CN104174069A - 一种致密骨基质及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种致密骨基质及其制备方法。本发明提供的制备骨基质（致密脱钙骨基质）的方法，包括如下步骤：（1）取离体的动物骨的骨干，使用表面活性剂溶液浸泡处理；（2）使用碱溶液浸泡处理步骤（1）的产物；（3）使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤（2）的产物；（4）使用酸溶液浸泡处理步骤（3）的产物；（5）使用碱溶液浸泡处理步骤（4）的产物；（6）使用pH6.0-7.5的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤（5）的产物；（7）将步骤（6）的产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到骨基质。本发明提供的骨基质无免疫排异反应，生物相容性好，能满足被修补组织的力学要求。
Description
技术领域
本发明属于医疗器械领域，具体涉及一种在外科手术中对骨组织进行修复的致密骨基质及其制备方法。
背景技术
随着现代医学的发展，骨外科整形手术涉及的范围已愈发广泛，如粉碎性骨折及骨不连的修复、颅骨重建、颌面外科整形、脊柱修复与重建等。
在手术技术迅速发展的同时，适宜的修复材料相对难以获得，成为此类手术推广的重大障碍。目前应用较多的金属修复材料，有重量轻、强度高、方便塑型等优势，但还存在如下问题：热传导性能过于良好，给患者造成强烈的异物感；弹性模量远强于真骨，易对周围骨组织造成机械损伤；不可降解，作为永久异物存在于体内，经常发生非菌炎性反应。后来发展的以生物陶瓷为代表的无机非金属材料在生物相容性方面优于金属材料，但其密度过大，在应用时受到一定制约，而且此类材料不易降解，即使能与组织良好相容，也不能达到理想的强度。自体骨是最理想的修复材料，受来源限制不能大量应用，仅在治疗骨不连中有优秀的表现，但也会造成新的损伤，增加术后并发症的发生，失败率高达10-30%。异体骨移植在材料筛选、储存方面相当困难、昂贵，还容易产生免疫排斥反应、感染艾滋病毒等，失败率更高。
发明内容
本发明的目的是提供一种致密骨基质及其制备方法。
本发明提供的制备骨基质（致密骨基质）的方法，又称方法甲，包括如下步骤：
（1）取离体的动物骨的骨干，使用表面活性剂溶液浸泡处理；
（2）使用碱溶液浸泡处理步骤（1）的产物；
（3）使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤（2）的产物；
（4）使用酸溶液浸泡处理步骤（3）的产物；
（5）使用碱溶液浸泡处理步骤（4）的产物；
（6）使用pH6.0-7.5（如pH6.0-6.8、pH6.8-7.5、pH6.0、pH6.8或pH7.5）的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤（5）的产物；
（7）将步骤（6）的产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到骨基质。
所述步骤（1）中：所述表面活性剂可为TritonX-100、Tween-80或Tween-40。所述步骤（1）中：所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为0.5-3g/100ml（如0.5-1g/100ml、1g-3g/100ml、0.5g/100ml、1g/100ml或3g/100ml）。所述步骤（1）中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-10℃、6-25℃、2±2℃、8±2℃或23±2℃）、1-168小时（如1-12小时、12-168小时、1小时、12小时或168小时）。所述表面活性剂溶液具体可为表面活性剂水溶液。
所述步骤（2）中：所述碱溶液可为碱性化合物溶液。所述碱性化合物可为NaOH、KOH或Ca(OH)2。所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度可为0.02-1M（如0.02-0.5M、0.5-1M、0.02M、0.5M或1M）。所述步骤（2）中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-10℃、6-25℃、2±2℃、8±2℃或23±2℃）、30-180分钟（如30-120分钟、120-180分钟、30分钟、120分钟或180分钟）。所述碱溶液具体可为碱性化合物的水溶液。
