JP5015377B2 - アルデヒド及びグリコシダーゼ処理した軟組織及び骨組織異種移植片 - Google Patents
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Description
【０００１】
発明の分野
本発明は、欠陥のあるヒトの膝関節、心臓弁、及び骨の治療の分野に、特に、欠陥のある又は損傷したヒトの膝関節、心臓弁及び骨を、非ヒト動物に由来する実質的に免疫学的に適合性の軟組織又は骨を用いて置換し又は修復する分野に関係する。
【０００２】
発明の背景
軟組織
用語「軟組織」は、ここで用いる場合、軟骨性の構造例えば半月又は関節軟骨；靭帯例えば前部十字形靭帯；腱；及び心臓弁をいう。
【０００３】
１．半月軟骨軟組織
特に、大腿部顆は、軟骨性の内側及び外側半月軟組織を介して、脛骨の表面平坦域と関節をなし、これらの構造のすべては、様々な靭帯により適所に保持されている。内側及び外側半月は、繊維軟骨細胞と呼ばれる細胞及びコラーゲンと弾性繊維の細胞外マトリクス並びに様々なプロテオグリカンよりなる構造である。損傷してない半月は、適当な力の分配、安定化及び膝関節内の影響し合う骨表面の潤滑を確実にすることにより膝に対する衝撃の緩衝を与え、これらの半月は、日常的に、通常の活動において反復される圧力負荷にさらされている。内側及び外側半月の衝撃吸収機能の殆どは、軟骨に固有の弾性特性に由来する。半月が、外傷、病気又は炎症により損傷した場合には、膝関節内で関節炎の変化が起き、その結果としての機能の喪失が起きる。
【０００４】
成人の関節軟骨は、一度破壊されると、自然に有意の程度に再生しないので、損傷した成人の半月は、歴史的には、様々な外科的介入により処置されてきた。損傷した半月は、除去されて、補綴用デバイスで置換されてきた。堅いプラスチック製の大腿部部材と金属性の脛骨部材を有する人工膝関節が、米国特許第４，０３４，４１８号に開示されている。米国特許第４，３４４，１９３号及び第４，５０２，１６１号のような、弾力のある材料例えばシリコーンゴム又は天然のゴムを利用する幾つかの半月プロテーゼが考案された。半月プロテーゼ用の更なる変形可能な、可撓性の弾力のある材料例えばコラーゲン、腱又は繊維軟骨が、米国特許第５，０９２，８９４号及び米国特許第５，１７１，３２２号に開示されている。小さいボールベアリング又はゼラチン状の液体を満たしたポリエチレンプラスチックから作られた軟骨代替装置が、米国特許第５，３５８，５２５号に記載されている。しかしながら、公知の人工プロテーゼは、弾力性に乏しく、それ故、天然の半月の特性である衝撃吸収性に乏しいので、損傷を受けた半月の治療に関して不満足なものであった。その上、これらの公知の人工デバイスは、ごく普通の膝関節機能に内在する力に耐えられることが判明していない。
【０００５】
本願発明者の１人は、以前の幾つかの特許(米国特許第４，８８０，４２９号；米国特許第５，００７，９３４号；米国特許第５，１１６，３７４号及び米国特許第５，１５８，５７４号)において、補綴用半月を改良した。これらの特許は、一般に、処理した天然繊維例えば再構成した架橋コラーゲンの乾燥した、多孔性マトリクスから処方された補綴用半月(適宜、グリコサミノグリカン分子を含む)を開示している。一般に、これらの補綴用半月のためのコラーゲンの起源は、動物のアキレス腱又は皮膚であった。再構成工程は、非コラーゲン性材料例えば糖タンパク質、プロテオグリカン、脂質、ネイティブなグリコサミノグリカンなどを除去し、これは、元の組織に更なる弾力性を与えることができる。
【０００６】
２．関節軟骨軟組織
関節軟骨軟組織は、ヒト及び動物の関節を形成するすべての骨の末端を覆っている。関節軟骨は、繊維軟骨細胞及びコラーゲン繊維の細胞外マトリクス並びに様々なプロテオグリカンからできている。軟骨は、関節において、力を分配するための機構として及び骨間の接触領域における潤滑剤として作用する。関節軟骨がなければ、関節が容易に動かせない程の応力集中及び摩擦が起きるであろう。関節軟骨の喪失は、通常、痛みのある関節炎及び低下した関節運動を生じる。
【０００７】
損傷を受けた成人の関節軟骨は、歴史的には、修復、置換又は切除を含む様々な外科的介入によって処置されてきた。修復又は切除を用いる場合には、組織の再生が起こり得るが、通常、その組織は、一時的なものであって、通常の関節の力に耐えるのに不十分なものである。
【０００８】
関節軟骨の置換は、通常、同種異系移植(Sengupta等(1974)J.Bone Suro.56B(1):167-177；Rodrigo等(1978) Clin Orth.134:342-349)によるもの、骨膜移植(例えば、Engkvist(1979) Scan J.Plast.Reconstr.Suro.13:361-369；Rubak(1982) Acta Orthop.Scan.53:181-186参照)によるもの又は金属及び／若しくはプラスチック製部品を用いるもの(Rubash等編(1991) Clin.Orth.Rel.Res.271:2-96)であった。死んだ軟骨組織の同種異系移植は、数年間にわたって試みられたが、殆ど成功しなかった。このアプローチは、宿主の移植片に対する免疫学的応答、低温保存工程の失敗及び付着部位の失敗のために、長期間にわたって、部分的に成功しただけであった。全関節面の金属及びプラスチック製部品での置換は、年長の座りがちの患者については非常に成功したが、一般には、関節の動きの衝撃に対する耐性に関して不十分と考えられ、通常の関節機構を回復したことは示されていない。
【０００９】
別の従来技術のアプローチにおいては、関節軟骨は、骨及び／又は人工材料よりなるプロテーゼで置き換えられた。例えば、米国特許第４，６２７，８５３号は、脱ミネラル化した同種異系又は異種骨セグメントの置換物としての利用を記載している。これらの置換物の適当な機能は、骨セグメントの差次的脱ミネラル化に依存する。米国特許第４，８４６，８３５号は、関節軟骨の損傷の治癒を促進するために繊維軟骨細胞を移植するための移植技術を記載している。米国特許第４，６４２，１２０号は、胎児の繊維軟骨細胞を含むゲル様組成物の利用を記載している。米国特許第５，３０６，３１１号は、乾燥した、多孔性の容積マトリクスを含む、天然の関節軟骨と実質的に同じ外形をイン・ビボで有するように適合された補綴用関節軟骨を記載している。
【００１０】
これらの開発にもかかわらず、関節軟骨軟組織の永久的人工材料からなる構造物での置換は、一般に、満足できるものではなく、関節軟骨として適当であり且つ天然の再吸収性物質から構成された構造物は、開発されなかった。向き合う哺乳動物関節の関節軟骨は非常にもろいので、それは、摩耗性接合面に耐えないし、従来技術の人工軟骨の移植から結局生じるコンプライアンスの標準からの変化にも耐えないであろう。加えて、関節にかかる力は、体重の数倍であり、膝関節及び股関節の場合、それらが、典型的には、年間百万回以上かかる。今までは、従来技術の永久的人工軟骨は、天然の関節軟骨の特性を有する材料で作られなかったし、かかる日常的な力に耐えるのに十分なように確実に位置させることができなかった。
【００１１】
３．靱帯軟組織
膝の前部十字形靭帯(以後、ＡＣＬと呼ぶ)の軟組織は、すべてのたわみ位置における大腿骨からの脛骨の前部のずれに抵抗するように機能する。ＡＣＬは又、過伸展に抵抗し且つ完全に伸びた膝の内側及び外側脛骨回転中の回転安定性に寄与する。このＡＣＬは、固有受容感覚において役割を演じ得る。このＡＣＬは、細胞、水、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、エラスチン及び他の糖タンパク質よりなる結合組織構造からできている。Cyril Frank,M.D.等、Normal Ligament:Structure, Function, and Composition. Injury and Repair of the Musculoskeletal Soft Tissues, 2: 45-101。構造的には、ＡＣＬは、脛骨の顆間の隆起の前の凹部に付着し、外側大腿骨顆の内側壁まで後部上方に伸びる。
【００１２】
損傷したＡＣＬの好適な治療は、骨−靭帯−骨自家移植片を用いる靭帯再構成である。十字形靭帯再構成は、即時的安定性及び即時的な活発なリハビリテーションの潜在能力の利点を有する。しかしながら、ＡＣＬ再構成の不利益は、有意であり：例えば、正常な解剖学的構造は、膝蓋腱又は膝窩腱を再構成用に用いた場合には破壊され；靭帯の固定には、膝内にハードウェアを配置することを必要とし；そして前部膝の痛みが頻繁に起こる。その上、十字形靭帯再構成の最近の総説は、膝内ＡＣＬ再構成に伴う変性関節炎の増大した危険を患者の大きな群について示している。
【００１３】
ＡＣＬ傷害を治療する第２の方法は、「一次修復」と呼ばれ、裂けた構造を元の場所に縫合することを含む。一次ＡＣＬ修復は、限られた関節鏡アプローチ、正常の解剖学的構造の最小の破壊、及び局所麻酔下での外来患者用の手順という潜在的利点を有する。一次十字形靭帯修復の潜在的不利益は、長期間にわたって、ＡＣＬ修復は、十分な人数の患者において安定性を与えず、後日、第２の再構成を必要とし得るという理解である。前部十字形靭帯修復の成功率は、一般に、６０〜７０％の範囲をさまよっている。
【００１４】
４．心臓弁軟組織
心臓弁は、繊維軟骨細胞及びコラーゲンと弾性繊維の細胞外マトリクス並びに様々なプロテオグリカンからなっている。様々な合成及び組織ベースの材料(後者は、レシピエント生物又は同じ種の異なる生物に由来する)が、心臓弁置換物を形成するために用いられてきた。各々は、それらの利点及び不利益を有している。
【００１５】
合成の心臓弁の場合には、合成ポリマーのモノマー及び／又は反応条件を変えることにより、心臓弁の特性を有利に改変することが可能である。しかしながら、合成の心臓弁は、血栓塞栓症及び機構的故障と関係し得る。米国特許第４，７５５，５９３号を参照されたい。
【００１６】
組織ベースの心臓弁は、合成のものと比べて優れた血液接触特性を示し得る。しかしながら、組織ベースの心臓弁は、劣ったイン・ビボ安定性と関係し得る。米国特許第４，７５５，５９３号を参照されたい。
【００１７】
心膜異種移植片組織弁が、上記の合成及び組織ベースの弁の代わりとして導入された。Ionescu,M.I.等、Heart Valve Replacement With The Ionescu-Shiley Pericardial Xenograft, J.Thorac.Cardiovas.Surg.73:31-42(1977)を参照されたい。しかしながら、かかる弁は、石灰化及び耐久性の問題を有し続け得る。Morse,D,編、Guide To Prosthetic Heart Valves, Springer-Verlag, New York, 225-232(1985)を参照されたい。
【００１８】
従って、血液と接触させることができ且つイン・ビボで安定な機構的に耐久性で可撓性の心臓弁置換物に対する要求がある。
【００１９】
骨組織
ヒトの骨は、石化した礎質の細胞外マトリクスに埋められた細胞とコラーゲン繊維よりなる硬質結合組織(ステッドマン医学辞典、Williams & Wilkins, Baltimore, MD(1995))であって、ヒトにおいて最も頻繁に移植される組織である。J.M.Lane等、Current Approaches to Experimental Bone Grafting, 18 Orthopedic Clinics of North America(2)213(1987)。米国だけで、外傷、感染症、先天性奇形又は悪性腫瘍から生じた骨の欠損を修復し又は置換するために、毎年、１００，０００の骨移植が行われる。同書。
【００２０】
骨移植片及び移植物は、しばしば、自己由来の骨で形成される。同書。しかしながら、大きい欠損のための移植可能な自己の骨組織は、特に子供において、しばしば、入手不可能である。同書。加えて、自己の骨の移植は、手術後の病的状態例えば痛み、出血、傷の問題、化粧不具合、感染症又は神経障害をドナー部位に生じ得る。同書。更に、移植した自己の骨組織から所望の機能的形状を製作する困難さは、骨欠損の最適な充填より劣る充填を生じ得る。
【００２１】
異種移植片
元の軟組織又は骨組織の構造の殆ど及び特性の多くは、異種移植片即ち移植片レシピエントと異なる種に由来する軟組織又は骨組織の利用により、移植物において保持され得る。例えば、米国特許第４，４００，８３３号においては、ウシその他の動物に由来する腱又は靭帯が合成のメッシュに覆われて異種宿主に移植されている。平らな組織例えばブタの心膜も又、異種移植に適しているとして、米国特許第４，４００，８３３号に開示されている。人工心臓弁、血管移植片、火傷その他の傷用の包帯に適した生体材料に加工されたウシの腹膜が、米国特許第４，７５５，５９３号に開示されている。ウシ、ヒツジ又はブタの血管異種移植片が、ＷＯ８４／０３０３６に開示されている。
【００２２】
一度個体に移植されれば、異種移植片は、その異種移植片の慢性拒絶及び超急性拒絶等の免疫反応を引き起こす。特に、骨移植片は、免疫による拒絶に続いて、高率で、骨折、再吸収及び癒着不能を生じ得る。
【００２３】
用語「慢性拒絶」は、ここで用いる場合、個体における、その個体に移植された異種移植片に対する免疫反応をいう。典型的には、慢性拒絶は、異種移植片を受けた個体の血清中のＩｇＧ自然抗体と、その異種移植片の細胞上に発現されている炭水化物部分及び／又は細胞マトリクス及び／又は細胞成分との間の相互作用により媒介される。例えば、非霊長類哺乳動物(例えば、ブタ又はウシ起源)に由来する軟組織軟骨異種移植片のヒトへの移植は、主として、ヒトの血清中に存在するＩｇＧ抗Ｇａｌ自然抗体と異種移植片で発現されている炭水化物構造のＧａｌα１―３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ(α−ガラクトシル又はα−ｇａｌエピトープ)との間の相互作用により妨げられる。K.R. Stone等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chrnic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645(1997)；U.Galili 等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: II. Changes in anti-Gal response during chronic rejection, 63 Transplantation 646-651(1997)。慢性拒絶において、免疫系は、典型的には、異種移植片の移植から１〜２週間以内に応答する。
【００２４】
「慢性拒絶」と対照的に、「超急性拒絶」は、ここで用いる場合、個体における、その個体に移植された異種移植片に対する免疫反応であって、拒絶が、典型的に、その異種移植片を受けた個体の血清中に存在するＩｇＭ自然抗体と、細胞上で発現されている炭水化物部分との相互作用により媒介されるものをいう。この相互作用は、血管床の溶解及び血流の停止を受容個体において数分から２〜３時間以内に引き起こす補体系を活性化する。
【００２５】
用語「細胞外成分」は、ここで用いる場合、軟組織中に存在する任意の細胞外の水、コラーゲン及び弾性繊維、プロテオグリカン、フィブロネクチン、エラスチン、その他の糖タンパク質をいい；骨組織中に存在するミネラル化した基質、骨及びコラーゲン繊維をいう。ステッドマン医学辞典、Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1995)。
【００２６】
異種移植片材料を、レシピエントへの移植の前に化学的に処理して、免疫原性を低減させることができる。例えば、米国特許第４，７５５，５９３号に詳細に記載されているように、異種移植片を、その抗原性を低減させるために、グルタルアルデヒドを用いて架橋し又は「なめす」。他の薬剤例えば脂肪族及び芳香族ジアミン化合物は、コラーゲンポリペプチドのアスパラギン酸及びグルタミン酸の側鎖のカルボキシル基を介する更なる架橋を与えることができる。グルタルアルデヒド及びジアミンによるなめしは又、異種移植片組織の安定性をも増大させる。
【００２７】
異種移植片組織は又、移植の準備において、様々な物理的処理にかけることができる。例えば、米国特許第４，７５５，５９３号は、異種移植片を、引っ張ることにより機械的緊張にかけて、移植のための一層薄くて堅い生体材料を生成することを開示している。同種異系移植のための組織は、例えば米国特許第５，０７１，７４１号；同第５，１３１，８５０号；同第５，１６０，３１３号；及び同第５，１７１，６６０号に開示されているように、一般に、低温保存して、貯蔵中の細胞の生存力を最適化する。米国特許第５，０７１，７４１号は、組織の凍結が、細胞外又は細胞内の氷の結晶の形成及び浸透性脱水の故に、組織中の細胞に機械的損傷を引き起こすことを開示している。
【００２８】
発明の要約
本発明は、軟組織又は骨組織の修復又は置換を必要とするヒトへの移植のための実質的に非免疫原性の軟組織又は骨組織異種移植片を提供する。この発明は、更に、ヒトへの異種移植につき、減じた免疫原性を有するが、実質的に、自然の弾力性及び負荷支持能力を有する異種移植片軟組織又は骨組織の製造方法を提供する。
【００２９】
ここで用いる場合、用語「異種移植片」は、「異種間移植片」と同義語であって、一の動物種から他の一の動物種へ移植される移植片をいう。ステッドマン医学辞典、Williams & Wilkins, Baltimore, MD(1995)。
【００３０】
ここで用いる場合、用語「異種の」は、例えば、異種の軟組織又は骨組織のように用いるが、一の動物種から他の一の動物種へ移植された軟組織又は骨組織をいう。同書。
【００３１】
この発明の方法は、照射処理、１サイクル以上の凍結・解凍、化学架橋剤での処理、アルコールでの処理又はオゾン処理を、単独で又は組み合わせて含む。これらの方法に加えて又はこれらに代えて、この発明の方法は、細胞破壊処理、異種移植片の炭水化物部分のグリコシダーゼ消化又はプロテオグリカン涸渇因子での処理(プロテオグリカン涸渇因子処理は軟組織異種移植片のみ)を、任意の順序で、単独で又は組み合わせて含む。適宜、グリコシダーゼ消化又はプロテオグリカン涸渇因子処理の後に、更なる処理例えば異種移植片の炭水化物部分のキャッピング分子での処理を行うことができる。上記の一つ以上の処理ステップの後で、この発明の方法は、天然の軟組織又は骨組織と実質的に同じ機械的特性を有する異種移植片を与える。
【００３２】
ここで用いる場合、用語「細胞破壊」は、例えば、細胞破壊処理において用いるが、細胞を殺す処理をいう。
【００３３】
ここで用いる場合、用語「キャッピング分子」は、炭水化物鎖と結合して、異種移植片が、宿主の免疫系によってもはや外来物として認識されないようにする分子をいう。
【００３４】
ここで用いる場合、用語「キャップする」又は「キャッピング」は、キャッピング分子例えば炭水化物ユニットを炭水化物鎖の末端に結合させることをいい、例えば、炭水化物ユニットを、異種移植片の表面炭水化物部分に共有結合させる。
【００３５】
一具体例において、この発明は、ヒトへの移植のための、実質的に非免役原性の軟組織又は骨組織異種移植片を含む製造品を提供する。
【００３６】
他の具体例において、この発明は、ヒトへの移植のための、軟組織又は骨組織異種移植片の製造方法であって、非ヒト動物から軟組織又は骨組織の少なくとも一部分を取り出して異種移植片を準備し；その異種移植片を水及びアルコールで洗い；その異種移植片を紫外線照射への曝露、アルコールへの浸漬、オゾン処理及び凍結／解凍サイクルよりなる群から選択する少なくとも一つの処理にかけることを含み、それにより、その異種移植片が、天然の軟組織又は骨組織の対応する部分と実質的に同じ機械的特性を有する当該製造方法を提供する。
【００３７】
ここで用いる場合、用語「部分」は、例えば、軟組織、骨組織、第２の表面炭水化物部分又はプロテオグリカンの一部分において用いるが、異種移植片の各軟組織、骨組織、第２の表面炭水化物部分又はプロテオグリカンの全部又は全部より少ない部分をいう。
【００３８】
他の具体例において、この発明は、ヒトへの移植のための、軟組織又は骨組織異種移植片の製造方法であって、非ヒト動物から軟組織又は骨組織の少なくとも一部分を取り出して異種移植片を準備し；その異種移植片を水及びアルコールで洗い；その異種移植片を、細胞破壊処理にかけ；そしてその異種移植片をグリコシダーゼで消化して第１の表面炭水化物部分を除去することを含み、それにより、この異種移植片が、天然の軟組織又は骨組織の対応する部分と実質的に同じ特性を有する、当該製造方法を提供する。
【００３９】
ここで用いる場合、用語「第１の表面炭水化物部分」は、炭水化物鎖の非還元末端の末端α−ガラクトシル糖をいう。
【００４０】
更に別の具体例において、この方法は、更なるステップ例えば異種移植片の第２の表面炭水化物部分をキャッピング分子で処理して第２の表面炭水化物部分の少なくとも一部分をキャップし、それにより、異種移植片を実質的に非免疫原性にすることを含むことができる。
【００４１】
ここで用いる場合、用語「第２の表面炭水化物部分」は、炭水化物鎖の非還元末端のＮ−アセチルラクトサミン残基をいい、この残基は、自然においても又はα−ガラクトシルエピトープの開裂の結果としてもキャップされていない。
【００４２】
更に別の具体例において、この発明は、ヒトへの移植のための骨異種移植片の製造方法であって、非ヒト動物から骨の少なくとも一部分を取り出して異種移植片を準備し；その異種移植片を水及びアルコールで洗い；そしてその異種移植片を殺菌及び細胞破壊処理にかけることを含み、それにより、その異種移植片は、天然の骨の対応する部分と実質的に同じ特性を有し且つ実質的に非免疫原性になる当該製造方法を提供する。
【００４３】
更なる具体例において、この発明は、ヒトへの移植のための軟組織異種移植片の製造方法であって、非ヒト動物から軟組織の少なくとも一部分を取り出して異種移植片を準備し；その異種移植片を水及びアルコールで洗い；その異種移植片を細胞破壊処理にかけ；そしてその異種移植片をプロテオグリカン涸渇因子で消化してその異種移植片からプロテオグリカンの少なくとも一部分を除去することを含み、それにより、その異種移植片が、天然の軟組織の対応する部分と実質的に同じ機械的特性を有し且つ実質的に非免疫原性となる当該製造方法を提供する。
【００４４】
尚更なる具体例において、この発明は、ヒトへの移植のための軟組織又は骨組織からなる異種移植片の製造方法であって、非ヒト動物から軟組織又は骨組織の少なくとも一部分を取り出して異種移植片を準備し；その異種移植片を水及びアルコールで洗い；その異種移植片を細胞破壊処理にかけ；その異種移植片を約０．０１〜０．１０％の範囲のアルデヒドに曝露し；そしてその異種移植片をグリコシダーゼで消化してその異種移植片から第１の炭水化物部分を実質的に除去することを含み、それにより、その異種移植片が実質的に非免疫原性となり且つ天然の軟組織又は骨組織と実質的に同じ機械的特性を有する当該製造方法を提供する。
【００４５】
尚更なる具体例において、この発明は、上記のこの発明の方法の少なくとも１つにより製造した実質的に非免疫原性の軟組織又は骨組織異種移植片を含むヒトへの移植のための製造品を提供する。
【００４６】
他の具体例において、この発明は、非ヒト動物由来の軟組織又は骨組織の一部分を含むヒトへの移植のための軟組織又は骨組織異種移植片であって、その部分が、グリコシダーゼ消化を受けやすい表面炭水化物部分を実質的に有さず、それにより、その部分が、天然の軟組織又は骨組織の対応する部分と実質的に同じ機械的特性を有する上記の異種移植片を提供する。
【００４７】
更に別の具体例において、この発明は、非ヒト動物に由来する軟組織又は骨組織の一部分を含むヒトへの移植のための軟組織又は骨組織異種移植片であって、その部分が、細胞外成分及び実質的に死細胞のみを含み、これらの細胞外成分及び死細胞が実質的に表面α−ガラクトシル部分を有さず且つ表面炭水化物部分の少なくとも一部分に結合したキャッピング分子を有する上記の異種移植片を提供する。この軟組織又は骨組織の部分は、実質的に非免疫原性であり且つ天然の軟組織又は骨組織と実質的に同じ機械的特性を有する。
【００４８】
更なる具体例において、この発明は、ヒトへの移植のための骨異種移植片であって、非ヒト動物に由来する、無菌の、骨の細胞を破壊した部分を含み、それにより、その部分が、実質的に非免疫原性であり且つ天然の骨の対応する部分と実質的に同じ機械的特性を有する上記の骨異種移植片を提供する。
【００４９】
尚更なる具体例において、この発明は、非ヒト動物に由来する軟組織の少なくとも一部分を含むヒトへの移植のための軟組織異種移植片であって、その部分が、細胞外成分及び実質的に死細胞のみを含み、細胞外成分が減少されたプロテオグリカンを有する上記の軟組織異種移植片を提供する。この軟組織の部分は、実質的に非免疫原性であり且つ天然の軟組織と実質的に同じ機械的特性を有する。
【００５０】
尚更なる具体例において、この発明は、非ヒト動物に由来する軟組織又は骨組織の一部分を含むヒトへの移植のための軟組織及び骨組織よりなる異種移植片であって、その部分が、複数の細胞外成分、複数の実質的に死んだ細胞だけ、及び複数の細胞外成分、細胞外成分及びグリコシダーゼ消化を受けやすい表面炭水化物部分を実質的に有しない死細胞を架橋させる約０．０１〜０．１０％の範囲のアルデヒドを含み、それにより、その部分が実質的に非免疫原性になり且つ天然の軟組織又は骨組織の対応する部分と実質的に同じ機械的特性を有する上記の異種移植片を提供する。
【００５１】
好適具体例の詳細な説明
