FI89613C

FI89613C - Foerfarande foer enzymatisk behandling av cellulosamassor

Info

Publication number: FI89613C
Application number: FI915755A
Authority: FI
Inventors: Liisa Viikari; Johanna Buchert; Matti Siika-Aho; Marjaana Raettoe
Original assignee: Valtion Teknillinen
Priority date: 1991-12-05
Filing date: 1991-12-05
Publication date: 1993-10-25
Also published as: FI89613B; BR9206860A; WO1993011296A1; JPH07501587A; EP0615564A1; FI915755A0; CA2125166A1; AU3088292A; NO942071L; NO942071D0

Description

8 9 61 3

Menetelmä selluloosamassojen entsymaattiseksi käsittelemiseksi

Esillä oleva keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 mukaista menetelmää selluloosamassojen entsymaattiseksi käsittelemiseksi.

5

Perinteisessä kloorivalkaisussa ligniinin liuottamiseen käytetään klooria tai klooridioksidia. Nykyisin selluloosamassa valkaistaan usein myös happikaasulla, vetyperoksidilla tai näiden ja edellä mainittujen valkaisukemikaalien yhdistelmillä. Näihin tavanomaisiin valkaisumenetelmiin on eräissä tunnetun tekniikan mukaisissa ratkaisuissa yhdistetty hemisel-10 lulaaseilla ja ligninaaseilla suoritettavat entsyymikäsittelyt, jolloin on saatu aikaan kuidun valkaistavuuden paraneminen. Tarvittavat entsyymimäärät ovat pienet valkaisuefektin saavuttamiseksi ja entsyymikäsittely voidaan helposti liittää osaksi massanvalmistusproses-sia.

15 Tunnetun tekniikan mukaiset entsymaattiset käsittelyt on tehty suoraan keitosta tuleville kuiduille. Suorittamissamme tutkimuksissa olemme kuitenkin voineet todeta, että selluloosamassan kuitujen ominaisuudet vaikuttavat oleellisesti entsyymien toimintaedellytyksiin. Niinpä esim. ksylanaasit toimivat huonosti kun kuidun pintavaraus s.o. zetapotentiaa-li on erittäin negatiivinen. Olemme myös todenneet, että alhaisessa pH:ssa käsitelty sul-20 faattimassa, jonka hemiselluloosan karboksyyliryhmät ovat happomuodossa eivätkä näin ollen sisällä metallivastaioneja, sopii huonosti entsyymien (hemisellulaasien) substraatiksi.

Tekniikan tason mukaisissa entsyymikäsittelyratkaisuissa näihin seikkoihin ei ole kuitenkaan kiinnitetty huomiota eikä tunnetussa tekniikassa ei ole pyritty muuttamaan kuitujen - 25 olomuotoja siten, että kuidut sopisivat paremmin entsymaaniseen käsittelyyn.

On tunnettua, että selluloosamassan eli sellun pintavaraukseen vaikuttavat pääasiassa sen sisältämät karboksyyliryhmät (Sjöström 1989). Näiden määrä riippuu oleellisesti massan keittomenetelmästä. Niinpä sulfaattimassan (samoin kuin mekaanisen massan) karboksyyli-30 ryhmät koostuvat pääasiassa massan ksylaanin metyyliglukuronihapporyhmistä (Sjöström 1989). Sulfiittimassan karboksyyliryhmät koostuvat sen sijaan ksylaanin metyyligluku-ronihappojen ohella myös ligniinissä olevista, keitossa muodostuneista sulfonihapoista.

2 8961 3

Karboksyyliryhmien varauksen voimakkuus ja dissosiaatioaste vaihtelee sen mukaan, mikä on karboksyyliryhmän vastaionin muoto (Scallan ja Grignon 1979, Scallan 1983, Lindström ja Carlson 1982). Tavallisesti vastaionina on vety- tai jokin metalli-ioni, jolloin karboksyylihapporyhmiin on sitoutunut suuri osa - itse asiassa suurin osa - massan sisältä-5 mistä metalli-ioneista. Tämä koskee sekä kemiallisia että mekaanisia massoja.

