CN104174068B - 一种生物型软骨修复材料及其制备方法 - Google Patents
一种生物型软骨修复材料及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种生物型软骨修复材料及其制备方法。本发明提供的制备软骨修复材料的方法，包括如下步骤：（1）使用表面活性剂溶液浸泡处理离体的动物软骨；（2）使用碱溶液浸泡处理步骤（1）的产物；（3）使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤（2）的产物；（4）使用碱溶液浸泡处理步骤（3）的产物；（5）使用pH5.0-9.0的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤（4）的产物。（6）将步骤（5）的产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到软骨修复材料。本发明提供的生物型软骨修复材料无免疫排异反应，生物相容性好，能满足被修补组织的力学要求。
Description
技术领域
本发明属于医疗器械领域，具体涉及一种在外科手术中对骨组织进行修复的生物型软骨修复材料及其制备方法。
背景技术
现代外科手术，常需对一些缺损的软骨组织进行修补，如骨损伤修复、关节面修复等。为满足这些修补的需要，目前临床上已有多种材料及方案用于软骨损伤的修复，但目前来说，都存在不同程度的应用缺陷。
理想的支架材料应具有以下特点：①有良好的组织相容性，无毒，无致畸性；②有三维立体结构；③生物可降解性；④良好的细胞界面；⑤具有可塑性和一定的机械强度。
目前在临床上使的修复材料包括以下几大类：
天然生物材料：主要包括胶原、明胶，纤维蛋白、壳聚糖、琼脂、糖胺多糖、藻酸盐、蚕丝蛋白、几丁质、松质骨骨基质、脱细胞基质等。天然生物支架材料安全性较高且易获得，但最大的缺点是降解太快，新生组织往往达不到很好的塑形，且力学强度不够，被大大限制了应用。
无机材料以羟基磷灰石、磷酸三钙为代表，有机材料以PLA、PGA、PLGA、聚己内酯、聚环氧乙烯、聚乙烯醇、聚氧化乙烯等高分子聚合物为主。其中研究最多的是PLA、PGA以及PLGA。但人工合成材料在不同程度上都存在生物相容性的问题，会引发物理刺激引起的无菌炎症及慢性排异引起的后遗症。。
自体软骨来源有限，且容易造成供区缺损；异体软骨被广泛应用，但可引起免疫排斥反应，或引起交叉感染；骨膜移植则存在效果不稳定的缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种异种来源的生物型软骨修复材料及其制备方法。
本发明提供的制备软骨修复材料（生物型软骨修复材料）的方法，包括如下步骤：
（1）使用表面活性剂溶液浸泡处理离体的动物软骨；
（2）使用碱溶液浸泡处理步骤（1）的产物；
（3）使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤（2）的产物；
（4）使用碱溶液浸泡处理步骤（3）的产物；
（5）使用pH5.0-9.0（如pH5.0-6.5、pH6.5-9.0、pH5.0、pH6.5或pH9.0）的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤（4）的产物；
（6）将步骤（5）的产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到软骨修复材料。
所述步骤（1）又称脱细胞处理。所述步骤（1）中：所述表面活性剂为非离子型表面活性剂，要求残留可控、无细胞毒性或低细胞毒性、不会污染环境。所述步骤（1）中：所述表面活性剂可为TritonX-100、Tween-80或Tween-40。所述步骤（1）中：所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为0.5-3g/100ml（如0.5-1g/100ml、1g-3g/100ml、0.5g/100ml、1g/100ml或3g/100ml）。所述步骤（1）中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-10℃、6-25℃、2±2℃、8±2℃或23±2℃）、5-168小时（如5-15小时、15-168小时、5小时、15小时或168小时）。所述表面活性剂溶液具体可为表面活性剂水溶液。
