FI92500C - Menetelmä mekaanisen massan valmistamiseksi - Google Patents

Description

925ηπ

Menetelma mekaa nisen massan valmistamiseksi s c. \J\J\J

Esillå olevan keksinnon kohteena on patenttivaatimuksen 1 johdannon mukainen menetelma mekaanisen massan valmistamiseksi.

5 Tållaisen menetelmån mukaan puuraaka-aine hajotetaan hakkeeksi, joka kuidutetaan haluttuun suotautuvuuteen, jolloin kuidutettavalle ainekselle suoritetaan valmistusprosessin aikana entsyymikåsittely.

10 Keksinto koskee myos patenttivaatimuksen 15 johdannon mukaista entsyymivalmistetta, joka sopii mekaanisen massan kasittelyyn.

Kemiallisilla ja mekaanisilla massoilla on erilaiset kemialliset ja kuitutekniset ominaisuudet ja siten niiden kayttokohteet paperinvalmistuksessa voidaan valita nåiden ominaisuuksien perus-15 teella. Monet paperilaadut sisaltavåt kumpaakin massatyyppiå vaihtelevissa suhteissa haluttu- jen lopputuoteominaisuuksien mukaan. Mekaanista massaa kaytetaan tarvittaessa paranta-maan/lisaamåan tuotteen jåykkyytta, tilavuusmassaa (bulkkia) tai optisia ominaisuuksia.

Paperin valmistamista vårten on puumateriaalin kuidut ensin erotettava toisistaan. Mekaani-20 sen massanvalmistuksessa kaytetaan påaasiassa hionta- tai hierremenetelmiå, joissa puuraaka- aine altistetaan jaksoittaisten painepulssien alaiseksi. Kitkalåmmon vaikutuksesta puurakenne pehmenee ja sen rakenne hollentyy, mikå lopulta johtaa kuitujen eroamiseen toisistaan [1]. Kuitenkin vain pieni osa systeemiin tuodusta energiasta kuluu kuitujen irrottamiseen toisistaan; valtaosa muuttuu låmmoksi. Tåsta syysta kuidutuksen kokonaisenergiatalous on hyvin 25 huono.

Tunnetussa tekniikassa on ehdotettu erilaisia ratkaisuja mekaanisen massanvalmistuksen energiatalouden parantamiseksi. Eråat nåista perustuvat hakkeen esikasittelyyn esim. vedellå tai hapolla (Fl-patenttijulkaisut 74493 ja 87371). Tunnetaan myos menetelmiå, joissa kuidu-3C tettavaa ainesta kasitellåan entsyymeillå kuidutusenergian våhentamiseksi. Niinpå FI-patentti- hakemuksessa 895676 on kuvattu koe, jossa kertaalleen jauhettua massaa kasiteltiin ksy-lanaasientsyymillå. Tåmån entsyymikasittelyn on esitetty jossain måarin våhentavån kuidu- : tuksen energiankulutusta. Julkaisussa mainitaan myos mahdollisuus kayttaa sellulaaseja, 2 92500 mutta niistå ei ole annettu esimerkkejå eika niiden vaikutusta ole osoitettu. Eristettyien entsyymien osalta kiinnostus on hemisellulaasien lisaksi kohdistunut ligniiniin vaikuttaviin entsyymeihin, mm. lakkaasi-entsyymiin [5]. Lakkaasi-kåsittelyllå ei kuitenkaan ole todettu vaikutusta energiankulutukseen [5], 5

Edellisten eristettyjen entsyymien lisaksi on myos tutkittu kasvavien valkolahottajasienten hyvåksikåyttoå mekaanisen massan valmistuksessa. Tållaisen ennen kuidutusta suoritetun valkolahottajasieni-kåsittelyn on todettu laskevan ominaisenergiankulutusta ja parantavan massojen lujuusominaisuuksia [6, 7, 8,]. Haittapuolina nåisså valkolahottaja-kåsittelvisså on 10 niiden vaatima pitkå kåsittelyaika (useimmiten viikkoja), alentunut saanto (85 - 95 %), prosessin vaikea såadettavyys ja huonontuneet optiset ominaisuudet.

Esillå olevan keksinnon tarkoituksena on poistaa tunnetun tekniikan epåkohdat ja saada aikaan aivan uudenlainen menetelmå mekaanisen massan valmistamiseksi.

15

Enneståån on tiedetty, ettå puuhun sitoutuneen veden måårållå ja låmpotilalla on suuri merki-tys kuidutuksen energiankulutuksen ja massan laadun kannalta [1]. Puumateriaaliin sitoutunut vesi alentaa nået kuitujen vålisen hemiselluloosan ja ligniinin pehmenemislåmpotilaa ja hei-kentåa samalla kuitujenvålisten sidosten lujuutta, mikå helpottaa kuitujen irtautumista toistaan 20 [2]. Kuidutuksessa energiaa sitoutuu låhinnå vain kuituaineksen amorfiseen osaan, eli hemi- selluloosaan ja ligniiniin. Tåstå syystå raaka-aineen amorfisuuden lisåys parantaa kuidutuksen energiataloutta.

Keksinto perustuu siihen ajatukseen, etta raaka-aineen amorfisuutta korotetaan mekaanisen 25 massan valmistuksen yhteydesså kåsittelemållå kuidutettavaa materiaalia sopivalla entsyymil- lå, joka reagoi raaka-aineen kiteisen, liukenemattoman selluloosan kanssa.