所述步骤（3）中：所述表面活性剂可为TritonX-100、Tween-80或Tween-40。所述步骤（3）中：所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为0.5-3g/100ml（如0.5-1g/100ml、1g-3g/100ml、0.5g/100ml、1g/100ml或3g/100ml）。所述步骤（3）中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-10℃、6-25℃、2±2℃、8±2℃或23±2℃）、1-168小时（如1-10小时、10-168小时、1小时、10小时或168小时）。所述表面活性剂溶液具体可为表面活性剂水溶液。
所述步骤（4）中：所述酸溶液可为酸性化合物溶液。所述酸性化合物具体可为盐酸。所述酸性化合物溶液中，所述酸性化合物的浓度为1-8g/100ml（如1-5g/100ml、5-8g/100ml、1g/100ml、5g/100ml或8g/100ml）。所述步骤（4）中：所述浸泡处理的条件为：4-25℃（如4-14℃、10-25℃、6±2℃、12±2℃或23±2℃）、18-26小时（如18-22小时、22-26小时、18小时、22小时或26小时）。所述酸性化合物溶液具体可为酸性化合物水溶液。
所述步骤（4）中：所述酸溶液可为酸性化合物溶液。所述酸性化合物具体可为盐酸。所述酸性化合物溶液中，所述酸性化合物的浓度为0.3-1g/100ml（如0.3-0.5g/100ml、0.5-1g/100ml、0.3g/100ml、0.5g/100ml或1g/100ml）。所述步骤（4）中：所述浸泡处理的条件为：10-20℃（如10-17℃、13-20℃、12±2℃、15±2℃或18±2℃）、18-26小时（如18-22小时、22-26小时、18小时、22小时或26小时）。所述酸性化合物溶液具体可为酸性化合物水溶液。
所述步骤（5）中：所述碱溶液可为碱性化合物溶液。所述碱性化合物可为NaOH、KOH或Ca(OH)2。所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度可为0.02-1M（如0.02-0.5M、0.5-1M、0.02M、0.5M或1M）。所述步骤（5）中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-10℃、6-25℃、2±2℃、8±2℃或23±2℃）、30-180分钟（如30-120分钟、120-180分钟、30分钟、120分钟或180分钟）。所述碱溶液为碱性化合物的水溶液。
所述步骤（6）中：所述辐照保护试剂可为芦丁。所述步骤（6）中：所述辐照保护试剂溶液中，所述辐照保护试剂的浓度可为0.01-0.5g/100ml（如0.01-0.1g/100ml、0.1g-0.5g/100ml、0.01g/100ml、0.1g/100ml或0.5g/100ml）。所述步骤（6）中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-14℃、10-25℃、2±2℃、12±2℃或23±2℃）、1-5小时（如1-3小时、3-5小时、1小时、3小时或5小时）。所述辐照保护试剂溶液具体可为辐照保护试剂水溶液。
所述辐照灭菌可为钴-60辐射灭菌。所述钴-60辐射灭菌的辐照剂量可为15-30KGy（如15-25KGy、25-30KGy、15KGy、25KGy或30KGy）。
所述动物可为牛或猪。
所述动物骨的骨干具体可为动物四肢骨的骨干。
本发明提供的制备骨基质（致密骨基质）的方法，又称方法乙，包括如下步骤：
①取离体的动物骨的骨干，使用表面活性剂溶液浸泡处理；
②使用碱溶液浸泡处理步骤①的产物；
③使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤②的产物；
④使用碱溶液浸泡处理步骤③的产物；
⑤使用pH6.0-7.5的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤④的产物；
