FI94265B - Menetelmä lignoselluloosamateriaalin valkaisemiseksi happi- ja entsyymikäsittelyllä - Google Patents

Description

94265

Menetelmä lignoselluloosamateriaalin valkaisemiseksi happi- ja entsyymikäsittelyllä Tämä keksintö liittyy menetelmään lignoselluloosa-5 materiaalin valkaisemiseksi happikäsittelyä ja ksylanaa-silla tapahtuvaa entsyymikäsittelyä käyttäen.

Kuitumaisessa muodossa olevalla lignoselluloosama-teriaalilla on laajaa kaupallista käyttöä paperin, pahvin, puukuitulevyn jne. raaka-aineena. Tähän tarvittava raaka-10 aine on tavallisesti puu, jonka pääkomponentit ovat selluloosa ja kolmiulotteinen makromolekyyli - ligniini, joka on tiettävästi selluloosa- ja hemiselluloosapolysakkari-dien ympäröimä. On yleisesti hyväksyttyä, että eri komponentteja toisiinsa sitovat liitokset syntyvät kemiallisel-15 ta luonteeltaan erilaisten sidosten välityksellä. Esimerkiksi ligniinistä muodostuvien saarekkeiden ajatellaan liittyvän toisiinsa ketjuilla, jotka ovat hemiselluloosaa, lignoselluloosamateriaalin toista komponenttia. Kovassa - puuaineksessa valtaosa hemiselluloosasta on glukuronoksy- 20 laania, joka sisältää D-ksyloosin polymeeriä ja jota jäl jempänä kutsutaan ksylaaniksi.

Paperinvalmistukseen kelpaavien vahvojen ja val-kaisukelpoisten kuitujen tuottamiseksi täytyy lignosellu-loosamateriaali käsitellä ligniinin poistamiseksi, ja ta-25 vallisesti tämän käsittelyn alkuvaihe tapahtuu keittimessä sellaisten kemikaalien, kuten natriumhydroksidin ja nat-riumsulfidin läsnäollessa (valkaisemattoman sulfaattisel-luloosamassan tuottamiseksi) tai sulfiittien, tavallisesti natriumin tai magnesiumin sulfiittien läsnäollessa (val- 30 kaisemattoman sulfiittiselluloosamassan tuottamiseksi), . ·· joista sitten tuotetaan kemiallista massaa. Ligniinin poistamista nimitetään delignifikaatioksi. Puumassojen li-gniinisisältö mitataan permanganaatin hapettumiskokeella yhteisön Technical Association of the Pulp and Paper In-35 dustry (TAPPI) standardimenetelmän mukaisesti, ja se il- 2 94265 moitetaan kappalukuna. Keittimestä saatu kemiallinen massa sisältää vielä tässä vaiheessa huomattavan määrän jäljellejäänyttä ligniiniä ja se soveltuu joissakin tapauksissa rakennus- tai pakkauspaperin valmistukseen ilman jatkopuh-5 distusta. Useimpia sovellutuksia varten, kuten paino-, kirjoitus- tai saniteettipaperien valmistukseen, massan väri on kuitenkin liian tummaa ja se täytyy kirkastaa valkaisemalla. Tämän keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää juuri tässä vaiheessa, so. sellaisen lignosellu-10 loosamateriaalin valkaisussa, josta materiaalista käytettiin edellä nimitystä kemiallinen massa. Valkaisun alkuvaiheiden seurauksena poistuu ligniiniä myös lisää.

Tavanomainen massan jatkokäsittely ligniinin poistamiseksi ja valkaisemiseksi on tapahtunut käyttämällä 15 erilaisia monivaiheisia valkaisujaksoja, joihin kuuluu kolmesta kuuteen vaihetta tai jaksoa, joiden välissä voi olla pesuvaihe tai tämä pesu on voitu jättää pois. Valkaisun tarkoituksena on kemiallisen massan kyseessä ollessa . saada massaa, jonka valkoisuusaste ja vahvuus ovat riittä- 20 vän korkeita paperin ja pehmopaperin valmistamiseksi. Ta vallisesti valmistetaan massoja, joiden valkoisuusaste on 85 % - 90 % ISO. Tietyistä valkaisemattomista massatyy-peistä voidaan valmistaa vielä korkeamman valkoisuusasteen massoja, mutta tämä maksaa enemmän ja siihen sisältyy mas-25 san vahvuuslaadun menettämisen riski tai massat valmistetaan tämän laadun kustannuksella. Sitä asymptoottista val-koisuusasterajaa, jota kukin massatyyppi tavanomaisissa valkaisumenetelmissä lähestyy, kutsutaan valkoisuuden kat-toarvoksi. Tämä valkoisuuden kattoarvo on se valkoisuus-30 taso, jonka ylitettyään valkaisun jatkotoimenpiteiden voi-·; daan arvioida olevan liian haitallisia massan laadulle, kustannuksiltaan liian kalliita tai sellaisia, joita tietyillä materiaaleilla ei voida saavuttaa.

Valkaisuvaiheet ovat perinteisesti perustuneet ta-35 valla tai toisella kloorin tai klooria sisältävien yhdis- 3 94265 teiden käyttöön. Käytettyjä klooripitoisia yhdisteitä ovat kloori, jota merkitään C:llä, klooridioksidi, jota merkitään D:llä, ja hypokloriitit, joita merkitään H:11a, joka on tavallisesti natriumhypokloriittia. Klooria, joko seok-5 sena klooridioksidin kanssa tai ilman tätä, käytetään yleensä kemiallisen massan valkaisun aloittamiseen, jota seuraa kloorilla käsitellyn massan uutto vesipitoisella emäksisellä liuoksella, joista yhdessä käytetään nimitystä C-E. Kloorin käyttömäärä (tai kloorin ja klooridioksidin 10 yhteinen käyttömäärä, jossa klooridioksidi on ilmoitettu kloorin hapettavien ekvivalenttien perusteella) C-vaihees-sa on verrannollinen käsiteltävänä olevan massan ligniini-sisältöön (kappalukuun). Emäksistä uuttovaihetta käytetään liuottamaan ja poistamaan pääosa kloorattua ja hapetettua 15 ligniinin jäljellä olevaa osaa, ja siinä poistuu myös jonkinverran hemiselluloosaa.

Klooripitoisiin valkaisukemikaaleihin liittyvien veden ja ilman saastumisen ongelmien poistamiseen tarkoitettujen ankarampien ympäristöä koskevin määräysten olles-20 sa odotettavissa, missä yhteydessä klooripitoisille jätteille tullaan tarvitsemaan laajamittaisia talteenottojärjestelmiä, saadaan selvää etua siitä, että näiden kemikaalien käyttöä valkaisumenetelmissä vähennetään tai näistä luovutaan kokonaan. Lisäksi, jos klooripitoinen jäte kier-• 25 rätetään valkaisemattoman sulfaattiselluloosan valmistus menetelmässä mustalipeän talteenottojärjestelmän kautta, seuraa tästä haihduttimen ja uunin vaurioituminen. Voi myös tapahtua natriumkloridin kerääntymistä, josta seuraa uunin vaurioituminen. Tämän vuoksi massa- ja paperiteolli-30 suudessa on kiinnitetty huomiota muihin valkaisukemikaaleihin, joiden avulla nämä ongelmat voitaisiin välttää.

Yksi tämän teollisuuden tärkeistä edistysaskeleista viimeisten kahden vuosikymmenen aikana on liittynyt hapen käyttöön ligniiniä poistavana aineena ja valkaisuaineena. 35 Yksi sovellutus on hapen käyttö tavanomaisen kloorausta 4 94265 seuraavan emäsuuttovaiheen yhteydessä, josta käytetään merkintää Eo. Kloorausta seuraava emäsuuttovaihe voi sisältää muita hapettavia aineita, kuten peroksidia (p) tai hypokloriittia (h) yhdessä hapen kanssa tai tämän sijasta.