本発明は、ヒトへの移植に関する異種移植片の慢性拒絶に対するものである。従って、この発明の方法に従って生成された軟組織又は骨組織異種移植片は、実質的に非免疫原性であって、一般に、天然の軟組織又は骨組織の機械的特性を保持している。
【００５２】
軟組織又は骨組織は、処理中に幾らか収縮し得るが、この発明により製造した軟組織異種移植片は、天然の軟組織又は骨組織異種移植片の一般的外観を有する。例えば、この発明により製造した内側半月板異種移植片は、天然の内側半月板の一般的外観を有し、この発明の外側半月板異種移植片は、天然の外側半月板の一般的外観を有するであろう。この軟組織又は骨組織異種移植片は又、以下に示すように、セグメントに切って、その各々をレシピエントに移植することもできる。
【００５３】
この発明は、一具体例において、ヒトへの植付けのための異種の軟組織又は骨組織を製造し又は処理する方法を提供する。この軟組織又は骨組織は、任意の非ヒト動物から採取して、この発明の異種移植片を製造することができる。非ヒトトランスジェニック動物由来の又は遺伝的に変化させた非ヒト動物由来の軟組織又は骨組織も又、本発明による異種移植片として利用することができる。好ましくは、ウシ、ヒツジ又はブタの膝関節、一層好ましくはブタの膝関節は、これらの異種移植片の製造のために利用される内側及び外側半月並びに関節軟骨軟組織の源として役立ち得る。好ましくは、ウシ及びブタの関節、一層好ましくはブタの関節が、靭帯軟組織異種移植片の源として役立つ。好ましくは、ブタの腹膜が、心臓弁異種移植片を製造するために利用される軟組織の源として役立つ。或は、ブタの心膜を利用して、本発明の心臓弁異種移植片を形成することができる。好ましくは、ウシ、ヒツジ又はブタの骨が、一層好ましくはブタの骨が、これらの異種移植片を製造するために利用される骨の源として役立つ。一層好ましくは、未成熟の動物の関節は、若い動物の軟組織であればある程、本来的に、一層高齢の動物より一層弾力性で且つ植付け可能であるので、軟組織の源である。一層好ましくは、未成熟のブタ、ウシ又はヒツジの骨は、若い動物の骨であればある程、一層海綿状の骨からなり、一層高齢の動物の骨よりもろくないので、骨の源である。最も好ましくは、源の動物の齢は、屠殺時において、６〜１８月齢である。加えて、膝蓋腱、前部若しくは後部十字形靭帯、アキレス腱又は膝腱を、動物起源から採取して、ドナー靭帯として利用することができる。
【００５４】
この発明の方法の第１のステップにおいて、無傷の軟組織を非ヒト動物から取り出す。内側又は外側半月を、非ヒト動物の膝関節から取り出す。関節軟骨を、非ヒト動物の任意の関節から取り出す。靭帯及び腱例えばアキレス腱並びに無傷の骨部分も、非ヒト動物から取り出す。好ましくは、対応する関節に由来する軟組織を用いて、この発明の軟組織異種移植片を作成する。例えば、大腿骨−脛骨(膝)関節由来の関節軟骨を用いて、膝への移植のための関節軟骨異種移植片を作成する。同様に、ドナー動物の股関節由来の関節軟骨を用いて、ヒトの股関節のための関節軟骨異種移植片を作成する。
【００５５】
軟組織又は骨組織の源は、新鮮な屠殺された動物から採取すべきであり、好ましくは直ちに適当な無菌等張液その他の組織保存溶液中に入れる。軟組織及び骨組織の採取は、動物の屠殺後できるだけ早く行うべきであり、好ましくは、冷却下で即ち約５〜２０℃の範囲で行って軟組織及び骨組織の酵素による分解を最少にすべきである。
【００５６】
軟組織及び骨組織部分は、厳格な無菌技術下で冷却して採取する。
【００５７】
半月軟組織に関しては、最初に膝蓋腱を横に切開することにより、関節を切開する。半月の角から付着組織を切り離す。凡そ直径５ミリメートル、深さ５ミリメートルの実質的に円筒形のプラグを表す少量の骨が、これらの角に付着したままであってよい。半月の滑液連絡を注意深く同定し、半月組織自体から除き、それにより、異種移植片を作成する。
【００５８】
関節軟骨軟組織に関して、軟骨下の骨の小層を伴う関節軟骨の薄皮を、ドナーの関節から削り取って、異種移植片を作成する。
【００５９】
靱帯軟組織に関して、ドナーの関節を標準的な外科的技術により切開する。好ましくは、靱帯を、一端又は両端に付着した骨のブロックと共に採取する(もっとも、この発明の幾つかの形態においては、靱帯を単独で採取するが)。この発明の一形態において、約９〜１０ｍｍの直径で約２０〜４０ｍｍの長さの実質的に円筒状のプラグを表す骨のブロックが、靱帯に付着したままであってよい。この靱帯を注意深く同定して、付着組織を切り離し、それにより、異種移植片を作成する。
【００６０】
心臓弁軟組織に関しては、当業者に公知の手順により、ブタの腹膜又は心膜を採取して、心臓弁異種移植片を形成する。例えば、Laurenの米国特許第４，７５５，５９３号で検討している腹膜採取手順を参照されたい。
【００６１】
骨組織に関しては、採取した骨部分を、ストリップ又はブロックに切って、皮質骨に付着した海綿状骨を伴って又は伴わないで用意する。
【００６２】
この異種移植片を、次いで、約１０倍容の無菌冷水中で洗って、残留血液タンパク質及び水溶性物質を除去する。次いで、この異種移植片を、室温で約５分間アルコールに漬けて組織を殺菌し、非コラーゲン物質を除去する。
【００６３】
半月軟組織異種移植片は、上部側の主表面(上面)が全体に三日月形状で、底部側の主表面(下面)が全体に三日月形状の、Ｃ字形状の光沢のある繊維組織の外観を呈し、これらの上面及び下面の外側部分は外側側方表面により連結され、内側部分は内側側方表面により連結される。
【００６４】
膝関節軟組織異種移植片は、骨基質に支えられたガラス質組織の如き外観を呈し、先端側の主表面(上面)が全体に球形で、骨の下側の表面(下面)は粗くなっている。
【００６５】
アルコール浸漬の後に、異種移植片を、直ちに移植することもできるし、次の処理の少なくとも一つにかけることもできる：照射処理、アルコールでの処理、オゾン処理、一サイクル以上の凍結・解凍、及び／又は化学的架橋剤での処理。これらの処理の１つより多くを異種移植片に適用する場合には、それらの処理は、任意の順序で行うことができる。
【００６６】
この発明の方法の一具体例において、異種移植片を紫外線照射に約１５分間、又は約０．５〜３メガラドの量のガンマ線照射に曝露することにより処理することができる。
【００６７】
他の具体例において、異種移植片を、アルコール溶液中に再度置くことにより処理することができる。任意のアルコール溶液を用いて、この処理を行うことができる。好ましくは、異種移植片を、室温で、イソプロパノールの７０％溶液中に置く。
【００６８】
更に別の具体例においては、異種移植片を、オゾン処理にかけることができる。
この発明の方法の更なる具体例においては、異種移植片を、凍結／解凍サイクルにより処理することができる。例えば、異種移植片を、該異種移植片を完全に凍結させることができるならば即ち未凍結軟組織を含む内部温点を残さない限り、任意の凍結方法を用いて凍結させることができる。好ましくは、異種移植片を、液体窒素に約５分間浸して、この方法のこのステップを実施する。一層好ましくは、異種移植片を、冷凍庫中に置くことにより、ゆっくりと凍結させる。凍結／解凍サイクル処理の次のステップにおいて、異種移植片を、等張塩溶液に室温(約２５℃)で約１０分間浸すことにより解凍する。繊維の分解を最小にするために、外部熱源又は照射源は使用しない。
【００６９】
尚更なる具体例においては、異種移植片を、適宜、化学薬剤に曝露し、細胞外成分内のタンパク質をなめし又は架橋して、異種移植片中に存在する免疫原性の決定基を更に減少させることができる。任意のなめし剤又は架橋剤をこの処理のために用いることができ、完全な架橋を保証し、そうして、異種移植片の免疫原性を最適に減少させるために、一より多くの架橋ステップを実施し又は一より多くの架橋剤を用いることができる。例えば、アルデヒド例えばグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、アジピン酸ジアルデヒド等を用いて、この発明の方法により、異種移植片の細胞外コラーゲンを架橋することができる。他の適当な架橋剤には、脂肪族及び芳香族ジアミン、カルボジイミド、ジイソシアネート等が含まれる。
【００７０】
アルデヒド例えばグルタルアルデヒドを架橋剤として用いる場合には、異種移植片を、約０．００１〜５．０％(好ましくは、約０．０１〜５．０％)のグルタルアルデヒドを含む緩衝溶液(ｐＨ約７．４)中に置くことができる。一層好ましくは、約０．０１〜０．１０％の、最も好ましくは約０．０１〜０．０５％のアルデヒドを用いる。架橋反応の持続期間(１〜１４日間、好ましくは１〜５日間、最も好ましくは３〜５日間)中に溶液のｐＨにわたる制御を維持することが可能であれば、任意の適当な緩衝液例えばリン酸緩衝塩溶液又はトリスヒドロキシメチルアミノメタン等を用いることができる。
【００７１】
或は、異種移植片を、気化アルデヒド架橋剤例えば気化ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドを含む(但し、これらに限らない)蒸気形態の架橋剤に曝露することができる。気化架橋剤は、ある濃度及びｐＨを有することができ、異種移植片を、その気化架橋剤に、架橋反応を生じさせるのに適当な期間曝露することができる。例えば、異種移植片を、約０．００１〜５．０％の、好ましくは約０．０１〜５．０％の濃度及び約７．４のｐＨを有する気化架橋剤に曝露することができる。一層好ましくは、異種移植片を、約０．０１〜０．１０％の範囲のアルデヒドに、最も好ましくは、約０．０１〜０．０５％の範囲のアルデヒドに曝露することができる。異種移植片を、一定期間(１〜１４日間、好ましくは１〜５日間、最も好ましくは３〜５日間であってよい)にわたってアルデヒドに曝露する。気化架橋剤への曝露は、架橋剤曝露より減じた異種移植片中の化学剤を生じ得る。
【００７２】
架橋反応は、免疫原決定基が異種移植片軟組織から実質的に除去されるまで続けるべきであるが、異種移植片の機械的特性の有意の変化の前に終了すべきである。ジアミンも架橋剤として使用する場合には、如何なる未反応のジアミンもキャップされるように、グルタルアルデヒド架橋は、ジアミン架橋の後にすべきである。架橋反応が上記のように完了するまで進行した後に、異種移植片をすすいで残留化学薬剤を除去すべきであり、０．０１〜０．１０Ｍグリシン、好ましくは０．０１〜０．０５Ｍグリシンを加えて、残っている如何なる未反応のアルデヒド基をもキャップすることができる。
【００７３】
上記の処理に加えて又はそれらに代えて、異種移植片を細胞破壊処理にかけて、異種移植片の細胞を殺すことができる。適宜、この細胞破壊処理を、第一の表面炭水化物部分を異種移植片から除去するための異種移植片のグリコシダーゼによる消化の前又は後に行う。軟組織異種移植片に関しては、グリコシダーゼ処理に加えて又は該処理に代えて、グリコシダーゼ処理の前又は後に、軟組織をプロテオグリカン涸渇因子で処理する。更に、グリコシダーゼ及び／又はプロテオグリカン涸渇因子消化(後者は、軟組織異種移植片についてのみ行う)の後に、適宜、キャッピング分子例えばフコシル又はｎ−アセチルグルコサミン分枝の結合を行って、異種移植片の炭水化物鎖の表面Ｎ−アセチルラクトサミン末端をキャップする。
【００７４】
この発明のこの方法の具体例において、異種移植片を細胞破壊処理にかけて、軟組織又は骨組織の細胞を殺す。典型的には、表面炭水化物部分を生細胞及び細胞外成分から除去した後に、それらの生細胞は、表面炭水化物部分を再発現する。異種移植片の抗原性部分の再発現は、異種移植片の継続された免疫原性拒絶を誘発し得る。対照的に、死細胞は、表面炭水化物部分を再発現することができない。異種移植片の死細胞及び細胞外成分からの抗原性表面炭水化物部分の除去は、実質的に、永久的に、異種移植片の免疫原性拒絶の起源としての抗原性表面炭水化物部分を除去する。
【００７５】
従って、上記の具体例において、本発明の異種移植片を、上記のように、凍結／解凍サイクルにかけて、軟組織又は骨組織の細胞を破壊する(即ち、殺す)。或は、本発明の異種移植片を、０．２〜約３メガラドの量を有するガンマ線照射により処理する。かかる照射は、軟組織又は骨組織の細胞を殺し且つ異種移植片を殺菌する。一度殺せば、それらの軟組織又は骨組織の細胞は、もはや、移植された異種移植片の免疫原性拒絶における因子である抗原性の表面炭水化物部分例えばα−ｇａｌエピトープを再発現することはできない。
【００７６】
この発明の具体例においては、軟組織又は骨組織細胞を殺す前又は後の何れかにおいて、異種移植片を、グリコシダーゼ特にガラクトシダーゼ(例えば、α−ガラクトシダーゼ)によるイン・ビトロ消化にかけて、抗原性表面炭水化物部分を酵素的に除去する。特に、α−ｇａｌエピトープは、下記の反応に示したように、α−ガラクトシダーゼによる酵素処理によって除去される：
【化１】
Ｎ−アセチルラクトサミン残基は、普通にヒト及び哺乳動物細胞において発現されており、それ故、免疫原性でないエピトープである。異種移植片のグリコシダーゼによるイン・ビトロ消化は、様々な方法により達成することができる。例えば、異種移植片を、グリコシダーゼを含む緩衝溶液に浸し又は該溶液中でインキュベートすることができる。加えて、以下に更に記載するように、異種移植片に穴をあけて浸透性を増大させることができる。或は、グリコシダーゼを含む緩衝溶液を圧力下に、脈動灌注プロセスによって、異種移植片に押し込むことができる。
【００７７】
α−ｇａｌエピトープの異種移植片からの除去は、異種移植片に対する免疫拒絶を低減させる。α−ｇａｌエピトープは、非霊長類哺乳動物及び新世界猿(南米の猿)において、１×１０6〜３５×１０6エピトープ／細胞で発現され、並びに細胞外成分の巨大分子例えばプロテオグリカンにおいて発現される。U. Galili等、Man, apes, and Old World monkeys differ from other mammals in the expression of α-galactosyl epitopes on nucleated cells, 263 J.Biol.Chem.17755(1988)。しかしながら、このエピトープは、旧世界霊長類(アジア及びアフリカの猿、及び類人猿)及びヒトには存在しない。同上。抗Ｇａｌは、ヒト及び霊長類において、胃腸管内の細菌上のα−ｇａｌエピトープ炭水化物構造に対する免疫応答の結果として生成される。U. Galili等、Interaction between human natural anti-α-galactosyl immunoglobulin G and bacteria of the human flora, 56 Infect.Immun.1730(1988)；R.M. Hamadeh等、Human natural anti-Gal IgG regulates alternative complement pathway activation on bacterial surface, 89 J.Clin.Invest.1223(1992)。非霊長類哺乳動物はα−ｇａｌエピトープを生成するので、これらの哺乳動物から霊長類への異種移植片の異種移植は、異種移植片上のこれらのエピトープに結合する霊長類の抗Ｇａｌの故に、拒絶を生じる。この結合は、補体結合により及び抗体依存性の細胞障害性により、異種移植片の破壊を生じる。U. Galili等、Interaction of the natural anti-Gal antibody with α-galactosyl epitopes: A major obstacle for xenotransplantation in humans, 14 Immunology Today 480(1993)；M. Saandrin等、Anti-pig IgM antibodies in human serum react predominantly with Galα1-3Gal epitopes, 90 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 11391(1993)；H. Good等、Identification of carbohydrate structures which bind human anti-porcine antibodies: implications for discordant grafting in man. 24 Transplant.Proc.559(1992)；B.H. Collins等、Cardiac xenografts between primate species provide evidence for the importance of the α-galactosyl determinant in hyperacute rejection, 154 J.Immunol.5500(1995)。更に、異種移植は、増大された量の高親和性の抗Ｇａｌを産生する免疫系の主要な活性化を生じる。従って、異種移植片の細胞及び細胞外成分からのα−ｇａｌエピトープの実質的な除去及び細胞のα−ｇａｌエピトープの再生の阻止は、α−ｇａｌエピトープと結合する抗Ｇａｌ抗体と関連する異種移植片に対する免疫応答を低減させることができる。
【００７８】
更に、本発明の軟骨軟組織異種移植片は、イン・ビトロでの、α−ｇａｌエピトープの酵素的除去に対して特によく研究されている。臓器その他の組織と対照的に、軟骨細胞外成分は、極めてゆっくりしたターンオーバーを受ける。その上、一度軟骨細胞即ち繊維軟骨細胞が殺されれば、これらの細胞は、上記のように、α−ｇａｌエピトープを再発現させることを阻止される。
【００７９】
加えて、軟組織又は骨組織異種移植片を、グリコシダーゼ処理の前又は該処理と同時にポリエチレングリコール(ＰＥＧ)で処理することができる。ＰＥＧは、酵素とコラーゲン(細胞外成分)に共有結合することによりグリコシダーゼに対するキャリアーとして作用する。更に、ＰＥＧ処理した異種移植片は、減少した免疫原性を有する。
【００８０】
軟組織異種移植片に関して、かかる組織細胞を殺す前又は殺した後に、この発明の具体例において、異種移植片を、一種以上の異なる種類のプロテオグリカン涸渇因子を用いて洗い又は消化する。このプロテオグリカン涸渇因子での処理は、グリコシダーゼ処理の前であっても後であってもよい。プロテオグリカン例えばグリコサミノグリカン(ＧＡＧ)は、本発明の異種移植片の細胞外成分内で、個々の分子として均一に又は変化する量で散在される。これらのＧＡＧは、ムコ多糖分子例えばコンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸、及びこれらの混合物を含む。ＧＡＧ等を含むプロテオグリカンは、付着された炭水化物例えばα−ｇａｌエピトープを含む。かかるエピトープは、上記のように、一度異種移植片が移植されれば、免疫応答を刺激する。異種移植片をプロテオグリカン涸渇因子で洗い又は消化することは、プロテオグリカン及び付着したα−ｇａｌエピトープの少なくとも一部分を異種移植片の細胞外成分から除去し、それにより、移植の際の異種移植片に対する免疫応答を低減させる。このプロテオグリカン涸渇因子処理及びそれに続く移植の後に、天然の組織は、残留コラーゲンシェルを再増殖させることができる。
【００８１】
本発明で用いるプロテオグリカン涸渇因子の非制限的例には、プロテオグリカン涸渇酵素例えばコンドロイチナーゼＡＢＣ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチンＡＣＩＩリアーゼ、ケラタナーゼ及びトリプシンが含まれる。
【００８２】
本発明で用いられる他のプロテオグリカン涸渇因子には、フィブロネクチンの断片が含まれる。Homanberg等は、フィブロネクチンの断片例えばアミノ末端の２９ｋＤａの断片が関節軟骨軟組織の外面に結合し、その軟骨を透過してそれらの軟骨細胞を取り囲むということを示唆している。G.A. Homandberg等、Fibronectin-fragment-induced cartilage chondrolysis is associated with release of catabolic cytokines, Biochem.J.(1997)321,751-757；G.A. Homandberg等、Hyaluronic acid suppresses fibronectin fragment mediated cartilage chondrolysis: I. In vitro, Osteoarthritis and Cartilage(1997)5, 309-319；G.A.Homandberg等、High concentrations of fibronectin fragments cause short- term catabolic effects in cartilage tissue while lower concentrations cause continuous anabolic effects, Archives Of Biochemistry And Biophysics, Vol. 311, No. 2, June, p.213-218(1994)；G.A. Homandberg等、Agents that block fibronectin fragment-mediated cartilage damage also promote repair, Inflammation Research 46(1997)467-471。選択した濃度において、Homandberg等は、更に、かかるフィブロネクチンの軟骨への添加が、イン・ビトロ又はイン・ビボにおいて、プロテオグリカン合成の一時的な抑制及び細胞外メタロプロテイナーゼの増強を生じ、これは更にプロテオグリカンの軟骨組織からの迅速な消失を引き起こすということを示唆している。同上。
【００８３】
しかしながら、他の当業者に公知のプロテオグリカン涸渇因子も又、本発明で利用することができる。本発明の異種移植片を、プロテオグリカンの少なくとも一部分を異種移植片の細胞外成分から除去するのに有効な量のプロテオグリカン涸渇因子で処理する。好ましくは、異種移植片を、約１．０〜１００．０ＴＲＵ／ｍｌの量のヒアルロニダーゼ等のプロテオグリカン涸渇因子で、又は約０．０１〜２．０ｕ／ｍｌ(最も好ましくは、約１．０〜２．０ｕ／ｍｌ)の量のコンドロイチナーゼＡＢＣ等のプロテオグリカン涸渇因子で処理する。この異種移植片は又、約０．０１〜１．０μＭ(好ましくは、約０．１〜１．０μＭ)の量のプロテオグリカン涸渇因子例えばフィブロネクチン断片(例えば、アミノ末端の２９ｋＤａのフィブロネクチン断片)で処理することもできる。
【００８４】
グリコシダーゼ処理又はプロテオグリカン涸渇因子処理(後者は、軟組織異種移植片についてだけ行う)の後に、異種移植片の残留炭水化物鎖(例えば、グリコサミノグリカン)を、適宜、キャッピング分子で処理して残留炭水化物鎖の少なくとも一部分をキャップする。しかしながら、キャッピング分子での処理は、グリコシダーゼ処理した異種移植片とグリコシダーゼ処理してない異種移植片の両方に適用可能である。例えば、α−ｇａｌエピトープを欠くであろうノックアウト動物由来の異種移植片を、キャッピング分子で処理して異種移植片上の炭水化物部分をキャップし、それにより、その異種移植片の免疫原性を低減させることができる。本発明で用いるキャッピング分子の例には、フコシル及びＮ−アセチルグルコサミンが含まれる。
【００８５】
処理の前に、異種移植片の外面(例えば、半月軟組織異種移植片の外側面)に、適宜、穴を開けて、使用する薬剤に対する透過性を増大させて、その異種移植片を実質的に非免疫原性にすることができる。無菌の外科用針例えば１８ゲージの針を用いて、この穴あけステップを行うことができ、或は、複数の針を有する櫛様器具を用いることもできる。この穴あけは、異種移植片の内部への所望の進入路を確立するために、様々なパターンで、又、様々な穴間距離で行うことができる。穴あけは又、レーザーを用いて行うこともできる。この発明の一形態においては、約３ミリメートル離れた一本以上の刺し穴の直線を、異種移植片の外側面の周囲に設ける。
【００８６】
移植の前に、この発明の軟組織又は骨組織異種移植片を、タンパク質分解酵素例えばフィシン若しくはトリプシンによる限定的消化により処理して、組織の柔軟性を増大させ、又は抗石灰化剤、抗血栓コーティング、抗生物質、成長因子、若しくは他の異種移植片のレシピエントの関節への組込みを促進させ得る薬物で被覆することができる。この発明の軟組織異種移植片を、更に、公知の方法例えば更なるグルタルアルデヒド若しくはホルムアルデヒドでの処理、エチレンオキサイド殺菌、プロピレンオキサイド殺菌等を用いて殺菌することができる。この異種移植片を、用いる必要が生じるまで、凍結して保存することができる。
【００８７】
更に、この発明の骨異種移植片を、軟組織細胞の骨組織フォーマーへの変換を刺激するのに十分な量の骨誘導因子で処理することができる。別法として又は加えて、骨誘導因子を、直接、標的の欠損に対して投与することができる。ここで用いる場合、用語「骨誘導因子」は、未決定結合組織細胞の骨形成細胞への分化を刺激するタンパク質をいう。J.M. Lane等、Current Approaches to Experimental Bone Grafting, 18 Orthopedic Clinics of North America(2)214(1987)。
【００８８】