Selluloosan modifiointiin ja hajotukseen osallistuvista entsyymeistå kaytetaån yhteisnimitysta "sellulaasit". Nåita entsyymejå ovat endo-/3-glukanaasit, sellobiohydrolaasit ja /3-glukosidaasi. 30 Yksinkertaisuuden vuoksi kaytetaån nåiden entsyymien seoksista jopa yksikon muotoa "sellu- laasi". Hyvin monet organismit, kuten erilaiset lahottajasienet, homeet ja anaerobit bakteerit tuottavat joitakin mainituista entsyymeista tai niitå kaikkia. Organismin ja kasvatus-olosuhtei- 3 92500 den mukaan kyseisiå entsyymejå erittyy solun ulkopuolelle vaihtelevissa suhteissa ja mååris-så.

On yleisesti tunnettua, ettå sellulaaseilla, etenkin sellobiohydrolaasilla ja endoglukanaasilla 5 on keskenåån voimakas synergistinen vaikutus; ts. nåiden entsyymien yhteisvaikutus on tehokkaampi kuin yksinåån kåytettyjen entsyymien yhteenlaskettu vaikutus. Tållainen entsyy- · mien yhteistoiminta, synergia, on kuitenkin useimmiten epåtoivottavaa teollisissa sellu-loosakuitujen entsymaattisissa sovelluksessa. Niinpå sellulaasi-entsyymit pyritåån yleenså kokonaan sulkemaan pois kåsittelyistå tai niiden mååråå pyritaån våhentåmåån. Eråisså 10 sovelluksissa kåytetåan hyvin alhaisia sellulaasimååriå esim. hienoaineksen poistoon. mutta tålloin hydrolyysiasteeltaan rajoitetussa kåsittelysså hydrolysoidaan liukoisimmat yhdisteet sokereiksi entsyymien yhteisvaikutuksen ansiosta [3, 4].

Kokeissamme olemme pystyneet toteamaan, etta synergisesti toimivaa sellulaasi-entsyymi-15 tuotetta, eli "sellulaasia", ei voida kåyttåå mekaanisen massan valmistuksen ediståmiseksi koska tållainen entsyymituote johtaa liukenemattoman selluloosan hydrolysoitumiseen ja si ten massan lujuusominaisuuksien heikkenemiseen. Tåsså keksinnosså on sensijaan yllåttåen havaittu, ettå kåytettaesså sellaista sellulaasientsyymivalmistetta, jolla ei ole synergististå vaikutustapaa, voidaan selluloosaa modifioida toivotulla tavalla ja aikaansaada halu tt uja 20 muutoksia ilman merkittåvåå hydrolyysiå ja saantotappioita. Keksinnon mukaan kåytetaån tålloin sellulaasientsyymivalmistetta, jolla on oleellinen sellobiohydrolaasi aktiivisuus ja — suhteessa sellobiohydrolaasiaktiivisuuteen — korkeintaan pieni endo-j3-glukanaasi- aktiivisuus.

25 Tåsmållisemmin sanottuna keksinnon mukaiselle menetelmålle on pååasiallisesti tunnusomais- ta se, mika on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

Keksinnon mukaiselle entsyymivalmisteelle on puolestaan tunnusomaista se, mikå on esitetty patenttivaatimuksen 15 tunnusmerkkiosassa.

30

Sellulaasi-entsyymit koostuvat toiminnallisesti kahdesta eri osasta: ytimestå (engl. core) ja hantaosasta (engl tail), seka niitå yhdistavåsta våliosasta (engl. linker). Entsyy min aktii vinen 4 92500 keskus sijaitsee ydin-osassa. Håntåosan funktiona oletetaan låhinnå olevan entsyymin kiinnit-taminen liukenemattomaan substraattiin; jos håntåosa poistetaan, entsyymin aktiivisuus suurimolekyylisiin ja kiteisiin substraatteihin alenee oleellisesti.

5 Keksinnon mukaan kåsitellåån kuidutettavaa materiaalia selluloosan kiteisyytta spesifisesti alentavalla entsyymilla, joka on sellobiohydrolaasi tai tåmån rakenneosa ja joka sellulaasi-entsyymivalmisteena toimii ei-synergisesti, kuten yllå todettiin. Rakenneosalla tarkoitetaan tåsså yhteydessa ydinta (engl. core) tai håntåå (engl. tail). Voidaan myos kåyttåå viimeksi mainittujen seoksia, jotka saadaan esim. digestoimalla natiivientsyymiå.

10

Aikaisemmin ei ole esitetty menetelmiå, joissa kåytetåån ainoastaan yhtå tai useampaa bioke-miallisesti tunnettua entsyymiå pååaktiivisuutena halutun muutoksen aikaansaamiseen. Kiijal-lisuudesta tunnetaan sensijaan menetelmiå ja prosesseja, joissa hyvåksi kaytetaan sellulaasien hydrolyyttisiå ominaisuuksia sokerien tuottamiseksi erilaisista selluloosapitoisista materiaa-15 leista. Nåisså sovelluksissa pyritaan kuitenkin — påinvastoin kuin esillå olevassa keksinnossa — nimenomaan entsyymien mahdollisimman tehokkaaseen, synergistiseen vaikutukseen.

Tåssa hakemuksessa kaytetyllå termilla "entsyymivalmiste" tarkoitetaan rnita tahansa sellaista tuotetta, joka sisåltaa ainakin yhden entsyymin tai entsyymin rakenneosan. Niinpå entsyymi-20 valmiste voi olla esim. entsyymiå tai entsyymejå sisåltåvå kasvatusliuos, eristetty entsyymi tai kahden tai useamman entsyymin seos. "Sellulaasi" tai "sellulaasientsyymivalmiste" tar-koittaa puolestaan entsyymivalmistetta, joka sisåltåå ainakin yhden edellå mainituista sellu-laasientsyymeistå.

