KR101151358B1 - 실크 및 콜라겐을 포함하는 복합 지지체 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 실시예들은 조직을 대체하거나 조직 재생을 유도하는 생분해성의 지지체 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 적어도 하나의 직조된 실크 튜브층 및 튜브 내부의 콜라겐층을 포함하는 구조를 형성함으로써, 조직 재생 및 기계적 물성 측면에서 우수할 뿐만 아니라, 이식 후 면역반응을 거의 일으키지 않아 인대 및 건의 재생, 근육손상시 근육 재건을 위한 기질로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

실크 및 콜라겐을 포함하는 복합 지지체 및 그 제조방법{Composite Scaffold Containing Silk and Collagen and Preparation Method Thereof}

본 발명은 조직을 대체하거나 조직 재생을 유도하는 생분해성의 지지체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

미국에서는 해마다 130,000명 이상의 손상된 인대 치료에 약 50억불이 지출되고 있다. 축구, 핸드볼 그리고 아이스하키 등 다양한 스포츠의 보급이 늘어남에 따라 인대손상 환자도 늘어났으며, 유럽에서는 인대손상환자의 75%가 전방십자인대의 물리치료 또는 외과적인 수술이 필요하였다.

손상된 인대 및 건 재건을 위해서 일반적으로 이종이식, 동종이식, 그리고 자가이식 등의 방법이 사용되고 있다.

이종이식은 소의 인대를 약물처리하여 세포를 제거한 후 이식하는 방법으로 삼출물의 발생, 이식 실패, 그리고 활막염 등을 유발하여 미국 식품 의약품 안전관리국 (Food and Drug Administration; FDA)의 허가를 받지 못했다.

또한 타인의 인대를 얼려 세포를 제거한 후 이식하는 동종이식은 면역거부반응, 인대 조직 재생의 저해, 질병의 감염, 그리고 기증자의 부족 등의 문제점을 갖고 있다.

가장 일반적인 치료법은 본인의 슬개건 (patella tendon) 이나 반건양건 (semitendinous tendon)을 이식하는 자가 이식 방법인데 효과가 좋아 보편적인 인대 재건술에 이용되고 있다. 그러나 이 시술법 또한 공여부의 동통, 근육 위축, 그리고 장기간의 재활을 필요로 하는 문제점이 있다.

상기 생물학적인 이식물을 대체하고자 비분해성 인공 합성 인대의 개발이 이루어져 오고 있는데, 다양한 종류의 인공 인대가 개발되어 시술되었으나 15년간의 시술 후 경과를 보면 40?78%의 재파열과 이완, 염증등의 부작용이 발생하고 있다. 이는 골 또는 꼬아진 실 사이의 마모에 대한 낮은 저항성, 굴곡과 비틀림으로 인한 축방향 쪼개짐, 그리고 다른 조직의 침윤으로 인한 구조적인 변화 등 때문이라고 알려져 있다.

이러한 단점을 보완하기 위해 생체 친화성 물질인 실크를 이용하여 인대를 재생하기 위한 연구가 시작되었다. 실크는 누에(Boombyx mori, Linne 종)에서 뽑아낸 것으로 세리신(sericin)을 제거하는 공정을 거치면 콜라겐과 같이 체내에서 면역반응이 매우 약하게 일어나 생체재료로서 적합하다. 이는 체내에서 6개월 정도 지나면 분해되기 시작하여 1년 후에는 인장강도를 상실하며 2년 이내에 완전히 분해된다.

따라서 본 발명의 발명자들은 이식시 우려되는 면역반응을 줄이고, 생체조직과 좀더 유사하면서 조직친화성 및 물성이 우수한 조직 재생유도용 생분해성 지지체를 개발하기 위해 연구한 결과, 실크를 튜브형으로 직조하여 내부에 콜라겐을 주입시킨 지지체가 물성면에서 우수하고 이식 후 면역반응을 실질적으로 일으키지 않음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 물성이 우수하고 이식 후 면역반응을 실질적으로 일으키지 않는 생분해성 지지체를 제공하고자 한다.

본 발명의 실시예들은 상기 과제를 해결하기 위하여

적어도 하나의 직조된 실크 튜브층 및 튜브층 내부의 콜라겐층을 포함하는 복합 지지체를 제공한다.