移植片に対する又は標的の欠損に対する骨誘導因子を調製して投与する方法は、Sharon Stevenson, D.V.M., Ph.D.等、The Effect of Osteogenic (A Bone Morphogenetic Prtein) on the Formation of Bone in Orthotopic Segmental Defects in Rats, 76, A. The Journal of Bone And Joint Surgery No. 11, 1676-1687 (1994)及びJohn E. Feighan等、Induction of None by a Demineralized Bone Matrix Gel: A Study in a Rat Femoral Defect Model, 13 Journal of Orthopaedic Research 881-889 (1995)等の従来技術において公知である。例えば、合成キャリアー例えばヒドロキシアパタイトセラミック円筒の存在下で又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)又はグリセロール等のキャリアー、又は緩衝液例えばホスフェート、及び／又は上記の任意の組合せを用いて、ゲル形態の骨誘導因子を欠損部位に投与し及び／又は異種移植片を浸すことができる。
【００８９】
骨誘導因子を、異種移植片の間隙及び／又は欠損部位に、骨形成を誘導するのに有効な量で加える。例えば、約１０〜２００ｍｇの投与量の骨誘導因子を加えることができる。本発明で用いることのできる骨誘導因子の例には、骨形態形成タンパク質(ＢＭＰ)及び関連非コラーゲン様タンパク質(ＮＣＰ)が含まれる。かかる骨誘導因子は、例えば、マサチューセッツ、Hopkington, Creative Biomolecules, Inc.から市販されている。
【００９０】
この発明の骨異種移植片も又、その異種移植片の細胞外マトリクスからカルシウム等のミネラルを実質的に除去するのに有効な量の脱ミネラル化剤で処理することができる。例えば、この発明の異種移植片を、脱ミネラル化剤例えば塩酸及び他の当業者に公知の脱ミネラル化剤を、予め決めた濃度で含む溶液に浸して、この発明の異種移植片を実質的に脱ミネラル化することができる。一度ミネラルが異種移植片から除去されれば、約５０〜５００ミクロンの寸法の細孔を有する多孔性の容積マトリクスが形成される。脱ミネラル化した細胞外骨マトリクスのコラーゲンは骨伝導性足場として役立ち、一度骨移植片が移植されれば、骨形成成分の移動を容易にするということが、理論化されている。J.M. Lane等、Current Approaches to Experiment Bone Grafting, 18 Orthopedic Clinics of North America (2)220(1987)。脱ミネラル化した骨は、骨のミネラルが骨誘導因子の細胞外骨マトリクスからの放出を妨げるので、例えば自己の骨より一層大きい骨誘導活性を有するということが、更に、理論化されている。同書、２１８。この理論によれば、脱ミネラル化は、周囲の応答性の細胞の骨誘導タンパク質への接近を大きくし、骨誘導タンパク質の潜在能力を増大させる。かかる脱ミネラル化剤は、例えば、ミズーリ、St.Louis, Sigma, Inc.から市販されている。
【００９１】
加えて、結合剤を本発明の骨異種移植片に加えることができる。ここで用いる場合、結合剤は、接着分子、又は接着性タンパク質若しくはその類似体であり、これは、骨形成細胞が付着することのできる粘着面を与えることにより骨の形成を助成する。この結合剤を、間充織及び他の分化した骨形成細胞の骨異種移植片の細胞外マトリクスへの付着を促進するのに有効な量で加える。本発明において有用な結合剤の例には、骨セメント；フィブリングルー；イガイグルー、幾つかのイガイ属ミチルス種から得られた生物粘着性ポリフェノールタンパク質を含むイガイグルー(例えば、米国特許第４，５８５，５８５号参照)；コンドロネクチン；オステオネクチン；並びにフィブロネクチン及びアルギニン−グリシン−アスパラギン酸(ＲＧＤ)ペプチド(例えば、米国特許第５，６８１，３５３号参照)(一部分は、例えば、コンドロイチン硫酸に結合することができる)、並びに当業者に公知の他の結合剤が含まれる。かかる結合剤は、例えば、カリフォルニア、San Diego, Telios Pharmaceuticals, Inc.から市販されている。
【００９２】
この発明の軟組織若しくは骨組織異種移植片又はそのセグメントは、当業者により、公知の関節鏡外科手術の技術を用いて、損傷を受けたヒトの関節に移植することができる。関節鏡技術を実施するための特殊な器具は、当業者に公知であり、軟組織移植物の正確且つ再現可能な配置を確実にする。
【００９３】
半月軟骨軟組織異種移植片の移植
半月軟骨の置き換えの成功のためには、下記のゴールが、達成されるのが好ましい：
１．天然の半月軟骨の引き裂かれた断片は、除去しなければならない。
２．半月角の付着部位は、解剖学的位置になければならない。
３．半月移植物の周辺は、軸方向及び回転方向の負荷を許容するのに十分なだけ確実に結合されなければならない。
４．膝関節の周囲被膜及び靱帯は、過度に妨害されてはならず、また固定技術によって拘束されてもならない。以下に詳細に記載する半月の移植方法は、K.R. Stone等のArthroscopy:The Journal of Aryhroscopic and Related Surgery 9,234-237(1993)から誘導される。本発明の異種性半月異種移植片を使用するために他の半月移植法を使用することもできる。
【００９４】
最初に、公知の方法を使用して、膝関節の完全診断関節鏡検査法を実施する。もしもＡＣＬ外科手術を同時に実施しようとするならば、十字形再形成のための大腿骨及び脛骨トンネルを先ず穿孔すべきである。半月軟骨の断裂部分を測定する。もしも組織がひどく引裂かれ又は低品質のために半月修復を達成することができないならば、軟骨組織の断裂部分を除去することによって半月リムの調製を行う（図３）。ヒトの半月全体をこの発明の異種性半月異種移植片によって置き換えるべきときは、ヒトの半月の殆ど全部を除去する。加えて、ヒトの半月全体をこの発明の異種性半月異種移植片によって置き換えるためには、骨プラグを受け入れるためにヒト半月板角の切除及び骨のトンネルの調製が要求される場合がある。ヒトの半月の一部分だけをこの発明の異種性半月異種移植片の一部分によって置き換えるときには、損傷を受けた部分だけを除去し、異種性半月異種移植片の一部分の結合のための周辺リムや角は保存される。半月リムが全く存在しない場合には、半月の部分的置換は実施すべきでない。もしも関節が過度に固い場合には、関節伸延器を適用することができ、又は内側の側副靱帯を一部分離すことができる。
【００９５】
内側及び外側半月の交換では、関節鏡を中間外側又は前部外側門(portal)に挿入し、脛骨ガイドを後部内側門を通して挿入する。ガイドの先端をまず半月の後部角にもたらす。後部内側角は脛骨隆起の後部傾斜部に挿入されることに注意すべきである。ドリルピンを次に脛骨粗面の前部内側から後部角挿入部にもたらす（図４）。ピンの設置は関節鏡を顆間切痕を通して挿通し、ピンの出位置を見ることで確認できる。膝の後部被膜を通しての貫通を回避するために非常な用心をして神経血管束を傷つけないようにすべきである。ピン位置が確認されたら、ピンをつぎに４．５ｍｍカニューレ付きのドリルビットで（随意にドリルストップで後部被膜貫通を防止する）オーバー穿孔する（図５）。ビットは所定の位置に残され、縫合糸挿通子の通過のためのトンネルとして使用する。縫合糸はJohnson & Johnson社より市販の＃２Ｅｔｈｉｂｏｎｄ（商標）等がある。縫合糸はドリルビットの孔に通され、そしてドリルビットは除去され、そして縫合糸は所定位置に残される。
【００９６】
ヒトの前部内側半月の挿入点はかなり変動し、最も頻繁には内側脛骨隆起の前部に見いだされる。外側半月の前部角は前部十字形靱帯の後部に挿入される。前部ドリル穴はまず、外側半月の前部角の挿入点を同定し、ドリルガイドのチップを配置して相対的に垂直穴が形成されるようにする（図６）。ドリルピンを配置し、ついでカニューレを挿入したドリルビットを使用してドリルピン位置を越えてドリルし、後部ドリル穴を形成する。縫合糸挿通子を全部ドリル穴に配置する。別法として、内側半月の前部角を縫合アンカーによりドリル穴に対向して骨に直接固定する。
【００９７】
縫合糸が前部及び後部ドリル穴により捕捉されるまえに、前門が約２ｃｍに拡張される。縫合糸の捕捉子は次に拡張された門を通され、前部及び後部縫合糸は同時に引き出される。この技術は縫合糸が脂肪パッド及び被膜組織の２つの面で絡まないようにする。
【００９８】
移植片は今やフィールドにもたらされる。２つの水平マットレス縫合糸は例えば＃２−０Ｅｔｈｉｂｏｎｄ（商標）等であり、異種性半月移植片の各角を通され、その自由端は内部表面から出る（図７）。２本の後部縫合糸は次に膝を通して引かれ、後部脛骨トンネルを出る（図８）。もしも内側及び外側門からみると、後部外側門は移植片を内側に押して２．５ｃｍの切開を通して所定位置にもたらすためのプローブ挿入に使用できる。挿入カニューレは必要がない。前部縫合糸をついで同様に通過せしめられる。角縫合糸は次に前部脛骨骨ブリッジに渡り結ばれる。
【００９９】
次に、帯域特異的半月修復カニューレが所定位置にもたらされる。内側挿入のために、後部内側垂直切開が膝の背面から３分の１のところに形成されて、伏在静脈神経の保護がなされ、又、裏返した半月板修復針の回収の用意がされる。通常、第２の垂直切開が、前部内側関節鏡門に接して前部に更に必要であり、それにより前部に出る針を捕捉するようにする。これらの２つの切開部を通じて縫合針は捕捉でき、結び目は被膜の上に直接置かれる（図９）。
【０１００】
半月板修復針を使用するとき、まず垂直且つ均等に離間した縫合糸を有する後部カニューレを使用すべきである。修復は後部から前部に進行し、その結果異種移植片の内部に座屈が生じないようにする。各結び目は縫合糸の絡みを生じないようにそのまま結束される。結び目はほぼ４ｍｍの間隔にされる。膝は数個の完全な運動範囲でサイクルし、異種移植片の運動が円滑になるように保証する。
【０１０１】
外側半月の取り替えを行うときは、内側門が異種移植片の挿入に適当である。これには靱帯粘膜の切除と脂肪パッドの一部の除去が必要となろう。外側半月の後部角に対するドリルガイドが前部内側門を通して挿入される。外側脛骨棘の後部傾斜が、正確な半月角挿入のために同定されなければならない。前部角は前部十字形靱帯の外側に近接して外側脛骨棘の前部傾斜に挿入される。これらの穴を内側からあける利益は、トンネルの拡開が大きくなり、各角挿入体の間の大きい骨ブリッジを提供できることである。挿入技術の残りは同じであるが、後部角を縫合するときに神経血管束を注意深く保護すべきである。後部外側からの接近は、共通の腓骨神経を保護し、外側被膜を露出するために必要である。もしも縫合場所の疑問があれば、解放した後部角縫合は標準法に従って行うべきである。別法として、半月の及び／又は安定化装置例えば矢又は綴針などを使用することができる。Bionix, Inc., Malvern, PAにより製造されている安定化矢はかかる安定化矢の一例である。他の安定化装置は当業者に知られているものが使用できる。
【０１０２】
日常的な皮膚クロージャー及び手当て用品も使用できる。３０ｍｌの０．５％Ｍａｒｃａｉｎｅ（Astra社製）をエピネフリンと共に必要ならば注入できる。術後ヒンジ膝補強材を適用して屈伸の範囲を９０度、伸縮の範囲を３０度に限定することができる。
【０１０３】
関節軟骨軟組織異種移植片の移植
レシピエントの関節の下にある骨床を、骨バーを用いて準備して、海綿状の出血床を生成する。移植は、関節表面又は関節表面の一部分を含むことができる。この発明の実質的に非免疫原性の関節軟骨異種移植片をレシピエントの関節に覆いとして適用し、それを少なくとも一の縫い糸アンカー、吸収性のピン、スクリュー、ステープル等により適所に保持する。フィブリン血餅も又、実質的に非免疫原性の関節軟骨異種移植片を適所に保持するために利用することができる。
【０１０４】
靭帯軟組織異種移植片の移植
回復できないダメージを受けた靭帯は、外科用シェーバーを用いて除去する。この靭帯の解剖学的挿入部位を同定し、穴をあけて骨プラグを適応させる。この骨プラグの大きさは、幅約９〜１０ｍｍ、深さ約９〜１０ｍｍ、長さ約２０〜４０ｍｍであってよい。この異種靭帯を、ドリル穴を通して運び、干渉スクリューを用いて固定する。日常的閉鎖を行う。
【０１０５】
この発明を、更に、下記の実施例により説明するが、これは、制限と解するべきではない。この出願中で引用されるすべての参考文献並びに公開された特許及び特許出願の内容を、本明細書中に参考として援用する。
【０１０６】
心臓弁軟組織異種移植片の移植
この発明の心臓弁異種移植片又はそのセグメントは、ブタの腹膜又は心膜から形成することができ、損傷を受けた心臓弁を置換し及び／又は修復することができる。かかる技術は、移植物の正確且つ再現性のある配置を保証する特殊な器具を用いて実施され、該器具は、当業者に公知である。
【０１０７】
骨組織異種移植片の移植
この発明の骨異種移植片又はそのセグメントは、損傷を受けたヒト関節に、当業者により、公知の関節鏡外科技術を用いて移植することができる。骨の穴に、標準的外科技術により、手作業で、骨を詰める。外科技術を実施するための特殊な器具は、骨移植物の正確且つ再現性のある配置を確実にし、該器具は、当業者に公知である。
【０１０８】
実施例１：α−Ｇａｌエピトープのα−ガラクトシダーゼによる軟組織からの除去についてのアッセイ
この実施例においては、α−ｇａｌエピトープの軟組織からの除去をアッセイするためにＥＬＩＳＡアッセイを行う。
【０１０９】
糖タンパク質上のα−ｇａｌエピトープに対して高度に特異的なモノクローナル抗Ｇａｌ抗体(Ｍ８６という)を、抗Ｇａｌを生成する、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼについての抗Ｇａｌ産生用ノックアウトマウスに由来する脾臓細胞とマウスハイブリドーマ融合パートナーとの融合により生成する。
【０１１０】
Ｍ８６の糖タンパク質上のα−ｇａｌエピトープに対する特異性を図１１に示す。Ｍ８６は、●−ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、▲−ウシチログロブリン(これは、１１のα−ｇａｌエピトープを有する。R.G. Spiro等、Occurrence of α-D-galactosyl residues in the thyroglobulin from several species. Localization in the saccharide chains of complex carbohydrates, 259 J.Biol.Chem.9858(1984))；又は■−マウスラミニン(これは、５０のα−ｇａｌエピトープを有する。R.G. Arumugham等、Structure of the asparagine-linked sugar chains of laminin. 883 Biochem.Biophys.Acta 112(1986))に結合された合成のα−ｇａｌエピトープに結合するが；□−ヒトチログロブリン又はヒトラミニン、○−Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＢＳＡ(Ｎ−アセチルラクトサミン−ＢＳＡ)及びＧａｌα１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＢＳＡ(ＢＳＡに結合されたＰ１抗原)(これらは、すべて、完全にα−ｇａｌエピトープを欠く)に結合された合成のα−ｇａｌエピトープには結合しない。結合は、Ｍ８６組織培養培地の種々の希釈物にて測定する。
【０１１１】
一度Ｍ８６抗体が単離されれば、このモノクローナル抗体を約１：２０〜１：１６０に希釈し、好ましくは約１：５０〜１：１３０に希釈する。この抗体を、約５〜２４時間の予め決めた時間、約３〜８℃の予め決めた温度でインキュベートする。この抗体を、約５〜１００μｍの大きさの軟組織の断片と、好ましくは約１０〜５０μｍの大きさの軟組織断片と、約２００〜１．５ｍｇ／ｍｌの様々な軟組織濃度で、一定の回転で維持する。その後、これらの軟組織断片を、遠心速度約２０，０００〜５０，０００×ｇの遠心分離により除去する。軟組織に結合したＭ８６の割合を、従来技術(例えば、U. Galili等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: II. Changes in anti-Gal response during chronic rejection, 63 Transplantation 645-651(1997))に記載されたように、α−ｇａｌ−ＢＳＡを用いるＥＬＩＳＡにおいて、上清に残っているＭ８６活性を測定することにより評価する。Ｍ８６の軟組織に対する結合の程度を、その後のα−ｇａｌ−ＢＳＡへの結合の阻害パーセンテージとして規定する。軟組織中のα−ｇａｌエピトープの量と軟組織断片と複合体形成して上清から除去されたＭ８６の割合(即ち、阻害パーセンテージ)の間には、直接的相関関係がある。
【０１１２】
このアッセイの例を図１２に示す。ホモジェナイズした半月軟骨(○)又はα−ガラクトシダーゼで処理した半月軟骨(●)の断片を、Ｍ８６モノクローナル抗体(１：１００で希釈)と４℃で２０時間インキュベートする。その後、これらの半月軟骨断片を、３５，０００×ｇでの遠心分離により除去し、上清中に残存しているＭ８６を、固相抗原としてのα−ｇａｌ−ＢＳＡを用いるＥＬＩＳＡでアッセイする。図１２は、半月軟骨の２００Ｕ／ｍｌのα−ガラクトシダーゼでの４時間３０℃での処理及びその後の５回のリン酸緩衝溶液(ＰＢＳ)での洗浄がα−ｇａｌエピトープを完全に除去することを示している。従って、その後は、２００ｍｇ／ｍｌという高い半月軟骨断片濃度であっても、Ｍ８６のα−ｇａｌ−ＢＳＡへの結合を阻害するものは存在しない。
【０１１３】
実施例２：移植されたα−ガラクトシダーゼで処理したブタ半月軟骨、関節軟骨、靱帯及び心臓弁軟組織異種移植片に対する霊長類の応答の評価
この実施例においては、ブタ半月軟骨、関節軟骨、靱帯及び腹膜心臓弁軟組織移植物をα−ガラクトシダーゼで処理して、α−ガラクトシルエピトープを除去し、それらの移植物をカニクイザルに移植して、その霊長類のこれらの軟組織移植物に対する応答を評価する。
【０１１４】
ブタの膝関節を無菌的に用意し、半月軟骨及び関節軟骨並びに他の周囲の付着軟組織を外科的に取り出す。ブタの腹膜も、心臓弁異種移植片を形成するために採取して、付着脂肪及び／又は筋肉組織を外科的に除去する。これらの半月軟骨、関節軟骨及び心臓弁軟組織試料を少なくとも５分間、アルコール例えばエタノール又はイソプロパノールで洗って滑液及び脂溶性夾雑物を除去する。これらの半月軟骨、関節軟骨及び心臓弁軟組織試料を、約−３５〜−９０℃の温度で、好ましくは約−７０℃の温度で凍結させて、これらの試料の繊維軟骨細胞を破壊する(即ち、殺す)。
【０１１５】
ブタの膝関節も、無菌的に用意し、一端又は両端に骨のブロックが付着した靭帯を低温で、厳密な無菌技術の下で取り出す。各骨のブロックは、直径約９ｍｍで長さ約４０ｍｍの実質的に円筒状のプラグを表す。各靭帯軟組織試料を注意深く同定して、付着組織を切り取って、異種移植片を形成する。この靭帯軟組織異種移植片試料を、次いで、アルコール例えばエタノール又はイソプロパノールで少なくとも５分間洗って、滑液及び脂溶性の夾雑物を除去する。その後、これらの試料を約−７０℃の温度で凍結させて、靭帯試料の細胞を破壊する(即ち、殺す)。
【０１１６】
各半月軟骨、関節軟骨、心臓弁及び靭帯軟組織資料を２つの部分に切断する。各第１の部分を、α−ガラクトシダーゼを予め決めた濃度で含む緩衝溶液に浸す。これらの試料を、これらの緩衝溶液中で、予め決めた時間、予め決めた温度でインキュベートする。各第２の部分を、対応する第１の部分と同じ条件下で、α−ガラクトシダーゼの非存在下でインキュベートする(これは、対照として役立つ)。
【０１１７】
このインキュベーションの最後に、これらの軟組織異種移植片試料を、酵素を拡散させる条件下で洗う。アッセイを行って、α−ｇａｌエピトープの完全な除去を確認する。
【０１１８】
各半月軟骨軟組織異種移植片試料を、６匹のカニクイザルの膝蓋骨嚢に移植する。これらの動物を全身吸入麻酔下で用いて、その膝蓋骨嚢に直接約１ｃｍの切開を中心方向に伸びる膝蓋骨の上部内側の境界に作る。約０．５〜１ｃｍの長さのブタ軟骨軟組織の断片を、この嚢内に単一の３−０ナイロン縫合糸を標識として用いて配置させる。
【０１１９】
関節軟骨異種移植片試料を、上記の移植手順に実質的に従って、６匹のカニクイザルの膝蓋骨嚢に移植する。
【０１２０】
ブタの腹膜から心臓弁を形成して、その心臓弁異種移植片試料を、６匹のカニクイザルに、当業者に公知の心臓弁移植手順に従って移植する。
【０１２１】
靱帯軟組織異種移植片試料を、下記の移植手順に従って、６匹のカニクイザルに移植する。これらの動物を全身吸入麻酔下で用いて、この異種性靱帯の解剖学的挿入部位を同定して、実質的に９ｍｍの直径で４０ｍｍの長さの骨プラグを適応させるためのドリル穴を開ける。この異種性靱帯をドリル穴を通して運び、干渉スクリューを用いて添付する。
【０１２２】
移植手順を、無菌の外科的手順により実施し、傷を３−０ビクリル又は当業者に公知の適当な同等物を用いて閉じる。これらの動物をケージ内で自由に活動させて、不快、腫脹、感染又は拒絶の如何なる徴候をも監視する。血液試料(約２ｍｌ)を、抗体をモニターするために、周期的(２週毎)に採取する。
【０１２３】
異種移植片に対する免疫応答が生じたことは、移植を受けたサルからの血清試料中の抗Ｇａｌ及び非抗Ｇａｌ抗軟組織抗体(即ち、α−ｇａｌエピトープ以外の軟組織抗原に結合する抗体)を測定することにより評価する。少なくとも２ｍｌの血液試料を、移植を受けたサルから、移植の外科手術の日に採取し且つ移植後周期的に(例えば、２週間毎に)採取する。これらの血液試料を遠心分離して、血清試料を凍結させ、抗Ｇａｌ及び他の非抗Ｇａｌ抗軟組織抗体活性について評価する。
【０１２４】
抗Ｇａｌ活性を、血清試料中で、α−ｇａｌ−ＢＳＡを固相抗原として用いるＥＬＩＳＡにおいて、当業者に公知の方法例えばGalili等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: II. Changes in anti-Gal response during chronic rejection, 63 Transplantation 645-651(1997)に記載された方法に従って測定する。
【０１２５】
アッセイを行って、α−ガラクトシダーゼ処理した異種移植片が抗軟組織抗体の形成を誘導するかどうかを測定する。抗軟組織抗体活性を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを、当業者に公知の方法例えばK.R. Stone等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chronic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645(1997)により記載された方法に従って行う。
【０１２６】
軟組織異種移植片試料を、適宜、移植後１〜２ヶ月の時点で外植し、炎症性浸潤の組織学的評価のために切片を作成して染色する。抗Ｇａｌその他の抗軟骨軟組織抗体活性の移植後の変化は、移植後１〜２ヶ月で、外植軟組織内における炎症性の組織学的特性(即ち、顆粒球又は単核細胞浸潤物)と相関している(当業者に公知の方法例えばK.R. Stone等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chronic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645(1997)に記載された方法を使用)。
【０１２７】
軟組織を外植する場合には、軟組織異種移植片を、麻酔手順、関節の外科的露出、移植物の撤去及び軟組織の閉鎖の手順を用いて、無菌的に採取する(動物を快復させる場合)。移植片の肉眼的及び組織学的評価が移植軟組織のよい成績を示しているならば、異種移植片撤去時に、関節液を(吸引に十分な量あれば)膝関節から免疫学的試験用に集める。
【０１２８】
これらの半月軟骨又は関節軟骨異種移植片の移植を有する動物を快復させて、切開部が癒えて足取りが正常になるまでしっかりとモニターする。これらの異種移植片試料を、集め、処理して、顕微鏡検査を行う。
【０１２９】
半月軟骨、関節軟骨、心臓弁及び靱帯移植物及び周囲組織の部分を、免疫組織化学評価のための包埋型中の凍結組織試料用に、従来技術において公知の方法により、包埋媒質中で凍結させる。「ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ(登録商標)」Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド(約１０％ｗ／ｗポリビニルアルコール、約４％ｗ／ｗポリエチレングリコール及び約８６％ｗ／ｗ非反応性成分を含み、Sakura FinTek, Torrence, カリフォルニアにより製造されている)は、本発明での使用のための可能な包埋媒質の非制限的例である。他の当業者に公知の包埋用媒質も又、用いることができる。残りの移植物及び周囲組織を、組織病理学的検査用に、１０％の中性緩衝ホルマリン中に集める。
【０１３０】
実施例３：α−ガラクトシダーゼ、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼで処理して移植された半月軟骨、関節軟骨、靱帯及び心臓弁並びに軟組織異種移植片に対する霊長類の応答の評価