25 "Sellobiohydrolaasi-aktiivisuudella" tarkoitetaan tåmån hakemuksen puitteissa entsymivalmis- tetta, joka kykenee modifioimaan selluloosan kiteisiå osia. Niinpå kåsitteeseen "sellobio-hydrolaasi-aktiivisuus" sisåltyvåt etenkin ne entsyymit, jotka liukenemattomalla selluloosa-alustalla tuottavat sellobioosia. Kåsite kattaa kuitenkin myos sellaiset entsyymit, joilla ei ole selvåsti hydrolysoivaa vaikutusta tai joilla on vain osittain tållainen vaikutus, mutta siitå 30 huolimatta muuttavat selluloosan kiteistå rakennetta niin, ettå lignoselluloosamateriaalissa selluloosan kiteisten ja amorfisten osien vålinen suhde pienenee, toisin sanoen amorfisen materiaalin osuus kasvaa. Nåitå viimeksi mainittuja entsyymejå ovat esim. sellobiohydrolaa- I! 5 92500 sin rakenneosat yhdesså ja erikseen.

Keksinnon mukaan entsyymikasittely suoritetaan edullisesti mekaanisen massanvalmistuksen "karkealle massalle". Tållå termillå tarkoitetaan tåmån hakemuksen puitteissa lignosellu-5 loosapohjaista materiaalia, josta mekaaninen massa on tarkoitus valmistaa ja jolle valmistus- prosessin aikana on jo suoritettu jonkinasteinen kuidutus esim. jauhamalla tai hiomalla. Tyypillisesti kåsiteltåvån aineen suotautuvuus (freenessluku) on noin 30 - 1000 ml, edullisesti noin 300 - 700 ml. Suoraan hakkeelle tehtynå entsyymikåsittely ei tavallisesti ole yhtå teho-kas, koska entsyymivalmistetta on vaikea saada imeytymåån tehokkaasti hakkeen muodossa 10 olevan raaka-aineen kuituihin. Sensijaan esim. kertaalleen jauhettu massa sopii hyvin kåytet- tåvåksi keksinnon mukaisessa kåsittelysså. Termi karkea massa kattaa siten mm. kertaalleen jauhetun tai hiotun massan, kuiturejektin ja pitkåkuitufraktion sekå nåiden yhdistelmåt, jotka on tuotettu hiertåmållå (esim. TMP) tai hiomalla (esim. GW ja PGW). Keksinnon kannalta on oleellista, ettå entsyymikasittely suoritetaan ainakin ennen viimeistå mekaanista kuidutus-15 vaihetta, jossa materiaali kuidutetaan haluttuun suotautuvuuteen, joka tyypillisesti on korkein- taan 300 ml CSF, edullisesti korkeintaan 100 ml CSF.

Menetelmå ei ole rajoittunut tiettyyn puuraaka-aineeseen, vaan sitå voidaan soveltaa yleisesti sekå havu- ettå lehtipuille, kuten esimerkiksi Pinaceae -lahkon kasveille (esim Picea- ja 20 Pinus- heimot), Salicaceae -lahkon kasveille (esim. Populus -heimo) ja Betula -heimon kasveille.

Keksinnon mukaan voidaan mekaanisen massan valmistuksessa sellobiohydrolaasientsyymin asemasta kayttåå sen osiakin, etenkin sen ydinta. On nået yllåttåen todettu, ettå entsyymin 25 osilla, etenkin sen ytimellå on samankaltainen, tosin heikompi, hydrolyyttinen vaikus kuin kokonaisella entsyymillå keksinnon mukaisessa menetelmåsså. Sellobiohydrolaasientsyymin hånnån on myos todettu vaikuttavan selluloosaa modifioivasti ja soveltuu siten myos kåytettå-våksi esillå olevassa keksinnosså.

30 Keksinnon eråån edullisen sovellutusmuodon mukaan kåsitellåån kertaalleen jauhettuja me- kaanisia massoja, joiden suotautuvuus on noin 300 - 1000 ml CSF, sellobiohydrolaasi-ent-. syymivalmisteella 30 - 90 °C:ssa, sopivimmin noin 40 - 60 °C:ssa, massan sakeuden ollessa 6 92500 noin 0,1 - 20 %, sopivimmin noin 1 - 10 %. Kåsittelyaika on 1 min - 20 h, sopivimmin noin 10 min - 10 h, erityisen edullisesti noin 30 min - 5 h. Kåsittelyn pH-arvo pidetaan neutraali-na tai lievåsti happamana tai alkalisena. tyypillisesti toimitaan pH-alueella 3-10, edullisesti noin 4-8. Entsyymivalmisteen annostus vaihtelee kasiteltåvån massan ja kåytettåvån valmis-5 teen sellobiohydrolaasi-aktiivisuuden mukaan, mutta on tyypillisesti noin 10 μ% - 100 mg proteiinia per grammaa kuivaa massaa. Edullisesti annostellaan noin 100 - 10 mg proteii-· nia/g kuivaa massaa.

Keksinnon mukaiseen menetelmåan voidaan haluttaessa yhdistaa muilla entsyymeillå, kuten 10 hemisellulaaseilla (esim. ksylanaasit, glukuronidaasit ja mannanaasit) tai esteraaseilla suori- tettuja kasittelyita. Edellå mainittujen lisaksi esillå olevassa menetelmassa voidaan lisaentsyy-minå kayttaa /3-glukosidaasiaktiivisuuden omaavaa valmistetta, koska tallainen glu-kosidaasiaktiivisuus estaa sellobioosin aiheuttaman lopputuoteinhibition.