또한 본 발명의 실시예들은,

직조기로 적어도 하나의 실크튜브층을 형성하는 단계;

상기 실크튜브층의 세리신을 제거하는 단계;

세리신이 제거된 실크튜브층 내부에 콜라겐 또는 콜라겐과 히아루론산 및 글리코사미노글리칸으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혼합물을 주입한 후 동결건조하여 콜라겐층을 형성하는 단계; 및

가교결합하는 단계를 포함하는 복합 지지체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 실시예들에 따른 복합 지지체는 생분해가 가능하여 부가적인 제거수술이 필요하지 않고, 조직 재생 및 기계적 물성 측면에서 우수할 뿐만 아니라, 이식 후 면역반응을 실질적으로 일으키지 않아 인대 및 건의 재생, 근육손상시 근육 재건을 위한 기질로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 실시예 1의 복합 지지체의 외형 사진이다.
도 2는 실시에 2의 이식 과정에 관한 사진이다.
도 3은 실시예 2의 H/E 염색 사진이다. a, b는 실시예 1의 복합 지지체가 이식된 모델, c, d는 제조예 1의 실크 튜브 외부에 콜라겐 용액이 코팅된 지지체가 이식된 모델이다.
도 4는 실시예 3의 이식 과정에 대한 사진이다.
도 5는 실시예 3의 각각의 모델에 대한 H/E 염색 사진이다. a: 아무 코팅이 이루어지지 않은 실시예 1의 복합 지지체, b: 표면이 하이드록시아파타이트로 코팅된 복합 지지체, c: 표면이 BMP로 코팅된 복합 지지체, d: 하이드록시아파트이트 및 BMP로 코팅된 복합 지지체
도 6은 실시예 4의 이식 과정에 대한 사진이다.
도 7은 실시예 4의 각각의 모델에 대한 H/E 염색 사진이다. a, b, c 는 이식 2주 후 결과(40배 확대)이며, d, e, f 는 이식 8주 후 결과(100배 확대)이다.
a, d: 실크 튜브만으로 이루어진 지지체가 이식된 군
b, e: 실시예 1의 복합 지지체가 이식된 군
c, f: 실시예 1의 복합 지지체를 이식한 후 양막으로 이식부위를 감싸고 봉합사로 봉합하여 차폐층을 형성한 군
도 8은 실시예 5의 이식 과정에 대한 사진이다.
도 9는 실시예 5의 이식 모델에 대한 H/E 염색 사진이다.

본 발명의 실시예들은 적어도 하나의 직조된 실크 튜브층 및 튜브층 내부의 콜라겐층을 포함하는 복합 지지체를 제공한다.

본 발명의 발명자들은 생체 친화성이 우수한 실크와 콜라겐을 이용하여 물성이 우수한 지지체를 만들고자 하였는데, 콜라겐을 실크와 단순 혼합하여 제조하는 방법으로 제조된 지지체는 이식시 콜라겐이 유실되고, 물성도 감소하는 문제점이 존재하였다. 이에 이러한 문제를 해결하기 위해 다양한 구조를 연구하던 중, 실크를 튜브형으로 직조하여 내부에 콜라겐을 주입시킨 지지체가 물성이 우수하고 세포 증식도 잘 이루어지며, 이식 후 면역반응을 실질적으로 일으키지 않음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 면역반응을 실질적으로 일으키지 않는다 함은 이식 후 통상의 기간동안 항생제 투여 한 후에 별도의 염증반응, 삼출물 등이 발견되지 않고, 골과의 생착이 잘 이루어짐을 의미한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 실크 튜브층은 실크사를 튜브형태로 직조하여 제조할 수 있으며, 필요에 따라 하나 이상의 실크 튜브층을 겹쳐 사용할 수 있다.

실크 튜브층의 수는 사용 태양에 따라 임의 선택 가능하나, 보통 1 내지 4개 또는 2 내지 3개를 사용하는 것이 좋다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 실크 튜브 한 층의 두께는 1 내지 2mm가 적당하다.