Selluloosamassan metalli-ionit voivat olla eduksi tai haitaksi massalle suoritettavalle käsittelylle. Kuten edellä mainittiin sopii sulfaattimassa, jonka hemiseiluloosien karbok-syylihapporyhmistä puuttuu metallivastaionit, huonosti entsyymikäsittelyyn. Toisaalta 10 massan sisältämät metallit ovat useassa suhteessa ei-toivottavia massan jatkokäsittelyn kannalta. Niinpä monet metalli-ionit, etenkin rauta ja mangaani, ovat haitallisia peroksidi-valkaisussa peroksidin pysyvyydelle ja ne on poistettava optimaalisen valkaisutuloksen saavuttamiseksi.

15 Nykyisten menetelmien mukaan kuidun metallipitoisuutta alennetaan joko laskemalla massan pH riittävät alas, jolloin metallit dissosioituvat, tai käsittelemällä massaa tunnetuilla kompleksinmuodostajilla, esim. DTPA:lla tai EDTA:LLa (Basta et ai 1991). Näihin ratkaisuihin liittyy kuitenkin huomattavia epäkohtia. Niinpä happamissa olosuhteissa suoritetusta metallinpoistosta saadaan massa, jolle on vaikea suorittaa 20: tehokas entsyymikäsittely valkaisun yhteydessä. Luonnolle vieraiden kompleksinmuodosta jien käytöstä saattaa taas aiheutua ongelmia esim. biologisen jätevesipuhdistuksen yhteydessä.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on poistaa tunnettuun tekniikkaan liittyvät 25 epäkohdat ja saada aikaan aivan uudenlainen menetelmä selluloosamassojen käsittelemi seksi.

Keksintömme lähtee näet siitä ajatuksesta, että vaikuttamalla selluloosamassan sisältämien hemiseiluloosien karboksyylihapporyhmiin, voidaan muuttaa paitsi selluloosamassan pinta-30: varausta myös sen metallipitoisuutta. Keksinnön mukaan sellusta poistetaan tällöin sopi- vimmin karboksyylihapporyhmiä käsittelemällä sellua oleellisen glukuronidaasi-aktiivisuu-den omaavalla entsyymivalmisteella.

i 8 9 61 3 3 Täsmällisemmin sanottuna keksinnön mukaiselle menetelmälle on pääasiallisesti tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.

"Entsyymivalmisteella" tarkoitetaan tämän hakemuksen puitteissa mitä tahansa sellaista S tuotetta, joka sisältää ainakin yhden entsyymin. Niinpä entsyymivalmiste voi olla esim.

entsyymiä tai entsyymejä sisältävä kasvatusliuos, eristetty entsyymi tai kahden tai useamman entsyymin seos.

Käsitteellä "oleellinen glukuronidaasiaktiivisuus" tarkoitetaan sitä, että entsyymivalmisteen 10 glukuroniaktiivisuus on kohtuullisen suuri suhteessa entsyymivalmisteen mahdollisiin muihin entsyymiaktiivisuuksiin, jotta saataisiin oleellinen osa glukuronihapporyhmistä lohkaistuksi substraatista.

Keksinnön erään edullisen sovellutusmuodon mukaan pyritään siihen, että muuttamalla 15 spesifisesti karboksyyliryhmien määrää glukuronidaasin avulla voidaan säädellä entsyy mien optimaalista toimintakykyä kuidussa pilkkomatta muuta kuidun hemiselluloosaa.

Mitä korkeampi glukuronidaasi suhteellinen aktiivisuus on käytetyssä entsyymivalmistees-sa, sitä helpommin päästään tähän tavoitteeseen.

20 On tunnettua, että eräät valkaisun esikäsittelynä käytetyt entsyymipreparaatit sisältävät glukuronidaasia, jolla saattaa olla hemiselluloosien hydrolyysiä edistävä vaikutus. Tällöin näiden käyttö on kuitenkin perustunut nimenomaan glukuronihapporyhmiä sisältävän ksylaanin hydrolyysituloksen parantamiseen (Kantelinen et ai. 1988, Poutanen et ai.