15 Sellobiohydrolaasientsyymivalmisteet valmistetaan kasvattamalla sopivia mikro-organismikan- toja, joiden tiedetaan tuottavan sellulaasia. Kasvatusalustana kaytetaan esimerkiksi yksinker-taista selluloosa-alustaa (1 % Solka floe), johon on lisatty tarvittavat hivenaineet [18]. Tuot-tokantoina voidaan kayttaa bakteereja, homeita ja sieniå. Esimerkkeina mainittakoon seuraa-viin sukuihin kuuluvat mikro-organismit: 20

Trichoderma (esim. T. reesei), Aspergillus (esim. A. niger ), Phanerochaete (esim. P.

. chrysosporium\ [12]), Penicillium (esim. P. janthinellum, P. digitatum), Streptomyces (esim.

S. olivochromogenes, S. flavogriseus), Humicola (esim. H. insolens) ja Bacillus (esim. B. subtilis, B. circulans, [13]). Voidaan kayttaa myos muitakin valkolahottajiin kuuluvia sieniå, 25 esim. Phlebia-, Ceriporiopsis-, Trametes- sukuihin kuuluvia lajeja.

Sellobiohydrolaaseja tai niiden rakenneosia on myos mahdollista tuottaa kannoilla, jotka on geneettisesti parannettu tuottamaan juuri nåita proteiineja tai muilla geneettisesti parannetuilla tuottoisannillå, joihin nåita proteiineja koodaavat geenit on siirretty. Kun halutun proteiinin 30 geenit on kloonattu [14], on proteiinia tai sen osaa mahdollista tuottaa halutussa isånnåsså.

Haluttuna isåntånå voi olla T. reesei -home [16], hiiva [15], jokin toinen home, esim. Asper-. gillus -suvusta [19], bakteeri tai mikå tahansa muu genetiikaltaan riittavåsti tunnettu mikro- 7 92500 organismi.

Keksinnon edullisen sovellutusmuodon mukaan haluttu sellobiohydrolaasi tuotetaan homekan-nan Trichoderma reesei avulla. Sanottu kanta on yleisesti kaytetty tuotto-organismi ja sen 5 sellulaasit tunnetaan kohtuullisen hyvin. T. reesei syntetisoi kahta sellobiohydrolaasia, joista seuraavassa kåytetåån lyhenteita CBH I ja CBH II, useita endoglukanaaseja ja ainakin kahta · j3-glukosidaasia [17]. Entsyymien biokemiallisia ominaisuuksia on runsaasti kuvattu erilaisil-la, puhtailla selluloosasubstraateilia. Endoglukanaasit ovat tyypillisesti aktiivisia liukoisilla ja amorfisilla substraateilla (CMC, HEC, jS-glukaani), sen sijaan sellobiohydrolaasit pvstyvåt 10 hydrolysoimaan kiteistå selluloosaa. Sellobiohydrolaasit toimivat keskenåån selkeån synergis- tisesti kiteisellå selluloosalla, mutta niiden hydrolyysimekanismi on oletettavasti erilainen. Nykyiset kåsitykset sellulaasien toimintamekanismeista perustuvat puhtailla selluloosapre-paraateilla saatuihin tutkimustuloksiin, eivåtkå ne ole yleispåteviå tapauksissa, joissa subst-raatti sisåltåå myos muita komponentteja, kuten esim. ligniiniå tai hemiselluloosaa.

15 T. reesein sellulaasit (sellobiohydrolaasit ja endoglukanaasit) eivåt juurikaan eroa toisistaan optimaalisten toimintaolosuhteiden, esim pH ja låmpotilan, suhteen. Sen sijaan ne eroavat toisistaan puuraaka-aineen selluloosaa hydrolysoivan ja modifioivan kykynsa perusteella.

20 Myos sellobiohydrolaasit I ja II eroavat toisistaan jossain måårin aktiivisuuksien osalta, jota ominaisuutta voidaan hyddyntåå tåssa sovelluksessa. Niinpå Trichoderma reesein tuottamaa sellobiohydrolaasi I:tå (CBH I) kåytetaan keksinnon mukaan erityisen edullisesti mekaanisen massan valmistuksen ominaisenergiankulutuksen våhentåmiseksi. Tåmån entsyymin pi on kiijallisuudessa esitettyjen tietojen mukaan 3,2 - 4,2 riippuen isoentsyymimuodosta [20] tai 25 mååritettynå esimerkissa 2 kuvatulla tavalla 4,0 - 4,4 ja molekyylipaino SDS-PAGE:lla måaritettynå on noin 64 000. Tålloin on kuitenkin huomattava, etta SDS-PAGE-menetelmållå mååritettyyn molekyylipainoon liittyy aina n. 10 %:n epåvarmuus. Sellobiohydrolaaseja ' yksinåan tai yhdistettyinå esim. hemisellulaaseihin voidaan erityisen edullisesti kåyttaa mekaanisen massan ominaisuuksien modifiointiin, esim. sen paperiteknisten ominaisuuksien 30 parantamiseen. Kuidutettavan massan kasittelyyn voidaan tietenkin myos kåyttaa sellobiohyd- rolaasien seoksia, kuten esimerkistå 6 kåy ilmi.