실크는 천연물질이므로 현재도 외과수술 후 봉합용 실로 사용되는 등 부작용이 없고, 인체에 접합되었을 때 콜라겐 등의 분비를 촉진하고 연골세포에 거부감 없이 쉽게 부착되는 특성이 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 실크 튜브층은 세리신이 제거된 실크 튜브층을 사용할 수 있다.

세리신은 누에고치에서 갓 뽑아낸 명주실에 묻어 있는 경단백질의 하나로 피브로인과 함께 누에고치 섬유를 구성하는 단백질이다. 세리신은 체내에 염증반응을 유발할 수 있으므로 이를 알칼리염으로 처리하여 제거하는 것이 좋다. 사용할 수 있는 알칼리염으로는 탄산나트륨(Na₂CO₃), 수산화나트륨(NaOH) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 실크 튜브층 말단에 하이드록시 아파타이트 및 골형성 단백질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 코팅할 수 있다.

하이드록시아파타이트(HAp)는 염기성 인산캄슘으로, 화학식은 Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂이다. 이는 인체의 뼈나 치아의 무기질 성분과 매우 유사하며, 생체독성이 없을 뿐 아니라 계면에 골유도를 촉진하기 때문에, 인공 이식물의 코팅재료로 널리 사용되고 있는 대표적인 생체재료이다.

이는 실크 튜브가 골과 접합하게 될 부분인 말단부분에 코팅되어 골세포의 활성을 촉진하고, 콜라겐과 결합하여 줄기세포의 골세포 분화를 촉진시킨다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 하이드록시아파타이트 입자는 1 내지 1000nm의 직경을 가질 수 있다.

골형성 단백질(bone morphogeneic protein, BMP)은 골접합 부위에 골융합을 촉진하기 위해 사용되는 것으로, 일예로 BMP-2 또는 BMP-12가 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 직조된 실크 튜브층 외부에 차폐층을 추가로 포함할 수 있다.

차폐층은 인대 및 건 외의 다른 연조직 세포의 침입을 억제하는 기능을 하며, 일반적으로 다른 연조직 세포의 침입을 억제할 수 있는 것을 사용할 수 있다. 구체적으로는 이에 제한되는 것은 아니나 양막, 소장점막하조직막, 콜라겐막 및 젤라틴막 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있으며 두께는 0.5 내지 1mm가 적당하다.

본 발명의 한 구체예에서, 실크 튜브층 내부의 콜라겐층은 다공성으로 세포의 부착, 이동 및 증식을 촉진시키는 역할을 하며 콜라겐 단독 또는 콜라겐과 히아루론산 및 글리코사미노글리칸으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혼합물을 포함할 수 있다.

상기 콜라겐은 불용성 콜라겐과 가용성 콜라겐 모두 사용 가능하며, 구체적으로는 이에 제한되는 것은 아니나 소와 같은 포유동물로부터 유래된 것, 경골어류의 피부와 같은 해양생물로부터 유래된 것 등을 사용할 수 있다.

상기 해양생물의 구체적인 예로는 무색소 피부를 갖는 어류, 보다 구체적으로는 서대, 문치가자미, 터봇, 브릴과 같은 가자미류 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구체예에서, 골분화의 촉진을 위해 상기 콜라겐에 히아루론산 및 글리코사미노글리칸으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 사용할 수 있다.

히아루론산은 n-아세틸글루코사민과 글로크론산이 서로 결합한 산성 뮤코다당의 일종으로 콘드로이틴황산 등과 함께 포유동물의 결합조직에 널리 분포되어 있다. 이는 결합조직 내에서 세포간극에 수분을 유지하며, 또 조직내에 젤상의 매트릭스를 형성해서 세포를 유지하고, 피부의 윤활성과 유연성을 갖게 하며, 외력 및 세균감염을 방지하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 상기 히아루론산은 분자량이 180 내지 350인 것이 적당하다.

글리코사미노글리칸은 콜라겐간에 가교 역할을 수행한다. 구체적으로 이에 제한되는 것은 아니나, 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 헤파란, 헤파란 설페이트 및 더마탄 설페이트 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 복합 지지체의 직경은 5 내지 10mm 또는 5 내지 7mm일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 복합 지지체는 인대, 근육 및 건 조직 치료용으로 사용될 수 있다.