この実施例では、ブタの半月軟骨、関節軟骨、靱帯及び腹膜心臓弁軟組織移植物を、実施例２に記載したように、α−ガラクトシダーゼで処理してα−ｇａｌエピトープを除去する。これらの軟組織移植物を、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼで更に処理して、フコシルを有する残留炭水化物鎖をキャップする。フコシルトランスフェラーゼは、フコシルの異種移植片へのトランスファーを促進する。フコシルは、残留炭水化物鎖に結合し、そうして、それらをキャップする。フコシルでのキャッピングは、患者の免疫系がその異種移植片を外来物として認識する能力を邪魔する。これらの軟組織移植物を、カニクイザルに移植して、これらの組織移植物に対する霊長類の応答を評価する。
【０１３１】
ブタの膝関節からの半月軟骨及び関節軟骨移植物、ブタの腹膜からの心臓弁、及びブタの関節からの靱帯移植物を、実施例２において移植物を調製したように調製する(α−ガラクトシダーゼ処理を含む)。しかしながら、サルへの移植の前に、これらの移植物を、予め決めた量のフコシル及びフコシルトランスフェラーゼで、特定の濃度で、予め決めた時間及び温度で更に処理して、残留炭水化物鎖をフコシルでキャップする。例えば、これらの移植物を、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼの予め決めた濃度で緩衝溶液に浸す。これらの移植物を、予め決めた時間、予め決めた温度でインキュベートする。
【０１３２】
対応するグリコシルトランスフェラーゼと組み合わせたＮ−アセチルグルコサミン等の他の分子も又、これらの移植物の炭水化物鎖のキャッピングに用いることができる。
【０１３３】
その後、これらの移植物を洗って酵素を除去してサルに移植し、この異種移植片に対する免疫応答の出現を実施例に２に記載したようにして評価する。
【０１３４】
実施例４：凍結融解サイクル及びプロテオグリカン涸渇因子による処理にかけて移植された半月軟骨、関節軟骨、靱帯及び心臓弁軟組織異種移植片に対する霊長類の応答の評価
この実施例においては、ブタの半月軟骨、関節軟骨、靱帯及び腹膜心臓弁軟組織移植物を調製し、実施例２に記載したように、凍結して試料の細胞を破壊する(即ち、殺す)。これらの軟組織移植物をプロテオグリカン涸渇因子で更に処理して、プロテオグリカンを異種移植片から実質的に除去する。その後、これらの異種移植片を、実施例２に記載したように、グリコシダーゼで処理して、残留α−ｇａｌエピトープを異種移植片から実質的に除去する。プロテオグリカンと残留α−ｇａｌエピトープの実質的な除去は、レシピエント患者の免疫系が異種移植片を外来物として認識する能力を邪魔する。これらの軟組織移植物をカニクイザルに移植して、これらの軟組織移植物に対する霊長類の応答を評価する。
【０１３５】
ブタ膝関節からの半月軟骨、関節軟骨及び靱帯移植物及びブタ腹膜からの心臓弁移植物を、実施例２に概説した無菌化及び凍結／融解サイクル処理を含む調製手順に従って調製する。次いで、コンドロイチナーゼＡＢＣ溶液を、０．０５Ｍトリス−ＨＣＬ(７．８８ｇｍ／リットル−ＭＷ＝１５７．６０)、５ｍＭベンザミジン−ＨＣＬ(０．７８３ｇｍ／リットル−ＭＷ＝１５６．６１)、０．０１０Ｍ Ｎ−エチルマレイミド(１．２５１３ｇｍ／リットル−ＭＷ＝１２５．１３)及び０．００１Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリド(０．１７４２０ｇｍ／リットル−ＭＷ＝１７４．２)(メタノールに溶解)を合わせることにより調製する。０．１５Ｍ ＮａＣｌ(８．７７５ｇｍ／リットル−ＭＷ＝５８．５)、ペニシリン及びストレプトマイシン(１％(ｖ／ｖ)１０ｍｌ／リットル)の混合物を、溶液１ｍｌ当たり１ユニットのコンドロイチナーゼＡＢＣ(Sigma #C-3509)エンザイムソルーションの量の酵素と共に加えて、この溶液を１リットルにする。
【０１３６】
各軟組織異種移植片試料を、コンドロイチナーゼＡＢＣ酵素溶液中でインキュベートする(直径３ｍｍの組織プラグ当たり溶液１ｍｌの濃度で)。このインキュベーションを、震盪水浴中で、ｐＨ８．０で、３７℃で４８時間行う。インキュベーション後、各軟組織試料を適当な緩衝液中で洗い、洗液をコンドロイチナーゼＡＢＣ溶液に加える。次いで、各軟組織試料を、上記のように、コンドロイチンＡＢＣ溶液と、溶液１ｍｌ当たり１ユニットのコンドロイチナーゼＡＢＣ(Sigma #C-3509)エンザイムソルーションの濃度で、更に４８時間再インキュベートする。各軟組織試料を適当な緩衝溶液中で再び洗い、洗液をコンドロイチナーゼＡＢＣ溶液に加える。
【０１３７】
次いで、各軟組織試料を、１ｍｌのトリプシン溶液(１ｍｇ／ｍｌトリプシン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ Ｎａホスフェート)中で、ｐＨ７．２で２４時間インキュベートする。このインキュベーションを、震盪水浴中で、３７℃で行う。各軟組織試料を適当な緩衝溶液中で洗い、洗液をトリプシン溶液に加える。
【０１３８】
次いで、各試料を１ｍｌのヒアルロニダーゼ溶液(０．０１ｍｇ／ｍｌ精巣ヒアルロニダーゼ、０．００５ＭベンザミジンＨＣＬ、００１Ｍ ＰＭＳＦ、０．０１０Ｍ ネチルマレイミド、０．００５Ｍ ベンザミジンＨＣＬ、１％ｖ／ｖペニシリン及びストレプトマイシン)中に、ｐＨ６．０で２４時間置く。このインキュベーションを、震盪水浴中で３７℃で行う。次いで、各軟組織試料を、再び、適当な緩衝溶液中ですすぎ、洗液をヒアルロニダーゼ溶液に加える。
【０１３９】
その後、これらの移植片を、実施例２に記載したようにグリコシダーゼで処理して、サルに移植し、それらの異種移植片の各々に対する免疫応答の出現を、実施例２に記載したようにして評価する。
【０１４０】
実施例５：α−ガラクトシダーゼ及び骨誘導因子を含む脱ミネラル化した骨マトリクスで処理して移植した異種移植片に対するマウスにおける応答の評価
この実施例においては、ブタの骨の移植物をα−ガラクトシダーゼで処理してα−ガラクトシルエピトープを除去し、骨誘導因子を含む脱ミネラル化した骨マトリクスに浸透させて、標的欠損における軟組織フォーマーの骨性組織フォーマーへの変換を刺激する。これらの移植物をマウスに移植して、それらに対する応答を評価する。欠損Ｄにおける典型的な骨部分１０を、図１３に示す。
【０１４１】
ブタの骨移植物を、無菌的に調製し、周囲に付着している軟組織を外科的に除去する。それらの骨試料を、少なくとも５分間、アルコール例えばエタノール又はイソプロパノールで洗って、滑液及び脂溶性夾雑物を除去する。
【０１４２】
骨試料を、約−３５〜−９０℃の温度範囲で、好ましくは約−７０℃以下の温度で凍結させて、試料の骨細胞を破壊する(即ち、殺す)。
【０１４３】
各骨試料を２つの部分に切断する。第一の骨部分を、α−ガラクトシダーゼを予め決めた濃度で含む緩衝溶液に浸す。第一の骨部分をこの緩衝溶液中で予め決めた温度で予め決めた時間インキュベートする。第二の骨部分を、第一の骨部分と類似の条件下で緩衝溶液中で、α−ガラクトシダーゼの非存在下でインキュベートする(これは、対照として役立つ)。
【０１４４】
インキュベーションの終了時に、これらの骨部分を、酵素を拡散させる条件下で洗浄する。アッセイを行って、α−ｇａｌエピトープの完全な除去を確実にする。
【０１４５】
次いで、α−ガラクトシダーゼ第一の骨部分(上に開示)を、従来技術例えばJohn E. Feighan等、Induction of Bone by a Demineralized Bone Matrix Gel: A Study in a Rat Femoral Defect Model, 13 Journal of Orthopaedic Research 881-889(1995)で公知の方法により調製した骨誘導因子を含む脱ミネラル化したマトリクスゲルに浸透させる。
【０１４６】
これらの骨試料を、全身吸入麻酔下に公知の外科的手順に従ってマウスの皮下組織中に移植する。骨を、皮下組織に移植して、骨の骨誘導特性を評価する。形成された如何なる骨も、骨誘導特性の証拠である。骨異種移植片の骨誘導特性を、異種移植片を移植した後に、長骨ドリル穴モデル等の骨欠損モデルを用いて評価する。移植手順を、無菌的外科技術下で行い、その傷を３−０ビクリル又は当業者に公知の適当な同等物を用いて閉じる。図１４は、欠損Ｄに位置された異種移植片Ｘ(斜交平行線を付けて示す)を有する骨部分１０を示す。これらの動物をケージ内で自由に活動させて、不快、膨潤、感染、又は拒絶の如何なる徴候をも監視する。血液試料(例えば、２ｍｌ)を周期的に(例えば、２週毎に)採取して、抗体をモニターする。
【０１４７】
異種移植片に対する免疫応答の出現を、移植を受けたマウスからの血清試料において、抗Ｇａｌ及び非抗Ｇａｌ(即ち、α−ｇａｌエピトープ以外の抗原への抗体結合)の抗骨異種移植片抗体を測定することにより評価する。血液試料を、移植を受けたマウスから、移植外科手術の日に採取し且つ移植後に周期的(例えば、２週間)間隔で採取する。これらの血液試料を遠心分離して、血清試料を凍結し、抗Ｇａｌ及び他の非抗Ｇａｌの抗骨異種移植片抗体について評価する。
【０１４８】
抗Ｇａｌ活性を、これらの血清試料において、α−ｇａｌ−ＢＳＡを固相抗原として用いるＥＬＩＳＡにおいて、従来技術で公知の方法例えばGalili等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: II. Changes in anti-Gal response during chronic rejection, 63 Transplantation 645-651(1997)に記載された方法に従って測定する。
【０１４９】
アッセイを行って、α−ガラクトシダーゼ処理した異種移植片が抗骨異種移植片抗体の形成を誘導するかどうかを測定する。抗骨異種移植片抗体活性を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを、当分野で公知の方法例えばK.R. Stone等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chronic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645(1997)に記載された方法に従って行う。
【０１５０】
これらの骨異種移植片を、適宜、移植後１〜２ヶ月の時点で外植し、炎症性浸潤の組織学的評価のために切片を作成して染色する。抗Ｇａｌその他の抗骨異種移植片抗体活性の移植後の変化は、移植後１〜２ヶ月で、外植骨内における炎症性の組織学的特性(即ち、顆粒球又は単核細胞浸潤物)と相関している(当業者に公知の方法例えばK.R. Stone等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chronic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645(1997)に記載された方法を使用)。
【０１５１】
骨異種移植片を外植する場合は、その骨異種移植片を、麻酔手順、移植物の撤去及び軟組織の閉鎖の手順を用いて無菌的に採取する。もしこれらの移植物の肉眼的及び組織病理学的評価が移植された骨のよい成績を示していれば、可能な免疫学的試験のために組織を採取する。これらの異種移植片試料を集め、処理して顕微鏡検査をする。移植片及び周囲の組織の一部分を、当業者に公知の方法により、免疫組織化学評価のために包埋用型中の凍結組織試料用に包埋用媒質中で凍結させる。「ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ(登録商標)」Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド(１０．２４％ｗ／ｗポリビニルアルコール、４．２６％ｗ／ｗポリエチレングリコール及び８６．６０％ｗ／ｗ非反応性成分を含み、Sakura FinTek, Torrence, カリフォルニアにより製造されている)は、本発明での使用のための可能な包埋用媒質の非制限的な例である。他の当業者に公知の包埋用媒質を用いることもできる。残りの移植物及び周囲組織を、病理組織学的検査のために、１０％の中性緩衝ホルマリン中に集める。
【０１５２】
実施例６：α−ガラクトシダーゼ及び骨誘導因子を含む脱ミネラル化骨マトリクスゲルで処理して移植した骨異種移植片に対する霊長類の応答の評価
この実施例では、ブタ骨移植物を、α−ガラクトシダーゼ及び骨誘導因子を含む脱ミネラル化した骨マトリクスゲルで処理し、それらの移植物をカニクイザルに移植し、これらの骨移植物に対する霊長類の応答を、実施例５に記載したようにして評価する。これらの骨異種移植片を外植して組織を可能な免疫学的試験用に採取した後に、これらの動物を快復させて、切開部が癒えてこれらの動物の足取りが正常になるまでしっかりとモニターする。
【０１５３】
実施例７：α−ガラクトシダーゼ、骨誘導因子を含む脱ミネラル化骨マトリクスゲル、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼで処理して移植した骨異種移植片に対するマウスにおける応答の評価
この実施例では、ブタ骨移植物を、実施例５に記載したように、α−ガラクトシダーゼで処理してα−ｇａｌエピトープを除去する。これらの移植物をフコシル及びフコシルトランスフェラーゼで更に処理して、フコシルを有する炭水化物鎖をキャップする。フコシルトランスフェラーゼは、フコシルの異種移植片へのトランスファーを促進する。このフコシルは、これらの炭水化物鎖に結合し、そうして、それらをキャップする。フコシルでのキャッピングは、患者の免疫系が異種移植片を外来物として認識する能力を邪魔する。これらの移植物をマウスに移植して、それらの骨移植物に対する応答を評価する。
【０１５４】
ブタ骨移植物を、実施例１に記載したようにして評価する(α−ガラクトシダーゼ処理を含む)。しかしながら、マウスへの移植の前に、それらの移植物を、予め決めた量のフコシル及びフコシルトランスフェラーゼで、特定濃度で、予め決めた時間予め決めた温度で処理して、フコシルを有する炭水化物鎖をキャップする。例えば、これらの試料を、緩衝溶液に、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼの予め決めた濃度で浸す。これらの試料を、予め決めた時間、予め決めた温度でインキュベートする。
【０１５５】
対応するグリコシルトランスフェラーゼと組み合わせたｎ−アセチルグルコサミン等の他の分子も又、これらの移植物の炭水化物鎖のキャッピングのために用いることができる。
【０１５６】
その後、これらの試料を洗って酵素を除去して、マウスに移植し、異種移植片に対する免疫応答の出現を、実施例５に記載したようにして評価する。
【０１５７】
実施例８：α−ガラクトシダーゼ、骨誘導因子を含む脱ミネラル化骨マトリクスゲル、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼで処理して移植した骨異種移植片に対する霊長類の応答の評価
この実施例では、ブタ骨移植物は、α−ガラクトシダーゼ、骨誘導因子を含む脱ミネラル化した骨マトリクスゲル、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼで処理し；それらの移植物をカニクイザルに移植して、それらの骨移植物に対する霊長類の応答を、実施例５、６及び７に記載したようにして評価する。
【０１５８】
実施例９：アルコール及び凍結／融解サイクルで処理して移植した骨異種移植片に対するマウスにおける応答の評価
この実施例では、ブタ骨移植物を、マウスへの移植の前に、アルコール及び凍結／融解サイクルにより処理し、これらの移植物に対するマウスの応答を評価する。
【０１５９】
ブタ骨移植物を、無菌的に調製し、周囲の付着軟組織を外科的に除去する。その結果生成された異種移植片を約１０倍容の無菌冷水中で洗って残留血液タンパク質及び水溶性物質を除去する。次いで、この異種移植片を、室温で約５分間、アルコールに浸けて、骨を殺菌し且つ非コラーゲン様物質を除去する。
【０１６０】
アルコール洗浄後、異種移植片を、再び、７０％イソプロパノールのアルコール溶液中に室温で少なくとも５分間置くことにより処理する。
【０１６１】
アルコール処理のステップに続いて、これらの骨移植物を、フリーザー中に、異種移植片が完全に凍結する(即ち、未凍結組織を含む内部温点が残っていない)まで置く。次いで、各骨移植物を、室温(約２５℃)で、等張の塩溶液浴に約１０分間浸すことにより融解させる。
【０１６２】
これらの骨移植物を、別法として、アルコール処理ステップの前に、上記の凍結／融解サイクル処理にかけることができるということは、理解されるべきである。
【０１６３】
次いで、これらの移植物をマウスに移植し、異種移植片に対する免疫応答の出現を、実施例５に記載したようにして評価する。
【０１６４】
実施例１０：アルコール及び凍結／融解サイクルにより処理して移植した骨異種移植片に対する霊長類の応答の評価
この実施例では、ブタ骨移植物を、アルコール及び凍結／融解サイクルにより処理してからカニクイザルに移植して、それらの移植物に対する霊長類の応答を実施例５〜１０に記載したようにして評価する。
【０１６５】
実施例１１：α−ガラクトシダーゼ及びグルタルアルデヒドで処理して移植した軟組織及び骨異種移植片に対する霊長類における応答の評価
この実施例では、ブタの半月軟骨、関節軟骨、靱帯、腹膜心臓弁及び骨移植物を、アルコール及び凍結／融解サイクルにより、実施例１〜１０に記載したようにして処理する。それらを、更に、０．０１〜０．１０％グルタルアルデヒドで処理し、次いで、α−ガラクトシダーゼで処理して、それらの移植物に対する霊長類の応答を実施例１〜１０に記載した用にして評価する。
【０１６６】
当業者は、この発明が、その精神又は本質的特徴から離れることなく、別の特定の形態で具体化され得ることを認めるであろう。従って、現在記載してある具体例は、すべての点で、説明のためのものと考えるべきであり、前述した記載ではなく添付の請求の範囲により示されるこの発明の範囲を限定するものと考えるべきではなく、同等の請求の範囲内の意味及び範囲内に含まれるこの発明のすべての変形は、請求の範囲内に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 内側及び外側半月板がそれらの本来の位置にあるヒトの膝関節の概略図である。
【図２】 生体内で脛骨の内側及び外側顆の上方に位置決めされるときの内側及び外側半月板を示すヒトの膝関節の破断図である。
【図３】 ヒトの膝の断裂した外側半月板の切除術及び半月板移植片の受け入れのための膝の準備を示す図である。
【図４】 ヒトの膝への後方外側半月板角挿入のための好ましいドリルガイド配置を示す図である。
【図５】 ヒトの膝への後方外側半月板角挿入におけるカニューレ挿入ドリルオーバードリルガイドワイヤを示す図である。
【図６】 半月板角挿入のための後方及び前方ドリル孔を設けたヒトの膝の様子を示す図である。
【図７】 ヒトの膝関節中に半月板移植片を引き込むための好ましい縫合糸通し器具の配置を示す図である。
【図８】 挿入段階の間の半月板移植片を収納したヒトの膝の様子を示す図である。
【図９】 半月板移植片を収納し、ゾーン特異的半月板修復縫合糸をこの半月板修復縫合糸を最終的に縛るための位置に備えたヒトの膝の様子を示す図である。
【図１０】 大腿骨２の関節端部上の関節軟骨７及び脛骨４の関節端部上の関節軟骨８の正常な位置を示すヒトの膝関節３を表す図である。
【図１１】 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシチログロブリン、マウスラミニン、Galβ1-4 GlcNAc-BSA（Ｎ−アセチルラクトサミン−ＢＳＡ）、Galα1-4Galβ1-4 GlcNAc-BSA（ＢＳＡに結合したＰ１抗原）、及びヒトチログロブリン又はヒトラミニン上のα−ガラクトシルエピトープに対するモノクローナル抗Gal抗体の特異性を表すグラフである。
【図１２】 α−ガラクトシダーゼ処理された半月板軟骨からのα−ガラクトシルエピトープの除去を表すグラフである。
【図１３】 欠損を有する骨の一部分を示す図である。
【図１４】 欠損中にこの発明の異種移植片を有する図１３の骨の部分を示す図である。
【符号の説明】
２ 大腿骨
３ 膝関節
４ 脛骨
７、８ 関節軟骨
発明の分野
本発明は、欠陥のあるヒトの膝関節、心臓弁、及び骨の治療の分野に、特に、欠陥のある又は損傷したヒトの膝関節、心臓弁及び骨を、非ヒト動物に由来する実質的に免疫学的に適合性の軟組織又は骨を用いて置換し又は修復する分野に関係する。
【０００２】
発明の背景
軟組織
用語「軟組織」は、ここで用いる場合、軟骨性の構造例えば半月又は関節軟骨；靭帯例えば前部十字形靭帯；腱；及び心臓弁をいう。
【０００３】
１．半月軟骨軟組織
特に、大腿部顆は、軟骨性の内側及び外側半月軟組織を介して、脛骨の表面平坦域と関節をなし、これらの構造のすべては、様々な靭帯により適所に保持されている。内側及び外側半月は、繊維軟骨細胞と呼ばれる細胞及びコラーゲンと弾性繊維の細胞外マトリクス並びに様々なプロテオグリカンよりなる構造である。損傷してない半月は、適当な力の分配、安定化及び膝関節内の影響し合う骨表面の潤滑を確実にすることにより膝に対する衝撃の緩衝を与え、これらの半月は、日常的に、通常の活動において反復される圧力負荷にさらされている。内側及び外側半月の衝撃吸収機能の殆どは、軟骨に固有の弾性特性に由来する。半月が、外傷、病気又は炎症により損傷した場合には、膝関節内で関節炎の変化が起き、その結果としての機能の喪失が起きる。
【０００４】
成人の関節軟骨は、一度破壊されると、自然に有意の程度に再生しないので、損傷した成人の半月は、歴史的には、様々な外科的介入により処置されてきた。損傷した半月は、除去されて、補綴用デバイスで置換されてきた。堅いプラスチック製の大腿部部材と金属性の脛骨部材を有する人工膝関節が、米国特許第４，０３４，４１８号に開示されている。米国特許第４，３４４，１９３号及び第４，５０２，１６１号のような、弾力のある材料例えばシリコーンゴム又は天然のゴムを利用する幾つかの半月プロテーゼが考案された。半月プロテーゼ用の更なる変形可能な、可撓性の弾力のある材料例えばコラーゲン、腱又は繊維軟骨が、米国特許第５，０９２，８９４号及び米国特許第５，１７１，３２２号に開示されている。小さいボールベアリング又はゼラチン状の液体を満たしたポリエチレンプラスチックから作られた軟骨代替装置が、米国特許第５，３５８，５２５号に記載されている。しかしながら、公知の人工プロテーゼは、弾力性に乏しく、それ故、天然の半月の特性である衝撃吸収性に乏しいので、損傷を受けた半月の治療に関して不満足なものであった。その上、これらの公知の人工デバイスは、ごく普通の膝関節機能に内在する力に耐えられることが判明していない。
【０００５】
本願発明者の１人は、以前の幾つかの特許(米国特許第４，８８０，４２９号；米国特許第５，００７，９３４号；米国特許第５，１１６，３７４号及び米国特許第５，１５８，５７４号)において、補綴用半月を改良した。これらの特許は、一般に、処理した天然繊維例えば再構成した架橋コラーゲンの乾燥した、多孔性マトリクスから処方された補綴用半月(適宜、グリコサミノグリカン分子を含む)を開示している。一般に、これらの補綴用半月のためのコラーゲンの起源は、動物のアキレス腱又は皮膚であった。再構成工程は、非コラーゲン性材料例えば糖タンパク質、プロテオグリカン、脂質、ネイティブなグリコサミノグリカンなどを除去し、これは、元の組織に更なる弾力性を与えることができる。
【０００６】
２．関節軟骨軟組織
関節軟骨軟組織は、ヒト及び動物の関節を形成するすべての骨の末端を覆っている。関節軟骨は、繊維軟骨細胞及びコラーゲン繊維の細胞外マトリクス並びに様々なプロテオグリカンからできている。軟骨は、関節において、力を分配するための機構として及び骨間の接触領域における潤滑剤として作用する。関節軟骨がなければ、関節が容易に動かせない程の応力集中及び摩擦が起きるであろう。関節軟骨の喪失は、通常、痛みのある関節炎及び低下した関節運動を生じる。
【０００７】
損傷を受けた成人の関節軟骨は、歴史的には、修復、置換又は切除を含む様々な外科的介入によって処置されてきた。修復又は切除を用いる場合には、組織の再生が起こり得るが、通常、その組織は、一時的なものであって、通常の関節の力に耐えるのに不十分なものである。
【０００８】
関節軟骨の置換は、通常、同種異系移植(Sengupta等(1974)J.Bone Suro.56B(1):167-177；Rodrigo等(1978) Clin Orth.134:342-349)によるもの、骨膜移植(例えば、Engkvist(1979) Scan J.Plast.Reconstr.Suro.13:361-369；Rubak(1982) Acta Orthop.Scan.53:181-186参照)によるもの又は金属及び／若しくはプラスチック製部品を用いるもの(Rubash等編(1991) Clin.Orth.Rel.Res.271:2-96)であった。死んだ軟骨組織の同種異系移植は、数年間にわたって試みられたが、殆ど成功しなかった。このアプローチは、宿主の移植片に対する免疫学的応答、低温保存工程の失敗及び付着部位の失敗のために、長期間にわたって、部分的に成功しただけであった。全関節面の金属及びプラスチック製部品での置換は、年長の座りがちの患者については非常に成功したが、一般には、関節の動きの衝撃に対する耐性に関して不十分と考えられ、通常の関節機構を回復したことは示されていない。
【０００９】