8 92500

Sellobiohydroiaasi voidaan erottaa Trichoderma reesei -homeen kasvatusliuoksista useilla tunnetuilla tavoilla. Nåisså erotusmenetelmisså tyypillisesti yhdistetåån useita erilaisia puhdis-tustekniikoita. kuten saostuksia, ioninvaihtokromatografisia ja affineettikromatografisia sekå geelikromatografisia menetelmiå. Affiniteettikromatografiaa kåyttåen sellobiohydroiaasi 5 voidaan erottaa nopeasti jopa suoraan kasvatusliuoksesta [9]. Kyseistå affiniteettikromato grafiaa vårten tarvittavan geelimateriaalin valmistus on kuitenkin vaikeaa eikå kyseista materiaalia ole kaupallisesti saatavilla. Esillå olevan keksinnon edullisessa sovellutusmuodos-sa sellobiohydroiaasi I -entsyymi erotettiin muista kasvatusliuoksen proteiineista nopealla anioniseen ioninvaihtoon perustuvalla puhdistusmenetelmållå. Menetelmåå on kuvattu låhem-10 min alla esimerkisså 1. Keksinnosså ei kuitenkaan rajoituta tåhån proteiinien erotusmenetel- måån, vaan haluttu proteiini on mahdollista eriståå tai rikastaa myos muilla tunnetuilla menetelmillå.

Keksinnon avulla saavutetaan huomattavia etuja. Niinpå sen avulla voidaan merkittåvåsti 15 våhentåå jauhatuksen ominaisenergiankulutusta; kuten alla esitettåvåt esimerkit osoittavat pååståån keksinnon mukaan jopa 20 % alempaan energiankulutukseen kuin kåsittelemåttomil-lå låhtoaineilla. Sopivalla sellobiohydrolaasilla voidaan myos massan ominaisuuksia parantaa. Keksinnon mukaisella ratkaisulla, jossa kåytettyjen entsyymivalmisteiden synergistinen vaikutus puuttuu tai on vain våhåinen, voidaan samalla vålttaa tunnetun sienikasittelyn yllå 20 esitetyt ongelmat. Niinpå kasittelyaika on pelkåståån muutamia tunteja, saanto erittåin korkea, massan laatu hyvå ja menetelmån liittåminen nykyisiin prosesseihin on yksinkertaista.

Keksintoå voidaan soveltaa kaikissa mekaanisissa ja puolimekaanisissa massan val mis tus-menetelmissa, kuten hiokkeen (GW, PGW), kuumahierteen (TMP) ja kemimekaanisen 25 massan (CTMP) valmistuksessa.

Keksintoå ryhdytåån seuraavassa låhemmin tarkastelemaan muutaman ei-rajoittavan so veil u-tusesimerkin avulla.

30 «

II

9 92500

Esimerkki 1

Sellobiohydrolaasi I -entyymin puhdistus

Trichoderma reesei-hometta. (kanta VTT-D-86271, Rut C-30) kasvatettiin tilavuudeltaan 2 5 m3:n fermentorissa alustalla, joka sisålsi 3 paino-% solka-floc-selluloosaa, 3 % maissinliotus- vetta, 1,5 % KH2P04 ja 0,5 % (NH4)2S04. Kasvatuslåmpotila oli 29 °C ja kasvatuksen pH · pidettiin vålillå 3,3 - 5,3. Kasvatusta jatkettiin 5 vrk, jonka jålkeen homerihmasto erotettiin rumpusuodattimella ja kasvuliuos kasiteltiin bentoniitilla, kuten Zurbriggen et al. [10] ovat kuvanneet. Tåmån jålkeen liuos konsentroitiin ultrasuodattamalla.

10

Entsyymin eristaminen aloitettiin puskuroimalla konsentraatti geelisuodattamalla pH-arvoon 7,2 (Sephadex G-25 coarse). Entsyymiliuos pumpattiin tassa pH-arvossa (pH 7,2) anionit vaihtavaan kromatografiapylvååseen (DEAE-Sepharose FF), johon suurin osa nåytteen proteiineista, mukaanlukien CBH I, tarttui. Suurin osa pylvååseen sitoutuneista proteiineista 15 ja mm. muut sellulaasit kuin CBH I eluoitiin puskurilla pH 7,2, johon lisattiin natriumklori- dia siten, etta sen konsentraatio eluointipuskurissa nousi asteittain arvoon 0,12 mol Γ1. Pylvåstå pestiin puskurilla pH 7,2, joka sisålsi 0,12 M NaCl kunnes siita ei enåå irronnut merkittavåsti proteiinia. CBH I eluoitiin kohottamalla NaCl:n konsentraatio arvoon 0,15 mol 11. Puhdistettu CBH I keråttiin tallå puskurilla eluioituneisiin jakeisiin.

20

Esimerkki 2

Sellobiohydrolaasi I -entsyymin karakterisointi

Esimerkin 1 mukaisesti puhdistetun entsyymipreparaatin proteiiniominaisuudet maaritettiin 25 tavanomaisilla proteiinikemian menetelmilla. Isoelektrinen fokusointi ajettiin Pharmacian

Multiphor II System -laitteistolla valmistajan ohjeiden mukaan kåyttaen 5 % pol yakry yliami-dia sisåltåvåå geeliå. pH-gradientti tehtiin kåyttåen kantaja-amfolyyttiå Ampholine, pH 3,5 -10 (Pharmacia), jolloin isoelektrisessa fokusoinnissa muodostui pH:n suhteen gradientti vålille pH 3,5 - pH 10. Perinteinen geelielektroforeesi denaturoivissa olosuhteissa (SDS-30 PAGE) ajettiin kuten Laemmli (11) on kuvannut kåyttåen 10 % polyakryyliamidia sisåltåå geeliå. Molemmista geeleistå proteiinit våijåttiin hopeavåijåyksellå (Bio Rad, Silver Stain Kit).

« _____ -- ---— Τ'- 92500 10 CBH Ι:η molekyylipainoksi saatiin 64000 ja isoelektriseksi pisteeksi 4,0 - 4,4. Geelien perusteella voitiin arvioida, etta yli 90 % preparaatin proteiinista oli sellobiohydrolaasi I:ta.