본 발명의 실시예들은 또한 직조기로 적어도 하나의 실크튜브층을 형성하는 단계; 상기 실크튜브층의 세리신을 제거하는 단계; 세리신이 제거된 실크튜브층 내부에 콜라겐 또는 콜라겐과 히아루론산 및 글리코사미노글리칸으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혼합물을 주입한 후 동결건조하여 콜라겐층을 형성하는 단계; 및 가교결합하는 단계를 포함하는 복합 지지체의 제조방법을 제공한다.

이하 각 단계를 상세히 설명한다.

실크튜브층을 형성하는 단계에서는 실크사를 튜브형태로 직조기를 이용하여 제조하는 공정이 이루어진다. 실크튜브의 직경은 다양하게 제작될 수 있으며, 작은 지름의 실크튜브를 지름이 큰 실크튜브에 삽입시켜 다중층 구조의 실크튜브를 제조할 수 있다.

세리신을 제거하는 단계에서는 알칼리염과 상기 실크튜브층을 물에 넣고 3 내지 10시간, 5 내지 9시간 또는 6 내지 8시간 동안 끓이는 공정이 수행된다.

이 경우 알칼리염의 양은 0.01 내지 0.1M, 0.01 내지 0.07 또는 0.01 내지 0.05M이 적당하다. 상기 알칼리염으로는 구체적으로 이에 제한되는 것은 아니나 탄산나트륨(Na₂CO₃), 수산화나트륨(NaOH) 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 세리신을 제거하는 단계 이후에 하이드록시아파타이트 및 골형성 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나 이상을 코팅하는 단계가 추가로 이루어질 수 있다.

하이드록시아파타이트의 입자는 1 내지 1000nm의 직경을 갖는 것을 사용할 수 있고, 0.1 내지 1g/ml, 0.1 내지 0.5g/ml 또는 0.5 내지 0.2g/ml의 농도로 사용할 수 있다.

골형성 단백질은 가교시약에 0.1 내지 10㎍/ml, 0.1 내지 5㎍/ml 또는 0.1 내지 2㎍/ml의 골형성 단백질을 용해시켜 실크층 외부 말단에 100 내지 200ng/cm²의 농도로 코팅할 수 있다.

골형성 단백질은 BMP-2 또는 BMP-12가 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 가교시약은 디페닐포스포릴아자이드, 글루타르알데히드, 헥사메틸렌이소시아네이트, 석신이미드, 카보디이미드, 제니핀(Genipin) 및 포도씨추출물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

코팅방법은 표면에 물질을 입히기 위한 방법이면 무엇이든 사용될 수 있으며 구체적으로 이에 제한되는 것은 아니나 스프레이분사, 침강 후 건조법 등을 사용할 수 있다.

하이드록시아파타이트와 골형성 단백질을 함께 코팅하는 경우에는 골형성 단백질의 손실을 최소화하기 위해 먼저 나노하이드록시아파타이트를 코팅하고 2 내지 50℃, 2 내지 40℃ 또는 2 내지 25℃에서 24 내지 60시간, 30 내지 54시간 또는 36 내지 48시간 동안 건조한 후, 골형성 단백질을 코팅하고 상기와 동일 조건하에 건조하는 것이 좋다.

콜라겐 층을 형성하는 단계에서는 실크 튜브층 내부로 콜라겐의 주입이 이루어지게 된다. 상기 콜라겐은 콜라겐 단독으로 또는 콜라겐과 히아루론산 및 글리코사미노글리칸으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혼합물을 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 실크 튜브층을 형틀(실리콘튜브)에 넣고, 상기 콜라겐 단독 또는 혼합물을 주입하는 단계; -50 내지 -80℃에서 동결건조하는 단계를 통해 실크 튜브층 내부로 콜라겐이 도입된다.

보다 구체적으로, 혼합물이 사용되는 경우, 콜라겐을 0.1 내지 30mg/ml 또는 0.5 내지 20mg/ml의 농도로 산성용액에 용해시켜 겔상의 용액을 제조한 다음, 히아루론산 및 글리코사미노글리칸으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 실크 튜브층에 함께 주입하거나, 산성용액에 용해된 콜라겐을 먼저 주입하고 히아루론산 및 글리코사미노글리칸으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 따로 주입할 수도 있으며, 양 방법을 혼합하여 사용할 수도 있다.