所述步骤（2）中：所述碱溶液可为碱性化合物溶液。所述碱性化合物可为NaOH、KOH或Ca(OH)2。所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度可为0.02-1M（如0.02-0.5M、0.5-1M、0.02M、0.5M或1M）。所述步骤（2）中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-10℃、6-25℃、2±2℃、8±2℃或23±2℃）、30-180分钟（如30-60分钟、60-180分钟、30分钟、60分钟或180分钟）。所述碱溶液具体可为碱性化合物的水溶液。
所述步骤（3）又称脱脂处理。所述步骤（3）中：所述表面活性剂可为TritonX-100、Tween-80或Tween-40。所述步骤（3）中：所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为0.5-3g/100ml（如0.5-1g/100ml、1g-3g/100ml、0.5g/100ml、1g/100ml或3g/100ml）。所述步骤（3）中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-10℃、6-25℃、2±2℃、8±2℃或23±2℃）、1-168小时（如1-10小时、10-168小时、1小时、10小时或168小时）。所述表面活性剂溶液具体可为表面活性剂水溶液。
所述步骤（4）中：所述碱溶液可为碱性化合物溶液。所述碱性化合物可为NaOH、KOH或Ca(OH)2。所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度可为0.02-1M（如0.02-0.5M、0.5-1M、0.02M、0.5M或1M）。所述步骤（4）中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-10℃、6-25℃、2±2℃、8±2℃或23±2℃）、30-180分钟（如30-60分钟、60-180分钟、30分钟、60分钟或180分钟）。所述碱溶液具体可为碱性化合物的水溶液。
所述步骤（5）中：所述的辐照保护剂可以是阻隔剂、稳定剂、还原剂中的一种或几种。所述步骤（5）中：所述辐照保护试剂可为甘氨酸。所述步骤（5）中：所述辐照保护试剂溶液中，所述辐照保护试剂的浓度可为0.1-3.5g/100ml（如0.1-1g/100ml、1g-3.5g/100ml、0.1g/100ml、1g/100ml或3.5g/100ml）。所述步骤（5）中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-8℃、4-25℃、2±2℃、6±2℃或23±2℃）、60-180分钟（如60-120分钟、120-180分钟、60分钟、120分钟或180分钟）。所述辐照保护试剂溶液具体可为辐照保护试剂水溶液。
所述辐照灭菌具体可为钴-60辐射灭菌。所述钴-60辐射灭菌的辐照剂量可为15-30KGy（如15-25KGy、25-30KGy、15KGy、25KGy或30KGy）。
所述动物软骨可为动物肋软骨或动物关节软骨。
所述动物可为牛或猪。
以上任一所述方法制备得到的软骨修复材料也属于本发明的保护范围。
动物骨组织含有丰富的细胞及间质，表现出很强的免疫原性。常规的乙醇清洗、过氧化氢清洗脱除细胞的能力有限，几乎不能做到完全脱细胞；结合深冻工艺，虽可以进一步降低材料的免疫原性，但深冻本身并不能进一步脱除细胞成分，仍然有较强的免疫原性；而且遗传物质的残留也存在较大的安全隐患。
本发明中，选用的动物的软骨组织为动物肋软骨，属透明软骨。肋软骨适宜加工为柱状材料，其机械强度较高，带有宏观孔洞，但与关节软骨所制得材料相比略脆。软骨本身细胞含量极少，主要成分硫酸软骨素和胶原蛋白均为安全成分，可作为植入材料，其他成分含量也很少。也可以采用关节软骨，适宜加工为片状材料，可为平直或弯曲的片状，且有较好的弹性及柔韧度。
发明中，通过脱细胞、脱脂可以完全去除内毒素，完全脱除抗原的成分。
本发明中，对软骨修复材料进行了辐照保护处理，在软骨组织上结合辐照保护剂，降低辐照过程对生物型软骨修复材料固有结构的破坏，从而避免其在使用过程中降解过快，使材料只在骨组织再生时被破骨细胞被动降解，降解与组织的生长速度同步，同时降解产物可被机体吸收利用，有利于缺损组织的再生性修复。
本发明的优点：原料是动物软骨组织，主要成分是硫酸软骨素和胶原蛋白，保留了与机体相似的空间结构，可被动降解，降解速度与再生组织的生长速度同步，降解产物可被机体吸收利用，有利于缺损组织的再生性修复，本发明无免疫排异反应，生物相容性好，能满足被修补组织的力学要求。
附图说明
图1为实施例1的步骤2的产物的切片的HE染色图。
图2为实施例1制备的生物型软骨修复材料的切片的HE染色图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