⑥将步骤⑤的产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到骨基质。
所述步骤①中：所述表面活性剂可为TritonX-100、Tween-80或Tween-40。所述步骤①中：所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为0.5-3g/100ml（如0.5-1g/100ml、1g-3g/100ml、0.5g/100ml、1g/100ml或3g/100ml）。所述步骤①中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-10℃、6-25℃、2±2℃、8±2℃或23±2℃）、1-168小时（如1-12小时、12-168小时、1小时、12小时或168小时）。所述表面活性剂溶液具体可为表面活性剂水溶液。
所述步骤②中：所述碱溶液可为碱性化合物溶液。所述碱性化合物可为NaOH、KOH或Ca(OH)2。所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度可为0.02-1M（如0.02-0.5M、0.5-1M、0.02M、0.5M或1M）。所述步骤②中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-10℃、6-25℃、2±2℃、8±2℃或23±2℃）、30-180分钟（如30-120分钟、120-180分钟、30分钟、120分钟或180分钟）。所述碱溶液具体可为碱性化合物的水溶液。
所述步骤③中：所述表面活性剂可为TritonX-100、Tween-80或Tween-40。所述步骤③中：所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为0.5-3g/100ml（如0.5-1g/100ml、1g-3g/100ml、0.5g/100ml、1g/100ml或3g/100ml）。所述步骤③中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-10℃、6-25℃、2±2℃、8±2℃或23±2℃）、1-168小时（如1-10小时、10-168小时、1小时、10小时或168小时）。所述表面活性剂溶液具体可为表面活性剂水溶液。
所述步骤④中：所述碱溶液可为碱性化合物溶液。所述碱性化合物可为NaOH、KOH或Ca(OH)2。所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度可为0.02-1M（如0.02-0.5M、0.5-1M、0.02M、0.5M或1M）。所述步骤④中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-10℃、6-25℃、2±2℃、8±2℃或23±2℃）、30-180分钟（如30-120分钟、120-180分钟、30分钟、120分钟或180分钟）。所述碱溶液为碱性化合物的水溶液。
所述步骤⑤中：所述辐照保护试剂可为芦丁。所述步骤⑤中：所述辐照保护试剂溶液中，所述辐照保护试剂的浓度可为0.01-0.5g/100ml（如0.01-0.1g/100ml、0.1g-0.5g/100ml、0.01g/100ml、0.1g/100ml或0.5g/100ml）。所述步骤⑤中：所述浸泡处理的条件可为：0-25℃（如0-14℃、10-25℃、2±2℃、12±2℃或23±2℃）、1-5小时（如1-3小时、3-5小时、1小时、3小时或5小时）。所述辐照保护试剂溶液具体可为辐照保护试剂水溶液。
所述辐照灭菌可为钴-60辐射灭菌。所述钴-60辐射灭菌的辐照剂量可为15-30KGy（如15-25KGy、25-30KGy、15KGy、25KGy或30KGy）。
所述动物可为牛或猪。
所述动物骨的骨干具体可为动物四肢骨的骨干。
以上任一所述方法制备得到的骨基质也属于本发明的保护范围。
本发明的优点：原料是动物骨组织，主要成分是胶原蛋白和无机骨盐，保留了与机体相似的空间结构，可被动降解，降解速度与再生组织的生长速度同步，降解产物是二十种氨基酸或多肽，非完全脱钙材料还可以提供无机骨盐，可被机体吸收利用，有利于缺损组织的再生性修复。本发明提供的骨基质无免疫排异反应，生物相容性好，能满足被修补组织的力学要求；表面较柔软并具有一定弹性，适宜与自体骨组织贴合，且避免了因植入材料与自体骨组织硬度不同造成的自体骨组织二次伤害。