5 Nämä vaiheet merkitään tämän mukaisesti Epo:lla, Eho:11a, Ep:lla tai Eh:lla, ja näitä kutakin kutsutaan tavallisesti hapettavaksi uutoksi.

Hapen toinen pääsovellutus on pääasiassa massan keiton jälkeinen ja valkaisua edeltävä ligniinin poisto, 10 jota merkitään 0:11a. Näin käytettynä viedään happea emäksisessä liuoksessa olevaan valkaisemattomaan massaan paineen alaisena. Vaikkakin hapen käyttö on tarjonnut vaihtoehtoisen menetelmän ligniinin poistoon ja valkaisuun, siitä on vain rajoitetusti hyötyä, koska se vaikuttaa huonon-15 tavasti selluloosan polymeroitumisasteeseen, mitä pidetään haitallisena. Selluloosan polymeroitumisaste kuvaa massan vahvuutta, ja se mitataan massan viskositeettina TAPPI:n standardimenetelmän mukaisesti. Yksi valkaisuvaiheelle ; asetettava tarpeellinen kriteeri on se, että tuloksena 20 olevan massan viskositeetin ei tule oleellisesti laskea. On yleisesti tehty se havainto, että vain noin 50 % mas-sanmuodostuksen jälkeen jäävästä ligniinistä voidaan poistaa siten, että massan viskositeettihäviö on sallituissa rajoissa. Yritykset päästä parempaan ligniinin poistoon 25 tässä vaiheessa tapahtuvat suurempien viskositeettihäviöi-den kustannuksella. Massan viskositeettihäviöiden uskotaan syntyvän selluloosa- ja hemiselluloosaosien kemiallisesta modifioitumisesta (hajoamisesta).

Happea ligniinin poistoon käyttävät sovellutukset 30 ovat edesauttaneet klooria sisältävien yhdisteiden käytön ·· vähentämisessä valkaisuvaiheissa, koska kemikaalien syöttö kloorausvaiheessa perustuu massan ligniinisisältöön, ja tämä ligniinisisältö on vähentynyt huomattavasti (noin 40 - 50 %) ligniinin happipoistossa.

5 94265

Entsyymejä on tutkittu niiltä osin, miten niitä voidaan käyttää lignoselluloosamateriaalin käsittelyssä. On esimerkiksi osoitettu, että ligniiniä hajoittavat entsyymit, erityisesti valkohomesienistä peräisin olevat ent-5 syymit, hajoittavat ligniiniä eriasteisesti. Tiedetään myös hyvin, että sellulaasientsyymit hajottavat selluloosaa, ja niillä on kaupallista mielenkiintoa elintarviketeollisuudessa ja alkoholien valmistuksessa. Paperin valmistukseen aiotun massan valmistuksessa saattaa sellulaa-10 sientsyymillä olla huonontava vaikutus, mikä johtuu siitä, että tällöin tapahtuisi selluloosan polymeroitumisasteen alenemista.

Lignoselluloosamateriaalin hemiselluloosakomponen-tin ollessa kyseessä on raportoitu tutkimuksia ksylanaasi-15 entsyymien vaikutuksista puumassoihin. Ksylanaasit reagoivat odotetusti selektiivisesti hemiselluloosan ksylaanin kanssa.

FR-patenttihakemusjulkaisu nro 2 557 894 (julkaistu 1985) kuvaa menetelmän lehtipuusta valmistetun valkaistun 20 sulfaattiselluloosamassan tai havupuusta valmistetun val kaistun sulfiittimassan käsittelemiseksi ksylanaasia sisältävällä entsyymiliuoksella paperinvalmistuksessa tarvittavan myöhäisemmän hajotuksen tai jauhatuksen määrän vähentämiseksi. Tarvittiin erityisen suuria määriä entsyy-25 miä valkaistun massan käsittelemiseen halutun vaikutuksen aikaansaamiseksi. Jauhatuksen vähentämiseen käytettäväksi tarkoitettu Sporotrichum dimorphosporum-basldiomykeetti-sienen erittämä ksylanaasi ei lisäksi ollut sellulaasista vapaata, ja huonontavaa sellulaasiaktiivisuutta ehkäistiin 30 prosessiin lisäytyllä elohopeakloridilla. Elohopeayhdis- ·; teiden käyttö ei ole hyväksyttävää näiden tunnettujen myr kyllisten ja muiden vahingollisten vaikutusten johdosta, jotka liittyvät altistumiseen näille yhdisteille.

Chauvet et ai. [Proceedings of the International 35 Symposium on Wood and Pulping Chemistry, Paris (1987) 325] 6 94265 raportoivat Sporotrichum dimorphosporum -basidiomykeetis-tä saadun ksylanaasivalmisteen käytöstä esikäsittelyyn tavanomaisen kemiallisen massan valkaisun sarjassa C/D-E-D-E-D. Raakaentsyymikompleksi käsitellään elohopeakloridilla 5 kaikkien polysakkaridaasiaktiivisuuksien inaktivoimiseksi ksylanaasiaktiivisuutta lukuunottamatta. Massan esikäsittely käsittää entsyymikäsittelyn, jota seuraa pesu ja tätä seuraava liotus vesipitoisessa hapossa, joista lehtipuu-näytteille saadaan tulokseksi kappaluvun väheneminen aina 10 14 %:lla. Massan vahvuus ei muutu.

Sellaista ksylanaasin käyttöä lehti- ja havupuun sulfaattiselluloosamassaan, jonka tarkoituksena on parantaa valkoisuutta ja edistää kappaluvun vähenemistä myöhemmin tapahtuvassa kemiallisessa käsittelyssä vetyperoksi-15 dilla tai valkaisusarjassa, tarkastelevat Viikari et ai.

[Proceedings of the International Symposium on Wood and Pulping Chemistry, Paris (1987)]. Ksylanaasit saadaan fer-mentoimalla Aspergillus awamori -sienen kantaa tai fer-. mentoimalla Streptomyces o1ivochromogenes- tai Bacillus 20 subtilis -bakteerikantoja. Ksylanaasit osoittavat sekä ksylanaasi- että ksylosidaasiaktiivisuuksia lukuunottamatta jälkimmäisestä bakteerista saatua ksylanaasia, joka on ksylosidaasista vapaa. Entsyymivalmisteissa on pieniä määriä sellulaasiaktiivisuutta. Pieniä 1,0 - 3,4:in suuruisia 25 valkoisuuspisteen lisääntymisiä valkoisuudessa havaitaan joko lehti- tai havupuumassassa entsymaattista käsittelyä seuraavassa vetyperoksidikäsittelyssä. Useissa tapauksissa tuloksena olevat massan viskositeetit säilyivät ennallaan tai ovat vain vähän alempia. Ei ole osoitusta siitä, 30 mikä vaikutus pelkällä entsyymikäsittelyllä on massan omi- ·· naisuuksiin.

Paice et ai. [Biotech, and Bioeng. 32 (1988) 235 -239] kuvaavat valkaisemattoman lehtipuumassan käsittelyn vaiheittaisella ksylanaasikäsittelyllä, jota seuraa käsit-35 tely natriumhydroksidilla, jota on 1 % massasta. Tällä 7 94265 kaksivaiheisella menetelmällä saatiin valkoisuuden lisääntyminen ja kappaluvun väheneminen. Valkoisuuden paraneminen säilyy myöhemmän C-E-D -valkaisun jälkeen jonkin verran, mutta ei kokonaan. Ksylanaasin raportoitiin olevan 5 sellulaasista vapaata ja coli -kloonin tuottamaa.