甘氨酸：国药集团化学试剂有限公司，产品编号为62011516，CAS编号为56-40-6。
实施例1、生物型软骨修复材料的制备
1、从规范化管理的屠宰厂中收集刚完成屠宰的成年猪的肋软骨，尽量避免接触污染物，收集后立即冷冻储存。
2、将步骤1得到的肋软骨解冻后并充分清洗，剪去肌肉组织，剔除骨膜（此时的HE染色结果见图1）。
3、脱细胞处理
使用表面活性剂溶液浸泡处理肋软骨。
本步骤的目的为：破坏细胞膜结构，使细胞破碎溶出。
具体步骤：使用0.5g/100mlTritonX-100水溶液8±2℃浸泡处理15小时，然后用清水洗涤。
4、第一次碱处理
使用碱溶液浸泡处理步骤3的产物。
本步骤的目的为：破坏并溶出非胶原类蛋白。
具体步骤：使用1MNaOH水溶液，8±2℃浸泡处理60min，然后用清水洗涤。
5、脱脂处理
用表面活性剂溶液浸泡处理步骤4的产物。
本步骤的目的为：去除脂肪及脂溶性杂质。
具体步骤：使用1g/100mlTritonX-100水溶液8±2℃浸泡处理10小时，然后用清水洗涤。
6、第二次碱处理
使用碱溶液浸泡处理步骤5的产物。
本步骤的目的为：去除内毒素及灭活可能存在的病毒。
具体步骤：使用1MNaOH水溶液，8±2℃浸泡处理60min，然后用清水洗涤。
7、辐照保护剂处理
具体步骤：使用pH6.5、1g/100mL的甘氨酸水溶液，6±2℃浸泡处理120min，然后用清水洗涤。
8、取步骤7的产物，使用冻干机进行冷冻干燥，然后封装并用钴-60辐射灭菌（辐照剂量为25KGy）。产物的HE染色结果见图2，可以观察到产品的脱细胞效果显著。
实施例2、生物型软骨修复材料的制备
1、从规范化管理的屠宰厂中收集刚完成屠宰的成年猪的关节软骨，尽量避免接触污染物，收集后立即冷冻储存。
2、将步骤1得到的关节软骨解冻后并充分清洗，剪去肌肉组织，剔除骨膜。
3、脱细胞处理
使用表面活性剂溶液浸泡处理关节软骨。
具体步骤：使用1g/100mlTween-80水溶液23±2℃浸泡处理5小时，然后用清水洗涤。
4、第一次碱处理
使用碱溶液浸泡处理步骤3的产物。
具体步骤：使用0.5MKOH水溶液，23±2℃浸泡处理30min，然后用清水洗涤。
5、脱脂处理
用表面活性剂溶液浸泡处理步骤4的产物。
具体步骤：使用0.5g/100mlTween-80水溶液23±2℃浸泡处理1小时，然后用清水洗涤。
6、第二次碱处理
使用碱溶液浸泡处理步骤5的产物。
具体步骤：使用0.5MKOH水溶液，23±2℃浸泡处理30min，然后用清水洗涤。
7、辐照保护剂处理
具体步骤：使用pH5.0、0.1g/100mL的甘氨酸水溶液，23±2℃浸泡处理60min，然后用清水洗涤。
8、取步骤7的产物，使用冻干机进行冷冻干燥，然后封装并用钴-60辐射灭菌（辐照剂量为15KGy）。
实施例3、生物型软骨修复材料的制备
1、从规范化管理的屠宰厂中收集刚完成屠宰的成年牛的肋软骨，尽量避免接触污染物，收集后立即冷冻储存。
2、将步骤1得到的肋软骨解冻后并充分清洗，剪去肌肉组织，剔除骨膜。
3、脱细胞处理
使用表面活性剂溶液浸泡处理肋软骨。
具体步骤：使用3g/100mlTween-40水溶液2±2℃浸泡处理168小时，然后用清水洗涤。
4、第一次碱处理
使用碱溶液浸泡处理步骤3的产物。
具体步骤：使用0.02MCa(OH)2水溶液，2±2℃浸泡处理180min，然后用清水洗涤。
5、脱脂处理
用表面活性剂溶液浸泡处理步骤4的产物。
具体步骤：使用3g/100mlTween-40水溶液2±2℃浸泡处理168小时，然后用清水洗涤。
6、第二次碱处理
使用碱溶液浸泡处理步骤5的产物。
具体步骤：使用0.02MCa(OH)2水溶液，2±2℃浸泡处理180min，然后用清水洗涤。
7、辐照保护剂处理
具体步骤：使用pH9.0、3.5g/100mL的甘氨酸水溶液，2±2℃浸泡处理180min，然后用清水洗涤。
8、取步骤7的产物，使用冻干机进行冷冻干燥，然后封装并用钴-60辐射灭菌（辐照剂量为30KGy）。
实施例4、动物实验
实验动物：新西兰白兔、体重2-2.5kg。
1、将实验动物麻醉，膝关节前切口，纵向切开皮肤，逐层深入，暴露股骨踝间窝关节面，用手钻做一直径为3毫米、深5毫米的软骨缺损。止血后，用等渗盐水冲洗创口，逐层缝合。伤后连续3天肌内注射青霉素钠盐，不外固定，笼内喂养。
2、将完成步骤1的动物分组处理：
实验组-1：将实施例1得到的生物型软骨修复材料修剪为合适的形态后修补软骨缺损，用等渗盐水冲洗创口，逐层缝合，术后肌内注射青霉素钠4×105U预防感染（每天两次，共3天）；
实验组-2：将实施例2得到的生物型软骨修复材料修剪为合适的形态后修补软骨缺损，用等渗盐水冲洗创口，逐层缝合，术后肌内注射青霉素钠4×105U预防感染（每天两次，共3天）；