附图说明
图1和图2为实施例1制备的致密型脱钙骨基质的切片的HE染色图。
图3为实施例1制备的致密型脱钙骨基质的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
芦丁：国药集团化学试剂有限公司，产品编号为U1606503，CAS编号为250249-75-3。该商购的芦丁的分子式为C27H30O16·3H2O，实施例中制备的芦丁溶液的浓度均以C27H30O16计。
芦丁的结构式如下：
实施例1、致密骨基质的制备（完全脱钙）
1、从规范化管理的屠宰厂中收集刚完成屠宰的成年猪的四肢骨，尽量避免接触污染物，收集后立即冷冻储存。
2、将步骤1得到的四肢骨解冻并充分清洗，取骨干部分，去除骨膜和骨髓，加工成适宜处理的条状或块状。
3、脱细胞处理
使用表面活性剂溶液浸泡处理骨干。
本步骤的目的为：破坏细胞膜结构，使细胞破碎溶出。
具体步骤：使用0.5g/100ml TritonX-100水溶液8±2℃浸泡处理12小时，然后用清水洗涤。
4、第一次碱处理
使用碱溶液浸泡处理步骤3的产物。
本步骤的目的为：破坏并溶出非胶原类蛋白，脱脂。
具体步骤：使用1M NaOH水溶液，8±2℃浸泡处理120min，然后用清水洗涤。
5、脱脂处理
用表面活性剂溶液浸泡处理步骤4的产物。
本步骤的目的为：抽提骨材料中的脂肪及脂溶性杂质。
具体步骤：使用1g/100ml TritonX-100水溶液8±2℃浸泡处理10小时，然后用清水洗涤。
6、酸处理
用酸溶液浸泡处理步骤5的产物。
本步骤的目的为：完全脱除骨组织中的无机骨盐。
具体步骤：使用5g/100ml盐酸水溶液12±2℃浸泡处理22小时，然后用清水洗涤。
7、第二次碱处理
使用碱溶液浸泡处理步骤6的产物。
本步骤的目的为：去除可能存在的内毒素及灭活可能存在的病毒。
具体步骤：使用1M NaOH水溶液，8±2℃浸泡处理120min，然后用清水洗涤。
8、辐照保护处理
用pH6.0-7.5的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤7的产物。
具体步骤：使用pH6.8、0.1g/100ml的芦丁水溶液，12±2℃浸泡处理3小时，然后用清水洗涤。
也可以用辐照保护试剂溶液对步骤7的产物进行表面涂抹，来代替浸泡处理。
9、取步骤8的产物，使用冻干机进行冷冻干燥后，然后封装并用钴-60辐射灭菌（辐照剂量为25KGy）。照片见图3。
实施例2、致密骨基质的制备（完全脱钙）
1、从规范化管理的屠宰厂中收集刚完成屠宰的成年牛的四肢骨，尽量避免接触污染物，收集后立即冷冻储存。
2、将步骤1得到的四肢骨解冻并充分清洗，取骨干部分，去除骨膜和骨髓，加工成适宜处理的条状或块状。
3、脱细胞处理
使用表面活性剂溶液浸泡处理骨干。
具体步骤：使用1g/100ml Tween-80水溶液23±2℃浸泡处理1小时，然后用清水洗涤。
4、第一次碱处理
使用碱溶液浸泡处理步骤3的产物。
具体步骤：使用0.02M Ca(OH)2水溶液，2±2℃浸泡处理180min，然后用清水洗涤。
5、脱脂处理
用表面活性剂溶液浸泡处理步骤4的产物。
具体步骤：使用0.5g/100ml Tween-80水溶液23±2℃浸泡处理1小时，然后用清水洗涤。
6、酸处理
用酸溶液浸泡处理步骤5的产物。
具体步骤：使用1g/100ml盐酸水溶液6±2℃浸泡处理26小时，然后用清水洗涤。
7、第二次碱处理
使用碱溶液浸泡处理步骤6的产物。
具体步骤：使用0.02M Ca(OH)2水溶液，2±2℃浸泡处理180min，然后用清水洗涤。
8、辐照保护处理
用pH6.0-7.5的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤7的产物。
具体步骤：使用pH6.0、0.01g/100ml的芦丁水溶液，23±2℃浸泡处理1小时，然后用清水洗涤。
也可以用辐照保护试剂溶液对步骤7的产物进行表面涂抹，来代替浸泡处理。
9、取步骤8的产物，使用冻干机进行冷冻干燥后，然后封装并用钴-60辐射灭菌（辐照剂量为15KGy）。
实施例3、致密脱钙骨基质的制备（完全脱钙）
1、从规范化管理的屠宰厂中收集刚完成屠宰的成年猪的四肢骨，尽量避免接触污染物，收集后立即冷冻储存。