Tässä työssä on tehty nyt se hämmästyttävä havainto, että kemiallisesta massasta voidaan poistaa ligniini ja tämä voidaan valkaista tehokkaammin käsittelysarjoissa, joihin kuuluu ligniinin happipoistovaihe ja ksylanaasikä-10 sittely.

Tämän keksinnön kohteena on siksi tarjota menetelmä lignoselluloosamateriaalin delignifikaatioasteen lisäämiseksi, josta ei aiheudu merkittävää viskositeetin lisähä-viötä.

15 Tämän keksinnön toisena kohteena on tarjota mene telmä lignoselluloosamateriaalin valkaisemiseksi, jossa käytetään pienempiä määriä klooripitoisia valkaisuaineita kuin tavanomaisesti käytettäessä tai josta alkuainemuotoi-; sen kloorin käyttö on oleellisesti eliminoitu, ja joka si- 20 ten tarjoaa käyttöön ympäristön suhteen hyväksyttävän menetelmän.

Tämän keksinnön vielä yhtenä kohteena on tarjota lignoselluloosamateriaalin delignifikaatio- ja valkaisumenetelmä, joka nostaa tehokkaasti mainitun materiaalin val-25 koisuuden kattoarvoa.

Tämän mukaisesti tämän keksinnön yhtenä kohtana tarjotaan menetelmä ksylanaasilla hydrolysoituvia ksylosi-disiä sidoksia sisältävän lignoselluloosamateriaalin val-kaisemiseksi, ja mainittu menetelmä käsittää mainitun lig-30 noselluloosamateriaalin käsittelyn * (a) hapella tai happea sisältävällä kaasulla emäk sisessä liuoksessa ja (b) riittävällä määrällä sellulaasista vapaata ksy-lanaasia mainittujen hydrolysoitavien ksylosidisten sidos-35 ten hydrolyysin toteuttamiseksi mainitussa materiaalissa; valkaistun lignoselluloosamateriaalin saamiseksi.

8 94265 Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä ksylanaasi-käsittely voi olla ennen käsittelyä hapella tai happea sisältävällä kaasulla. Tämän keksinnön mukaisen menetelmän yleisesti edullisessa sovellutusmuodossa käsittely 5 hapella tai happea sisältävällä kaasulla on ennen ksyla-naasikäsittelyä.

Lignoselluloosamateriaalin käsittely hapella tai happea sisältävällä kaasulla suoritetaan massaksi tehdylle materiaalille vesiliuoksessa sakeudessa, joka on 3 - 35 10 paino-%, edullisesti noin 10 - noin 30 paino-%, hapella tai happea sisältävällä kaasulla hapen osapaineessa, joka on noin 207 - 1724 kN/m2 paineyksikköä, erityisesti noin 276 - 1034 kN/m2 paineyksikköä, ja lämpötilassa, joka on noin 70 - noin 170 °C, edullisesti noin 100 - noin 150 °C, 15 edullisemmin noin 110 - noin 130 °C, noin 10 - noin 90 minuutin, edullisesti noin 20 - 60 minuutin pituisen ajanjakson kuluessa.

Menetelmässä käytettävä happea sisältävä kaasu on yleensä ilma. Käytettäessä ilmaa tarvitaan korkeampia pai-20 neita kuin happea käytettäessä. Esimerkiksi ilmaa käytetään paineessa 1034 - 1724 kN/m2 paineyksikköä, kun taas happi on tehokasta 207 - 1034 kN/m2 paineyksikön alueella olevissa paineissa. Hapen voidaan antaa muodostua myös in situ. Happi voidaan tuottaa myös vetyperoksidin hajoami-25 sen avulla ja happikäsittelyssä voidaan käyttää aktivaat-toreita, kuten typpidioksidia.

Käsittely hapella tai happea sisältävällä kaasulla suoritetaan alkaliemäksen tai maa-alkalimetalliemäksen läsnäollessa määrässä, jota on 1 - 20 paino-% (mainitun 30 materiaalin perusteella). Emäs on edullisesti natriumhyd-·· roksidia ja sitä käytetään 1-10 paino-% oleva määrä.

Viskositeetin säilyttämiseksi käytettävää ainetta, kuten magnesiumionia, voidaan lisätä edellä määritellyn mukaiseen happikäsittelyyn 0,05 - 1 paino-% oleva määrä. 35 Sopiviin magnesiumia sisältäviin yhdisteisiin kuuluvat 9 94265 magnesiumsulfaatti, magnesiumoksidi, magnesiumkarbonaatti ja magnesiumhydroksidi. Muut sopivat viskositeetin säilyttämiseen käytettävät lisäaineet voivat käsittää komp-leksinmuodostusta aiheuttavia yhdisteitä, kuten aminoal-5 kyylifosfonaatteja ja polyaminopolykarboksylaatteja.

Lignoselluloosamateriaalin käsittely olennaisesti sellulaasista vapaalla ksylanaasilla suoritetaan sakeudes-sa, joka on 1 - 20 paino-%, edullisesti 2 - 12 %, ksyla-naasin pitoisuusalueella 1 - 500 IU/ml lämpötila-alueella 10 20 - 80 °C 1 - 48 tunnin mittaisen ajan kuluessa. Lämpö tila on edullisesti noin 50 °C. Käsittely suoritetaan lisäksi vesiliuoksessa pH-alueella 4-8. Liuos on valinnaisesti puskuroitu pH:n säätämiseksi. Sopiviin puskureihin kuuluvat muita pois sulkematta asetaattipuskuri ja 15 asetaatti/sitraattipuskuri.

Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä ksylanaasi luonnehditaan olennaisesti sellulaasista vapaaksi. Ilmaisulla "olennaisesti sellulaasista vapaa" tarkoitetaan, , että sellulaasia ei ole läsnä riittävästi aiheuttamaan 20 glukosidisten sidosten epäsuotuisaa hajoamista. Tämä hyd-rolyysi voisi olla haitallista ja häiritsevää lignoselluloosamateriaalin käsittelyssä mainitun materiaalin ominaisuuksien parantamiseksi tämän keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti siten, kuin edellä on määritelty. Siedettä-25 vissä oleva sellulaasin määrä riippuu tämän keksinnön kulloisestakin käyttökohteesta.

Yhtenä tämän keksinnön mukaisen menetelmän tunnusomaisena piirteenä on edellä kuvatut happikäsittely ja ksylanaasikäsittely, joihin liittyy yksi tai useampi seu-30 raavista käsittelyistä, jotka ovat ·· (i) käsittely vesipitoisessa liuoksessa kloorilla, klooridioksidilla tai näiden seoksella, (ii) käsittely vesipitoisessa liuoksessa klooridioksidilla, 35 (iii) käsittely vesipitoisessa emäksisessä liuok sessa peroksidilla, 10 94265 (iv) käsittely vesipitoisessa liuoksessa hypokloriitilla, (v) käsittely vesipitoisessa liuoksessa otsonilla, (vi) käsittely vesipitoisessa liuoksessa typpidiok- 5 sidilla.

Mainittua yhtä tai useampaa käsittelyä voi edeltää happi- tai ksylanaasikäsittely, tai niitä voidaan käyttää välikäsittelyinä happi- ja ksylanaasikäsittelyjen välissä, tai ne voivat tapahtua happi- ja ksylanaasikäsittelyjen 10 jälkeen tai niitä voi käyttää näiden vaihtoehtoisten ajoi tusten yhdistelmissä.

Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä mainittu yksi tai useampi käsittely tapahtuu edullisesti happi- ja ksylanaasikäsittelyjen jälkeen.