5 Esimerkki 3

Entsyymikasittely

Esimerkkien 1 ja 2 mukaisesti puhdistettujen ja karakterisoitujen entsyymien kyky hydro-lysoida karkeaa puuainesta (kuusi) selvitettiin ja verrattiin muihin sellulaaseihin. Entsyymian-10 nos oli 0,5 mg/g massaa ja hydrolyysiolosuhteet: pH 5 - 5,5, låmpdtila 45 °C, 24 h. Tulok- set on kuvattu taulukossa 1. On merkillepantavaa, etta sellobiohydrolaasit eivåt yksinåan aiheuttaneet sokereiden muodostumista eika siten massatappioita.

Taulukko 1. Puuaineksen (kuusi) hydrolyysikoe eri sellulaaseilla 15 ' ' """ - -— — "i · 1 1-----

Entsyymi DNS, g/1 Hydrolyysiaste, % CBH I 0,003 0,01 CBH II 0,05 0,1 EG I 0,06 0,12 EG II 0,04 0,08 20: *

Esimerkki 4

Entsyymikasittelyn vaikutus puun turpoamiseen 25

Fraktioidun TMP-kuusimassan pitkakuitujaetta (+48) kasiteltiin eri sellulaaseilla 5 %:n sakeudessa ja 45 °C:ssa 24 h. Massa lietettin vesijohtoveteen ja pH saadettiin vålille 5 - 5,5 laimealla rikkihapolla. Entsyymiannostus oli 0,5 mg/g kuivaa massaa. Kåsittelyn jålkeen massa pestiin vedellå ja kuitujen turpoamista kuvaava WRV-arvo (SCAN ehd. ) måaritettiin. 30: * Tulokset on esitettty taulukossa 2.

11 92500

Taulukko 2. TMP -kuusimassan turpoaminen entsyymien vaikutuksesta.

Entsyymi WRV, % CBH I 108 5 Kontrolli 102

Tulosten mukaan CBH I modifioi massaa lisaten sen kykyå pidåttaa vetta (turpoamista), mika parantaa jauhautuvuutta.

10 Esimerkki 5

Entsyymikåsittelyn vaikutus kuidun taipuisuuteen TMP-kuusimassan pitkakuitufraktiota (mesh +48) kasiteltiin CBH I- entsyymillå 5 %:n sakeudessa 2 tuntia 45 °C:ssa. Entsyymiannnostus oli 1 mg CBH I/g. Kåsittelyn jålkeen 15 mitattiin kuitujen jåykkyys hydrodynaamisella mentelmållå. Kustakin nåytteestå mitattiin 100 - 200 kuitua. Tulokset on esitetty taulukossa 3. Tulosten mukaan kuitujen jåykkyys pieneni, ts. kuitujen taipuisuus lisaåntyi CBH-kåsittelyn vaikutuksesta.

« ft » --- - 1— i2 92500

Taulukko 3. Entsyymikasittelyiden vaikutus kuidunjåykkyyteen.

Kuidunjåykkyysjakauman Kontrolli-nåyte CBH I

tunnusluku (yksikkonå 10'12Nm2 5 Pienin arvo 2,7 2,1

Alempi kvartiili 6,2 7,2

Mediaani 16,8 14.2

Ylempi kvartiili 27,4 21,8

Suurin arvo 45,5 40,2 10 Keskiarvo 17,7 15,8

Standardipoikkeama 11.2 9,6

Esimerkki 6 15 Entsyymikåsittelyn vaikutus jauhatuksen ominaisenergiankulutukseen

Kolmessa toisistaan riippumattomassa koesaijassa kertaalleen jauhettuja TMP-kuusimassoja, joiden freeness-arvot (CSF) olivat 450-550 ml, kasiteltiin CBH I -entsyymipreparaatilla. Massasulpun sakeus oli kaikissa kokeissa 5 % vesijohtovedesså, kasittelyaika 2 h ja låmpotila 20 45 - 50 °C. Kåsittelyisså kaytettiin 1 kg kuivaksi laskettua massaa ja entsyymiannostus oli 0,5 mg/g kuivaa massaa. Kåsittelyn jålkeen massat sakeutettiin, lingottiin ja homogenoitiin. Vertailunåytteet kasiteltiin muuten samoin, mutta niihin ei lisatty entsyymiå.

Massat jauhettiin edelleen Bauer- tai Sprout Waldron -levyjauhimilla kayttaen pienenevåa 25 teråvåliå. Kuituuntumista seurattiin måarittamållå vålinåytteiden freeness-arvot. Jauhatukset lopetettiin, kun massojen freeness oli < 100 ml. Kuhunkin jauhatukseen kulunut sahkoener-gian måarå mitattiin ja laskettiin ominaisenergiankulutus, kWh/kg. Tulokset on esitetty taulukossa 4.

13 92500

Taulukko 4. Kuidutuksen ominaisenergiankulutus CBH I -kasitellyillå nåytteillå ja vertailuilla kolmessa eri koesaijassa. Ominaisenergiankulutukset on laskettu freeness-iasolla 100 ml.

Nåyte Saija I Saija II Saxja II

kWh/kg kWh/kg kWh/kg CBH I 1,73 1,64 2,04 5 Kontrollit 1,97 2.05 2,39

Saaduista tuloksista huomataan, ettå CBH I -entsyymikasitellyllå on mahdollista alentaa Kuidutuksen ominaisenergiankulutusta 15 -20 % kasittelemåttomåån nåytteeseen verrattuna.

10 Sama efekti saavutettiin myos, jos preparaatti sisalsi molempia sellobiohydrolaasi-aktiivisuuk- sia tai proteolyyttisesti digestoitua CBH:ta. Viimeksi mainittu valmiste sisalsi CBH:n molem-mat rakenneosat (ydin ja hån ta), jotka kuitenkin oli erotettu toisistaan.