2、将步骤1得到的四肢骨解冻并充分清洗，取骨干部分，去除骨膜和骨髓，加工成适宜处理的条状或块状。
3、脱细胞处理
使用表面活性剂溶液浸泡处理骨干。
具体步骤：使用3g/100ml Tween-40水溶液2±2℃浸泡处理168小时，然后用清水洗涤。
4、第一次碱处理
使用碱溶液浸泡处理步骤3的产物。
具体步骤：使用0.5M KOH水溶液，23±2℃浸泡处理30min，然后用清水洗涤。
5、脱脂处理
用表面活性剂溶液浸泡处理步骤4的产物。
具体步骤：使用3g/100ml Tween-40水溶液2±2℃浸泡处理168小时，然后用清水洗涤。
6、酸处理
用酸溶液浸泡处理步骤5的产物。
具体步骤：使用8g/100ml盐酸水溶液23±2℃浸泡处理18小时，然后用清水洗涤。
7、第二次碱处理
使用碱溶液浸泡处理步骤6的产物。
具体步骤：使用0.5M KOH水溶液，23±2℃浸泡处理30min，然后用清水洗涤。
8、辐照保护处理
用pH6.0-7.5的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤7的产物。
具体步骤：使用pH7.5、0.5g/100ml的芦丁水溶液，2±2℃浸泡处理5小时，然后用清水洗涤。
也可以用辐照保护试剂溶液对步骤7的产物进行表面涂抹，来代替浸泡处理。
9、取步骤8的产物，使用冻干机进行冷冻干燥后，然后封装并用钴-60辐射灭菌（辐照剂量为30KGy）。
实施例4、致密骨基质的制备（部分脱钙）
1、同实施例1的步骤1。
2、同实施例1的步骤2。
3、脱细胞处理
同实施例1的步骤3。
4、第一次碱处理
同实施例1的步骤4。
5、脱脂处理
同实施例1的步骤5。
6、酸处理
用酸溶液浸泡处理步骤5的产物。
本步骤的目的为：部分脱除骨组织中的无机骨盐。
具体步骤：使用0.5g/100ml盐酸水溶液15±2℃浸泡处理22小时，然后用清水洗涤。
7、第二次碱处理
同实施例1的步骤7。
8、辐照保护处理
同实施例1的步骤8。
9、同实施例1的步骤9。
实施例5、致密骨基质的制备（部分脱钙）
1、同实施例2的步骤1。
2、同实施例2的步骤2。
3、脱细胞处理
同实施例2的步骤3。
4、第一次碱处理
同实施例2的步骤4。
5、脱脂处理
同实施例2的步骤5。
6、酸处理
用酸溶液浸泡处理步骤5的产物。
本步骤的目的为：部分脱除骨组织中的无机骨盐。
具体步骤：使用1g/100ml盐酸水溶液12±2℃浸泡处理18小时，然后用清水洗涤。
7、第二次碱处理
同实施例2的步骤7。
8、辐照保护处理
同实施例2的步骤8。
9、同实施例2的步骤9。
实施例6、致密骨基质的制备（部分脱钙）
1、同实施例3的步骤1。
2、同实施例3的步骤2。
3、脱细胞处理
同实施例3的步骤3。
4、第一次碱处理
同实施例3的步骤4。
5、脱脂处理
同实施例3的步骤5。
6、酸处理
用酸溶液浸泡处理步骤5的产物。
本步骤的目的为：部分脱除骨组织中的无机骨盐。
具体步骤：使用0.3g/100ml盐酸水溶液18±2℃浸泡处理26小时，然后用清水洗涤。
7、第二次碱处理
同实施例3的步骤7。
8、辐照保护处理
同实施例3的步骤8。
9、同实施例3的步骤9。
实施例7、致密骨基质的制备（不脱钙）
1、同实施例1的步骤1。
2、同实施例1的步骤2。
3、脱细胞处理
同实施例1的步骤3。
4、第一次碱处理
同实施例1的步骤4。
5、脱脂处理
同实施例1的步骤5。
6、第二次碱处理
同实施例1的步骤7。
7、辐照保护处理
同实施例1的步骤8。
8、同实施例1的步骤9。
实施例8、致密骨基质的性能
实施例1制备的致密骨基质的切片的HE染色图见图1和图2。实施例1得到的致密骨基质染色后显示为粉红色，没有蓝色显示，表明该致密骨基质已完全脱钙。实施例1得到的致密骨基质可见内环骨板、外环骨板、哈佛氏系统等结构留下的胶原基质；可见骨陷窝中无遗传物质残留。实施例2和实施例3得到的致密骨基质的HE染色结果与实施例1的结果一致。
分别检测实施例1至实施例7制备的各个致密骨基质的无机物含量，方法为：称取100-105℃恒重的待测样品1g，置已炽灼至恒重的坩埚中(恒重的坩埚的重量为W1)，精密称定，置电炉上缓缓炽灼至完全炭化，放冷至室温，然后800℃炽灼6-8小时使完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温精密称定（灰化物和坩埚的总重为W2）。