15 Toisena tämän keksinnön mukaisen menetelmän tunnus omaisena piirteenä on, että menetelmä käsittää lisäksi edellä kuvatusta happikäsittelystä ja ksylanaasikäsittely-stä saadun valkaistun lignoselluloosamateriaalin käsitte-. lyn lisäkäsittelyllä, joka on valittu seuraavista: 20 (i) uutto vesipitoisessa liuoksessa aikaiiemäksel- lä, ja (ii) hapettava uutto vesipitoisessa liuoksessa al-kaliemäksellä.

On edullista, että happi- ja ksylanaasikäsittelyä 25 seuraavat lisäkäsittelyt, jotka käsittävät järjestyksessä (i) käsittelyn vesipitoisessa liuoksessa kloorilla, klooridioksidilla tai näiden seoksella, (ii) uuton tai hapettavan uuton alkaliemäksellä, ja (iii) vesipitoisen liuoksen käsittelyn klooridiok- 30 sidilla.

** Vielä yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa happi- ja ksylanaasikäsittelyjä seuraavat lisäkäsittelyt, jotka käsittävät järjestyksessä (i) käsittelyn vesipitoisessa liuoksessa klooridi-35 oksidilla, ja 11 94265 (ii) käsittelyn vesipitoisessa emäksisessä liuoksessa vetyperoksidilla.

On ymmärrettävissä, että tämän keksinnön edullisen sovellutusmuodon mukaisessa menetelmässä sekä edellä ku-5 vattujen piirteiden ja edullisten sovellutusmuotojen mukaisessa menetelmässä ksylanaasikäsittely voi tapahtua ennen happikäsittelyä, ellei toisin ole osoitettu.

Vielä yhtenä puolena tämä keksintö tarjoaa käyttöön edellä määriteltyjen menetelmien mukaisen valkaistun lig-10 noselluloosamateriaalin.

Sovellettaessa tämän keksinnön mukaista menetelmää ovat sen lisäkäsittelyt massanvalkaisussa entuudestaan tunnettuja sekä yksittäisinä että monissa tapauksissa tietyssä järjestyksessä tapahtuvina, ja ne voidaan toteuttaa 15 millä tahansa järkevällä tavalla, jota käytetään tavanomaisesti tai joka on entuudestaan tunnettu. Tämän keksinnön mukaisiin edullisiin menetelmiin valkaistun massan tuottamiseksi kuuluvat sarjat, jotka ovat 0-X-C/D-E-D mu-. kaisla, (missä X tarkoittaa ksylanaasikäsittelyä ja C/D

20 tarkoittaa kloori- tai klooridioksidikäsittelyä tai käsittelyä näiden seoksella), ja uutosvaihe (E) on valinnaisesti edellä määritelty hapettava uutto. Vaihtoehtoisesti tämä menetelmä voi olla sarjan 0-X-D-P määrittämä, mikä ei sisällä käsittelyä alkuaineesta koostuvalla kloorilla. 25 Klooridioksidin valmistuksen luonteen mukaisesti läsnä on useinmiten klooria, jota ei tarvitse poistaa, eikä se ole haitaksi tämän keksinnön mukaiselle menetelmälle.

Ksylanaasi, jolla on käyttöä tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä, on olennaisesti sellulaasista vapaata 30 ja sitä saadaan fermentoimalla mitä tahansa ksylanaasia . ;* tuottavaa mikro-organismia, kuten ksylanaasia tuottavaa bakteeria. Mikro-organismi voi olla luonnossa esiintyvä kanta tai tämän mutantti, tai yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistettu kanta, ts. rekombinanttikanta joka on valmis-35 tettu ksylanaasin tuoton lisäämiseksi ja/tai puhtaamman, 12 94265 esimerkiksi olennaisesti sellulaasista vapaan ksylanaasi-seoksen tuottamiseksi.

On edullista, että ksylanaasi on saatu olennaisesti sellulaasista vapaassa muodossa lajeihin Escherichia coli, 5 Bacillus subtilis tai sukuun Streptomyces kuuluvista mikro-organismeista, jotka on muokattu yhdistelmä-DNA-teknii-kalla osoittamaan olennaisesti sellulaasista vapaata aktiivisuutta. On edullisempaa, että ksylanaasi saadaan olennaisesti sellulaasista vapaassa muodossa rekombinant-10 tiksylanaasigeenin sisältävästä Streptomyces lividans -lajin mikro-organismista.

Esimerkiksi Mondue et ai. [Gene 49(3), (1987) 323 -329] kuvaavat yhdistelmä-DNA -tekniikalla valmistetun, sukuun Streptomyces kuuluvan rekombinanttimikro-organismin 15 ja tässä keksinnössä käytettäväksi soveltuvan, olennaisesti sellulaasista vapaan ksylanaasin tuoton tästä organismista. Rekombinanttimikro-organismi voidaan saada viemällä hybridiplasmidi Streptomyces-sukuisen isäntämikro-organis-min mutanttikantaan, jolle on ominaista siinä oleva olen-20 naisesti sellulaasista vapaa aktiivisuus, ja jossa oleva mainittu hybridiplasmidi on rakennettu liittämällä ksyla-naasigeeni sopivaan vektoriplasmidiin. Hybridiplasmidi kykenee indusoimaan sellulaasista vapaan ksylanaasin erittymisen isäntämikro-organismissa, johon mainittu hybridi-25 plasmidi on tuotu. Hybridiplasmidi voidaan rakentaa millä tahansa tavanomaisella menetelmällä, kuten ligaatiolla, tarvittavan DNA:n osan, ksylanaasigeenin, liittämiseksi vektoriplasmidiin. Ksylanaasigeeni voidaan saada tunnetusta Streptomyces lividans 1326 -kannasta. Sopiva vektori-30 plasmidi on tunnettu pIJ702, joka voidaan saada kannasta Streptomyces lividans 3131.

e

Hybridiplasmidi voidaan viedä isäntämikro-organis-miin menetelmillä, kuten protoplastifuusio tai transduktio tai transformaatio.

13 94265

Edellä olevan mukaisesti tämän keksinnön mukaisissa edullisissa sovellutusmuodoissa saadaan Streptomyces livi-dans 66 (kanta 1326) -kannan ksylanaasigeenin (xln) homologisella kloonauksella ksylanaasia, joka on olennaisesti 5 sellulaasista vapaata ja kelvollista käytettäväksi ligno-selluloosamateriaalin ksylanaasikäsittelyyn. Ksylanaasi-geeni voidaan kloonata Streptomyces lividans 10-164 ksyla-naasinegatiivisen ja sellulaasinegatiivisen kaksoismutant-tikannan toiminnallisella komplementaatiolla käyttäen mo-10 nikopioista plasmidia pIJ702. Tämä kloonausmenetelmä on kuvattu täydellisesti julkaisussa Mondue et ai. [Gene 49(3), (1987) 323 - 329], ja tästä saadaan yksi tällainen klooni Streptomyces lividans IAF28.

Plasmidin pIJ702 sisältävä Streptomyces lividans 15 3131 on talletettu laitokseen American Type Culture Col lection talletusnumerolle ATCC 35287. Kannasta Streptomyces lividans 1326 ja kaksoismutanttikannasta Streptomyces lividans 10-164 on tehty talletukset laitokseen National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited, 20 Aberdeen, UK, helmikuun 8. päivänä 1990 vastaaville tunnuksille NCIMB 40257 ja NCIMB 40258.

Ksylanaasigeenin (xln) ilmentäminen ja ksylanaasin tuotto Streptomyces lividans -kloonista IAF18 luonnollisilla substraateilla on kuvattu julkaisussa J.-L. Bertrand . 25 et ai. Biotechnol. Bioengineering 33 (1989) 791 - 794.