Esimerkki 7 15 £ntsyymikåsittelyiden vaikutus paperiteknisiin ominaisuuksiin.

Kåsiteltiin TMP-massoja, jotka oli jauhettu eri freeness tasoihin (30 - 300) entsyymivalmis-teilla, jotka sisålsivåt CBH I ja CBH II -entsyymejå. Todettiin kuidun paperiteknisten omi-naisuuksien, kuten lujuuden paraneminen.

20

Toisessa koesaijassa CBH-valmisteeseen lisattiin hemisellulaaseja (ksylanaaseja, manna-naaseja ja esteraaseja yhdessa ja erikseen) jauhetun massan kasittelemiseksi. Hemisellulaasi-lisaysten voitiin todeta parantavan massan valkaistavuutta peroksidilla.

25 Esimerkki 8

Entsyymikasittelyn vaikutus selluloosan kiteisyyteeu.

TMP-kuusimassaa kåsiteltiin natiiveilla sellobiohydrolaasi-entsyymeillå ja vastaavilla diges-toiduilla valmisteilla. Kåsittelyiden vaikutuksesta puuraaka-aineen selluloosan kiteisyys aleni. 30' * Samaa efektiå ei todettu endoglukanaasi-entsyymeillå (EG I ja EG II).

14 92500

Kirjallisuus 1. Puumassan valmistus. Toim. Nils-Erik Virkola, Suomen Paperi-insinoorien yhdistys.

Turku 1983.

5 2. D.A. Goring. Thermal Softening of Lignin, Hemicellulose and Cellulose. Pulp And Ppaer· Magazine of Canada 64 (1963) 12, T517-27.

3. J-C Pommier, J-L Fuentes & G. Goma. Using enzymes to improve the process and the 10 product quality in the recycled paper industry. Part 1: the basic laboratory work. TAPPI J.

72 (1989) 6. 187-191.

4. J-C Pommier, G. Goma, J-L Fuentes, C. Rousser, O. Jokinen, Using enzymes to improve the process and the product quality in the recycled paper industry. Part 2: Industrial 15 applications. TAPPI J. 73 (1990) 12, 197-202.

5. K. Jokinen & M. Savolainen. Puun mekaanisen massan kasittely lakkaasilla. PSC Communications 18. Espoo 1991.

20 6. E. Setliff, R. Marton, G. Granzow & K. Eriksson. Biochemical pulping with white-rot fungi. TAPPI J. 73 (1990), 141-147.

7. G. Leatham, G. Myers & T. Wegner. Biomechanical pulping of aspen chips: energy savings resulting from different fungal treatments. TAPPI J. 73 (1990), 197-200.

25 8. M. Akhtar, M. Attridge, G. Myers, T.K. Kirk & R. Blanchette. Biomechanical pulping of loblolly pine with different strains of the white-rot fungus Ceriporiopsis subvermispora.

: TAPPIJ. 75 (1992), 105-109.

30 9. van Tilbeurgh, H. Bhikhabhai, R. Pettersson, L. and Claeyessens M. (1984) Separation of endo- and exo-type cellulases using a new affinity method. FEBS Lett. 169, 215-218.

15 92500 10. Zurbriggen, B.Z., Bailey, M.J., Penttilå, M.E., Poutanen, K. and Linko M. (1990)

Pilot scale production of a heterologous Trichodema reesei cellulase in Saccharomyces cerevisiae. J. Biotechno]. 13, 267-278.

5 11. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacte riophage T4. Nature 227 (1970), 680-685.

Chen H., Hayn M. & Esterbauer H. Purificatio and characterization of two extracellular β-glucosidases from Trichoderma reesei. Biochim.Biophys.Acta 1121 (1992), 54-60.

10 12. Covert, S., Vanden Wymelenberg, A. & Cullen, D., Structure, organisation and trans cription of a cellobiohydrolase gene cluster from Phanerochaere chrysosporium, Appl. Environ. Microbiol. 58 (1992), 2168-2175.

13. Ito, S., Shikata, S., Ozaki, K., Kawai, S., Okamoto, K., Inoue, S., Takei, A., Ohta, Y.

15 & Satoh, T., Alkaline cellulase for laudry detergents: production by Bacillus sp. KSM-635 and enzymatic properties, Agril. Biol. Chem. 53 (1989), 1275-1281 14. Teeri, T., Salovuori, I. & Knowles, J., The molecular cloning of the major cellobiohydrolase gene from Trichoderma reesei Bio/Technolgy 1 (1983), 696-699 20 15. Penttilå, M., Antre, L., Lehtovaara, P., Bailey, M., Teeri, T. & Knowles, J. Effecient secretion of two fungal cellobiohydrolases by Saccharomyces cerevisiae. Gene 63 (1988) 103-112.

25 16. Mitsuishi, Y., Nitisinprasert, S., Saloheimo, M., Biese. I., Reinikainen, T., Clayssens, M., Kerånen, S., Knowles, J. & Teeri, T. Site-directed mutagenesis of the putative catalysic residues of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I and endoglucanase I, FEBS Lett. 275 (1990), 135-138 30 17. Chen, H., Hayn, M. & Esterbauer, H. Purification and characterization of two extracel lular /5-glucosidases from Trichoderma reesei, Biochim. Biophys. Acta 1121 (1992), 54-60 92500 16 18. Mandels, Μ. & Weber, J. The production of cellulases. Advances in Chemistry Series, No. 95, 1969, 391-414 19. van den Hondel, C., Punt, P. & van Gorcom, R. Production of extracellular proteins by 5 the filamentous fungus Aspergillus. Antonio van Leeuwenhoek 61 (1992), 153-160 20. Tomme, P., McCrae, S., Wood, T. & Claeyssens, M. Chromatographic separation of cellulolytic enzymes. Methods Enzymol. 160 (1988), 187-193.