实施例1至实施例7制备的各个致密骨基质的无机物含量见表1。
表1实施例1至实施例7制备的各个致密骨基质的无机物含量
实施例7制备的为不脱钙型致密骨基质，根据其无机物含量计算实施例4、实施例5和实施例6制备的各个致密骨基质的脱钙率。为了便于计算，将实施例7得到的致密骨基质的无机物含量计算为70%。
实施例4制备得到的致密骨基质的平均脱钙率为51.13%。实施例4制备得到的致密骨基质的平均脱钙率55.16%。实施例6制备得到的致密骨基质的平均无机物含量为60.52%，平均脱钙率为34.30%。
实施例9、致密骨基质的抗压强度试验
参照中华人民共和国国家标准GB/T1448-2005《纤维增强塑料压缩性能实验方法》分别检测实施例4的产物、实施例5的产物、实施例6的产物和实施例7的产物的抗压强度，具体步骤如下：
1、将试样制成抗压横截面积40-80mm2，高约为10-15mm的立方体或圆柱体，两抗压面切平,试样边缘平滑无缺口，舍去边缘有缺陷的试样。
2、用游标卡尺测量试样长度、宽度、高或直径、高，准确至0.01mm，每个项目测量三次并计算出其平均值。
3、将试样置于试验机（微机控制电子万能试验机，深圳市新三思计量技术有限公司，型号CMT8502）的两压板之间，使试样纵轴与上下夹具中心连线相重合，设置试样定变形5mm，按照10mm/min的规定速度，开动试验机进行试验。当试验机返车时，记录试样屈服负荷力值和屈服强度。
实施例4得到的致密骨基质的抗压强度为50MPa。
实施例5得到的致密骨基质的抗压强度为35MPa。
实施例6得到的致密骨基质的抗压强度为60MPa。
实施例7得到的致密骨基质的抗压强度为190MPa。
实施例10、致密骨基质修复长骨骨折动物实验
实验动物：新西兰白兔、清洁级、6个月龄，体重3-4kg。
1、将实验动物麻醉，从左后肢股骨前外侧纵切口，长约10cm，切开皮肤、皮下组织和深筋膜，沿股直肌与股外侧肌间隙锐性分开进入，不切开骨膜，于股骨前外侧放置已塑形好的4孔普通钢板（钢板预弯一定的弧度，约5°-8°，以使钢板和股骨向前外凸的弧度相吻合），电钻钻孔后依次旋入4枚螺钉固定。于钢板第2孔、第3孔之间，以线锯锯断股骨一侧，用直尺测量股骨1.5cm长，并标记好另一端截骨线，线锯截断，并切除该段对应的骨膜，造成标准的1.5cm段缺性骨与骨膜缺损。
2、将完成步骤1的动物分组处理：
实验组-1：将实施例1得到的致密骨基质修剪为合适的形态后修补1.5cm段的骨缺损，然后用生理盐水冲洗伤口后逐层缝合，切口用敷料包扎，术后肌内注射青霉素钠4×105U预防感染（每天两次，共3天）；
实验组-2：将实施例2得到的致密骨基质修剪为合适的形态后修补1.5cm段的骨缺损，然后用生理盐水冲洗伤口后逐层缝合，切口用敷料包扎，术后肌内注射青霉素钠4×105U预防感染（每天两次，共3天）；
实验组-3：将实施例3得到的致密骨基质修剪为合适的形态后修补1.5cm段的骨缺损，然后用生理盐水冲洗伤口后逐层缝合，切口用敷料包扎，术后肌内注射青霉素钠4×105U预防感染（每天两次，共3天）；
实验组-4：将实施例4得到的致密骨基质修剪为合适的形态后修补1.5cm段的骨缺损，然后用生理盐水冲洗伤口后逐层缝合，切口用敷料包扎，术后肌内注射青霉素钠4×105U预防感染（每天两次，共3天）；
实验组-5：将实施例5得到的致密骨基质修剪为合适的形态后修补1.5cm段的骨缺损，然后用生理盐水冲洗伤口后逐层缝合，切口用敷料包扎，术后肌内注射青霉素钠4×105U预防感染（每天两次，共3天）；
实验组-6：将实施例6得到的致密骨基质修剪为合适的形态后修补1.5cm段的骨缺损，然后用生理盐水冲洗伤口后逐层缝合，切口用敷料包扎，术后肌内注射青霉素钠4×105U预防感染（每天两次，共3天）；
对照组：用生理盐水冲洗伤口后逐层缝合，切口用敷料包扎，术后肌内注射青霉素钠4×105U预防感染（每天两次，共3天）。
术后18周时，解剖动物并观察股骨形态。对照组动物可见骨缺损区生成骨痂，但骨缺损区仍无骨性连接，其内大部分仍然是由肉芽疤痕填充，骨缺损未愈合。实验组-1、实验组-2、实验组-3、实验组-4、实验组-5、实验组-6中，动物的骨缺损基本愈合。
实施例11、采用实施例7制备的致密骨基质修复关节骨折的动物实验
实验动物：健康成年新西兰白兔24只，体重3-4kg。