• < Tässä tapauksessa saadun ksylanaasientsyymin puhdistus ja ominaisuudet on kuvattu julkaisussa R. Morosoli et ai. Biochem. J. 239 (1986) 587 - 592.

Ksylanaasia tuottavien mikro-organismien fermen-30 toinnissa tarvitaan kasvatusliuoksen hiilenlähde, joka voi • vaikuttaa ksylanaasin tuottamisnopeuteen. Esimerkiksi olennaisesti sellulaasista vapaan ksylanaasin tuottamisessa Streptomyces lividans -lajin rekombinanttimikro-orga-nismin fermentoinnilla voi fermentointiin käytetty ravin-35 toliuos sisältää heinää, vehnänolkia, kuivattua rehumais- 14 94265 siä, ksylaania ja/tai mallasjuomien valmistuksessa käytettyjä jyviä ensisijaisina hiilenlähtelnä yhdessä sopivien pinta-aktiivisten aineiden, kuten oliiviöljyn ja/tai Tween 80:n (tavaramerkki) kanssa, kuten julkaisussa Kluepfel et 5 ai. teoksessa Proceedings of the 6th Canadian Bioenergy R & D Seminar, Vancouver, Canada (1987) on kuvattu.

Milloin ksylanaasia sisältävä entsyymiseos sisältää myös olennaisia määriä sellulaasia, sellulaasi poistetaan millä tahansa ksylanaasin puhdistusmenetelmänä tunnetulla 10 menetelmällä tai sellulaasi inaktivoidaan selektiivisesti millä tahansa hyväksyttävällä kemiallisella tai mekaanisella menetelmällä.

Ksylanaasi voidaan lisätä tuotantomuotoisessa fer-mentaatioliuoksessaan tai tämän tiivisteliuoksena tai 15 seoksena, joka on valmistettu joko ksylanaasin vielä tätäkin tiivistetymmästä liuoksesta tai ksylanaasin kuivatusta valmisteesta.

Tämän keksinnön mukainen lignoselluloosamateriaalin ksylanaasikäsittely suoritetaan ravistellen tai ilman ra-20 vistelua. Ksylanaasikäsittelyajan lopulla voidaan syntynyt käsitelty materiaali käyttää sellaisenaan tai se voidaan sakeuttaa ja mainittu käsitelty materiaali voidaan sitten käyttää jatkokäsittelyyn. Mukaan voidaan liittää myös valinnainen pesu.

.. 25 Tämän keksinnön mukaisen menetelmän lisäpiirteenä •« on, että ksylanaasikäsittelyn jälkeisestä sakeuttamisesta ja/tai pesusta saatu aktiivista jäännösksylanaasia sisältävä suodos käytetään edullisesti uudelleen lisäämällä mainittu suodos ksylanaasilla käsiteltävään materiaaliin. 30 Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan valkaistu tuote, jolla on tyydyttävä valkoisuusaste ja viskositeetti, joka on samanlainen tai parempi, kuin mitä havaitaan yhtä pitkälle valkaistuilla massoilla, jotka on valmistettu tavanomaisin menetelmin. Käytännössä voidaan 35 saavuttaa myös korkeampia vaikeustasoja, paitsi että näi- 15 94265 hin vaikeustasoihin päästään vain merkittävästi suuremmalla klooripitoisten kemikaalien käytön ja/tai viskositeetin haitallisen laskun kustannuksella.

Tässä kuvattu menetelmä tarjoaa käyttöön valkaistun 5 massan, joka on valmistettu käyttäen pienempiä määriä klooripitoisia kemikaaleja, ja mahdollistaa olennaisesti lopettaa alkuaineesta koostuvan kloorin käytön, jolloin tätä menetelmää käyttävän selloloosatehtaan saastuttavat jätevedet vähenevät.

10 Tässä selityksessä kaikki suhteet ja prosenttiosuu det perustuvat uunikuivatun materiaalin painoon, ellei toisin ole mainittu. Tämän keksinnön mukaisen materiaalin luonnehtimiseen käytetyt testit suoritettiin seuraavien standardimenetelmien mukaan.

15 Kappaluku TAPPI-menetelmä T-236 M-76

Viskositeetti TAPPI-menetelmä T-230 om-82 Valkoisuusaste TAPPI-menetelmä T-452 om-83 Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä.

Esimerkit 1 ja 2 kuvaavat Streptomyces lividans 20 kloonin IAF18 tuoton.

Esimerkki 1

Kromosomaalinen DNA uutettiin Streptomyces lividans 66 (kanta 1326) -kannasta ja pilkottiin osittain Sau 3A:lla. Saadut fragmentit fraktioitiin lineaarisessa 10 -25 40-% sakkaroosigradientissa. Rikastetut jakeet, jotka si- • · sälsivät 4-10 kiloemäksen fragmentteja yhdistettiin ennen niiden saostamista etanolilla. Vektoriplasmidi pIJ702, joka oli saatu Streptomyces lividans 3131 -kannasta, pilkottiin täydellisesti Bgl II:11a, ja entsyymi poistettiin 30 fenoli-kloroformiuutolla. Plasmidi saostettiin etanolilla ja defosforyloitiin julkaisussa Kendall ja Cullum [Gene 29 (1984) 315] kuvatulla tavalla. Ligaasireaktiota varten käsiteltiin osittain pilkotun kromosomaalisen Streptomyces lividans -DNA:n fragmenttien ja defosforyloidun pIJ702:n 35 seos suhteessa 5:1 0,1 yksiköllä T4 DNA-ligaasia yli yön huoneenlämmössä pitoisuudessa 37,5 pg/ml.

94265 16

Streptomyces lividans -kanta 1326 mutagenisoitiin käyttäen N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiiniä (Delic et ai. Mutation Res. 9 (1970) 167) ja valikoitiin kaksinkertainen B-l,4-D-glukaaniglukanohydrolaasi (endosellulaasi)-5 negatiivinen ja ksylanaasinegatiivinen mutantti. Kaksois-mutantti valikoitiin kiinteällä minimielatusaineella, joka sisälsi pääasiallisena hiilenlähteenä 1 % karboksimetyyli-selluloosaa. Endosellulaasiaktiivisuuden visualisointi tapahtui Teather':n ja Woodin (op. clt. ) mukaisesti kongo-10 punavärjäyksellä. Ksylanaasinegatiivisten mutanttien ha vaitseminen tehtiin samoin korvaamalla karboksimetyyli-selluloosa 1 %:lla kauraspelttien ksylaania. Kongopunan antaman värivasteen havaittiin myös soveltuvan ksylanaasi-aktiivisuuden havaitsemiseen. Molemmissa tapauksissa pi-15 dettiin värin häviämisvyöhykkeiden puuttumista merkkinä entsyymin tuoton puuttumisesta. Kaksoismutantti Streptomyces lividans 10-164 oli hyvin pysyvä, sillä saatiin suurin transformaatiotehokkuus ja se valittiin siksi edullisimmaksi isäntämikro-organismiksi ilmentämisjärjestelmän 20 kehitystä varten.

Kaksoismutantin Streptomyces lividans 10-164 pro-toplastien valmistus ja transformaatio suoritettiin julkaisussa Chapter et ai. [Curr. Topics Microbiol. Immunol. 97 (1982) 69] kuvatulla tavalla. Transformoidut protoplas- .. 25 tit maljattiin R5 ravintoliuoksessa, joka sisälsi 0,6 % • · agaria, 42 °C lämpötilassa. Transformantit valikoitiin tiostreptonia vastaan syntyneen vastustuskyvyn suhteen 16 tunnin kuluttua 30 °C:n lämpötilassa Kendallin ja Cullumin (op. cit) menetelmän mukaan. Ksylanaasipositiivisten kloo-30 nien seulonta tehtiin käyttäen RBB-ksylaanilla täydennet- • tyä minimielatusainetta, joka oli valmistettu julkaisun

Biely et ai. [Anal. Biochem. 144 (1985) 142] mukaisesti. Ksylanaasia tuottavat pesäkkeet hydrolysoivat tätä substraattia tuottaen kirkkaita vyöhykkeitä.