II

Claims (17)

92500 Patentti vaat iniu kset:

1. Menetelmå mekaanisen massan valmistamiseksi puuraaka-aineesta, jonka menetelmån mukaan 5. raaka-aine hajotetaan hakkeeksi, ja - hake kuidutetaan ainakin oleellisesti mekaanisesti, jolloin kuidutettava aine kåsitellåån entsyymillå valmistusprosessin sopivassa vaiheessa, t u η n e 11 u siita, ettå - entsyyminå kåytetåån sellaista entsyymivalmistetta, jonka pååasiallinen sellulaasiaktii- 10 visuus koostuu sellobiohydrolaasi-aktiivisuudesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, t u η n e 11 u siita, etta kaytetaan sellaista entsyymivalmistetta, jonka endo-/3-glukanaasi- aktiivisuus on korkeintaan pieni suhteessa sellobiohydrolaasi-aktiivisuuteen. 15

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmå, t u η n e 11 u siita, etta kaytetaan entsyymivalmistetta, joka sisåltåå eristettyjå sellobiohydrolaasientsyymejå tai niiden osia.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, t u η n e 11 u siita., etta kuidutettavan 20 aineen amorfisen osan osuutta kasvatetaan entsyymikåsittelyllå ennen sen kuiduttamista halut- tuun lopulliseen suotautuvuuteen.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, t u η n e 11 u siita, etta kaytetaan sellaista entsyymivalmistetta, joka on tuotettu kasvattamalla sopivalla kasvatusalustalla mikro-organis- 25 mikantaa, joka on kuuluu Trichoderma-sukum, Aspergillus-sukuun, Phanerochaete-sukuun, Penicillium-sukuun, Streptomyces-sukuun, Humicola-sukuun, tai Bacillus-sukuun.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmå, t u η n e 11 u siita, etta kaytetaan sellaista entsyymivalmistetta, joka on tuotettu kannalla, jota on geneettisesti parannettu tuottamaan 30 sellobiohydrolaasi-aktiivisuuden omaavaa entsyymiå, tai johon sanottua aktiivisuutta koodaa- va geeni on siirretty. 92500 ---- " - T—

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, t u η n e 11 u siitå, ettå kåytetåån entsyy-mivalmistetta, joka sisåltåå mikro-organismin Trichoderma reesei tuottamaa sellobiohydrolaa-sia.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 5-7 mukainen menetelmå, t u η n e 11 u siita, ettå kayte taan sellaista sellobiohydrolaasi-entsyymiå, joka on erotettu muista kasvatusliuoksen proteii- neista nopealla anioniseen ioninvaihtoon perustuvalla puhdistusmenetelmållå

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmå, t u η n e t t u siitå, ettå kåytetåån entsyy- 10 mivalmistetta. joka sisåltaa homekannan Trichoderma reesei tuottamaa sellobiohydrolaasia I (CBH I), jonka molekyylipaino SDS-PAGE:iia mååritettynå on noin 64.000 ja isoelektrinen piste on noin 3,2 - 4,4.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, t u η n e t t u siitå, ettå kåsitellåån entsy- 15 maattisesti karkeaa massaa, jonka suotautuvuus on noin 30 - 1000 ml CSF, edullisesti noin 300 - 700 ml CSF.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmå, t u η n e 11 u siitå, ettå kåsitellåån entsy-maattisesti karkeaa massaa, joka kåsittåå kertaalleen jauhetun tai hiotun massan, kuiturejektin 20 tai pitkåkuitufraktion tai nåiden yhdistelmån.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, t u η n e 11 u siitå, ettå entsyymikåsittely suoritetaan 30 - 90 °C:ssa, edullisesti noin 40 - 60 °C, massan sakeuden ollessa noin 0,1 -20 %, edullisesti noin 1 - 10 %, ja kåsittelyajan ollessa 1 min - 20 h, edullisesti noin 30 min 25 - 5 h.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, t u η n e 11 u siitå, ettå entsyymivalmis-tetta kåytetåån noin 10 μ% - 100 mg proteiinia per g kuivaa massaa, edullisesti noin 100 μ% -10 mg proteiinia/g kuivaa massaa. 30

14. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmå, t u η n e 11 u siitå, ettå mekaaninen massa valmistetaan GW-, PGW-, TMP- tai CTMP-menetelmållå. 19 92500

15. Mekaanisen massan kasittelyyn tarkoitettu entsyymivalmiste, t u η n e 11 u siita, etta sillå on oleellinen sellobiohydrolaasi aktiivisuus ja — suhteessa sellobiohydrolaasiaktiivisuu-teen — korkeintaan pieni endo-/3-glukanaasi-aktiivisuus.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siita, etta se on tuotettu kasvattamalla sopivalla alustalla mikro-organismikantaa, joka kuuluu Trichoderma- sukuun, Aspergillus-sukmn, Phanerochaete-sukuun, Penicillium-sukuun, Streptomyces-sukuun, Humicola-sukuun, tai Bacillus-sukum.

17. Patenttivaatimuksen 15 mukainen entsyymivalmiste, tunnettu siita, etta se on tuotettu kasvattamalla homekantaa Trichoderma reesei tai tamån modifioitua kantaa, johon sellobiohydrolaasia tai sen rakenneosaa koodaava geeni on siirretty, tai kasvattamalla hiivan, homeen tai bakteerin geneettisesti modifioitua kantaa, johon Trichoderma reesein sellobiohydrolaasia tai sen rakenneosaa koodaava geeni on siirretty. « « 20 92500