別の従来技術のアプローチにおいては、関節軟骨は、骨及び／又は人工材料よりなるプロテーゼで置き換えられた。例えば、米国特許第４，６２７，８５３号は、脱ミネラル化した同種異系又は異種骨セグメントの置換物としての利用を記載している。これらの置換物の適当な機能は、骨セグメントの差次的脱ミネラル化に依存する。米国特許第４，８４６，８３５号は、関節軟骨の損傷の治癒を促進するために繊維軟骨細胞を移植するための移植技術を記載している。米国特許第４，６４２，１２０号は、胎児の繊維軟骨細胞を含むゲル様組成物の利用を記載している。米国特許第５，３０６，３１１号は、乾燥した、多孔性の容積マトリクスを含む、天然の関節軟骨と実質的に同じ外形をイン・ビボで有するように適合された補綴用関節軟骨を記載している。
【００１０】
これらの開発にもかかわらず、関節軟骨軟組織の永久的人工材料からなる構造物での置換は、一般に、満足できるものではなく、関節軟骨として適当であり且つ天然の再吸収性物質から構成された構造物は、開発されなかった。向き合う哺乳動物関節の関節軟骨は非常にもろいので、それは、摩耗性接合面に耐えないし、従来技術の人工軟骨の移植から結局生じるコンプライアンスの標準からの変化にも耐えないであろう。加えて、関節にかかる力は、体重の数倍であり、膝関節及び股関節の場合、それらが、典型的には、年間百万回以上かかる。今までは、従来技術の永久的人工軟骨は、天然の関節軟骨の特性を有する材料で作られなかったし、かかる日常的な力に耐えるのに十分なように確実に位置させることができなかった。
【００１１】
３．靱帯軟組織
膝の前部十字形靭帯(以後、ＡＣＬと呼ぶ)の軟組織は、すべてのたわみ位置における大腿骨からの脛骨の前部のずれに抵抗するように機能する。ＡＣＬは又、過伸展に抵抗し且つ完全に伸びた膝の内側及び外側脛骨回転中の回転安定性に寄与する。このＡＣＬは、固有受容感覚において役割を演じ得る。このＡＣＬは、細胞、水、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、エラスチン及び他の糖タンパク質よりなる結合組織構造からできている。Cyril Frank,M.D.等、Normal Ligament:Structure, Function, and Composition. Injury and Repair of the Musculoskeletal Soft Tissues, 2: 45-101。構造的には、ＡＣＬは、脛骨の顆間の隆起の前の凹部に付着し、外側大腿骨顆の内側壁まで後部上方に伸びる。
【００１２】
損傷したＡＣＬの好適な治療は、骨−靭帯−骨自家移植片を用いる靭帯再構成である。十字形靭帯再構成は、即時的安定性及び即時的な活発なリハビリテーションの潜在能力の利点を有する。しかしながら、ＡＣＬ再構成の不利益は、有意であり：例えば、正常な解剖学的構造は、膝蓋腱又は膝窩腱を再構成用に用いた場合には破壊され；靭帯の固定には、膝内にハードウェアを配置することを必要とし；そして前部膝の痛みが頻繁に起こる。その上、十字形靭帯再構成の最近の総説は、膝内ＡＣＬ再構成に伴う変性関節炎の増大した危険を患者の大きな群について示している。
【００１３】
ＡＣＬ傷害を治療する第２の方法は、「一次修復」と呼ばれ、裂けた構造を元の場所に縫合することを含む。一次ＡＣＬ修復は、限られた関節鏡アプローチ、正常の解剖学的構造の最小の破壊、及び局所麻酔下での外来患者用の手順という潜在的利点を有する。一次十字形靭帯修復の潜在的不利益は、長期間にわたって、ＡＣＬ修復は、十分な人数の患者において安定性を与えず、後日、第２の再構成を必要とし得るという理解である。前部十字形靭帯修復の成功率は、一般に、６０〜７０％の範囲をさまよっている。
【００１４】
４．心臓弁軟組織
心臓弁は、繊維軟骨細胞及びコラーゲンと弾性繊維の細胞外マトリクス並びに様々なプロテオグリカンからなっている。様々な合成及び組織ベースの材料(後者は、レシピエント生物又は同じ種の異なる生物に由来する)が、心臓弁置換物を形成するために用いられてきた。各々は、それらの利点及び不利益を有している。
【００１５】
合成の心臓弁の場合には、合成ポリマーのモノマー及び／又は反応条件を変えることにより、心臓弁の特性を有利に改変することが可能である。しかしながら、合成の心臓弁は、血栓塞栓症及び機構的故障と関係し得る。米国特許第４，７５５，５９３号を参照されたい。
【００１６】
組織ベースの心臓弁は、合成のものと比べて優れた血液接触特性を示し得る。しかしながら、組織ベースの心臓弁は、劣ったイン・ビボ安定性と関係し得る。米国特許第４，７５５，５９３号を参照されたい。
【００１７】
心膜異種移植片組織弁が、上記の合成及び組織ベースの弁の代わりとして導入された。Ionescu,M.I.等、Heart Valve Replacement With The Ionescu-Shiley Pericardial Xenograft, J.Thorac.Cardiovas.Surg.73:31-42(1977)を参照されたい。しかしながら、かかる弁は、石灰化及び耐久性の問題を有し続け得る。Morse,D,編、Guide To Prosthetic Heart Valves, Springer-Verlag, New York, 225-232(1985)を参照されたい。
【００１８】
従って、血液と接触させることができ且つイン・ビボで安定な機構的に耐久性で可撓性の心臓弁置換物に対する要求がある。
【００１９】
骨組織
ヒトの骨は、石化した礎質の細胞外マトリクスに埋められた細胞とコラーゲン繊維よりなる硬質結合組織(ステッドマン医学辞典、Williams & Wilkins, Baltimore, MD(1995))であって、ヒトにおいて最も頻繁に移植される組織である。J.M.Lane等、Current Approaches to Experimental Bone Grafting, 18 Orthopedic Clinics of North America(2)213(1987)。米国だけで、外傷、感染症、先天性奇形又は悪性腫瘍から生じた骨の欠損を修復し又は置換するために、毎年、１００，０００の骨移植が行われる。同書。
【００２０】
骨移植片及び移植物は、しばしば、自己由来の骨で形成される。同書。しかしながら、大きい欠損のための移植可能な自己の骨組織は、特に子供において、しばしば、入手不可能である。同書。加えて、自己の骨の移植は、手術後の病的状態例えば痛み、出血、傷の問題、化粧不具合、感染症又は神経障害をドナー部位に生じ得る。同書。更に、移植した自己の骨組織から所望の機能的形状を製作する困難さは、骨欠損の最適な充填より劣る充填を生じ得る。
【００２１】
異種移植片
元の軟組織又は骨組織の構造の殆ど及び特性の多くは、異種移植片即ち移植片レシピエントと異なる種に由来する軟組織又は骨組織の利用により、移植物において保持され得る。例えば、米国特許第４，４００，８３３号においては、ウシその他の動物に由来する腱又は靭帯が合成のメッシュに覆われて異種宿主に移植されている。平らな組織例えばブタの心膜も又、異種移植に適しているとして、米国特許第４，４００，８３３号に開示されている。人工心臓弁、血管移植片、火傷その他の傷用の包帯に適した生体材料に加工されたウシの腹膜が、米国特許第４，７５５，５９３号に開示されている。ウシ、ヒツジ又はブタの血管異種移植片が、ＷＯ８４／０３０３６に開示されている。
【００２２】
一度個体に移植されれば、異種移植片は、その異種移植片の慢性拒絶及び超急性拒絶等の免疫反応を引き起こす。特に、骨移植片は、免疫による拒絶に続いて、高率で、骨折、再吸収及び癒着不能を生じ得る。
【００２３】
用語「慢性拒絶」は、ここで用いる場合、個体における、その個体に移植された異種移植片に対する免疫反応をいう。典型的には、慢性拒絶は、異種移植片を受けた個体の血清中のＩｇＧ自然抗体と、その異種移植片の細胞上に発現されている炭水化物部分及び／又は細胞マトリクス及び／又は細胞成分との間の相互作用により媒介される。例えば、非霊長類哺乳動物(例えば、ブタ又はウシ起源)に由来する軟組織軟骨異種移植片のヒトへの移植は、主として、ヒトの血清中に存在するＩｇＧ抗Ｇａｌ自然抗体と異種移植片で発現されている炭水化物構造のＧａｌα１―３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ(α−ガラクトシル又はα−ｇａｌエピトープ)との間の相互作用により妨げられる。K.R. Stone等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chrnic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645(1997)；U.Galili 等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: II. Changes in anti-Gal response during chronic rejection, 63 Transplantation 646-651(1997)。慢性拒絶において、免疫系は、典型的には、異種移植片の移植から１〜２週間以内に応答する。
【００２４】
「慢性拒絶」と対照的に、「超急性拒絶」は、ここで用いる場合、個体における、その個体に移植された異種移植片に対する免疫反応であって、拒絶が、典型的に、その異種移植片を受けた個体の血清中に存在するＩｇＭ自然抗体と、細胞上で発現されている炭水化物部分との相互作用により媒介されるものをいう。この相互作用は、血管床の溶解及び血流の停止を受容個体において数分から２〜３時間以内に引き起こす補体系を活性化する。
【００２５】
用語「細胞外成分」は、ここで用いる場合、軟組織中に存在する任意の細胞外の水、コラーゲン及び弾性繊維、プロテオグリカン、フィブロネクチン、エラスチン、その他の糖タンパク質をいい；骨組織中に存在するミネラル化した基質、骨及びコラーゲン繊維をいう。ステッドマン医学辞典、Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1995)。
【００２６】
異種移植片材料を、レシピエントへの移植の前に化学的に処理して、免疫原性を低減させることができる。例えば、米国特許第４，７５５，５９３号に詳細に記載されているように、異種移植片を、その抗原性を低減させるために、グルタルアルデヒドを用いて架橋し又は「なめす」。他の薬剤例えば脂肪族及び芳香族ジアミン化合物は、コラーゲンポリペプチドのアスパラギン酸及びグルタミン酸の側鎖のカルボキシル基を介する更なる架橋を与えることができる。グルタルアルデヒド及びジアミンによるなめしは又、異種移植片組織の安定性をも増大させる。
【００２７】
異種移植片組織は又、移植の準備において、様々な物理的処理にかけることができる。例えば、米国特許第４，７５５，５９３号は、異種移植片を、引っ張ることにより機械的緊張にかけて、移植のための一層薄くて堅い生体材料を生成することを開示している。同種異系移植のための組織は、例えば米国特許第５，０７１，７４１号；同第５，１３１，８５０号；同第５，１６０，３１３号；及び同第５，１７１，６６０号に開示されているように、一般に、低温保存して、貯蔵中の細胞の生存力を最適化する。米国特許第５，０７１，７４１号は、組織の凍結が、細胞外又は細胞内の氷の結晶の形成及び浸透性脱水の故に、組織中の細胞に機械的損傷を引き起こすことを開示している。
【００２８】
発明の要約
本発明は、軟組織又は骨組織の修復又は置換を必要とするヒトへの移植のための実質的に非免疫原性の軟組織又は骨組織異種移植片を提供する。この発明は、更に、ヒトへの異種移植につき、減じた免疫原性を有するが、実質的に、自然の弾力性及び負荷支持能力を有する異種移植片軟組織又は骨組織の製造方法を提供する。
【００２９】
ここで用いる場合、用語「異種移植片」は、「異種間移植片」と同義語であって、一の動物種から他の一の動物種へ移植される移植片をいう。ステッドマン医学辞典、Williams & Wilkins, Baltimore, MD(1995)。
【００３０】
ここで用いる場合、用語「異種の」は、例えば、異種の軟組織又は骨組織のように用いるが、一の動物種から他の一の動物種へ移植された軟組織又は骨組織をいう。同書。
【００３１】
この発明の方法は、照射処理、１サイクル以上の凍結・解凍、化学架橋剤での処理、アルコールでの処理又はオゾン処理を、単独で又は組み合わせて含む。これらの方法に加えて又はこれらに代えて、この発明の方法は、細胞破壊処理、異種移植片の炭水化物部分のグリコシダーゼ消化又はプロテオグリカン涸渇因子での処理(プロテオグリカン涸渇因子処理は軟組織異種移植片のみ)を、任意の順序で、単独で又は組み合わせて含む。適宜、グリコシダーゼ消化又はプロテオグリカン涸渇因子処理の後に、更なる処理例えば異種移植片の炭水化物部分のキャッピング分子での処理を行うことができる。上記の一つ以上の処理ステップの後で、この発明の方法は、天然の軟組織又は骨組織と実質的に同じ機械的特性を有する異種移植片を与える。
【００３２】
ここで用いる場合、用語「細胞破壊」は、例えば、細胞破壊処理において用いるが、細胞を殺す処理をいう。
【００３３】
ここで用いる場合、用語「キャッピング分子」は、炭水化物鎖と結合して、異種移植片が、宿主の免疫系によってもはや外来物として認識されないようにする分子をいう。
【００３４】
ここで用いる場合、用語「キャップする」又は「キャッピング」は、キャッピング分子例えば炭水化物ユニットを炭水化物鎖の末端に結合させることをいい、例えば、炭水化物ユニットを、異種移植片の表面炭水化物部分に共有結合させる。
【００３５】
一具体例において、この発明は、ヒトへの移植のための、実質的に非免役原性の軟組織又は骨組織異種移植片を含む製造品を提供する。
【００３６】
他の具体例において、この発明は、ヒトへの移植のための、軟組織又は骨組織異種移植片の製造方法であって、非ヒト動物から軟組織又は骨組織の少なくとも一部分を取り出して異種移植片を準備し；その異種移植片を水及びアルコールで洗い；その異種移植片を紫外線照射への曝露、アルコールへの浸漬、オゾン処理及び凍結／解凍サイクルよりなる群から選択する少なくとも一つの処理にかけることを含み、それにより、その異種移植片が、天然の軟組織又は骨組織の対応する部分と実質的に同じ機械的特性を有する当該製造方法を提供する。
【００３７】
ここで用いる場合、用語「部分」は、例えば、軟組織、骨組織、第２の表面炭水化物部分又はプロテオグリカンの一部分において用いるが、異種移植片の各軟組織、骨組織、第２の表面炭水化物部分又はプロテオグリカンの全部又は全部より少ない部分をいう。
【００３８】
他の具体例において、この発明は、ヒトへの移植のための、軟組織又は骨組織異種移植片の製造方法であって、非ヒト動物から軟組織又は骨組織の少なくとも一部分を取り出して異種移植片を準備し；その異種移植片を水及びアルコールで洗い；その異種移植片を、細胞破壊処理にかけ；そしてその異種移植片をグリコシダーゼで消化して第１の表面炭水化物部分を除去することを含み、それにより、この異種移植片が、天然の軟組織又は骨組織の対応する部分と実質的に同じ特性を有する、当該製造方法を提供する。
【００３９】
ここで用いる場合、用語「第１の表面炭水化物部分」は、炭水化物鎖の非還元末端の末端α−ガラクトシル糖をいう。
【００４０】
更に別の具体例において、この方法は、更なるステップ例えば異種移植片の第２の表面炭水化物部分をキャッピング分子で処理して第２の表面炭水化物部分の少なくとも一部分をキャップし、それにより、異種移植片を実質的に非免疫原性にすることを含むことができる。
【００４１】
ここで用いる場合、用語「第２の表面炭水化物部分」は、炭水化物鎖の非還元末端のＮ−アセチルラクトサミン残基をいい、この残基は、自然においても又はα−ガラクトシルエピトープの開裂の結果としてもキャップされていない。
【００４２】
更に別の具体例において、この発明は、ヒトへの移植のための骨異種移植片の製造方法であって、非ヒト動物から骨の少なくとも一部分を取り出して異種移植片を準備し；その異種移植片を水及びアルコールで洗い；そしてその異種移植片を殺菌及び細胞破壊処理にかけることを含み、それにより、その異種移植片は、天然の骨の対応する部分と実質的に同じ特性を有し且つ実質的に非免疫原性になる当該製造方法を提供する。
【００４３】
更なる具体例において、この発明は、ヒトへの移植のための軟組織異種移植片の製造方法であって、非ヒト動物から軟組織の少なくとも一部分を取り出して異種移植片を準備し；その異種移植片を水及びアルコールで洗い；その異種移植片を細胞破壊処理にかけ；そしてその異種移植片をプロテオグリカン涸渇因子で消化してその異種移植片からプロテオグリカンの少なくとも一部分を除去することを含み、それにより、その異種移植片が、天然の軟組織の対応する部分と実質的に同じ機械的特性を有し且つ実質的に非免疫原性となる当該製造方法を提供する。
【００４４】
尚更なる具体例において、この発明は、ヒトへの移植のための軟組織又は骨組織からなる異種移植片の製造方法であって、非ヒト動物から軟組織又は骨組織の少なくとも一部分を取り出して異種移植片を準備し；その異種移植片を水及びアルコールで洗い；その異種移植片を細胞破壊処理にかけ；その異種移植片を約０．０１〜０．１０％の範囲のアルデヒドに曝露し；そしてその異種移植片をグリコシダーゼで消化してその異種移植片から第１の炭水化物部分を実質的に除去することを含み、それにより、その異種移植片が実質的に非免疫原性となり且つ天然の軟組織又は骨組織と実質的に同じ機械的特性を有する当該製造方法を提供する。
【００４５】
尚更なる具体例において、この発明は、上記のこの発明の方法の少なくとも１つにより製造した実質的に非免疫原性の軟組織又は骨組織異種移植片を含むヒトへの移植のための製造品を提供する。
【００４６】
他の具体例において、この発明は、非ヒト動物由来の軟組織又は骨組織の一部分を含むヒトへの移植のための軟組織又は骨組織異種移植片であって、その部分が、グリコシダーゼ消化を受けやすい表面炭水化物部分を実質的に有さず、それにより、その部分が、天然の軟組織又は骨組織の対応する部分と実質的に同じ機械的特性を有する上記の異種移植片を提供する。
【００４７】
更に別の具体例において、この発明は、非ヒト動物に由来する軟組織又は骨組織の一部分を含むヒトへの移植のための軟組織又は骨組織異種移植片であって、その部分が、細胞外成分及び実質的に死細胞のみを含み、これらの細胞外成分及び死細胞が実質的に表面α−ガラクトシル部分を有さず且つ表面炭水化物部分の少なくとも一部分に結合したキャッピング分子を有する上記の異種移植片を提供する。この軟組織又は骨組織の部分は、実質的に非免疫原性であり且つ天然の軟組織又は骨組織と実質的に同じ機械的特性を有する。
【００４８】
更なる具体例において、この発明は、ヒトへの移植のための骨異種移植片であって、非ヒト動物に由来する、無菌の、骨の細胞を破壊した部分を含み、それにより、その部分が、実質的に非免疫原性であり且つ天然の骨の対応する部分と実質的に同じ機械的特性を有する上記の骨異種移植片を提供する。
【００４９】
尚更なる具体例において、この発明は、非ヒト動物に由来する軟組織の少なくとも一部分を含むヒトへの移植のための軟組織異種移植片であって、その部分が、細胞外成分及び実質的に死細胞のみを含み、細胞外成分が減少されたプロテオグリカンを有する上記の軟組織異種移植片を提供する。この軟組織の部分は、実質的に非免疫原性であり且つ天然の軟組織と実質的に同じ機械的特性を有する。
【００５０】
尚更なる具体例において、この発明は、非ヒト動物に由来する軟組織又は骨組織の一部分を含むヒトへの移植のための軟組織及び骨組織よりなる異種移植片であって、その部分が、複数の細胞外成分、複数の実質的に死んだ細胞だけ、及び複数の細胞外成分、細胞外成分及びグリコシダーゼ消化を受けやすい表面炭水化物部分を実質的に有しない死細胞を架橋させる約０．０１〜０．１０％の範囲のアルデヒドを含み、それにより、その部分が実質的に非免疫原性になり且つ天然の軟組織又は骨組織の対応する部分と実質的に同じ機械的特性を有する上記の異種移植片を提供する。
【００５１】
好適具体例の詳細な説明
本発明は、ヒトへの移植に関する異種移植片の慢性拒絶に対するものである。従って、この発明の方法に従って生成された軟組織又は骨組織異種移植片は、実質的に非免疫原性であって、一般に、天然の軟組織又は骨組織の機械的特性を保持している。
【００５２】
軟組織又は骨組織は、処理中に幾らか収縮し得るが、この発明により製造した軟組織異種移植片は、天然の軟組織又は骨組織異種移植片の一般的外観を有する。例えば、この発明により製造した内側半月板異種移植片は、天然の内側半月板の一般的外観を有し、この発明の外側半月板異種移植片は、天然の外側半月板の一般的外観を有するであろう。この軟組織又は骨組織異種移植片は又、以下に示すように、セグメントに切って、その各々をレシピエントに移植することもできる。
【００５３】
この発明は、一具体例において、ヒトへの植付けのための異種の軟組織又は骨組織を製造し又は処理する方法を提供する。この軟組織又は骨組織は、任意の非ヒト動物から採取して、この発明の異種移植片を製造することができる。非ヒトトランスジェニック動物由来の又は遺伝的に変化させた非ヒト動物由来の軟組織又は骨組織も又、本発明による異種移植片として利用することができる。好ましくは、ウシ、ヒツジ又はブタの膝関節、一層好ましくはブタの膝関節は、これらの異種移植片の製造のために利用される内側及び外側半月並びに関節軟骨軟組織の源として役立ち得る。好ましくは、ウシ及びブタの関節、一層好ましくはブタの関節が、靭帯軟組織異種移植片の源として役立つ。好ましくは、ブタの腹膜が、心臓弁異種移植片を製造するために利用される軟組織の源として役立つ。或は、ブタの心膜を利用して、本発明の心臓弁異種移植片を形成することができる。好ましくは、ウシ、ヒツジ又はブタの骨が、一層好ましくはブタの骨が、これらの異種移植片を製造するために利用される骨の源として役立つ。一層好ましくは、未成熟の動物の関節は、若い動物の軟組織であればある程、本来的に、一層高齢の動物より一層弾力性で且つ植付け可能であるので、軟組織の源である。一層好ましくは、未成熟のブタ、ウシ又はヒツジの骨は、若い動物の骨であればある程、一層海綿状の骨からなり、一層高齢の動物の骨よりもろくないので、骨の源である。最も好ましくは、源の動物の齢は、屠殺時において、６〜１８月齢である。加えて、膝蓋腱、前部若しくは後部十字形靭帯、アキレス腱又は膝腱を、動物起源から採取して、ドナー靭帯として利用することができる。
【００５４】
この発明の方法の第１のステップにおいて、無傷の軟組織を非ヒト動物から取り出す。内側又は外側半月を、非ヒト動物の膝関節から取り出す。関節軟骨を、非ヒト動物の任意の関節から取り出す。靭帯及び腱例えばアキレス腱並びに無傷の骨部分も、非ヒト動物から取り出す。好ましくは、対応する関節に由来する軟組織を用いて、この発明の軟組織異種移植片を作成する。例えば、大腿骨−脛骨(膝)関節由来の関節軟骨を用いて、膝への移植のための関節軟骨異種移植片を作成する。同様に、ドナー動物の股関節由来の関節軟骨を用いて、ヒトの股関節のための関節軟骨異種移植片を作成する。
【００５５】
軟組織又は骨組織の源は、新鮮な屠殺された動物から採取すべきであり、好ましくは直ちに適当な無菌等張液その他の組織保存溶液中に入れる。軟組織及び骨組織の採取は、動物の屠殺後できるだけ早く行うべきであり、好ましくは、冷却下で即ち約５〜２０℃の範囲で行って軟組織及び骨組織の酵素による分解を最少にすべきである。
【００５６】
軟組織及び骨組織部分は、厳格な無菌技術下で冷却して採取する。
【００５７】
半月軟組織に関しては、最初に膝蓋腱を横に切開することにより、関節を切開する。半月の角から付着組織を切り離す。凡そ直径５ミリメートル、深さ５ミリメートルの実質的に円筒形のプラグを表す少量の骨が、これらの角に付着したままであってよい。半月の滑液連絡を注意深く同定し、半月組織自体から除き、それにより、異種移植片を作成する。
【００５８】
関節軟骨軟組織に関して、軟骨下の骨の小層を伴う関節軟骨の薄皮を、ドナーの関節から削り取って、異種移植片を作成する。
【００５９】
靱帯軟組織に関して、ドナーの関節を標準的な外科的技術により切開する。好ましくは、靱帯を、一端又は両端に付着した骨のブロックと共に採取する(もっとも、この発明の幾つかの形態においては、靱帯を単独で採取するが)。この発明の一形態において、約９〜１０ｍｍの直径で約２０〜４０ｍｍの長さの実質的に円筒状のプラグを表す骨のブロックが、靱帯に付着したままであってよい。この靱帯を注意深く同定して、付着組織を切り離し、それにより、異種移植片を作成する。
【００６０】
心臓弁軟組織に関しては、当業者に公知の手順により、ブタの腹膜又は心膜を採取して、心臓弁異種移植片を形成する。例えば、Laurenの米国特許第４，７５５，５９３号で検討している腹膜採取手順を参照されたい。
【００６１】
骨組織に関しては、採取した骨部分を、ストリップ又はブロックに切って、皮質骨に付着した海綿状骨を伴って又は伴わないで用意する。
【００６２】
この異種移植片を、次いで、約１０倍容の無菌冷水中で洗って、残留血液タンパク質及び水溶性物質を除去する。次いで、この異種移植片を、室温で約５分間アルコールに漬けて組織を殺菌し、非コラーゲン物質を除去する。
【００６３】
半月軟組織異種移植片は、上部側の主表面(上面)が全体に三日月形状で、底部側の主表面(下面)が全体に三日月形状の、Ｃ字形状の光沢のある繊維組織の外観を呈し、これらの上面及び下面の外側部分は外側側方表面により連結され、内側部分は内側側方表面により連結される。
【００６４】
膝関節軟組織異種移植片は、骨基質に支えられたガラス質組織の如き外観を呈し、先端側の主表面(上面)が全体に球形で、骨の下側の表面(下面)は粗くなっている。