17 94265

Valittiin kaksi ksylanaasia tuottavaa kloonia ja nämä varustettiin merkinnöillä Streptomyces livldans IAF18 ja IAF30. Streptomyces lividans IAF18 ja IAF30 -kannoissa olevan plasmidi-DNA-materiaalin analyysi agaroosigeeli-5 elektroforeesilla osoitti, että kaikki havaitut plasmidit olivat suurempia kuin pIJ702, so. plasmideissa pIAF18 ja pIAF30 oli 5,7 ja 6,7 kiloemäksen kokoiset liittymät. Näitä hybridiplasmideja käytettiin transformoimaan kaksois-mutantti Streptomyces livldans 10-164 uudestaan. Kaikissa 10 tapauksissa 100 % transformanteista oli positiivisia aiemmin arvioidun entsyymiaktiivisuuden suhteen, mikä merkitsi sitä, että todennäköinen ksylanaasi(xln)geeni oli plasmi-diin liittynyt. Plasmidien pIAF18 ja pIAF30 restriktiokartoitus paljasti kahden liittymän välisen ristiriidan 15 restriktiokohtien suhteen. Southern-blottaus, jossa käytettiin koettimena pIAF18-liittymän sisälle sijoittuvaa BamHI-Sphl restriktiofragmenttia, osoitti kuitenkin, että noin 2 kiloemästä DNA:a oli yhteistä näille kahdelle liittymälle.

20 xln-geenin ilmentymistä tutkittiin eri kloonien uppoviljelmissä TSB (trypticase soy broth) -ravintoliuoksessa ja ksylaaniravintoliuoksessa ja tätä verrattiin Streptomyces lividans 1326 ja 3131 villityypin kantoihin. Ksylaaniravintoliuos, josta käyteään merkintää M13, käsit-.. 25 tää: ksylaania (kauraspelteistä; Sigma Chemical Co., St.

Louis, MO, U.S.A.), 10 g; (NH4)2S04, 1,4 g; K2HP04, 2,5 g; KH2P04, 1,0 g; hiivauute (Difco), 2 g; proteose peptone (Difco), 1 g; MgS04.7H20, 0,3 g; Tween 80, 2 ml; ja 1 ml hivenmetallien liuosta, joka sisälsi CoC12.6H20 ( 200 mg), 30 FeS04.7H20 ( 500 mg), MnS04.H20 (160 mg) ja ZnS04.7H20 (140 mg), jotka kaikki liuotettiin 100 ml:aan happamuusastee-seen pH 3 säädettyä tislattua vettä. Valittiin 34 °C:n in-kubaatiolämpötila, koska sillä saatiin aikaan hyvä suhde kasvun ja ksylanaasiaktiivisuuden välille [Kluepfel et. 35 ai. Appi. Microbiol. Biotechnol. 24 (1986) 230]. Kestol- 18 94265 taan 48 tunnin ja 72 tunnin inkubaatioita vastaavat tulokset on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1 5

Aktiivisuus on ilmoitettu UI:nä/ml viljelmän suo- dosta.

! ! Ksylanaasiaktiivisuus IU:näa) 10 ! ! Kanta |--------------------------------------------- | ! tai | TSB J Ksylaaniravintoliuos | i klooni i---------------------!----------------------- !

! ! 48 h ! 72 h ! 48 h ! 72 h J

1 R I-·· —____»_________I __________ I _________I___________ I I t | ----------- | ! 1326 ! 0| 0| 3,1 I 5,8 | I 3131 | 0 I 0| 3,7 I 6,3 | I IAF18 I 4,4 | 4,5 | 293,0 | 380,0 | 20 Ksylanaasimääritys tehtiin inkuboimalla 1 ml entsyymiliuosta, joka oli sopivasti laimennettu 0,1 M:seen Mcllvain puskuriin, pH 6,0, yhdessä 1 ml:n kanssa veteen tehtyä l-%:ista ksylaanisuspensiota 60 °C:ssa 10 minuutin ajan. Reaktio lopetettiin .. 25 lisäämällä 2 ml dinitrosalisyylihapporeagenssia ja • · kuumentamalla 15 minuutin ajan kiehuvassa vedessä. Vapautuneiden pelkistävien sokereiden määrä määritettiin käyttäen standardina D-ksyloosia. Nolla-näytteet käsittivät 1 ml: n ksylaanisuspensiota, 30 jota inkuboitiin samoin ja johon oli lisätty 2 ml . dinitrosalisyylihappoliuosta ja 1 ml entsyymiä.

Villityypin kanta ei tuottanut entsyymiä riippumatta siitä, oliko siinä plasmidi pIJ702 vai ei, kun tätä kasvatettiin TSB:ssa, ja ksylaaniravintoliuoksessa tuote-35 tut aktiivisuustasot vaihtelivat välillä 3 ja 6 IU/ml ra- 19 94265 vintoliuoksesta saatua suodosta. Kloonit IAF18 ja IAF30 osoittivat merkittävää aktiivisuutta TSB:ssa (0,9 - 4,5 IU/ml), jopa ilman minkäänlaista indusoijaa. Ksylaanira-vintoliuoksessa kasvatetut kloonit IAF18 ja IAF30 tuotti-5 vat hyvin korkeita ksylanaasitasoja, esimerkiksi IAF18 saavutti 380 IU/ml. Kaikkien viljelmien solunsisäisissä jakeissa havaittiin vain pieniä määriä ksylanaasiaktiivi-suutta, mistä voitiin päätellä erittymisen olevan tehokasta.

10 Streptomyces llvidans 3131 -kannan ja kloonien IAF18 ja IAF30 ksylaani-induktion jälkeisten viljelmien supernatantit analysoitiin erittyneen ksylanaasin suhteen SDS-9 % PAGE:11a Coomassie Blue -värjäyksen jälkeen. Näiden kloonien ksylanaasinkaltaisten tuotteiden Mr oli 43000. 15 Tämä arvo vastasi tarkalleen natiivin Streptomyces livi-dans 1326 -kannasta (Morosoli et ai. 1986) eristetyn ksylanaasin Mr:a, mikä viittasi siihen, että molemmissa klooneissa oli liittymät, jotka käsittivät ainakin täydellisen rakennegeenin koodin. Näiden proteiinien identtisyys vah-20 vietettiin immunologisesti Western-blottauskokeilla käyttäen ksylanaasia vastaan muodostettuja vasta-aineita.

Esimerkki 2

Streptomyces lividans IAF18 -kannan geneettinen pysyvyys tutkittiin testaamalla entsyymin tuottoa TSB-ravin-25 toliuoksessa ja M13-ravintoliuoksessa, joka sisälsi (edel lä esitetyn määritelmän mukaista) 1 % ksylaania sekä tio-streptonin kanssa että ilman tätä. Molemmissa ravinto-liuoksissa saadut entsyymitasot pysyivät vakioisina ainakin kymmenen perättäisen siirron ajan, eikä antibiootin 30 poissaolo vaikuttanut tähän. Monikopioisen geenin vaiku-♦ tus havaittiin TSB:ssa, jossa noin 2 IU/ml mitattiin jat kuvasti 24 tunnin jälkeen ja jossa saavutettiin 10 IU/ml 48 tunnin jälkeen. Tämä tuottotaso pysyi vakaana useita päiviä, ja sen selittää vain entsyymin hyvä pysyvyys 34 35 eC:ssa.