1、股骨内髁骨折模型的制备：新西兰白兔腹腔注射戊巴比妥钠(35mg/kg)全麻，于左侧股骨远端前侧沿髌韧带内侧做5cm纵形切口，暴露股骨远端，在距股骨远端5mm处由外下方向内上方，用骨刀凿开股骨内髁，制备股骨内髁骨折模型。
2、试验方法：随机抽签法分为实验组和对照组，实验组用实施例7制备的致密骨基质进行外形加工得到的骨钉固定，对照组用日本刚子牌可吸收螺钉固定。术后12、24周取骨钉及周围组织行组织学检测。
3、结果：术后两组动物均在2周完全愈合。病理切片显示：术后12周，炎性细胞数逐渐减少，纤维化较前明显，纤维边缘出现少许破骨细胞；术后24周，纤维层厚度减低，破骨细胞数明显增加，与宿主骨间发生骨桥连接。表明实施例7制备的骨基质加工形成的骨钉具有一定的诱导成骨作用，并无明显的免疫排斥反应。
实施例12、致密骨基质治疗股骨头坏死的动物实验
实验动物：健康成年新西兰白兔20只，体重3-4kg。
1、股骨头坏死动物模型的制备：新西兰白兔腹腔注射戊巴比妥钠(35mg/kg)全麻，无菌手术暴露左侧髋关节,切开关节囊显露股骨颈前上方,剪断圆韧带,脱出股骨头,于股骨颈前上方近关节缘处的骨皮,用直径300mm的钻头钻孔开窗,用刮匙向内侧刮除约50%的松质骨,用纱布团蘸取液氮,即刻填塞于骨腔冷冻,持续30秒钟,生理盐水复温，即制得股骨头坏死模型。
2、试验方法：随机抽签法分为实验组、对照组-1、对照组-2和对照组-3，三个实验组分别用实施例1制备的致密骨基质、实施例2制备的致密骨基质或实施例3制备的致密骨基质填充股骨头坏死处孔洞，对照组填充生理盐水。逐层缝合关节囊及各层，放回笼中分笼饲养，自然活动。术前肌注1次青霉素钠，术后肌注2次预防感染。术后4、8周两个时间组，取股骨头标本进行组织学检查。
3、结果：对照组股骨头缺损处骨组织愈合力差,缺损处基本由纤维组织填充；三个实验组术后4周时股骨头内纤维组织增生,有大量的软骨形成和成骨细胞增生明显,新骨形成多于对照组,8周时股骨头内填充区骨组织修复大部分已完成,充填区广泛分布相对较成熟的骨小梁。
Claims (10)
1.制备骨基质的方法，为方法甲或方法乙；
所述方法甲包括如下步骤：
（1）取离体的动物骨的骨干，使用表面活性剂溶液浸泡处理；
（2）使用碱溶液浸泡处理步骤（1）的产物；
（3）使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤（2）的产物；
（4）使用酸溶液浸泡处理步骤（3）的产物；
（5）使用碱溶液浸泡处理步骤（4）的产物；
（6）使用pH6.0-7.5的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤（5）的产物；
（7）将步骤（6）的产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到骨基质；
所述方法乙包括如下步骤：
①取离体的动物骨的骨干，使用表面活性剂溶液浸泡处理；
②使用碱溶液浸泡处理步骤①的产物；
③使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤②的产物；
④使用碱溶液浸泡处理步骤③的产物；
⑤使用pH6.0-7.5的辐照保护试剂溶液浸泡处理步骤④的产物；
⑥将步骤⑤的产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到骨基质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤（1）中：所述表面活性剂为TritonX-100、Tween-80或Tween-40；所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度为0.5-3g/100ml；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、1-168小时；
所述步骤①中：所述表面活性剂为TritonX-100、Tween-80或Tween-40；所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度为0.5-3g/100ml；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、1-168小时。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述步骤（2）中：所述碱溶液为碱性化合物溶液；所述碱性化合物为NaOH、KOH或Ca(OH)2；所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度为0.02-1M；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、30-180分钟；