이때 히아루론산은 0.1 내지 30mg/ml, 1 내지 20mg/ml 또는 7내지 20mg/ml을 첨가할 수 있고, 글리코사미노글리칸은 0.1 내지 20mg/ml, 1 내지 8 mg/ml 또는 3 내지 7mg/ml을 첨가할 수 있다.

상기 산성용액으로는 0.001 내지 0.01M 아세트산 또는 염산 수용액이 사용될 수 있다.

상기 주입과 동결건조단계는 필요에 따라 반복하여 수행될 수 있으며, 1 내지 6회 또는 3 내지 5회 정도 반복하는 것이 가능하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 가교결합은 물리적 또는 화학적으로 수행될 수 있으며, 물리적 가교결합의 경우에는 진공조건하에 100 내지 150℃ 또는 100 내지 130℃에서 24 내지 96시간, 36 내지 90시간 또는 60 내지 84시간 동안 열 건조 시키거나, 4 내지 25℃에서 5 내지 20W의 전력조건 하에서 2 내지 10시간 동안 UV조사하는 방법 등을 수행할 수 있다.

화학적 가교결합의 경우에는 4 내지 25℃에서 가교시약을 12 내지 24시간 처리하여 수행할 수 있다. 상기 가교시약은 디페닐포스포릴아자이드, 글루타르알데히드, 헥사메틸렌이소시아네이트, 석신이미드, 카보디이미드, 제니핀(genipin) 및 포도씨추출물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 가교결합하는 단계 이후에 차폐층을 형성하는 단계가 추가로 이루어질 수 있다.

차폐층은 인대 및 건 외의 다른 연조직 세포의 침입을 억제하는 기능을 하며, 일반적으로 다른 연조직 세포의 침입을 억제할 수 있는 것을 사용할 수 있다. 구체적으로는 이에 제한되는 것은 아니나 양막, 소장점막하조직막, 콜라겐막 및 젤라틴막 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.

본 발명의 또다른 구체예에서는 이미 제조된 막형태의 기질로 복합 지지체를 감싼 뒤 피브린글루로 접착시키는 방법으로 차폐층을 형성할 수 있다.

본 발명의 또다른 구체예에서는, 상기 가교결합이 이루어진 복합 지지체를 콜라젠용액, 히아루론산용액, 키토산용액, 알지네이트 용액, 폴리락트산(PLA)용액, 폴리글리콜산(PGA)용액 및 폴리카프로락탐(PCL)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 고분자 용액에 액침후 꺼내어 공기중에 건조시키는 방법으로 차폐층을 제조할 수 있다.

본 발명의 또다른 구체예에서는, 상기 가교결합이 이루어진 복합 지지체 위에 콜라젠용액, 히아루론산용액, 키토산용액, 알지네이트 용액, 폴리락트산(PLA)용액, 폴리글리콜산(PGA)용액 및 폴리카프로락탐(PCL)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 고분자 용액을 전기방사하여 막을 형성시키는 방법이 사용될 수 있다.

< 실시예 >

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 제조예 1> 실크튜브층의 제조

실크(Won Corporation, 한국)를 직조기를 이용하여 지름 2mm와 4mm의 튜브형태로 직조하였다. 그 후 작은 지름의 실크튜브를 큰 지름의 실크튜브에 삽입하여 이중관 실크튜브를 형성하였다.

그 후 세리신을 제거하기 위해 이를 0.02M Na₂CO₃용액에 넣고 100℃에서 8시간동안 처리하였다. 그 후 이를 0.3% 아이보리 세정제에 넣어 세정한 뒤, 3차증류수로 3일간 세척하고 4℃에서 건조시켜 세리신이 제거된 실크튜브층을 제조하였다.

< 실시예 1> 복합 지지체의 제조

아텔로 콜라겐(바이오랜드, 한국)을 0.05M 염산 수용액에 용해시켜 20mg/ml 의 겔상의 용액을 제조한 후, 20mg/ml의 콘드란틴 설페이트(sigma, 미국)를 상기 겔상의 용액 100중량부 대비 10중량부 첨가하여 콜라겐과 콘드란틴 설페이트의 혼합용액을 제조하였다.