20 94265

Glukoosin lisäys M13-ravintoliuokseen osoitti selvästi kataboliittirepression, ja entsyymin tuotto alkoi, kun tämä sokeri oli kulutettu loppuun, kun taas samassa ravintoliuoksessa oleva ksyloosi pääasiallisena hiilenläh-5 teenä tuotti solunulkopuolisen ksylanaasitason, joka oli 800 UI/ml pelkkää ksylaania käyttämällä, kuten taulukossa 2 esitetään.

Taulukko 2 10 ! ! aktiivisuus (IU:nä) ! Hiililähde |--------------------------------------- ! ! ! 24 h ! 48 h ! 72 h ! 96 h ! 120 h !

1 C · ---------_____I_______I_______I_______I_______I____ I

X «J I | | | ” “ “ | | | ! 1% ksylaani | 143 ! 564 j 782 | 957 | 1233 | ! 1% ksylaani +! i ! ! ! ! j 1% glukoosi ! 0 | 48 | 462 j 888 1085 ! 1% ksyloosi j 217 ! 652 | 672,0 ! 991 ! 1216 ! 20 --------------------------------------------------------

Taulukossa 3 on esitetty entsyymin tuoton vertailu villityypin Streptomyces lividans 1326 -kannan ja Strep-tomyces lividans IAF18 -kloonin välillä M13-ravintoliuok-sessa, joka sisälsi 1 % ja 2 % ksylaania. Edellinen tuot-.. 25 ti 28 IU/ml molemmissa pitoisuuksissa, kun taas jälkimmäi nen eritti 1300 ja 1600 IU/ml ksylanaasiaktiivisuutta.

· 21 94265

Taulukko 3 ! Kanta ja i aktiivisuus (IU/ml) i 5 ! ksylaani- |------------------------------------

! pitoisuus | 24 h j 48 h ! 72 h ! 96 h ! 120 h J

t__________________I______I______I______I______I_______ I

I I I ---I I I---- I

i S. lividans 1326 ! ! ! ! ! i ! 1% ksylaani ! 14 | 29 \ 30 | 29 | 29 ί 10 i 2% ksylaani | 8 | 23 ! 26 | 27 | 27 ! ! S. lividans IAF18J ! ! ! ! ! ! 1% ksylaani ! 84 | 576 ! 898 ! 1150 ! 1342 | ! 2% ksylaani ! 154 J 784 ! 1207 } 1408 ! 1604 \ 15 Esimerkki 3

Seuraavan sarjasta C/D-E-D-E-D esitettävän esimerkin tarkoituksena on verrata tämän keksinnön mukaisia sarjoja.

150 g:n erä uunikuivaa valkaisematonta lehtipuun 20 sulfaattiselluloosamassaa, jonka kappaluku oli 14,1, viskositeetti 49,1 mPa.s ja valkoisuusaste 34,3 % ISO, valkaistiin tavanomaisella C/D-E-D-E-D valkaisulla. Kemikaalien annostus oli seuraava: C/D vaihe: 2,81 % klooria, 0,12 % klooridioksidia 50 .. 25 °C:ssa 30 min ajan massan sakeuden olles sa 3 %.

Ex vaihe: 1,56 % natriumhydroksidia 70 °C:ssa 60 mi nuutin ajan massan sakeuden ollessa 10 %. Dx vaihe: 0,8 % klooridioksidia, 0,45 % natriumhyd- 30 roksidia 70 °C:ssa 3 tunnin ajan massan sa keuden ollessa 6 %.

I · E2 vaihe: 0,4 % natriumhydroksidia 70 °C:ssa 60 mi nuutin ajan massan sakeuden ollessa 10 %. D2 vaihe: 0,1 % klooridioksidia, 70 °C:ssa 3 tunnin 35 ajan massan sakeuden ollessa 6 %.

22 94265

Viimeisen klooridioksidivaiheen jälkeen massalla on seu-raavat ominaisuudet:

Valkoisuusaste 90,0 % ISO

Viskositeetti 31,9 mPa.s 5 Esimerkki 4

Seuraavan sarjasta 0-C/D-E-D esitettävän esimerkin tarkoituksena on verrata tämän keksinnön mukaisia sarjoja.

150 g:n erä uunikuivaa valkaisematonta lehtipuun sulfaattiselluloosamassaa, jonka kappaluku oli 14,1, visio kositeetti 49,1 mPa.s ja valkoisuusaste 34,3 % ISO, yhdistettiin 2,5 %:iin natriumhydroksidia ja riittävään vesimäärään 10-%:isen massan sakeuden saavuttamiseksi sekoittaen samalla Hobart-sekoittajassa. Massa siirrettiin sitten keskisakeustasoiseen happireaktoriin. Reaktorissa 15 massa käsiteltiin happikaasulla 414 kN/m2 paineyksikön suuruisessa paineessa 100 °C:n lämpötilassa 60 minuutin ajan. Massan lopullisen pH:n havaittiin olevan 11,4. Kun massa oli laimennettu 4 % sakeuteen, se suodatettiin, pestiin vedellä 1 % sakeudessa ja suodatettiin uudelleen. Pestyl-20 lä massalla oli seuraavat ominaisuudet:

Kappaluku 8,3 (41 % pienempi kuin valkaisematon) Viskositeetti 25,6 mPa.s

Valkoisuusaste 50,1% ISO

Hapella käsitelty massa valkaistiin edelleen C/D- .. 25 E-D-sarjalla kemikaalien annostuksien ja olosuhteiden oi- » < lessa seuraavat: C/D vaihe: 1,65 % klooria, 0,07 % klooridioksidia, 50 °C:ssa 30 minuutin ajan massan sakeuden ollessa 3 %.

30 E vaihe: 0,82 % natriumhydroksidia, 70 °C:ssa 60 mi nuutin ajan massan sakeuden ollessa 10 %.

D vaihe: 0,25 % klooridioksidia, 0,05 % natriumhydrok sidia, 70 °C:ssa 3 tunnin ajan massan sakeuden ollessa 6 %.

35 D-E-D sarjalla valkaistulla massalla oli seu raavat ominaisuudet:

Il 111 I 1;| li I I *»» p 23 94265

Valkoisuusaste 89,9 % ISO

Viskositeetti 18,9 mPa.s

Esimerkki 5

Seuraavan sarjasta X-C/D-E-D esitettävän esimerkin 5 tarkoituksena on verrata tämän keksinnön mukaisia sarjoja. Ksylanaasikäsittelyvaihe on sarjassa merkitty "X":llä.

50 gramman erä esimerkin 3 mukaista valkaisematonta lehtipuun sulfaattiselluloosamassaa, jonka kappaluku oli 14,1, viskositeetti 49,1 mPa.s ja valkoisuusaste 34,3 % 10 ISO, käsiteltiin sellulaasista vapaalla ksylanaasilla, joka oli saatu edellä mainitusta, esimerkeissä 1 ja 2 kuvatusta Streptomyces lividans IAF18 -kloonista. Käsittely tehtiin massan 3-%:isessa sakeudessa 50 °C:ssa 16 tunnin ajan sekoittaen 250 kierroksen minuuttinopeudella pusku-15 roidussa vesipitoisessa 0,1 M:ssa natriumasetaattiliuok-sessa, pH 5, ja ksylanaasin pitoisuuden ollessa 150 IU/ml. Entsyymikäsittelyn jälkeen massa suodatettiin, pestiin 1 %:n sakeudessa ja suodatettiin uudelleen. Pestyllä massalla oli seuraavat ominaisuudet: 20 Kappaluku 10,8 (23 % pienempi kuin valkaisematon)

Viskositeetti 53,5 mPa.s

Valkoisuusaste 40,1 % ISO

Ksylanaasilla käsitelty massa valkaistiin edelleen sarjalla C/D-E-D. Kemikaalien annostus ja olosuhteet oli- .. 25 vat seuraavat: * < C/D vaihe: 2,14 % klooria, 0,09 % klooridioksidia, 50 °C:ssa 30 minuutin ajan massan sakeuden ollessa 3 %.