1987). Tunnetun tekniikan mukaan ei ole kuitenkaan pyritty spesifiseen karboksyyliryhmi-; -25 en poistoon vaan tehokkaampaan hemiselluloosien kokonaishydrolyysiin. Keksinnön mukaiseen spesifiseen karboksyyliryhmien poistoon ei käytetyillä entsyymivalmisteilla olisi voitu päästäkään; siihen näiden valmisteiden suhteellinen glukuronidaasiaktiivisuus on liian pieni.

:3C* Keksinnön mukaan glukuronidaasikäsittely voidaan tehdä joko yhtäaikaa ksylanaasi tms.

hemisellulaasikäsittelyn kanssa tai ennen sitä. Kun glukuronidaasikäsittely tehdään yhdessä muun hemisellulaasikäsittelyn kanssa on edullisinta käyttää entsyymivalmistetta, johon on 8961 3 4 joko lisätty glukuronidaasiaktiivisuutta tai tuottokantaa on geneettisesti modifioitu tuottamaan enemmän glukuronidaasia, niin että aikaansaadaan valmiste, jolla on oleellinen glukuronidaasiaktiivisuus. Keksinnön mukainen glukuronidaasikäsittely voidaan myös yhdistää sinänsä tunnettuihin sellulaasi- ja/tai ligninaasikäsittelyihin.

5

Erityisen edullista on suorittaa glukuronidaasikäsittely ennen massan valkaisua, johon mahdollisesti on yhdistetty tavallinen ksylanaasikäsittely. Tällä tavalla voidaan entisestään vähentää valkaisukemikaalin kulutusta. Koska glukuronidaasi alentaa massan metallipitoisuutta, valkaisukemikaalina voidaan edullisesti käyttää vetyperoksidia.

10

Keksinnön mukainen menetelmä soveltuu myös käytettäväksi ligniinipitoisen massan, eli mekaanisen tai kemimekaanisen massan käsittelyyn. Suorittamissamme kokeissa olemme yllättäen voineet havaita, että glukuronidaasikäsittelyllä voidaan tällaisen massan jälki-kellertymistä vähentää.

15

Erään edullisen sovellutusmuodon mukaan entsyymi valmisteena käytetään glukuronidaasi-entsyymiä tuottavan mikro-organismin kasvatusliuosta. Toisen niinikään edullisen vaihtoehdon mukaan entsyymivalmisteena käytetään taas mikro-organismin kasvatusliuoksesta eristettyä entsyymiä.

20 Tämän keksinnön erään erityisen edullisen sovellutusmuodon mukaan glukuronidaasi-ent-syymi erotetaan THchoderma reesein kasvatusliuoksesta käyttämällä anionisia ioninvaih-timia ja hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuvaa kromatografiaa. Näiden erottamis-menetelmien avulla saadaan entsyymi erotetuksi yllättävän yksinkertaisesti ja helposti.

25 Tuloksena saatavan α-glukuronidaasi-entsyymin molekyylipaino SDS-PAGE-menetelmällä määritettynä on noin 95 kDa. Se soveltuu hyvin käytettäväksi keksinnön mukaisessa menetelmässä.

Keksinnössä ei kuitenkaan rajoituta esitettyyn entsyymin erotusmenetelmään, vaan kysei-30 nen entsyymi on mahdollista erottaa myös muita tunnettuja menetelmiä käyttäen.

Sopivaa glukuronientsyymiä on mahdollista tuottaa myös Trichodema reesei -kannoilla, «9613 5 jotka on geneettisesti tai mutatoimalla parannettu tuottamaan juuri haluttua entsyymiä, tai muilla geneettisesti muunnelluilla tuottoisännillä, joihin tätä entsyymiä koodaava geeni on siirretty. Glukuronidaasi voidaan eristää myös muista kannoista, joista esimerkkeinä mainittakoon seuraavat: Thermoascus auranticus (Khandke et ai. 1989), Agaricus bispo-5 rus, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Schizophyllum commune, Tyromyces palust- ris, Streptomyces flavogriseus, S. olivochromogenes, Streptomyces spp., Thermobacter auranticus (Poutanen et ai. 1991), Aureobasidium pullulans, Aspergillus oryzae, Bacillus circulars ja Bacillus subtilis.