实验组-3：将实施例3得到的生物型软骨修复材料修剪为合适的形态后修补软骨缺损，用等渗盐水冲洗创口，逐层缝合，术后肌内注射青霉素钠4×105U预防感染（每天两次，共3天）；
对照组：用等渗盐水冲洗创口，逐层缝合，术后肌内注射青霉素钠4×105U预防感染（每天两次，共3天）。
术后8周时，解剖动物并观察股骨踝间窝关节面的形态。对照组动物可见骨软骨缺损区填充物为灰白色、半透明、较硬、略凹，细胞排列不甚规则，分层不明显，仅少部分细胞形成陷窝样结构。实验组-1、实验组-2、实验组-3中，动物的股骨踝间窝关节面基本愈合。
Claims (5)
1.一种制备软骨修复材料的方法，包括如下步骤：
(1)使用表面活性剂溶液浸泡处理离体的动物软骨；所述表面活性剂为TritonX-100、Tween-80或Tween-40；所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度为0.5-3g/100ml；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、5-168小时；
(2)使用碱溶液浸泡处理步骤(1)的产物；所述碱溶液为碱性化合物溶液；所述碱性化合物为NaOH、KOH或Ca(OH)2；所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度为0.02-1M；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、30-180分钟；
(3)使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤(2)的产物；所述表面活性剂为TritonX-100、Tween-80或Tween-40；所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度为0.5-3g/100ml；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、1-168小时；
(4)使用碱溶液浸泡处理步骤(3)的产物；所述碱溶液为碱性化合物溶液；所述碱性化合物为NaOH、KOH或Ca(OH)2；所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度为0.02-1M；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、30-180分钟；
(5)使用pH5.0-9.0的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤(4)的产物；所述辐照保护试剂为甘氨酸；所述辐照保护试剂溶液中，所述辐照保护试剂的浓度为0.1-3.5g/100ml；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、60-180分钟；
(6)将步骤(5)的产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到软骨修复材料。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述灭菌为钴-60辐射灭菌。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述动物软骨为动物肋软骨或动物关节软骨。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述动物为牛或猪。
5.权利要求1至4中任一所述方法制备得到的软骨修复材料。
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Address after: 264006 No.7 Nanjing Street, Yantai Economic and Technological Development Zone, Yantai City, Shandong Province Patentee after: YANTAI ZHENGHAI BIO-TECH Co.,Ltd. Address before: 264006 No. 10, Yantai economic and Technological Development Zone, Shandong, Hengshan Road Patentee before: YANTAI ZHENGHAI BIO-TECH Co.,Ltd. |