상기 용액을 실시예 1에서 제조한 이중관 실크 튜브에 주입하였다. 이때 이중관 실크 튜브를 실리콘튜브(형틀)에 넣어 상기 혼합용액 주사한 뒤 -80℃에서 동결건조하였다.

상기 주사와 동결건조하는 단계를 4번 반복한 뒤, 마지막으로 20mg/ml 히아루론산(NovaMatrix, 노르웨이)을 주사한 뒤 -80℃에서 동결건조하였다. 그 후 카보디이마이드 가교시약에 넣어 20시간동안 가교결합을 실시한 뒤 세척후 동결건조하여 복합실크지지체를 완성하였다.

이후 10kGy의 감마조사(γ-irradiation)로 멸균하였고, 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다.

이의 구조를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 실크튜브층이 외부에 두 층 존재하고, 실크 튜브층 내부에 콜라겐 층이 존재함을 알 수 있다.

< 실시예 2> 복합 지지체의 동물 효능 평가

인대용 복합지지체의 동물 효능 평가를 위해 측부인대 손상 토끼를 사용하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 토끼의 슬개건 부위를 제거하고(a), 무릎의 측부인대를 제거한 뒤 2.5mm드릴을 이용하여 관절 융기(condyle) 부분에 터널굴착하였다(b). 형성된 터널에 'ㄷ'모양으로 제조예 1의 실크 튜브 외부에 콜라겐 용액이 코팅된 지지체 또는 본 발명의 복합 지지체를 삽입한 뒤(c), 최종적으로 'ㅁ'형태로 봉합하였다(d). 수술 후 약 10일간 항생제를 투여하였다.

이식 6개월 후, 제조예 1의 실크 튜브 외부에 콜라겐 용액이 코팅된 지지체와 본 발명의 복합 지지체의 이식 적합성을 확인하기 위해 측부손상 모델에 조직검사를 실시하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

제조예 1의 실크 튜브 외부에 콜라겐 용액이 코팅된 지지체 (c, d)와 상기 실시예 1의 복합 지지체(a, b) 모두 염증적 소견은 관찰되지 않았으며, 이식거부반응도 일어나지 않았다. 그러나 본 발명의 복합 지지체가 이식된 군(a, b)에서 골과의 생착이 더 잘 일어나고 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 3> 복합 지지체의 동물 효능 평가

인대용 복합지지체의 동물 효능 평가를 위해 측부인대 손상용 토끼를 사용하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 토끼의 피부만을 절개한 뒤 2.5mm드릴을 이용하여 관절 융기(condyle) 부분에 터널굴착하였고, 형성된 터널에 a) 아무 코팅이 이루어지지 않은 실시예 1의 복합 지지체, b) 표면이 하이드록시아파타이트로 코팅된 복합 지지체, c) 표면이 BMP로 코팅된 복합 지지체 또는 d) 하이드록시아파트이트 및 BMP로 코팅된 복합 지지체를 삽입하였다. 수술 후 약 10일간 항생제를 투여하였다.

이식 6개월 후, 골융합 정도를 관찰하였다.

결과를 도 5에 나타내었는데, 표면이 BMP로 코팅된 복합 지지체(c) 및 하이드록시아파트이트 및 BMP로 코팅된 복합 지지체(d)가 삽입된 군에서 좀 더 많은 칼슘침착이 관찰되었다.

< 실시예 4> 복합 지지체의 건재생 효능 평가

인대용 복합지지체의 건재생 효능 평가를 위하여 Achilles-tendon 손상 모델을 대상으로 하여 실험하였다.

도6에 나타낸 바와 같이, 인대용 복합지지체의 이식적합성 평가를 위하여 토끼 뒷다리의 Achilles-tendon을 약 15mm 제거하여 건결손모델을 형성하였다. 그 후 제거된 부위에 제조예 1의 실크 튜브만으로 이루어진 지지체 또는 실시예 1의 복합 지지체를 삽입하고 봉합사로 봉합한 뒤, 10일간 항생제를 투여하였다.