10 Kaikilla näillä mikro-organismikannoilla saadaan glukuronidaasia, joka pilkkoo erityisesti polymeerisen ksylaaniketjun glukuronihapposivuryhmiä. Käsittely ksylanaasientsyymeillä yksinään irrottaa ksylaanifragmentteja, joissa ksylaanin koostumuksen mukaan saattaa olla glukuronihapporyhmiä. Tämä käsittely yksinään ei kuitenkaan ole riittävän tehokas eikä spesifinen glukuronihapporyhmien oleelliseksi vähentämiseksi. Yhdistämällä gluku-15 ronidaasikäsittely ksylanaasikäsittelyyn voidaan haarautuneet ksylaaniketjut pilkkoa raken- neosikseen. Tällöin vaikutetaan kuitenkin pääasiassa ksylaania poistavasta Glukuronidaasi edistää kuidusta irrotettujen ksylaanifragmenttien hydrolysoitumista täydellisesti ksyloosik-si. Ksylaanin poisto ei kuitenkaan ole tämän keksinnön tarkoituksena, vaikka se tähän käsittelyyn voidaankin liittää.

20

Keksinnön avulla saavutetaan huomattavia etuja. Niinpä käsittelemällä sellua tämän keksinnön mukaisesti glukuronidaasilla joko ennen muuta entsyymikäsittelyä (esim. ksyla-. naasikäsittelyä) tai sen jälkeen, saadaan hydrolyysitaso nousemaan ja ksylanaasikäsittely voidaan tehdä alhaisessa pH-arvossa. Tässäkin tapauksessa entsyymin teho perustuu • -25 kuitenkin nimenomaan varattujen ryhmien poistoon eikä niinkään hemiselluloosan täydelli- 1 seen hydrolysoimiseen, kuten tunnetussa tekniikassa. Keksinnön mukaisen menetelmän vaikutus perustuu siihen, että poistamalla glukuronihapporyhmät entsymaattisesti voidaan kuidun pintavaraus muuttaa entsyymille edulliseen muotoon. Em. tekijöitä muuntelemalla voidaan näet vaikuttaa siihen, mihin kuidun osaan entsyymit tarkoituksenmukaisimmin 30 vaikuttavat. Näillä tekijöillä, joita aikaisemmissa tutkimuksissa ei lainkaan ole huomioitu, voidaan vaikuttaa siihen miten kuidussa oleva ligniini voidaan helpoimmin uuttaa kuidusta pois. Näiden tekijöiden säätelyllä voidaan siis suoraan vaikuttaa myös niiden kemikaalien 8961 3 6 tyyppiin ja määrään, joilla ligniini teollisesti uutetaan kuidusta ja voidaan näin ollen edelleen parantaa ympäristön kannalta edullisia vähäkloorisia tai kloorittomia valkaisumenetelmiä.

5 Tässä keksinnössä on edelleen yllättäen havaittu, että käsittelemällä massaa gluku- ronidaasilla voidaan metallien poistoa helpottaa poistamalla metalleja sitovat glukuronihap-poryhmät, jolloin peroksidivalkaisussa tarvittava metallien poisto jää joko kokonaan tai osittain tarpeettomaksi. Tämä vähentää peroksidivalkaisun ympäristökuormitusta entisestään.

10

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on myös tyypillistä, että glukuronidaasikäsittelyn avulla voidaan muunnella mekaanisen ja kemiallisen massan paperiteknisiä ominaisuuksia.