所述步骤②中：所述碱溶液为碱性化合物溶液；所述碱性化合物为NaOH、KOH或Ca(OH)2；所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度为0.02-1M；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、30-180分钟。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：
所述步骤（3）中：所述表面活性剂为TritonX-100、Tween-80或Tween-40；所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度为0.5-3g/100ml；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、1-168小时；
所述步骤③中：所述表面活性剂为TritonX-100、Tween-80或Tween-40；所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度为0.5-3g/100ml；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、1-168小时。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：
所述步骤（4）中：所述酸溶液为酸性化合物溶液；所述酸性化合物溶液中，所述酸性化合物的浓度为1-8g/100ml；所述浸泡处理的条件为：4-25℃、18-26小时；
或
所述步骤（4）中：所述酸溶液为酸性化合物溶液；所述酸性化合物溶液中，所述酸性化合物的浓度为0.3-1g/100ml；所述浸泡处理的条件为：10-20℃、18-26小时。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：
所述步骤（5）中：所述碱溶液为碱性化合物溶液；所述碱性化合物为NaOH、KOH或Ca(OH)2；所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度为0.02-1M；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、30-180分钟；
所述步骤④中：所述碱溶液为碱性化合物溶液；所述碱性化合物为NaOH、KOH或Ca(OH)2；所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度为0.02-1M；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、30-180分钟。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于：
所述步骤（6）中：所述辐照保护试剂为芦丁；所述辐照保护试剂溶液中，所述辐照保护试剂的浓度为0.01-0.5g/100ml；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、1-5小时；
所述步骤⑤中：所述辐照保护试剂为芦丁；所述辐照保护试剂溶液中，所述辐照保护试剂的浓度为0.01-0.5g/100ml；所述浸泡处理的条件为：0-25℃、1-5小时。
8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：所述灭菌为钴-60辐射灭菌。
9.如权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于：所述所述动物为牛或猪。
10.权利要求1至9中任一所述方法制备得到的骨基质。
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