【００６５】
アルコール浸漬の後に、異種移植片を、直ちに移植することもできるし、次の処理の少なくとも一つにかけることもできる：照射処理、アルコールでの処理、オゾン処理、一サイクル以上の凍結・解凍、及び／又は化学的架橋剤での処理。これらの処理の１つより多くを異種移植片に適用する場合には、それらの処理は、任意の順序で行うことができる。
【００６６】
この発明の方法の一具体例において、異種移植片を紫外線照射に約１５分間、又は約０．５〜３メガラドの量のガンマ線照射に曝露することにより処理することができる。
【００６７】
他の具体例において、異種移植片を、アルコール溶液中に再度置くことにより処理することができる。任意のアルコール溶液を用いて、この処理を行うことができる。好ましくは、異種移植片を、室温で、イソプロパノールの７０％溶液中に置く。
【００６８】
更に別の具体例においては、異種移植片を、オゾン処理にかけることができる。
この発明の方法の更なる具体例においては、異種移植片を、凍結／解凍サイクルにより処理することができる。例えば、異種移植片を、該異種移植片を完全に凍結させることができるならば即ち未凍結軟組織を含む内部温点を残さない限り、任意の凍結方法を用いて凍結させることができる。好ましくは、異種移植片を、液体窒素に約５分間浸して、この方法のこのステップを実施する。一層好ましくは、異種移植片を、冷凍庫中に置くことにより、ゆっくりと凍結させる。凍結／解凍サイクル処理の次のステップにおいて、異種移植片を、等張塩溶液に室温(約２５℃)で約１０分間浸すことにより解凍する。繊維の分解を最小にするために、外部熱源又は照射源は使用しない。
【００６９】
尚更なる具体例においては、異種移植片を、適宜、化学薬剤に曝露し、細胞外成分内のタンパク質をなめし又は架橋して、異種移植片中に存在する免疫原性の決定基を更に減少させることができる。任意のなめし剤又は架橋剤をこの処理のために用いることができ、完全な架橋を保証し、そうして、異種移植片の免疫原性を最適に減少させるために、一より多くの架橋ステップを実施し又は一より多くの架橋剤を用いることができる。例えば、アルデヒド例えばグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、アジピン酸ジアルデヒド等を用いて、この発明の方法により、異種移植片の細胞外コラーゲンを架橋することができる。他の適当な架橋剤には、脂肪族及び芳香族ジアミン、カルボジイミド、ジイソシアネート等が含まれる。
【００７０】
アルデヒド例えばグルタルアルデヒドを架橋剤として用いる場合には、異種移植片を、約０．００１〜５．０％(好ましくは、約０．０１〜５．０％)のグルタルアルデヒドを含む緩衝溶液(ｐＨ約７．４)中に置くことができる。一層好ましくは、約０．０１〜０．１０％の、最も好ましくは約０．０１〜０．０５％のアルデヒドを用いる。架橋反応の持続期間(１〜１４日間、好ましくは１〜５日間、最も好ましくは３〜５日間)中に溶液のｐＨにわたる制御を維持することが可能であれば、任意の適当な緩衝液例えばリン酸緩衝塩溶液又はトリスヒドロキシメチルアミノメタン等を用いることができる。
【００７１】
或は、異種移植片を、気化アルデヒド架橋剤例えば気化ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドを含む(但し、これらに限らない)蒸気形態の架橋剤に曝露することができる。気化架橋剤は、ある濃度及びｐＨを有することができ、異種移植片を、その気化架橋剤に、架橋反応を生じさせるのに適当な期間曝露することができる。例えば、異種移植片を、約０．００１〜５．０％の、好ましくは約０．０１〜５．０％の濃度及び約７．４のｐＨを有する気化架橋剤に曝露することができる。一層好ましくは、異種移植片を、約０．０１〜０．１０％の範囲のアルデヒドに、最も好ましくは、約０．０１〜０．０５％の範囲のアルデヒドに曝露することができる。異種移植片を、一定期間(１〜１４日間、好ましくは１〜５日間、最も好ましくは３〜５日間であってよい)にわたってアルデヒドに曝露する。気化架橋剤への曝露は、架橋剤曝露より減じた異種移植片中の化学剤を生じ得る。
【００７２】
架橋反応は、免疫原決定基が異種移植片軟組織から実質的に除去されるまで続けるべきであるが、異種移植片の機械的特性の有意の変化の前に終了すべきである。ジアミンも架橋剤として使用する場合には、如何なる未反応のジアミンもキャップされるように、グルタルアルデヒド架橋は、ジアミン架橋の後にすべきである。架橋反応が上記のように完了するまで進行した後に、異種移植片をすすいで残留化学薬剤を除去すべきであり、０．０１〜０．１０Ｍグリシン、好ましくは０．０１〜０．０５Ｍグリシンを加えて、残っている如何なる未反応のアルデヒド基をもキャップすることができる。
【００７３】
上記の処理に加えて又はそれらに代えて、異種移植片を細胞破壊処理にかけて、異種移植片の細胞を殺すことができる。適宜、この細胞破壊処理を、第一の表面炭水化物部分を異種移植片から除去するための異種移植片のグリコシダーゼによる消化の前又は後に行う。軟組織異種移植片に関しては、グリコシダーゼ処理に加えて又は該処理に代えて、グリコシダーゼ処理の前又は後に、軟組織をプロテオグリカン涸渇因子で処理する。更に、グリコシダーゼ及び／又はプロテオグリカン涸渇因子消化(後者は、軟組織異種移植片についてのみ行う)の後に、適宜、キャッピング分子例えばフコシル又はｎ−アセチルグルコサミン分枝の結合を行って、異種移植片の炭水化物鎖の表面Ｎ−アセチルラクトサミン末端をキャップする。
【００７４】
この発明のこの方法の具体例において、異種移植片を細胞破壊処理にかけて、軟組織又は骨組織の細胞を殺す。典型的には、表面炭水化物部分を生細胞及び細胞外成分から除去した後に、それらの生細胞は、表面炭水化物部分を再発現する。異種移植片の抗原性部分の再発現は、異種移植片の継続された免疫原性拒絶を誘発し得る。対照的に、死細胞は、表面炭水化物部分を再発現することができない。異種移植片の死細胞及び細胞外成分からの抗原性表面炭水化物部分の除去は、実質的に、永久的に、異種移植片の免疫原性拒絶の起源としての抗原性表面炭水化物部分を除去する。
【００７５】
従って、上記の具体例において、本発明の異種移植片を、上記のように、凍結／解凍サイクルにかけて、軟組織又は骨組織の細胞を破壊する(即ち、殺す)。或は、本発明の異種移植片を、０．２〜約３メガラドの量を有するガンマ線照射により処理する。かかる照射は、軟組織又は骨組織の細胞を殺し且つ異種移植片を殺菌する。一度殺せば、それらの軟組織又は骨組織の細胞は、もはや、移植された異種移植片の免疫原性拒絶における因子である抗原性の表面炭水化物部分例えばα−ｇａｌエピトープを再発現することはできない。
【００７６】
この発明の具体例においては、軟組織又は骨組織細胞を殺す前又は後の何れかにおいて、異種移植片を、グリコシダーゼ特にガラクトシダーゼ(例えば、α−ガラクトシダーゼ)によるイン・ビトロ消化にかけて、抗原性表面炭水化物部分を酵素的に除去する。特に、α−ｇａｌエピトープは、下記の反応に示したように、α−ガラクトシダーゼによる酵素処理によって除去される：
【化１】
【００７７】
α−ｇａｌエピトープの異種移植片からの除去は、異種移植片に対する免疫拒絶を低減させる。α−ｇａｌエピトープは、非霊長類哺乳動物及び新世界猿(南米の猿)において、１×１０6〜３５×１０6エピトープ／細胞で発現され、並びに細胞外成分の巨大分子例えばプロテオグリカンにおいて発現される。U. Galili等、Man, apes, and Old World monkeys differ from other mammals in the expression of α-galactosyl epitopes on nucleated cells, 263 J.Biol.Chem.17755(1988)。しかしながら、このエピトープは、旧世界霊長類(アジア及びアフリカの猿、及び類人猿)及びヒトには存在しない。同上。抗Ｇａｌは、ヒト及び霊長類において、胃腸管内の細菌上のα−ｇａｌエピトープ炭水化物構造に対する免疫応答の結果として生成される。U. Galili等、Interaction between human natural anti-α-galactosyl immunoglobulin G and bacteria of the human flora, 56 Infect.Immun.1730(1988)；R.M. Hamadeh等、Human natural anti-Gal IgG regulates alternative complement pathway activation on bacterial surface, 89 J.Clin.Invest.1223(1992)。非霊長類哺乳動物はα−ｇａｌエピトープを生成するので、これらの哺乳動物から霊長類への異種移植片の異種移植は、異種移植片上のこれらのエピトープに結合する霊長類の抗Ｇａｌの故に、拒絶を生じる。この結合は、補体結合により及び抗体依存性の細胞障害性により、異種移植片の破壊を生じる。U. Galili等、Interaction of the natural anti-Gal antibody with α-galactosyl epitopes: A major obstacle for xenotransplantation in humans, 14 Immunology Today 480(1993)；M. Saandrin等、Anti-pig IgM antibodies in human serum react predominantly with Galα1-3Gal epitopes, 90 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 11391(1993)；H. Good等、Identification of carbohydrate structures which bind human anti-porcine antibodies: implications for discordant grafting in man. 24 Transplant.Proc.559(1992)；B.H. Collins等、Cardiac xenografts between primate species provide evidence for the importance of the α-galactosyl determinant in hyperacute rejection, 154 J.Immunol.5500(1995)。更に、異種移植は、増大された量の高親和性の抗Ｇａｌを産生する免疫系の主要な活性化を生じる。従って、異種移植片の細胞及び細胞外成分からのα−ｇａｌエピトープの実質的な除去及び細胞のα−ｇａｌエピトープの再生の阻止は、α−ｇａｌエピトープと結合する抗Ｇａｌ抗体と関連する異種移植片に対する免疫応答を低減させることができる。
【００７８】
更に、本発明の軟骨軟組織異種移植片は、イン・ビトロでの、α−ｇａｌエピトープの酵素的除去に対して特によく研究されている。臓器その他の組織と対照的に、軟骨細胞外成分は、極めてゆっくりしたターンオーバーを受ける。その上、一度軟骨細胞即ち繊維軟骨細胞が殺されれば、これらの細胞は、上記のように、α−ｇａｌエピトープを再発現させることを阻止される。
【００７９】
加えて、軟組織又は骨組織異種移植片を、グリコシダーゼ処理の前又は該処理と同時にポリエチレングリコール(ＰＥＧ)で処理することができる。ＰＥＧは、酵素とコラーゲン(細胞外成分)に共有結合することによりグリコシダーゼに対するキャリアーとして作用する。更に、ＰＥＧ処理した異種移植片は、減少した免疫原性を有する。
【００８０】
軟組織異種移植片に関して、かかる組織細胞を殺す前又は殺した後に、この発明の具体例において、異種移植片を、一種以上の異なる種類のプロテオグリカン涸渇因子を用いて洗い又は消化する。このプロテオグリカン涸渇因子での処理は、グリコシダーゼ処理の前であっても後であってもよい。プロテオグリカン例えばグリコサミノグリカン(ＧＡＧ)は、本発明の異種移植片の細胞外成分内で、個々の分子として均一に又は変化する量で散在される。これらのＧＡＧは、ムコ多糖分子例えばコンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸、及びこれらの混合物を含む。ＧＡＧ等を含むプロテオグリカンは、付着された炭水化物例えばα−ｇａｌエピトープを含む。かかるエピトープは、上記のように、一度異種移植片が移植されれば、免疫応答を刺激する。異種移植片をプロテオグリカン涸渇因子で洗い又は消化することは、プロテオグリカン及び付着したα−ｇａｌエピトープの少なくとも一部分を異種移植片の細胞外成分から除去し、それにより、移植の際の異種移植片に対する免疫応答を低減させる。このプロテオグリカン涸渇因子処理及びそれに続く移植の後に、天然の組織は、残留コラーゲンシェルを再増殖させることができる。
【００８１】
本発明で用いるプロテオグリカン涸渇因子の非制限的例には、プロテオグリカン涸渇酵素例えばコンドロイチナーゼＡＢＣ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチンＡＣＩＩリアーゼ、ケラタナーゼ及びトリプシンが含まれる。
【００８２】
本発明で用いられる他のプロテオグリカン涸渇因子には、フィブロネクチンの断片が含まれる。Homanberg等は、フィブロネクチンの断片例えばアミノ末端の２９ｋＤａの断片が関節軟骨軟組織の外面に結合し、その軟骨を透過してそれらの軟骨細胞を取り囲むということを示唆している。G.A. Homandberg等、Fibronectin-fragment-induced cartilage chondrolysis is associated with release of catabolic cytokines, Biochem.J.(1997)321,751-757；G.A. Homandberg等、Hyaluronic acid suppresses fibronectin fragment mediated cartilage chondrolysis: I. In vitro, Osteoarthritis and Cartilage(1997)5, 309-319；G.A.Homandberg等、High concentrations of fibronectin fragments cause short- term catabolic effects in cartilage tissue while lower concentrations cause continuous anabolic effects, Archives Of Biochemistry And Biophysics, Vol. 311, No. 2, June, p.213-218(1994)；G.A. Homandberg等、Agents that block fibronectin fragment-mediated cartilage damage also promote repair, Inflammation Research 46(1997)467-471。選択した濃度において、Homandberg等は、更に、かかるフィブロネクチンの軟骨への添加が、イン・ビトロ又はイン・ビボにおいて、プロテオグリカン合成の一時的な抑制及び細胞外メタロプロテイナーゼの増強を生じ、これは更にプロテオグリカンの軟骨組織からの迅速な消失を引き起こすということを示唆している。同上。
【００８３】
しかしながら、他の当業者に公知のプロテオグリカン涸渇因子も又、本発明で利用することができる。本発明の異種移植片を、プロテオグリカンの少なくとも一部分を異種移植片の細胞外成分から除去するのに有効な量のプロテオグリカン涸渇因子で処理する。好ましくは、異種移植片を、約１．０〜１００．０ＴＲＵ／ｍｌの量のヒアルロニダーゼ等のプロテオグリカン涸渇因子で、又は約０．０１〜２．０ｕ／ｍｌ(最も好ましくは、約１．０〜２．０ｕ／ｍｌ)の量のコンドロイチナーゼＡＢＣ等のプロテオグリカン涸渇因子で処理する。この異種移植片は又、約０．０１〜１．０μＭ(好ましくは、約０．１〜１．０μＭ)の量のプロテオグリカン涸渇因子例えばフィブロネクチン断片(例えば、アミノ末端の２９ｋＤａのフィブロネクチン断片)で処理することもできる。
【００８４】
グリコシダーゼ処理又はプロテオグリカン涸渇因子処理(後者は、軟組織異種移植片についてだけ行う)の後に、異種移植片の残留炭水化物鎖(例えば、グリコサミノグリカン)を、適宜、キャッピング分子で処理して残留炭水化物鎖の少なくとも一部分をキャップする。しかしながら、キャッピング分子での処理は、グリコシダーゼ処理した異種移植片とグリコシダーゼ処理してない異種移植片の両方に適用可能である。例えば、α−ｇａｌエピトープを欠くであろうノックアウト動物由来の異種移植片を、キャッピング分子で処理して異種移植片上の炭水化物部分をキャップし、それにより、その異種移植片の免疫原性を低減させることができる。本発明で用いるキャッピング分子の例には、フコシル及びＮ−アセチルグルコサミンが含まれる。
【００８５】
処理の前に、異種移植片の外面(例えば、半月軟組織異種移植片の外側面)に、適宜、穴を開けて、使用する薬剤に対する透過性を増大させて、その異種移植片を実質的に非免疫原性にすることができる。無菌の外科用針例えば１８ゲージの針を用いて、この穴あけステップを行うことができ、或は、複数の針を有する櫛様器具を用いることもできる。この穴あけは、異種移植片の内部への所望の進入路を確立するために、様々なパターンで、又、様々な穴間距離で行うことができる。穴あけは又、レーザーを用いて行うこともできる。この発明の一形態においては、約３ミリメートル離れた一本以上の刺し穴の直線を、異種移植片の外側面の周囲に設ける。
【００８６】
移植の前に、この発明の軟組織又は骨組織異種移植片を、タンパク質分解酵素例えばフィシン若しくはトリプシンによる限定的消化により処理して、組織の柔軟性を増大させ、又は抗石灰化剤、抗血栓コーティング、抗生物質、成長因子、若しくは他の異種移植片のレシピエントの関節への組込みを促進させ得る薬物で被覆することができる。この発明の軟組織異種移植片を、更に、公知の方法例えば更なるグルタルアルデヒド若しくはホルムアルデヒドでの処理、エチレンオキサイド殺菌、プロピレンオキサイド殺菌等を用いて殺菌することができる。この異種移植片を、用いる必要が生じるまで、凍結して保存することができる。
【００８７】
更に、この発明の骨異種移植片を、軟組織細胞の骨組織フォーマーへの変換を刺激するのに十分な量の骨誘導因子で処理することができる。別法として又は加えて、骨誘導因子を、直接、標的の欠損に対して投与することができる。ここで用いる場合、用語「骨誘導因子」は、未決定結合組織細胞の骨形成細胞への分化を刺激するタンパク質をいう。J.M. Lane等、Current Approaches to Experimental Bone Grafting, 18 Orthopedic Clinics of North America(2)214(1987)。
【００８８】
移植片に対する又は標的の欠損に対する骨誘導因子を調製して投与する方法は、Sharon Stevenson, D.V.M., Ph.D.等、The Effect of Osteogenic (A Bone Morphogenetic Prtein) on the Formation of Bone in Orthotopic Segmental Defects in Rats, 76, A. The Journal of Bone And Joint Surgery No. 11, 1676-1687 (1994)及びJohn E. Feighan等、Induction of None by a Demineralized Bone Matrix Gel: A Study in a Rat Femoral Defect Model, 13 Journal of Orthopaedic Research 881-889 (1995)等の従来技術において公知である。例えば、合成キャリアー例えばヒドロキシアパタイトセラミック円筒の存在下で又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)又はグリセロール等のキャリアー、又は緩衝液例えばホスフェート、及び／又は上記の任意の組合せを用いて、ゲル形態の骨誘導因子を欠損部位に投与し及び／又は異種移植片を浸すことができる。
【００８９】
骨誘導因子を、異種移植片の間隙及び／又は欠損部位に、骨形成を誘導するのに有効な量で加える。例えば、約１０〜２００ｍｇの投与量の骨誘導因子を加えることができる。本発明で用いることのできる骨誘導因子の例には、骨形態形成タンパク質(ＢＭＰ)及び関連非コラーゲン様タンパク質(ＮＣＰ)が含まれる。かかる骨誘導因子は、例えば、マサチューセッツ、Hopkington, Creative Biomolecules, Inc.から市販されている。
【００９０】
この発明の骨異種移植片も又、その異種移植片の細胞外マトリクスからカルシウム等のミネラルを実質的に除去するのに有効な量の脱ミネラル化剤で処理することができる。例えば、この発明の異種移植片を、脱ミネラル化剤例えば塩酸及び他の当業者に公知の脱ミネラル化剤を、予め決めた濃度で含む溶液に浸して、この発明の異種移植片を実質的に脱ミネラル化することができる。一度ミネラルが異種移植片から除去されれば、約５０〜５００ミクロンの寸法の細孔を有する多孔性の容積マトリクスが形成される。脱ミネラル化した細胞外骨マトリクスのコラーゲンは骨伝導性足場として役立ち、一度骨移植片が移植されれば、骨形成成分の移動を容易にするということが、理論化されている。J.M. Lane等、Current Approaches to Experiment Bone Grafting, 18 Orthopedic Clinics of North America (2)220(1987)。脱ミネラル化した骨は、骨のミネラルが骨誘導因子の細胞外骨マトリクスからの放出を妨げるので、例えば自己の骨より一層大きい骨誘導活性を有するということが、更に、理論化されている。同書、２１８。この理論によれば、脱ミネラル化は、周囲の応答性の細胞の骨誘導タンパク質への接近を大きくし、骨誘導タンパク質の潜在能力を増大させる。かかる脱ミネラル化剤は、例えば、ミズーリ、St.Louis, Sigma, Inc.から市販されている。
【００９１】
加えて、結合剤を本発明の骨異種移植片に加えることができる。ここで用いる場合、結合剤は、接着分子、又は接着性タンパク質若しくはその類似体であり、これは、骨形成細胞が付着することのできる粘着面を与えることにより骨の形成を助成する。この結合剤を、間充織及び他の分化した骨形成細胞の骨異種移植片の細胞外マトリクスへの付着を促進するのに有効な量で加える。本発明において有用な結合剤の例には、骨セメント；フィブリングルー；イガイグルー、幾つかのイガイ属ミチルス種から得られた生物粘着性ポリフェノールタンパク質を含むイガイグルー(例えば、米国特許第４，５８５，５８５号参照)；コンドロネクチン；オステオネクチン；並びにフィブロネクチン及びアルギニン−グリシン−アスパラギン酸(ＲＧＤ)ペプチド(例えば、米国特許第５，６８１，３５３号参照)(一部分は、例えば、コンドロイチン硫酸に結合することができる)、並びに当業者に公知の他の結合剤が含まれる。かかる結合剤は、例えば、カリフォルニア、San Diego, Telios Pharmaceuticals, Inc.から市販されている。
【００９２】
この発明の軟組織若しくは骨組織異種移植片又はそのセグメントは、当業者により、公知の関節鏡外科手術の技術を用いて、損傷を受けたヒトの関節に移植することができる。関節鏡技術を実施するための特殊な器具は、当業者に公知であり、軟組織移植物の正確且つ再現可能な配置を確実にする。
【００９３】
半月軟骨軟組織異種移植片の移植
半月軟骨の置き換えの成功のためには、下記のゴールが、達成されるのが好ましい：
１．天然の半月軟骨の引き裂かれた断片は、除去しなければならない。
２．半月角の付着部位は、解剖学的位置になければならない。
３．半月移植物の周辺は、軸方向及び回転方向の負荷を許容するのに十分なだけ確実に結合されなければならない。
４．膝関節の周囲被膜及び靱帯は、過度に妨害されてはならず、また固定技術によって拘束されてもならない。以下に詳細に記載する半月の移植方法は、K.R. Stone等のArthroscopy:The Journal of Aryhroscopic and Related Surgery 9,234-237(1993)から誘導される。本発明の異種性半月異種移植片を使用するために他の半月移植法を使用することもできる。
【００９４】
最初に、公知の方法を使用して、膝関節の完全診断関節鏡検査法を実施する。もしもＡＣＬ外科手術を同時に実施しようとするならば、十字形再形成のための大腿骨及び脛骨トンネルを先ず穿孔すべきである。半月軟骨の断裂部分を測定する。もしも組織がひどく引裂かれ又は低品質のために半月修復を達成することができないならば、軟骨組織の断裂部分を除去することによって半月リムの調製を行う（図３）。ヒトの半月全体をこの発明の異種性半月異種移植片によって置き換えるべきときは、ヒトの半月の殆ど全部を除去する。加えて、ヒトの半月全体をこの発明の異種性半月異種移植片によって置き換えるためには、骨プラグを受け入れるためにヒト半月板角の切除及び骨のトンネルの調製が要求される場合がある。ヒトの半月の一部分だけをこの発明の異種性半月異種移植片の一部分によって置き換えるときには、損傷を受けた部分だけを除去し、異種性半月異種移植片の一部分の結合のための周辺リムや角は保存される。半月リムが全く存在しない場合には、半月の部分的置換は実施すべきでない。もしも関節が過度に固い場合には、関節伸延器を適用することができ、又は内側の側副靱帯を一部分離すことができる。