Massan karboksyyliryhmien määrä ja niihin liittyneet vastaionit vaikuttavat massan va-15 raukseen. Näitä tekijöitä voidaan kuvat erilaisilla tunnetuilla kemiallisilla ja fysikaalisilla määritysmenetelmillä. Massan pintavarausta voidaan mitata zetapotentiaalilla (Melzer 1972). Massan metallipitoisuutta voidaan mitata analysoimalla massan metallit atomiab-sorptiospektrometrisesti. Massan karboksyyliryhmäpitoisuus voidaan mitata esim. Sjöströ-min menetelmällä (KCL-menetelmä 192:68). Entsyymien toimintaa kuidussa kuvaavat sekä kuidusta vapautuvat sokerit ja siitä uutettuvat ligniinifragmentit, sekä se valkaisutu-los, joka voidaan saavuttaa entsyymeillä, kun kuidun pintavaraus, so. zetapotentiaali ja kuidun karboksyyliryhmäpitoisuus on saatu toivottuun muotoon.

Keksintöä ryhdytään seuraavassa tarkastelemaan muutaman ei-rajoittavan esimerkin valos-25 sa.

Esimerkki 1. Glukuronidaasin tuottaminen eräillä mikrobikannoilla 30 Aspergillus oryzae VTT-D-85248, Trichoderma reesei Rut C-30 ja Aureobasidium pullu 8 9 61 3 7

Ians VTT-D-89397 (NRRL Y-2311-1) kantoja kasvatettiin alustalla, joka sisälsi 20 g/1 ksylaania (Roth), 20 g/1 maissinliotusvettä ja ravinteita. Kasvuliuoksesta mitattiin gluku-ronidaasiaktiivisuus. Saadut aktiivisuudet olivat 250 pkat/ml, 1000 pkat/ml ja vastaavasti 100 pkat/ml. Tulosten mukaan glukuronidaasia voidaan tuottaa tavanomaisilla hemisellu-5 laasin tuottoon käytetyillä organismeilla.

Esimerkki 2. T. reesei -glukuronidaasin eristäminen ja karakterisointi

Entsyymin eristäminen aloitettiin puskuroimalla Trichoderma reesein kasvuliuos geeli-10 suodattamalla pH-arvoon 5,7 (Sephadex G-25). Entsyymi sidottiin tässä pH-arvossa anionit vaihtavaan kromatografiapylvääseen (DEAE-Sepharose FF), ja pylvääseen tarttuneet proteiinit eluoitiin puskurilla pH 5,7, johon lisättiin natriumkloridia siten, että muodostui lineaarinen konsentraatiogradientti pitoisuusvälille 0-0,15 M. Haluttu entsyymi kerättiin gradientin avulla eluoituneisiin jakeisiin.

15

Entsyymin sisältävät jakeet puhdistettiin edelleen hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuvan kromatografiapylvään (Phenyl Sepharose FF) avulla. Entsyymi sidottiin e.m. materiaaliin suolakonsentraatiossa 0,8 M (NH4)2S04:a. Pylvääseen tarttunut entsyymi eluoitiin puskurilla pH 5,6 siten, että siihen lisättiin (NH4)2S04:a siten, että muodostui 20 laskeva lineaarinen konsentraatiogradientti välille 0,8 - 0,4 M. Puhdistettu entsyymi eluoitui gradientin aikana kerättyihin jakeisiin ja se konsentroitiin ultrasuodattamalla (Amicon, PM-10 -membraani).

: ; : Entsyymin α-glukuronidaasiaktiivisuus on määritetty käyttäen menetelmää, jonka ovat : -25 kuvanneet Puis ym. (1987). Menetelmässä mitataan kromatografisesti entsyymin 4-0- metyyli-glukuronosylksylobioosista irrottaman metyyli-glukuronihapon määrää. Kokeissa '· on myös käytetty substraattina suurimolekyylistä ksylaania, jossa on glukuronihapposubsti- tuentteja (Roth xylan).

30 Puhdistetun entsyymin proteiiniominaisuudet määritettiin tavanomaisilla proteiinikemian menetelmillä. Näitä ominaisuuksia on kuvattu taulukossa 1.