또한 실시예 1의 복합 지지체를 삽입한 모델 중 일부에는 이식 후 양막으로 이식부위를 감싸고 봉합사로 봉합하여 차폐층을 형성하였다.

그 후 조직검사를 수행한 결과를 도 7에 나타내었다.

a, b, c 는 이식 2주 후 결과(40배 확대)이며, d, e, f 는 이식 8주 후 결과(100배 확대)이다.

제조예 1의 실크 튜브만으로 이루어진 지지체가 이식된 군(a, d)에서는 약간의 염증적 소견이 관측되으나, 실시예 1의 복합 지지체가 이식된 군(b, e)에서는 염증반응이 관찰되지 않았고, 생착도 잘 이루어졌다. 또한 실시예 1의 복합 지지체를 이식한 후 양막으로 이식부위를 감싸고 봉합사로 봉합하여 차폐층을 형성한 군(c, f)에서도 조직의 생착과 재생이 잘 진행되고 있음을 확인하였다.

< 실시예 5> 복합 지지체의 건재생 효능 평가

손상된 전방십자인대의 재건을 위한 동물 효능 평가를 위해 개(dog)모델을 사용하였다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 슬개건 부위의 근육을 제거하고 무릎의 전방십자인대를 완전히 제거한 뒤(a), 2.5mm드릴을 사용하여 십자인대 위치에 터널굴착 하였다(b). 형성된 터널에 실시예 1의 인대용 지지체를 삽입한 뒤(c), 최종적으로 나사로 양쪽 터널입구를 고정하였다(d).

이후 세포이동과 골융합을 관찰하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 약간의 염증적 소견은 있으나 삼출물은 발견되지 않았으며, 골과의 생착이 잘 형성되고 있었다. 또한 이식 후 6개월에도 파열과 풀림현상이 없어 인대 재건이 잘 진행되고 있음을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

1. 실크사를 튜브형태로 직조한 적어도 하나의 실크 튜브층 및 튜브층 내부의 콜라겐층을 포함하는 복합 지지체
2. 제 1항에 있어서,
   상기 직조된 실크 튜브층의 두께는 1 내지 2mm인 복합 지지체.
3. 제1항에 있어서,
   상기 직조된 실크 튜브층은 세리신이 제거된 것인 복합 지지체.
4. 제1항에 있어서,
   상기 직조된 실크 튜브층 말단이 하이드록시 아파타이트 및 골형성 단백질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 코팅된 것인 복합 지지체.
5. 제1항에 있어서,
   상기 직조된 실크 튜브층 외부에 차폐층을 추가로 포함하는 복합 지지체.
6. 제5항에 있어서,
   상기 차폐층은 양막, 소장점막하조직막, 콜라겐막 및 젤라틴막으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 복합 지지체.
7. 제5항에 있어서,
   상기 차폐층의 두께는 0.5 내지 1mm 인 복합 지지체.
8. 제1항에 있어서,
   상기 콜라겐층은 콜라겐 또는 콜라겐과 히아루론산 및 글리코사미노글리칸으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혼합물을 포함하는 것인 복합 지지체.
9. 제1항에 있어서,
   상기 복합 지지체의 직경은 5 내지 10mm인 복합 지지체.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복합 지지체는 인대, 근육 및 건 조직 치료용인 복합 지지체.
11. 직조기로 실크사를 튜브형태로 직조한 적어도 하나의 실크튜브층을 형성하는 단계;
    상기 실크튜브층의 세리신을 제거하는 단계;
    세리신이 제거된 실크튜브층 내부에 콜라겐 또는 콜라겐과 히아루론산 및 글리코사미노글리칸으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 혼합물을 주입한 후 동결건조하여 콜라겐층을 형성하는 단계; 및
    가교결합하는 단계를 포함하는 복합 지지체의 제조방법
12. 제11항에 있어서,
    세리신을 제거하는 단계 후 하이드록시아파타이트 및 골형성 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나 이상을 코팅하는 단계를 추가로 더 포함하는 복합 지지체의 제조방법.
13. 제11항에 있어서,
    가교결합하는 단계 후 차폐층을 형성하는 단계를 추가로 더 포함하는 복합 지지체의 제조방법.
    

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