【００９５】
内側及び外側半月の交換では、関節鏡を中間外側又は前部外側門(portal)に挿入し、脛骨ガイドを後部内側門を通して挿入する。ガイドの先端をまず半月の後部角にもたらす。後部内側角は脛骨隆起の後部傾斜部に挿入されることに注意すべきである。ドリルピンを次に脛骨粗面の前部内側から後部角挿入部にもたらす（図４）。ピンの設置は関節鏡を顆間切痕を通して挿通し、ピンの出位置を見ることで確認できる。膝の後部被膜を通しての貫通を回避するために非常な用心をして神経血管束を傷つけないようにすべきである。ピン位置が確認されたら、ピンをつぎに４．５ｍｍカニューレ付きのドリルビットで（随意にドリルストップで後部被膜貫通を防止する）オーバー穿孔する（図５）。ビットは所定の位置に残され、縫合糸挿通子の通過のためのトンネルとして使用する。縫合糸はJohnson & Johnson社より市販の＃２Ｅｔｈｉｂｏｎｄ（商標）等がある。縫合糸はドリルビットの孔に通され、そしてドリルビットは除去され、そして縫合糸は所定位置に残される。
【００９６】
ヒトの前部内側半月の挿入点はかなり変動し、最も頻繁には内側脛骨隆起の前部に見いだされる。外側半月の前部角は前部十字形靱帯の後部に挿入される。前部ドリル穴はまず、外側半月の前部角の挿入点を同定し、ドリルガイドのチップを配置して相対的に垂直穴が形成されるようにする（図６）。ドリルピンを配置し、ついでカニューレを挿入したドリルビットを使用してドリルピン位置を越えてドリルし、後部ドリル穴を形成する。縫合糸挿通子を全部ドリル穴に配置する。別法として、内側半月の前部角を縫合アンカーによりドリル穴に対向して骨に直接固定する。
【００９７】
縫合糸が前部及び後部ドリル穴により捕捉されるまえに、前門が約２ｃｍに拡張される。縫合糸の捕捉子は次に拡張された門を通され、前部及び後部縫合糸は同時に引き出される。この技術は縫合糸が脂肪パッド及び被膜組織の２つの面で絡まないようにする。
【００９８】
移植片は今やフィールドにもたらされる。２つの水平マットレス縫合糸は例えば＃２−０Ｅｔｈｉｂｏｎｄ（商標）等であり、異種性半月移植片の各角を通され、その自由端は内部表面から出る（図７）。２本の後部縫合糸は次に膝を通して引かれ、後部脛骨トンネルを出る（図８）。もしも内側及び外側門からみると、後部外側門は移植片を内側に押して２．５ｃｍの切開を通して所定位置にもたらすためのプローブ挿入に使用できる。挿入カニューレは必要がない。前部縫合糸をついで同様に通過せしめられる。角縫合糸は次に前部脛骨骨ブリッジに渡り結ばれる。
【００９９】
次に、帯域特異的半月修復カニューレが所定位置にもたらされる。内側挿入のために、後部内側垂直切開が膝の背面から３分の１のところに形成されて、伏在静脈神経の保護がなされ、又、裏返した半月板修復針の回収の用意がされる。通常、第２の垂直切開が、前部内側関節鏡門に接して前部に更に必要であり、それにより前部に出る針を捕捉するようにする。これらの２つの切開部を通じて縫合針は捕捉でき、結び目は被膜の上に直接置かれる（図９）。
【０１００】
半月板修復針を使用するとき、まず垂直且つ均等に離間した縫合糸を有する後部カニューレを使用すべきである。修復は後部から前部に進行し、その結果異種移植片の内部に座屈が生じないようにする。各結び目は縫合糸の絡みを生じないようにそのまま結束される。結び目はほぼ４ｍｍの間隔にされる。膝は数個の完全な運動範囲でサイクルし、異種移植片の運動が円滑になるように保証する。
【０１０１】
外側半月の取り替えを行うときは、内側門が異種移植片の挿入に適当である。これには靱帯粘膜の切除と脂肪パッドの一部の除去が必要となろう。外側半月の後部角に対するドリルガイドが前部内側門を通して挿入される。外側脛骨棘の後部傾斜が、正確な半月角挿入のために同定されなければならない。前部角は前部十字形靱帯の外側に近接して外側脛骨棘の前部傾斜に挿入される。これらの穴を内側からあける利益は、トンネルの拡開が大きくなり、各角挿入体の間の大きい骨ブリッジを提供できることである。挿入技術の残りは同じであるが、後部角を縫合するときに神経血管束を注意深く保護すべきである。後部外側からの接近は、共通の腓骨神経を保護し、外側被膜を露出するために必要である。もしも縫合場所の疑問があれば、解放した後部角縫合は標準法に従って行うべきである。別法として、半月の及び／又は安定化装置例えば矢又は綴針などを使用することができる。Bionix, Inc., Malvern, PAにより製造されている安定化矢はかかる安定化矢の一例である。他の安定化装置は当業者に知られているものが使用できる。
【０１０２】
日常的な皮膚クロージャー及び手当て用品も使用できる。３０ｍｌの０．５％Ｍａｒｃａｉｎｅ（Astra社製）をエピネフリンと共に必要ならば注入できる。術後ヒンジ膝補強材を適用して屈伸の範囲を９０度、伸縮の範囲を３０度に限定することができる。
【０１０３】
関節軟骨軟組織異種移植片の移植
レシピエントの関節の下にある骨床を、骨バーを用いて準備して、海綿状の出血床を生成する。移植は、関節表面又は関節表面の一部分を含むことができる。この発明の実質的に非免疫原性の関節軟骨異種移植片をレシピエントの関節に覆いとして適用し、それを少なくとも一の縫い糸アンカー、吸収性のピン、スクリュー、ステープル等により適所に保持する。フィブリン血餅も又、実質的に非免疫原性の関節軟骨異種移植片を適所に保持するために利用することができる。
【０１０４】
靭帯軟組織異種移植片の移植
回復できないダメージを受けた靭帯は、外科用シェーバーを用いて除去する。この靭帯の解剖学的挿入部位を同定し、穴をあけて骨プラグを適応させる。この骨プラグの大きさは、幅約９〜１０ｍｍ、深さ約９〜１０ｍｍ、長さ約２０〜４０ｍｍであってよい。この異種靭帯を、ドリル穴を通して運び、干渉スクリューを用いて固定する。日常的閉鎖を行う。
【０１０５】
この発明を、更に、下記の実施例により説明するが、これは、制限と解するべきではない。この出願中で引用されるすべての参考文献並びに公開された特許及び特許出願の内容を、本明細書中に参考として援用する。
【０１０６】
心臓弁軟組織異種移植片の移植
この発明の心臓弁異種移植片又はそのセグメントは、ブタの腹膜又は心膜から形成することができ、損傷を受けた心臓弁を置換し及び／又は修復することができる。かかる技術は、移植物の正確且つ再現性のある配置を保証する特殊な器具を用いて実施され、該器具は、当業者に公知である。
【０１０７】
骨組織異種移植片の移植
この発明の骨異種移植片又はそのセグメントは、損傷を受けたヒト関節に、当業者により、公知の関節鏡外科技術を用いて移植することができる。骨の穴に、標準的外科技術により、手作業で、骨を詰める。外科技術を実施するための特殊な器具は、骨移植物の正確且つ再現性のある配置を確実にし、該器具は、当業者に公知である。
【０１０８】
実施例１：α−Ｇａｌエピトープのα−ガラクトシダーゼによる軟組織からの除去についてのアッセイ
この実施例においては、α−ｇａｌエピトープの軟組織からの除去をアッセイするためにＥＬＩＳＡアッセイを行う。
【０１０９】
糖タンパク質上のα−ｇａｌエピトープに対して高度に特異的なモノクローナル抗Ｇａｌ抗体(Ｍ８６という)を、抗Ｇａｌを生成する、α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼについての抗Ｇａｌ産生用ノックアウトマウスに由来する脾臓細胞とマウスハイブリドーマ融合パートナーとの融合により生成する。
【０１１０】
Ｍ８６の糖タンパク質上のα−ｇａｌエピトープに対する特異性を図１１に示す。Ｍ８６は、●−ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、▲−ウシチログロブリン(これは、１１のα−ｇａｌエピトープを有する。R.G. Spiro等、Occurrence of α-D-galactosyl residues in the thyroglobulin from several species. Localization in the saccharide chains of complex carbohydrates, 259 J.Biol.Chem.9858(1984))；又は■−マウスラミニン(これは、５０のα−ｇａｌエピトープを有する。R.G. Arumugham等、Structure of the asparagine-linked sugar chains of laminin. 883 Biochem.Biophys.Acta 112(1986))に結合された合成のα−ｇａｌエピトープに結合するが；□−ヒトチログロブリン又はヒトラミニン、○−Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＢＳＡ(Ｎ−アセチルラクトサミン−ＢＳＡ)及びＧａｌα１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＢＳＡ(ＢＳＡに結合されたＰ１抗原)(これらは、すべて、完全にα−ｇａｌエピトープを欠く)に結合された合成のα−ｇａｌエピトープには結合しない。結合は、Ｍ８６組織培養培地の種々の希釈物にて測定する。
【０１１１】
一度Ｍ８６抗体が単離されれば、このモノクローナル抗体を約１：２０〜１：１６０に希釈し、好ましくは約１：５０〜１：１３０に希釈する。この抗体を、約５〜２４時間の予め決めた時間、約３〜８℃の予め決めた温度でインキュベートする。この抗体を、約５〜１００μｍの大きさの軟組織の断片と、好ましくは約１０〜５０μｍの大きさの軟組織断片と、約２００〜１．５ｍｇ／ｍｌの様々な軟組織濃度で、一定の回転で維持する。その後、これらの軟組織断片を、遠心速度約２０，０００〜５０，０００×ｇの遠心分離により除去する。軟組織に結合したＭ８６の割合を、従来技術(例えば、U. Galili等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: II. Changes in anti-Gal response during chronic rejection, 63 Transplantation 645-651(1997))に記載されたように、α−ｇａｌ−ＢＳＡを用いるＥＬＩＳＡにおいて、上清に残っているＭ８６活性を測定することにより評価する。Ｍ８６の軟組織に対する結合の程度を、その後のα−ｇａｌ−ＢＳＡへの結合の阻害パーセンテージとして規定する。軟組織中のα−ｇａｌエピトープの量と軟組織断片と複合体形成して上清から除去されたＭ８６の割合(即ち、阻害パーセンテージ)の間には、直接的相関関係がある。
【０１１２】
このアッセイの例を図１２に示す。ホモジェナイズした半月軟骨(○)又はα−ガラクトシダーゼで処理した半月軟骨(●)の断片を、Ｍ８６モノクローナル抗体(１：１００で希釈)と４℃で２０時間インキュベートする。その後、これらの半月軟骨断片を、３５，０００×ｇでの遠心分離により除去し、上清中に残存しているＭ８６を、固相抗原としてのα−ｇａｌ−ＢＳＡを用いるＥＬＩＳＡでアッセイする。図１２は、半月軟骨の２００Ｕ／ｍｌのα−ガラクトシダーゼでの４時間３０℃での処理及びその後の５回のリン酸緩衝溶液(ＰＢＳ)での洗浄がα−ｇａｌエピトープを完全に除去することを示している。従って、その後は、２００ｍｇ／ｍｌという高い半月軟骨断片濃度であっても、Ｍ８６のα−ｇａｌ−ＢＳＡへの結合を阻害するものは存在しない。
【０１１３】
実施例２：移植されたα−ガラクトシダーゼで処理したブタ半月軟骨、関節軟骨、靱帯及び心臓弁軟組織異種移植片に対する霊長類の応答の評価
この実施例においては、ブタ半月軟骨、関節軟骨、靱帯及び腹膜心臓弁軟組織移植物をα−ガラクトシダーゼで処理して、α−ガラクトシルエピトープを除去し、それらの移植物をカニクイザルに移植して、その霊長類のこれらの軟組織移植物に対する応答を評価する。
【０１１４】
ブタの膝関節を無菌的に用意し、半月軟骨及び関節軟骨並びに他の周囲の付着軟組織を外科的に取り出す。ブタの腹膜も、心臓弁異種移植片を形成するために採取して、付着脂肪及び／又は筋肉組織を外科的に除去する。これらの半月軟骨、関節軟骨及び心臓弁軟組織試料を少なくとも５分間、アルコール例えばエタノール又はイソプロパノールで洗って滑液及び脂溶性夾雑物を除去する。これらの半月軟骨、関節軟骨及び心臓弁軟組織試料を、約−３５〜−９０℃の温度で、好ましくは約−７０℃の温度で凍結させて、これらの試料の繊維軟骨細胞を破壊する(即ち、殺す)。
【０１１５】
ブタの膝関節も、無菌的に用意し、一端又は両端に骨のブロックが付着した靭帯を低温で、厳密な無菌技術の下で取り出す。各骨のブロックは、直径約９ｍｍで長さ約４０ｍｍの実質的に円筒状のプラグを表す。各靭帯軟組織試料を注意深く同定して、付着組織を切り取って、異種移植片を形成する。この靭帯軟組織異種移植片試料を、次いで、アルコール例えばエタノール又はイソプロパノールで少なくとも５分間洗って、滑液及び脂溶性の夾雑物を除去する。その後、これらの試料を約−７０℃の温度で凍結させて、靭帯試料の細胞を破壊する(即ち、殺す)。
【０１１６】
各半月軟骨、関節軟骨、心臓弁及び靭帯軟組織資料を２つの部分に切断する。各第１の部分を、α−ガラクトシダーゼを予め決めた濃度で含む緩衝溶液に浸す。これらの試料を、これらの緩衝溶液中で、予め決めた時間、予め決めた温度でインキュベートする。各第２の部分を、対応する第１の部分と同じ条件下で、α−ガラクトシダーゼの非存在下でインキュベートする(これは、対照として役立つ)。
【０１１７】
このインキュベーションの最後に、これらの軟組織異種移植片試料を、酵素を拡散させる条件下で洗う。アッセイを行って、α−ｇａｌエピトープの完全な除去を確認する。
【０１１８】
各半月軟骨軟組織異種移植片試料を、６匹のカニクイザルの膝蓋骨嚢に移植する。これらの動物を全身吸入麻酔下で用いて、その膝蓋骨嚢に直接約１ｃｍの切開を中心方向に伸びる膝蓋骨の上部内側の境界に作る。約０．５〜１ｃｍの長さのブタ軟骨軟組織の断片を、この嚢内に単一の３−０ナイロン縫合糸を標識として用いて配置させる。
【０１１９】
関節軟骨異種移植片試料を、上記の移植手順に実質的に従って、６匹のカニクイザルの膝蓋骨嚢に移植する。
【０１２０】
ブタの腹膜から心臓弁を形成して、その心臓弁異種移植片試料を、６匹のカニクイザルに、当業者に公知の心臓弁移植手順に従って移植する。
【０１２１】
靱帯軟組織異種移植片試料を、下記の移植手順に従って、６匹のカニクイザルに移植する。これらの動物を全身吸入麻酔下で用いて、この異種性靱帯の解剖学的挿入部位を同定して、実質的に９ｍｍの直径で４０ｍｍの長さの骨プラグを適応させるためのドリル穴を開ける。この異種性靱帯をドリル穴を通して運び、干渉スクリューを用いて添付する。
【０１２２】
移植手順を、無菌の外科的手順により実施し、傷を３−０ビクリル又は当業者に公知の適当な同等物を用いて閉じる。これらの動物をケージ内で自由に活動させて、不快、腫脹、感染又は拒絶の如何なる徴候をも監視する。血液試料(約２ｍｌ)を、抗体をモニターするために、周期的(２週毎)に採取する。
【０１２３】
異種移植片に対する免疫応答が生じたことは、移植を受けたサルからの血清試料中の抗Ｇａｌ及び非抗Ｇａｌ抗軟組織抗体(即ち、α−ｇａｌエピトープ以外の軟組織抗原に結合する抗体)を測定することにより評価する。少なくとも２ｍｌの血液試料を、移植を受けたサルから、移植の外科手術の日に採取し且つ移植後周期的に(例えば、２週間毎に)採取する。これらの血液試料を遠心分離して、血清試料を凍結させ、抗Ｇａｌ及び他の非抗Ｇａｌ抗軟組織抗体活性について評価する。
【０１２４】
抗Ｇａｌ活性を、血清試料中で、α−ｇａｌ−ＢＳＡを固相抗原として用いるＥＬＩＳＡにおいて、当業者に公知の方法例えばGalili等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: II. Changes in anti-Gal response during chronic rejection, 63 Transplantation 645-651(1997)に記載された方法に従って測定する。
【０１２５】
アッセイを行って、α−ガラクトシダーゼ処理した異種移植片が抗軟組織抗体の形成を誘導するかどうかを測定する。抗軟組織抗体活性を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを、当業者に公知の方法例えばK.R. Stone等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chronic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645(1997)により記載された方法に従って行う。
【０１２６】
軟組織異種移植片試料を、適宜、移植後１〜２ヶ月の時点で外植し、炎症性浸潤の組織学的評価のために切片を作成して染色する。抗Ｇａｌその他の抗軟骨軟組織抗体活性の移植後の変化は、移植後１〜２ヶ月で、外植軟組織内における炎症性の組織学的特性(即ち、顆粒球又は単核細胞浸潤物)と相関している(当業者に公知の方法例えばK.R. Stone等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chronic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645(1997)に記載された方法を使用)。
【０１２７】
軟組織を外植する場合には、軟組織異種移植片を、麻酔手順、関節の外科的露出、移植物の撤去及び軟組織の閉鎖の手順を用いて、無菌的に採取する(動物を快復させる場合)。移植片の肉眼的及び組織学的評価が移植軟組織のよい成績を示しているならば、異種移植片撤去時に、関節液を(吸引に十分な量あれば)膝関節から免疫学的試験用に集める。
【０１２８】
これらの半月軟骨又は関節軟骨異種移植片の移植を有する動物を快復させて、切開部が癒えて足取りが正常になるまでしっかりとモニターする。これらの異種移植片試料を、集め、処理して、顕微鏡検査を行う。
【０１２９】
半月軟骨、関節軟骨、心臓弁及び靱帯移植物及び周囲組織の部分を、免疫組織化学評価のための包埋型中の凍結組織試料用に、従来技術において公知の方法により、包埋媒質中で凍結させる。「ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ(登録商標)」Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド(約１０％ｗ／ｗポリビニルアルコール、約４％ｗ／ｗポリエチレングリコール及び約８６％ｗ／ｗ非反応性成分を含み、Sakura FinTek, Torrence, カリフォルニアにより製造されている)は、本発明での使用のための可能な包埋媒質の非制限的例である。他の当業者に公知の包埋用媒質も又、用いることができる。残りの移植物及び周囲組織を、組織病理学的検査用に、１０％の中性緩衝ホルマリン中に集める。
【０１３０】
実施例３：α−ガラクトシダーゼ、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼで処理して移植された半月軟骨、関節軟骨、靱帯及び心臓弁並びに軟組織異種移植片に対する霊長類の応答の評価
この実施例では、ブタの半月軟骨、関節軟骨、靱帯及び腹膜心臓弁軟組織移植物を、実施例２に記載したように、α−ガラクトシダーゼで処理してα−ｇａｌエピトープを除去する。これらの軟組織移植物を、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼで更に処理して、フコシルを有する残留炭水化物鎖をキャップする。フコシルトランスフェラーゼは、フコシルの異種移植片へのトランスファーを促進する。フコシルは、残留炭水化物鎖に結合し、そうして、それらをキャップする。フコシルでのキャッピングは、患者の免疫系がその異種移植片を外来物として認識する能力を邪魔する。これらの軟組織移植物を、カニクイザルに移植して、これらの組織移植物に対する霊長類の応答を評価する。
【０１３１】
ブタの膝関節からの半月軟骨及び関節軟骨移植物、ブタの腹膜からの心臓弁、及びブタの関節からの靱帯移植物を、実施例２において移植物を調製したように調製する(α−ガラクトシダーゼ処理を含む)。しかしながら、サルへの移植の前に、これらの移植物を、予め決めた量のフコシル及びフコシルトランスフェラーゼで、特定の濃度で、予め決めた時間及び温度で更に処理して、残留炭水化物鎖をフコシルでキャップする。例えば、これらの移植物を、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼの予め決めた濃度で緩衝溶液に浸す。これらの移植物を、予め決めた時間、予め決めた温度でインキュベートする。
【０１３２】
対応するグリコシルトランスフェラーゼと組み合わせたＮ−アセチルグルコサミン等の他の分子も又、これらの移植物の炭水化物鎖のキャッピングに用いることができる。
【０１３３】
その後、これらの移植物を洗って酵素を除去してサルに移植し、この異種移植片に対する免疫応答の出現を実施例に２に記載したようにして評価する。
【０１３４】
実施例４：凍結融解サイクル及びプロテオグリカン涸渇因子による処理にかけて移植された半月軟骨、関節軟骨、靱帯及び心臓弁軟組織異種移植片に対する霊長類の応答の評価
この実施例においては、ブタの半月軟骨、関節軟骨、靱帯及び腹膜心臓弁軟組織移植物を調製し、実施例２に記載したように、凍結して試料の細胞を破壊する(即ち、殺す)。これらの軟組織移植物をプロテオグリカン涸渇因子で更に処理して、プロテオグリカンを異種移植片から実質的に除去する。その後、これらの異種移植片を、実施例２に記載したように、グリコシダーゼで処理して、残留α−ｇａｌエピトープを異種移植片から実質的に除去する。プロテオグリカンと残留α−ｇａｌエピトープの実質的な除去は、レシピエント患者の免疫系が異種移植片を外来物として認識する能力を邪魔する。これらの軟組織移植物をカニクイザルに移植して、これらの軟組織移植物に対する霊長類の応答を評価する。
【０１３５】
ブタ膝関節からの半月軟骨、関節軟骨及び靱帯移植物及びブタ腹膜からの心臓弁移植物を、実施例２に概説した無菌化及び凍結／融解サイクル処理を含む調製手順に従って調製する。次いで、コンドロイチナーゼＡＢＣ溶液を、０．０５Ｍトリス−ＨＣＬ(７．８８ｇｍ／リットル−ＭＷ＝１５７．６０)、５ｍＭベンザミジン−ＨＣＬ(０．７８３ｇｍ／リットル−ＭＷ＝１５６．６１)、０．０１０Ｍ Ｎ−エチルマレイミド(１．２５１３ｇｍ／リットル−ＭＷ＝１２５．１３)及び０．００１Ｍフェニルメチルスルホニルフルオリド(０．１７４２０ｇｍ／リットル−ＭＷ＝１７４．２)(メタノールに溶解)を合わせることにより調製する。０．１５Ｍ ＮａＣｌ(８．７７５ｇｍ／リットル−ＭＷ＝５８．５)、ペニシリン及びストレプトマイシン(１％(ｖ／ｖ)１０ｍｌ／リットル)の混合物を、溶液１ｍｌ当たり１ユニットのコンドロイチナーゼＡＢＣ(Sigma #C-3509)エンザイムソルーションの量の酵素と共に加えて、この溶液を１リットルにする。
【０１３６】
各軟組織異種移植片試料を、コンドロイチナーゼＡＢＣ酵素溶液中でインキュベートする(直径３ｍｍの組織プラグ当たり溶液１ｍｌの濃度で)。このインキュベーションを、震盪水浴中で、ｐＨ８．０で、３７℃で４８時間行う。インキュベーション後、各軟組織試料を適当な緩衝液中で洗い、洗液をコンドロイチナーゼＡＢＣ溶液に加える。次いで、各軟組織試料を、上記のように、コンドロイチンＡＢＣ溶液と、溶液１ｍｌ当たり１ユニットのコンドロイチナーゼＡＢＣ(Sigma #C-3509)エンザイムソルーションの濃度で、更に４８時間再インキュベートする。各軟組織試料を適当な緩衝溶液中で再び洗い、洗液をコンドロイチナーゼＡＢＣ溶液に加える。
【０１３７】
次いで、各軟組織試料を、１ｍｌのトリプシン溶液(１ｍｇ／ｍｌトリプシン、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ Ｎａホスフェート)中で、ｐＨ７．２で２４時間インキュベートする。このインキュベーションを、震盪水浴中で、３７℃で行う。各軟組織試料を適当な緩衝溶液中で洗い、洗液をトリプシン溶液に加える。
【０１３８】
次いで、各試料を１ｍｌのヒアルロニダーゼ溶液(０．０１ｍｇ／ｍｌ精巣ヒアルロニダーゼ、０．００５ＭベンザミジンＨＣＬ、００１Ｍ ＰＭＳＦ、０．０１０Ｍ ネチルマレイミド、０．００５Ｍ ベンザミジンＨＣＬ、１％ｖ／ｖペニシリン及びストレプトマイシン)中に、ｐＨ６．０で２４時間置く。このインキュベーションを、震盪水浴中で３７℃で行う。次いで、各軟組織試料を、再び、適当な緩衝溶液中ですすぎ、洗液をヒアルロニダーゼ溶液に加える。
【０１３９】
その後、これらの移植片を、実施例２に記載したようにグリコシダーゼで処理して、サルに移植し、それらの異種移植片の各々に対する免疫応答の出現を、実施例２に記載したようにして評価する。
【０１４０】
実施例５：α−ガラクトシダーゼ及び骨誘導因子を含む脱ミネラル化した骨マトリクスで処理して移植した異種移植片に対するマウスにおける応答の評価
この実施例においては、ブタの骨の移植物をα−ガラクトシダーゼで処理してα−ガラクトシルエピトープを除去し、骨誘導因子を含む脱ミネラル化した骨マトリクスに浸透させて、標的欠損における軟組織フォーマーの骨性組織フォーマーへの変換を刺激する。これらの移植物をマウスに移植して、それらに対する応答を評価する。欠損Ｄにおける典型的な骨部分１０を、図１３に示す。