8 8 9 61 3

Taulukko 1. Trichoderma reesein α-glukuronidaasin ominaisuudet

Ominaisuus Arvo Yksikkö 5

Molekyylipaino (SDS-PAGE) 95 kDa

Molekyylipaino 88 kDa geelisuodatuksessa Spesifinen aktiivisuus 10 - substraattina 4-O-methyl n. 100 nkat/mg prot.

glukuronosylksylobioosi pH-optimi 3-5 15 Esimerkki 3. Sulfaattimassan karboksyyliryhmien poistaminen glukuronidaasilla Mänty- ja koivusulfaattimassaa käsitellään 5 %:n sakeudessa glukuronidaasilla pH:ssa 5. Käsittelyaika on 5 tuntia ja entsyymiannos 1000 nkat/g. Glukuronidaasikäsittelyn jälkeen massa pestään tislatulla vedellä ja massan karboksyyliryhmäpitoisuus määritetään. Massas-20 ta mitataan myös pintavaraus (zetapotentiaali) ja metallipitoisuus. Tuloksista voidaan todeta, että glukuronidaasikäsittelyllä pystytään alentamaan massan karboksyyliryhmien määrää, massan pintavarausta sekä massan metallipitoisuutta.

Esimerkki 4. Glukuronidaasilla käsitellyn sulfaattimassan peroksidivalkaisu 25 Mäntysulfaattimassaa käsitellään glukuronidaasilla kuten esimerkissä 3. Käsitelty ja käsittelemätön massa valkaistaan 1-vaiheisella peroksidisekvenssillä (3 % vetyperoksidia, 1,5 % NaOH, 0,2 % MgS04, 10 % sakeus, 60 min, 80 °C). Massasta mitataan jäännösperok-sidi, massan vaaleus ja kappaluku valkaisun jälkeen. Glukuronidaasikäsittelyllä on selvä 30 vaikutus peroksidin pysyvyyteen viskositeettiin ja vaaleuteen. Vertailumassana on käsittelemätön massa ja kompleksinmuodostajilla käsitelty massa (0,2 % DTPA, 30 min, 5 % sakeus, 50 °C).

9 y 6 Ί 3

Esimerkki 5. GiukuronidaasiUa käsitellyn massan ksylanaasikäsittely Mäntysulfaattimassa käsitellään glukuronidaasilla erikseen tai yhtäaikaa ksylanaasikäsitte-lyn kanssa kuten esimerkissä 3. Ksylanaasina käytetään T. reeseista puhdistettua ksylanaa-5 siä (Tenkanen et ai, lähetetty julkaistavaksi). Massa valkaistaan D/CEDED sekvenssillä.

Entsyymikäsittelyn vertailuna käytetään käsittelemätöntä massaa ja pelkästään ksylanaasilla käsiteltyä massaa ja hydrolyysien jälkeen mitataan käsittelyssä vapautuneet pelkistävät sokerit. Havaitaan, että glukuronidaasi käsittely edesauttaa ksylanaasin toimintaa pelkistävinä sokereina mitattuna. Tämä voidaan todeta myös valkaisun jälkeen mitattuna massan 10 vaaleutena. Todetaan, että kun glukuronidaasi-käsittely tehdään ennen ksylanaasikäsittelyä saadaan yhtä hyvä tulos kuin käytettäessä samanaikaisesti glukuronidaasia ja ksylanaasia.

Esimerkki 6. Happomuotoisen massan hydrolyysin parantaminen glukuronidaasilla 15 Mäntysulfaattimassa pestään rikkihapolla pH-arvossa 4 1 tunnin ajan. Käsittelyn jälkeen massaan lisätään glukuronidaasia ja käsittelyä jatketaan 2h. Entsyymiannos on 500 nkat/g. Glukuronidaasikäsittelyn jälkeen massasta mitataan karboksyylipitoisuus. Glukuronidaasilla käsiteltyä massaa hydrolysoidaan T. reesein ksylanaasilla (100 nkat/g) 2 h ja mitataan ’ pelkistävät sokerit. Verrattuna ainoastaan happopestyyn massaan pystytään glukuronidaasi-20 käsittelyllä parantamaan ksylanaasin toimintaa kuidussa.

