍，空白组只增加1.07±0.09倍，两组对比有显著性差异。而不含胶原蛋白的骨粉组(C组)和含30％胶原蛋白修复骨粉组(F组)骨缺损高度分别为基线的1.16±0.05倍、1.23±0.04倍，绝对数值上高于空白对照组，说明使用修复骨粉修复骨缺损具有明显的效果，且含有10％胶原蛋白含量组效果更明显。从骨增量宽度数据分析各组间并无明显差别。
以上数据说明在下颌牙槽骨缺损修复中，引入天然骨粉、修复骨粉都有利于骨缺损的修复，延缓牙槽骨吸收进程。C组的结果不及含10％胶原蛋白修复骨粉组(D、E组)，是因为羟基磷灰石其本身无成骨性，不能诱导组织成骨，只是提供了适合新的骨组织沉积的生理基质，引导骨组织长入种植区，修复时间长。经过本发明所述方法制备的修复骨粉化学成分与天然骨组织相近，在成骨过程中承担支架及吸附成骨细胞的功能，起到引导成骨细胞迁移的作用。加入10％胶原蛋白，化学组成更接近天然骨组织，同时胶原蛋白可以吸附锚定成骨细胞合成的生长因子，起到诱导组织成骨的作用，从而促进骨缺损修复，延缓牙槽骨吸收进程。含30％胶原蛋白修复骨粉组(F组)则可能因羟基磷灰石成分偏少，填充的拔牙创易发生塌陷而不利于骨增加。
经过本发明所述方法制备的修复骨粉具有更加显著的骨缺损修复效果，仅仅使用该修复骨粉(D组)的效果已经优于天然骨粉+口腔生物膜实验组(C组)，并且与修复骨粉+口腔生物膜实验组(E组)效果相当。这从一定程度上表明，使用本发明所述修复骨粉，可以简化手术中口腔生物膜的使用和相关操作，也为患者降低手术费用负担。
3)将试验A组和D组进行病理切片分析
图10为D组(骨缺损+含10％胶原蛋白修复骨粉)16周病理切片结果，40倍下可见一大片岛状新生类骨组织。b图，200倍镜下可见缝隙处骨组织边缘具有极性排列的成骨细胞存在。c图显示岛状新生类骨组织，其左侧为纤维组织结构，逐渐被类骨组织替代，并可看出此处类骨质从左至右呈现出越来越致密的趋势。
图11为A组(骨缺损)16周病理切片结果，40倍下可见骨缺损处被大量较厚纤维组织占据，覆盖在骨组织表面。图B、图C，100倍下有新生类骨组织存在于骨组织与纤维组织之间，并有骨陷窝形成。图D显示200倍镜下纤维组织与类骨组织的连接处，类骨质絮状红染。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种骨修复材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)天然羟基磷灰石的制备：离体松质骨经两次强碱、两次强氧化剂、4-5次热水浸泡，脱脂、脱蛋白、脱细胞，脱水后经分阶段高温煅烧，灭活可能存在的病毒，研磨后过筛，调节pH至中性，得到天然羟基磷灰石，所述分阶段高温 煅烧，阶段1：煅烧温度300℃，煅烧时间1h，阶段2：煅烧温度600℃，煅烧时间1h，保温1h，阶段3：煅烧温度900℃，煅烧时间1h，保温1h；
所述强碱的浓度为0.05～5M，所述强碱浸泡时间为1～48h；
所述强氧化剂的浓度为3％～30％，所述强氧化剂浸泡时间为1～48h；
所述热水浸泡所使用的热水的温度为50～100℃；所述热水处理时间为每次0.5～2h；
2)胶原凝胶的制备：在胶原乙酸溶胀液中加入硫酸软骨素乙酸溶液，得到胶原-硫酸软骨素浆液，冻干得到胶原膜，将胶原膜粉碎，加入乙酸溶液溶胀，搅拌均匀得到胶原凝胶，所述胶原为I型胶原蛋白；
3)胶原凝胶与天然羟基磷灰石的物理共混：在胶原凝胶中加入天然羟基磷灰石，机械搅拌至混合均匀、没有骨粉颗粒及胶原纤维团聚，获得注射型骨修复材料，所述天然羟基磷灰石的添加比例为：I型胶原蛋白：天然羟基磷灰石＝1:9～4:6(质量比)；
4)将步骤3)所述注射型骨修复材料注射进模具内，冷冻后拆除模具进行冻干得到块状，根据需要进行粉碎得到粉状，所述粉状粒径500nm～250μm，所述粒径在10μm以下的颗粒占总数的71.35％，所述粒径在100μm以上的颗粒所占比例小于0.5％，孔隙200nm～2μm，羟基磷灰石晶体间形成微纳米级的孔结构；
5)灭菌。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述强碱为NaOH、KOH、Ca(OH)2中的一种或几种，所述强碱的浓度为0.5～2M，所述强碱浸泡时间为12～24h；
所述强氧化剂为过氧化氢，所述强氧化剂的浓度为10～30％，所述强氧化剂浸泡时间为12～24h；
所述热水浸泡所使用的热水的温度为80～100℃，所述热水处理时间为每次0.5～1h，处理4～5次。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2)中硫酸软骨素乙酸溶液中的硫酸软骨素含量为0.4-0.8％(质量体积比)，乙酸浓度为0.4-0.6％(体积比)；胶原乙酸溶胀液中I型胶原蛋白的含量为0.6-1.0％(质量体积比)，乙酸浓度为0.3-0.6％(体积比)；溶胀胶原膜的乙酸溶液浓度为2-5％(体积比)。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述溶胀胶原膜的乙酸溶液浓度为3％(体积比)。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3)中搅拌速度为80-120转/分，搅拌温度为0-10℃。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤3)中天然羟基磷灰石的添加比例为：I型胶原蛋白：天然羟基磷灰石＝1:9(质量比)。
7.一种权利要求1- 6任一项所述方法制备获得的骨修复材料。
8.根据权利要求7所述骨修复材料，其特征在于，硫酸软骨素的添加量为0.5％～3.6％(质量比)。
9.根据权利要求8所述骨修复材料，其特征在于，硫酸软骨素的添加量为0.8％～3.3％(质量比)。
10.根据权利要求9所述骨修复材料，其特征在于，所述粉末状粒径1μm～10μm，孔隙200nm～2μm。
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