【０１４１】
ブタの骨移植物を、無菌的に調製し、周囲に付着している軟組織を外科的に除去する。それらの骨試料を、少なくとも５分間、アルコール例えばエタノール又はイソプロパノールで洗って、滑液及び脂溶性夾雑物を除去する。
【０１４２】
骨試料を、約−３５〜−９０℃の温度範囲で、好ましくは約−７０℃以下の温度で凍結させて、試料の骨細胞を破壊する(即ち、殺す)。
【０１４３】
各骨試料を２つの部分に切断する。第一の骨部分を、α−ガラクトシダーゼを予め決めた濃度で含む緩衝溶液に浸す。第一の骨部分をこの緩衝溶液中で予め決めた温度で予め決めた時間インキュベートする。第二の骨部分を、第一の骨部分と類似の条件下で緩衝溶液中で、α−ガラクトシダーゼの非存在下でインキュベートする(これは、対照として役立つ)。
【０１４４】
インキュベーションの終了時に、これらの骨部分を、酵素を拡散させる条件下で洗浄する。アッセイを行って、α−ｇａｌエピトープの完全な除去を確実にする。
【０１４５】
次いで、α−ガラクトシダーゼ第一の骨部分(上に開示)を、従来技術例えばJohn E. Feighan等、Induction of Bone by a Demineralized Bone Matrix Gel: A Study in a Rat Femoral Defect Model, 13 Journal of Orthopaedic Research 881-889(1995)で公知の方法により調製した骨誘導因子を含む脱ミネラル化したマトリクスゲルに浸透させる。
【０１４６】
これらの骨試料を、全身吸入麻酔下に公知の外科的手順に従ってマウスの皮下組織中に移植する。骨を、皮下組織に移植して、骨の骨誘導特性を評価する。形成された如何なる骨も、骨誘導特性の証拠である。骨異種移植片の骨誘導特性を、異種移植片を移植した後に、長骨ドリル穴モデル等の骨欠損モデルを用いて評価する。移植手順を、無菌的外科技術下で行い、その傷を３−０ビクリル又は当業者に公知の適当な同等物を用いて閉じる。図１４は、欠損Ｄに位置された異種移植片Ｘ(斜交平行線を付けて示す)を有する骨部分１０を示す。これらの動物をケージ内で自由に活動させて、不快、膨潤、感染、又は拒絶の如何なる徴候をも監視する。血液試料(例えば、２ｍｌ)を周期的に(例えば、２週毎に)採取して、抗体をモニターする。
【０１４７】
異種移植片に対する免疫応答の出現を、移植を受けたマウスからの血清試料において、抗Ｇａｌ及び非抗Ｇａｌ(即ち、α−ｇａｌエピトープ以外の抗原への抗体結合)の抗骨異種移植片抗体を測定することにより評価する。血液試料を、移植を受けたマウスから、移植外科手術の日に採取し且つ移植後に周期的(例えば、２週間)間隔で採取する。これらの血液試料を遠心分離して、血清試料を凍結し、抗Ｇａｌ及び他の非抗Ｇａｌの抗骨異種移植片抗体について評価する。
【０１４８】
抗Ｇａｌ活性を、これらの血清試料において、α−ｇａｌ−ＢＳＡを固相抗原として用いるＥＬＩＳＡにおいて、従来技術で公知の方法例えばGalili等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: II. Changes in anti-Gal response during chronic rejection, 63 Transplantation 645-651(1997)に記載された方法に従って測定する。
【０１４９】
アッセイを行って、α−ガラクトシダーゼ処理した異種移植片が抗骨異種移植片抗体の形成を誘導するかどうかを測定する。抗骨異種移植片抗体活性を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを、当分野で公知の方法例えばK.R. Stone等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chronic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645(1997)に記載された方法に従って行う。
【０１５０】
これらの骨異種移植片を、適宜、移植後１〜２ヶ月の時点で外植し、炎症性浸潤の組織学的評価のために切片を作成して染色する。抗Ｇａｌその他の抗骨異種移植片抗体活性の移植後の変化は、移植後１〜２ヶ月で、外植骨内における炎症性の組織学的特性(即ち、顆粒球又は単核細胞浸潤物)と相関している(当業者に公知の方法例えばK.R. Stone等、Porcine and bovine cartilage transplants in cynomolgus monkey: I. A model for chronic xenograft rejection, 63 Transplantation 640-645(1997)に記載された方法を使用)。
【０１５１】
骨異種移植片を外植する場合は、その骨異種移植片を、麻酔手順、移植物の撤去及び軟組織の閉鎖の手順を用いて無菌的に採取する。もしこれらの移植物の肉眼的及び組織病理学的評価が移植された骨のよい成績を示していれば、可能な免疫学的試験のために組織を採取する。これらの異種移植片試料を集め、処理して顕微鏡検査をする。移植片及び周囲の組織の一部分を、当業者に公知の方法により、免疫組織化学評価のために包埋用型中の凍結組織試料用に包埋用媒質中で凍結させる。「ＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ(登録商標)」Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド(１０．２４％ｗ／ｗポリビニルアルコール、４．２６％ｗ／ｗポリエチレングリコール及び８６．６０％ｗ／ｗ非反応性成分を含み、Sakura FinTek, Torrence, カリフォルニアにより製造されている)は、本発明での使用のための可能な包埋用媒質の非制限的な例である。他の当業者に公知の包埋用媒質を用いることもできる。残りの移植物及び周囲組織を、病理組織学的検査のために、１０％の中性緩衝ホルマリン中に集める。
【０１５２】
実施例６：α−ガラクトシダーゼ及び骨誘導因子を含む脱ミネラル化骨マトリクスゲルで処理して移植した骨異種移植片に対する霊長類の応答の評価
この実施例では、ブタ骨移植物を、α−ガラクトシダーゼ及び骨誘導因子を含む脱ミネラル化した骨マトリクスゲルで処理し、それらの移植物をカニクイザルに移植し、これらの骨移植物に対する霊長類の応答を、実施例５に記載したようにして評価する。これらの骨異種移植片を外植して組織を可能な免疫学的試験用に採取した後に、これらの動物を快復させて、切開部が癒えてこれらの動物の足取りが正常になるまでしっかりとモニターする。
【０１５３】
実施例７：α−ガラクトシダーゼ、骨誘導因子を含む脱ミネラル化骨マトリクスゲル、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼで処理して移植した骨異種移植片に対するマウスにおける応答の評価
この実施例では、ブタ骨移植物を、実施例５に記載したように、α−ガラクトシダーゼで処理してα−ｇａｌエピトープを除去する。これらの移植物をフコシル及びフコシルトランスフェラーゼで更に処理して、フコシルを有する炭水化物鎖をキャップする。フコシルトランスフェラーゼは、フコシルの異種移植片へのトランスファーを促進する。このフコシルは、これらの炭水化物鎖に結合し、そうして、それらをキャップする。フコシルでのキャッピングは、患者の免疫系が異種移植片を外来物として認識する能力を邪魔する。これらの移植物をマウスに移植して、それらの骨移植物に対する応答を評価する。
【０１５４】
ブタ骨移植物を、実施例１に記載したようにして評価する(α−ガラクトシダーゼ処理を含む)。しかしながら、マウスへの移植の前に、それらの移植物を、予め決めた量のフコシル及びフコシルトランスフェラーゼで、特定濃度で、予め決めた時間予め決めた温度で処理して、フコシルを有する炭水化物鎖をキャップする。例えば、これらの試料を、緩衝溶液に、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼの予め決めた濃度で浸す。これらの試料を、予め決めた時間、予め決めた温度でインキュベートする。
【０１５５】
対応するグリコシルトランスフェラーゼと組み合わせたｎ−アセチルグルコサミン等の他の分子も又、これらの移植物の炭水化物鎖のキャッピングのために用いることができる。
【０１５６】
その後、これらの試料を洗って酵素を除去して、マウスに移植し、異種移植片に対する免疫応答の出現を、実施例５に記載したようにして評価する。
【０１５７】
実施例８：α−ガラクトシダーゼ、骨誘導因子を含む脱ミネラル化骨マトリクスゲル、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼで処理して移植した骨異種移植片に対する霊長類の応答の評価
この実施例では、ブタ骨移植物は、α−ガラクトシダーゼ、骨誘導因子を含む脱ミネラル化した骨マトリクスゲル、フコシル及びフコシルトランスフェラーゼで処理し；それらの移植物をカニクイザルに移植して、それらの骨移植物に対する霊長類の応答を、実施例５、６及び７に記載したようにして評価する。
【０１５８】
実施例９：アルコール及び凍結／融解サイクルで処理して移植した骨異種移植片に対するマウスにおける応答の評価
この実施例では、ブタ骨移植物を、マウスへの移植の前に、アルコール及び凍結／融解サイクルにより処理し、これらの移植物に対するマウスの応答を評価する。
【０１５９】
ブタ骨移植物を、無菌的に調製し、周囲の付着軟組織を外科的に除去する。その結果生成された異種移植片を約１０倍容の無菌冷水中で洗って残留血液タンパク質及び水溶性物質を除去する。次いで、この異種移植片を、室温で約５分間、アルコールに浸けて、骨を殺菌し且つ非コラーゲン様物質を除去する。
【０１６０】
アルコール洗浄後、異種移植片を、再び、７０％イソプロパノールのアルコール溶液中に室温で少なくとも５分間置くことにより処理する。
【０１６１】
アルコール処理のステップに続いて、これらの骨移植物を、フリーザー中に、異種移植片が完全に凍結する(即ち、未凍結組織を含む内部温点が残っていない)まで置く。次いで、各骨移植物を、室温(約２５℃)で、等張の塩溶液浴に約１０分間浸すことにより融解させる。
【０１６２】
これらの骨移植物を、別法として、アルコール処理ステップの前に、上記の凍結／融解サイクル処理にかけることができるということは、理解されるべきである。
【０１６３】
次いで、これらの移植物をマウスに移植し、異種移植片に対する免疫応答の出現を、実施例５に記載したようにして評価する。
【０１６４】
実施例１０：アルコール及び凍結／融解サイクルにより処理して移植した骨異種移植片に対する霊長類の応答の評価
この実施例では、ブタ骨移植物を、アルコール及び凍結／融解サイクルにより処理してからカニクイザルに移植して、それらの移植物に対する霊長類の応答を実施例５〜１０に記載したようにして評価する。
【０１６５】
実施例１１：α−ガラクトシダーゼ及びグルタルアルデヒドで処理して移植した軟組織及び骨異種移植片に対する霊長類における応答の評価
この実施例では、ブタの半月軟骨、関節軟骨、靱帯、腹膜心臓弁及び骨移植物を、アルコール及び凍結／融解サイクルにより、実施例１〜１０に記載したようにして処理する。それらを、更に、０．０１〜０．１０％グルタルアルデヒドで処理し、次いで、α−ガラクトシダーゼで処理して、それらの移植物に対する霊長類の応答を実施例１〜１０に記載した用にして評価する。
【０１６６】
当業者は、この発明が、その精神又は本質的特徴から離れることなく、別の特定の形態で具体化され得ることを認めるであろう。従って、現在記載してある具体例は、すべての点で、説明のためのものと考えるべきであり、前述した記載ではなく添付の請求の範囲により示されるこの発明の範囲を限定するものと考えるべきではなく、同等の請求の範囲内の意味及び範囲内に含まれるこの発明のすべての変形は、請求の範囲内に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 内側及び外側半月板がそれらの本来の位置にあるヒトの膝関節の概略図である。
【図２】 生体内で脛骨の内側及び外側顆の上方に位置決めされるときの内側及び外側半月板を示すヒトの膝関節の破断図である。
【図３】 ヒトの膝の断裂した外側半月板の切除術及び半月板移植片の受け入れのための膝の準備を示す図である。
【図４】 ヒトの膝への後方外側半月板角挿入のための好ましいドリルガイド配置を示す図である。
【図５】 ヒトの膝への後方外側半月板角挿入におけるカニューレ挿入ドリルオーバードリルガイドワイヤを示す図である。
【図６】 半月板角挿入のための後方及び前方ドリル孔を設けたヒトの膝の様子を示す図である。
【図７】 ヒトの膝関節中に半月板移植片を引き込むための好ましい縫合糸通し器具の配置を示す図である。
【図８】 挿入段階の間の半月板移植片を収納したヒトの膝の様子を示す図である。
【図９】 半月板移植片を収納し、ゾーン特異的半月板修復縫合糸をこの半月板修復縫合糸を最終的に縛るための位置に備えたヒトの膝の様子を示す図である。
【図１０】 大腿骨２の関節端部上の関節軟骨７及び脛骨４の関節端部上の関節軟骨８の正常な位置を示すヒトの膝関節３を表す図である。
【図１１】 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシチログロブリン、マウスラミニン、Galβ1-4 GlcNAc-BSA（Ｎ−アセチルラクトサミン−ＢＳＡ）、Galα1-4Galβ1-4 GlcNAc-BSA（ＢＳＡに結合したＰ１抗原）、及びヒトチログロブリン又はヒトラミニン上のα−ガラクトシルエピトープに対するモノクローナル抗Gal抗体の特異性を表すグラフである。
【図１２】 α−ガラクトシダーゼ処理された半月板軟骨からのα−ガラクトシルエピトープの除去を表すグラフである。
【図１３】 欠損を有する骨の一部分を示す図である。
【図１４】 欠損中にこの発明の異種移植片を有する図１３の骨の部分を示す図である。
【符号の説明】
２ 大腿骨
３ 膝関節
４ 脛骨
７、８ 関節軟骨
Claims (54)
- ヒトへの移植のための軟組織又は骨組織よりなる異種移植片の製造方法であって、下記を含む当該方法
ａ．軟組織又は骨組織の少なくとも一部分を非ヒト動物から取り出して異種移植片を用意し；
ｂ．その異種移植片を水及びアルコールで洗い；
ｃ．その異種移植片を細胞破壊処理にかけ；
ｄ．その異種移植片を約０．０１〜０．１０％の量のアルデヒドにさらし；
ｅ．その異種移植片をα−ガラクトシダーゼで消化して、複数の、炭水化物鎖の非還元末端の末端α−ガラクトシル糖である第一の表面炭水化物部分をその移植片から実質的に除去し；
ｆ．その異種移植片が軟組織である場合には、ステップｄの後に、異種移植片を、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチンＡＣＩＩリアーゼ、ケラタナーゼ、及びフィブロネクチン断片よりなる群から選択する少なくとも一のプロテオグリカン涸渇因子により消化することによって、プロテオグリカンを異種移植片から除去し；そして
ｇ．その異種移植片が骨組織である場合には、異種移植片を、骨形態形成タンパク質(ＢＭＰ)及び関連非コラーゲン様タンパク質(ＮＣＰ)から選択された骨誘導因子で処理し、それにより、その移植片は、実質的に非免疫原性となり且つ天然の軟組織及び骨組織と実質的に同じ機械的特性を有する。 - 異種移植片をアルデヒドにさらすステップが、そのアルデヒドを、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド及びアジピン酸ジアルデヒドよりなる群から選択するアルデヒドにさらすことを含む、請求項１に記載の方法。
- ステップｃの後に、異種移植片に穴を開けるステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
- ステップｃの後に、異種移植片を第二の酵素で処理するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 第二の酵素を、フィシン及びトリプシンよりなる群から選択する、請求項４に記載の方法。
- ステップｃの後に、異種移植片を、抗石灰化剤、抗血栓剤、抗生物質及び成長因子よりなる群から選択する少なくとも一の薬剤で処理するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
- ステップｃの後に、異種移植片を殺菌するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 殺菌ステップが、異種移植片を、エチレンオキシド及びプロピレンオキシドよりなる群から選択する少なくとも一の薬剤によって殺菌することを含む、請求項７に記載の方法。
- ステップｃの後に、異種移植片をポリエチレングリコールで処理するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
- ステップｃの後に、異種移植片を、脂肪族ジアミン化合物及び芳香族ジアミン化合物よりなる群から選択する少なくとも一の薬剤にさらすことを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 細胞破壊処理が、凍結／融解サイクルを含む、請求項１に記載の方法。
- 細胞破壊処理が、ガンマ放射への曝露を含む、請求項１に記載の方法。
- ステップｅの後に、異種移植片上の複数の、炭水化物鎖の非還元末端のＮ−アセチルラクトサミン残基である第二の表面炭水化物部分を複数のキャッピング分子で処理して、これらの、炭水化物鎖の非還元末端のＮ−アセチルラクトサミン残基である第二の表面炭水化物部分の少なくとも一部分をキャップするステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
- キャッピング分子の少なくとも一部分が、複数のフコシル分子である、請求項１３に記載の方法。
- キャッピング分子の少なくとも一部分が、複数のｎ−アセチルグルコサミン分子である、請求項１３に記載の方法。
- 取り出すステップが、上部主表面及び内部主表面を有する内側又は外側半月の部分を取り出し、各主表面が、外部外側表面により接続された外部部分を有し且つ各主表面が、内部外側表面により接続された内部部分を有する、請求項１に記載の方法。
- 取り出すステップが、靱帯の部分を取り出すことを含む、請求項１に記載の方法。
- 取り出すステップが、その部分と共に、その部分の第一の末端に付着した骨の第一のブロックを取り出すことを含む、請求項１７に記載の方法。
- 取り出すステップが、その部分と共に、その部分の第一の末端と反対側の第二の末端に付着した骨の第二のブロックを取り出すことを含む、請求項１８に記載の方法。
- 取り出すステップが、関節軟骨の部分を取り出すことを含む、請求項１に記載の方法。
- 取り出すステップが、その部分と共に、軟骨下の骨の層を取り出すことを含む、請求項２０に記載の方法。
- ヒトへの移植のための軟組織又は骨組織よりなる実質的に非免疫原性のアルデヒド処理した、グリコシダーゼ処理した異種移植片を含み、下記のプロセスにより作成された製造品
ａ．軟組織、硬組織又は心臓弁の少なくとも一部分を非ヒト動物から取り出して異種移植片を用意し；
ｂ．その異種移植片を水及びアルコール中で洗い；
ｃ．その異種移植片を細胞破壊処理にかけ；
ｄ．その異種移植片を、約０．０１〜０．１０％の量のアルデヒドにさらし；
ｅ．その異種移植片を、グリコシダーゼで消化して、複数の、炭水化物鎖の非還元末端の末端α−ガラクトシル糖である第一の表面炭水化物部分をその異種移植片から実質的に除去し；
ｆ．その異種移植片が軟組織である場合には、ステップｄの後に、異種移植片を、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチンＡＣＩＩリアーゼ、ケラタナーゼ、及びフィブロネクチン断片よりなる群から選択する少なくとも一のプロテオグリカン涸渇因子により消化することによって、プロテオグリカンを異種移植片から除去し；そして
ｇ．その異種移植片が骨組織である場合には、異種移植片を、骨形態形成タンパク質(ＢＭＰ)及び関連非コラーゲン様タンパク質(ＮＣＰ)から選択された骨誘導因子で処理し、それにより、その異種移植片は、実質的に非免疫原性となり且つ天然の軟組織又は骨組織と実質的に同じ機械的特性を有する。 - アルデヒドを、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド及びアジピン酸ジアルデヒドよりなる群から選択する、請求項２２に記載の製造品。
- 異種移植片が、薬剤及び酵素の浸透性を増大させるために複数の刺し穴を有する、請求項２２に記載の製造品。
- 抗石灰化剤、抗血栓剤、抗生物質及び成長因子よりなる群から選択する少なくとも一の薬剤を更に含む、請求項２２に記載の製造品。
- 異種移植片を殺菌する、請求項２２に記載の製造品。
- 異種移植片が、ポリエチレングリコール処理した異種移植片である、請求項２２に記載の製造品。
- 脂肪族ジアミン化合物及び芳香族ジアミン化合物よりなる群から選択する薬剤を更に含む、請求項２２に記載の製造品。
- グリコシダーゼ処理した異種移植片が、ガラクトシダーゼ処理した異種移植片である、請求項２２に記載の製造品。
- ガラクトシダーゼ処理した異種移植片が、α−ガラクトシダーゼ処理した異種移植片である、請求項２９に記載の製造品。
- 異種移植片上の複数の、炭水化物鎖の非還元末端のＮ−アセチルラクトサミン残基である第二の表面炭水化物部分にキャップされた複数のキャッピング分子を更に含む、請求項２２に記載の製造品。
- キャッピング分子が、複数のフコシル分子を含む、請求項３１に記載の製造品。
- キャッピング分子が、複数のｎ−アセチルグルコサミン分枝を含む、請求項３１に記載の製造品。
- 異種移植片が、融解された凍結異種移植片である、請求項２２に記載の製造品。
- 異種移植片が、ガンマ照射した異種移植片である、請求項２２に記載の製造品。
- 部分が、上部主表面及び内部主表面を有する内側又は外側半月の部分であり、各主表面が、外部外側表面により接続された外部部分を有し且つ各主表面が、内部外側表面により接続された内部部分を有する、請求項２２に記載の製造品。
- 部分が、靱帯の部分である、請求項２２に記載の製造品。
- 靱帯の部分が、その部分の第一の末端に付着した第一の骨のブロックを含む、請求項３７に記載の製造品。
- 靱帯の部分が、その部分の第一の末端の反対側の第二の末端に付着し
た第二の骨のブロックを含む、請求項３８に記載の製造品。 - 部分が、関節軟骨の部分である、請求項２２に記載の製造品。
- 関節軟骨の部分が、軟骨下の骨の層を含む、請求項４０に記載の製造品。
- 請求項１〜２１のいずれかに記載の製造方法によって製造された、ヒトに移植するための、軟組織又は骨組織よりなる異種移植片であって、下記
非ヒト動物由来の軟組織又は骨組織の一部分(複数の細胞外成分、複数の実質的に死んだ細胞のみ、及び細胞外成分の複数のタンパク質を架橋している０．０１〜０．１０％の量のアルデヒドを含み、これらの細胞外成分及び死んだ細胞は、グリコシダーゼ消化を受け易い表面炭水化物部分を実質的に有しない)を含み、
その死んだ細胞は異種移植片を細胞破壊処理にかけて得られたものであり
上記アルデヒドは０．０１〜０．１０％の量のアルデヒドにさらした結果含まれたものであり、
その異種移植片が軟組織である場合には、異種移植片からプロテオグリカンが除去されており、
その異種移植片が骨組織である場合には、異種移植片は、骨形態形成タンパク質(ＢＭＰ)及び関連非コラーゲン様タンパク質(ＮＣＰ)から選択された骨誘導因子で処理されており、
それにより、この一部分が、実質的に非免疫原性となり且つ天然の軟組織又は骨組織の対応する部分と実質的に同じ機械的特性を有する上記の異種移植片。 - アルデヒドが、タンパク質を架橋させる約０．０１〜０．０５％の量である、請求項４２に記載の異種移植片。
- 部分が、異種移植片上の複数の表面炭水化物部分の少なくとも一部分に結合したキャッピング分子を有し、そしてそれにより、その異種移植片が、実質的に非免疫原性である、請求項４２に記載の異種移植片。
- キャッピング分子の少なくとも一部分が、複数のフコシル分子である、請求項４４に記載の異種移植片。
- キャッピング分子の少なくとも一部分が、複数のｎ−アセチルグルコサミン分子である、請求項４４に記載の異種移植片。
- 部分が、上部主表面及び内部主表面を有する内側又は外側半月の部分であり、各主表面が、外部外側表面により接続された外部部分を有し且つ各主表面が、内部外側表面により接続された内部部分を有する、請求項４２に記載の異種移植片。
- 部分が、靱帯の部分である、請求項４２に記載の異種移植片。
- 靱帯の部分が、その部分の第一の末端に付着した第一の骨のブロックを含む、請求項４８に記載の異種移植片。
- 靱帯の部分が、その部分の第一の末端の反対側の第二の末端に付着した第二の骨のブロックを含む、請求項４９に記載の異種移植片。
- 部分が、関節軟骨の部分である、請求項４２に記載の異種移植片。
- 関節軟骨の部分が、軟骨下の骨の層を含む、請求項５１に記載の異種移植片。
- 異種移植片をアルデヒドにさらすステップが、その異種移植片を、約０．０１〜０．０５％の量のアルデヒドにさらすことを含む、請求項１に記載の方法。
- 異種移植片を、その異種移植片を約０．０１〜０．０５％の量のアルデヒドにさらすことにより生成する、請求項２２に記載の製造品。
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