Esimerkki 7. Glukuronidaasin vaikutus mekaanisen ja kemiallisen massan paperitek-. . nisiin ominaisuuksiin ; -25 Mekaanista massaa ja sulfaattimassaa käsitellään glukuronidaasilla kuten esimerkissä 3.

Havaitaan, että käsittelyllä pystytään vaikuttamaan massojen paperiteknisiin ominaisuuk--: siin, vetolujuuteen ja sidoksenmuodostamiskykyyn.

30 Esimerkki 8. Glukuronidaasin vaikutus mekaanisen massan jälkikellertymiseen

CTMP ja PGW massasuspensioita käsiteltiin Agaricus bisporus glukuronidaasilla 0,2 M

3961 3 ίο natriumasetaattipuskurissa (pH 5) 40°C lämpötilassa 20 tuntia. Käsittelyn jälkeen massasta tehtiin 95cm2 arkit. Arkit valotettiin (27°C lämpötilassa ja 47 % suhteellisessa kosteudessa) kolmen tunnin ajan Xenotest ISO S laitteessa (Herauas Hanau) xenon lampulla. Massa-arkkejen reflektanssi mitattiin ennen ja jälkeen valotuksen 457 nm (vaaleus) suodattimena. 5 Jälkikellertymista kuvaavat PC arvot laskettiin Janssonin ja Forskälin (1989) esittämällä tavalla. Glukuronidaasikäsittelyn todettiin vähentävän molempien massojen jälkikellerty-mistä.

Taulukko 2. Glukuronidaasikäsittelyn vaikutus PGW massan jälkikellertymiseen

10 Käsittely Ro R, R, PCI PC2 PC

puskuri 59,7 60,3 56,85 -0,53 3,31 2,78 glukuronidaasi 10 59,7 60,55 57,15 -0,75 3,21 2,46 nkat/g glukuronidaasi 100 59,7 60,35 57,45 -0,57 2,73 2,16 15 nkat/g

Taulukko 3. Glukuronidaasikäsittelyn vaikutus CTMP massan jälkikellertymiseen

20 Käsittely Ro R, R, PCI PC2 PC

puskuri 57,7 57,6 54,25 0,1 3,68 3,78 glukuronidaasi 10 57,7 57,55 54,45 0,15 3,39 3,54 nkat/g glukuronidaasi 100 57,7 58,35 55,15 -0,65 3,38 2,73 25 nkat/g 8 9 61 ό 11

Viitteet:

Kantelinen A, Rättö M, Sunquist J, Ranua M, Viikari L ja Linko M (1988) 5 Hemicellulases and their potential role in bleaching, TAPPI PRoc 1988 Int Pulp

Bleaching Conf, April 1988, ss. 1-9.

Melzer I (1972) Zeta-potential und seine Bedeutung bei der Herstellung von Papier. Das Papier 26(7): 305-332.

10

Poutanen K, Rättö M, Puls J ja Viikari L (1987) J. Biot. 6:49-60.

Puls, J., Schmidt, O. & Granzow, C., Enzyme Microb. Technol. 1987, 9: 83-88.

15 Lindström T ja Carlsson G (1982) The effect of chemical environment on fiber swelling.

Svensk Papperstidn 85(3): R14-20.

Scallan AM ja Grignon J (1979) The effect of cations on pulp and paper properties. Svensk Papperstidn 1979: nro 2: 40-47.

20

Scallan (1983) The effect of acidic groups on the swelling of pulps: a review. Tappi Journal 66 (11):73-75.

Sjöström E (1989) The origin of charge on cellulosic fibres. Nordic Pulp and Paper 25 Research Journal 4(2): 90-93.

Sjöström E, Massan karboksyylipitoisuus, KCL menetelmä 192:68

Buchert J ja Viikari L (1991) Menetelmä lignoselluloosapitoisten materiaalien etenkin : 30 selluloosamassojen entsymaattiseksi käsittelemiseksi. Suom. pat. hak. 914780

Poutanen K, Tenkanen M, Korte H ja Puls J (1991) Accessory enzymes involved in the 8961 3 12 hydrolysis of xylans. ACS Symp. Ser 460, Enzymes in Biomass Conversion, ss. 426-436.

Khandke KM, Vithayathil PI, and Murthy SK (1989) Arch Biochem Biophys 274: 511-517.

5

Basta J, Holtinger L ja Hook J (1991) Controlling the profile of metals in the pulp before hydrogen peroxide treatment. Proc. 6th Int. Symp. Wood and Pulping Chemistry, Melbourne 1991, ss. 237-244.

10 Jansson J ja Forsskähl I (1989) Color changes in lignin rich pulps on irradiation by light. Nordic Pulp and Paper Research Journal no 3/1989: 197-203.

Claims

13 K961i

1. Menetelmä selluloosamassan en tsy maaniseksi käsittelemiseksi, tunnettu siitä, että massa saatetaan kosketuksiin sellaisen entsyymivalmisteen kanssa, jolla on oleellinen 5 glukuronidaasi-aktiivisuus, massan glukuronihapporyhmien ainakin osittaiseksi poistami seksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään entsyymivalmistetta, joka on tuotettu mikro-organismikannalla Thermoascus auranticus,

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymival-misteena käytetään glukuronidaasi-entsyymiä tuottavan mikro-organismin kasvatusliuosta.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymival- misteena käytetään mikro-organismin kasvatusliuoksesta eristettyä entsyymiä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, jossa käytetään entsyymivalmistetta, joka : on tuotettu mikro-organismikannalla Trichoderma reesei, tunnettu siitä, että . .25 ot-glukuronidaasi-aktiivisuuden omaava entsyymi erotetaan kasvatusliuoksesta anionisella ioninvaihtimella ja hydrofobiseen vuorovaikutukseen perustuvalla kromatografialla.

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sellu-loosamassaa käsitellään α-glukuronidaasi-entsyymillä, jonka molekyylipaino SDS-PAGE-.-30 menetelmällä määritettynä on noin 95 kDa.

. 7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 8961 8 massaa käsitellään ensin oleellisen glukuronidaani-aktiivisuuden omaavalla entsyymival-misteella, minkä jälkeen se saatetaan kosketuksiin hemisellulaasi-, sellulaasi- ja/tai ligninaasiaktiivisuuden omaavan entsyymivalmisteen kanssa.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että massaa käsitellään samanaikaisesti oleellisen glukuronidaasi-aktiivisuuden omaavalla entsyymi valmisteella ja hemisellulaasi-, sellulaasi-ja/tai ligninaasiaktiivisuuden omaavalla entsyymivalmisteella.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että massaa käsitel lään entsyymivalmisteella, jolla on ainakin oleellinen glukuronidaasi-aktiivisuus ja ksy-lanaasi-aktiivisuus.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että selluloosamas- 15 san käsittely sanotulla entsyymivalmisteella suoritetaan ennen massan valkaisua.

10 Agaricus bisporus, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Schizophyllum commune, Tyromyces palustris, Streptomyces flavogriseus, S. olivochromogenes, Streptomyces spp., Thermobacter auranticus, Aureobasidium pullulans, Aspergillus oryzae, Bacillus circulars, Bacillus subtilis tai Trichoderma reesei, tai jollain näistä mikro-organismeista jalostetulla kannalla tai jollain muulla tuottoisännällä, johon glukuronidaasia tuottava geeni on 15 lisätty.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että selluloosamassaa käsitellään sanotulla entsyymivalmisteella ennen peroksidivalkaisua massan metallipitoisuuden vähentämiseksi. 20

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligniinipitoista selluloosamassaa käsitellään sanotulla entsyymivalmisteella massan jälkikellertymisen vähentämiseksi.

13. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyyminä käytetään sellaista glukuronidaasia, joka pilkkoo erityisesti polymeerisen ksylaaniketjun glukuronihapposivuryhmiä. 8961 3