E vaihe: 1,2 % natriumhydroksidia 70 °C:ssa 60 mi- 30 nuutin ajan massan sakeuden ollessa 10 %.

D vaihe: 1,0 % klooridioksidia 70 °C:ssa 3 tunnin ‘ « ajan massan sakeuden ollessa 6 %.

Sarjalla X-C/D-E-D valkaistulla massalla oli seuraavat ominaisudet: 24 94265

Valkoisuusaste 90,8 % ISO

Viskositeetti 30,3 mPa.s

Esimerkki 6

Seuraava esimerkki esitetään ainoastaan vertailu-5 tarkoituksessa.

Esimerkin 4 mukaiselle valkaisemattomalle lehtipuun sulfaattiselluloosamassalle tehtiin esimerkin 4 mukainen happikäsittely. Happikäsitelty massa käsiteltiin sitten olosuhteissa, jotka olivat esimerkissä 5 pääpiirteittäin 10 esitetyn ksylanaasikäsittelyn mukaisia, mutta sillä poik keuksella, että ksylanaasia ei ollut läsnä. Sen jälkeen massa suodatettiin, pestiin vedellä sakeuden ollessa 1% ja suodatettiin. Pestyllä massalla oli seuraavat ominaisuudet: 15 Kappaluku 8,0

Viskositeetti 25,6 mPa.s

Valkoisuusaste 52,5 % ISO

Voidaan siten nähdä, että happi-puskurisarjalla käsitellyllä massalla on sama kappaluku ja viskositeet-20 tiominaisuudet kuin esimerkin 4 mukaisella happikäsitel-lyllä massalla. Puskurikäsittelyllä ei ole mitään oleellista vaikutusta näihin massan ominaisuuksiin.

Esimerkki 7

Seuraava kuvaus on esimerkki O-X-C/D-E-D-sarjasta.

.. 25 Esimerkin 4 mukaiselle valkaisemattomalle lehtipuun • » sulfaattiselluloosamassalle tehtiin esimerkin 4 mukainen happikäsittely. Happikäsitellylle massalle tehtiin sitten ksylanaasikäsittely esimerkin 5 mukaisesti. Pesun jälkeen happi-ksylanaasikäsitellyllä massalla oli seuraavat omi-30 naisuudet:

Kappaluku 5,3 (62 % pienempi kuin valkaisematon)

Viskositeetti 26,6 mPa.s

Valkoisuusaste 55,9 % ISO

Hapella ja ksylanaasilla käsitelty massa valkais-35 tiin edelleen sarjalla C/D-E-D. Kemikaalien annostus ja olosuhteet olivat seuraavat: i* ta miu n m i 25 94265 C/D vaihe: 1,05 % klooria, 0,044 % klooridioksidia 50 °C:ssa 30 minuutin ajan massan sakeuden ollessa 3 %.

E vaihe: 0,59 % natriumhydroksidia 70 °C:ssa 60 mi- 5 nuutin ajan massan sakeuden ollessa 10 %.

D vaihe: 0,1 % klooridioksidia, 0,05 % natriumhyd roksidia 70 °C:ssa 3 tunnin ajan massan sakeuden ollessa 6 %.

Sarjalla 0-X-C/D-E-D valkaistulla massalla oli seulo raavat ominaisudet:

Valkoisuusaste 90,5 % ISO

Viskositeetti 25,7 mPa.s

Pelkälle happikäsittelylle esimerkissä 4 merkitty kappaluku on 8,3, joka on 41 % matalampi kuin valkaisemat-15 toman massan kappaluku. Pelkälle ksylanaasikäsittelylle esimerkissä 5 merkitty kappaluku on 10,8, joka on 23 % matalampi kuin valkaisemattoman massan kappaluku. Näihin verrattuna saatiin peräkkäisestä happi-ksylanaasikäsitte-lystä kappaluvuksi 5,3, joka merkitsee 62 %:n alenemaa 20 valkaisemattoman massan kappaluvusta ja osoittaa vakuuttavasti näiden kahden käsittelyn välillä olevan yhteisvaikutuksen, joka perustuu näiden yksittäisiin tehokkuuksiin, joiden yksinkertaisesti toisiinsa lisättyinä voitaisiin odottaa antavan kappaluvun 64, joka vastaa 55 %:n alene-25 maa.

Myös C/D-vaiheen, E-vaiheen ja D-vaiheen kemikaali-annostukset ovat kukin merkittävästi pienempiä 0-X-käsi-tellyn massan myöhemmässä valkaisussa, kuten on osoitettu olevan laita esimerkin 7 mukaisessa O-X-C/D-E-D-sarjassa, 30 kun tätä verrataan niihin kemikaaliannostuksiin, joita tarvitaan samantasoisen tai jopa pienemmän lopullisen vai- 4 koisuusasteen saavuttavissa minkä tahansa sarjojen C/D-E-D-E-D, 0-C/D-E-D tai X-C/C-E-D mukaisissa valkaisuissa, kuten esimerkeissä 3, 4 ja 5 on kuvattu.

26 94265

Esimerkki 8

Seuraava kuvaus on esimerkki O-X-C/D-E-D-sarjasta. Esimerkin 4 mukaiselle valkaisemattomalle lehtipuun sulfaattiselluloosamassalle tehtiin esimerkin 5 mukainen 5 ksylanaasikäsittely, jonka jälkeen seurasi happikäsittely esimerkin 4 mukaisesti. X-O-käsitellyllä massalla oli seu-raavat ominaisuudet:

Kappaluku 5,3 (62 % pienempi kuin valkaisematon) Viskositeetti 30,2 mPa.s 10 Valkoisuusaste 62,3 % ISO

X-O-käsitelty massa valkaistiin edelleen sarjalla C/D-E-D. Kemikaalien annostus ja olosuhteet olivat seu-raavat: C/D vaihe: 1,05 % klooria, 0,044 % klooridioksidia 50 15 °C:ssa 30 minuutin ajan massan sakeuden ollessa 3 %.

E vaihe: 0,64 % natriumhydroksidia 70 °C:ssa 60 mi nuutin ajan massan sakeuden ollessa 10 %. D vaihe: 0,15 % klooridioksidia 70 °C:ssa 3 tunnin 20 ajan massan sakeuden ollessa 6 %.

Sarjalla X-O-C/D-E-D valkaistulla massalla oli seu-raavat ominaisudet:

Valkoisuusaste 91,6 % ISO

Viskositeetti 21,8 mPa.s w 25 Tässä esimerkissä 8 merkitty X-O-käsitellyn massan kappaluku on sama kuin mitä saatiin O-X-käsitellylle massalle esimerkissä 7, ja tämä kuvaa sitä, että näiden kahden käsittelyn yhteisvaikutus on olemassa mainittujen käsittelyjen järjestyksestä riippumatta. Tälle X-O-käsitel-30 lylle massalle saadaan myös parempi valkoisuusaste ja paljon parempi viskositeetti O-X-käsittelyyn tai pelkkään O- « käsittelyyn verrattuna.

Tämä lopullinen valkoisuusaste, joka on saatu tässä X-O-C/D-E-D-sarjassa, on 91,6 % ISO, joka kuvaa massan 35 valkoisuusasteen kattoarvon voimakasta kohoamista käytet- 27 94265 täessä pieniä määriä klooria ja klooripitoisia kemikaaleja, samalla kun haitalliset sivuvaikutukset ovat vältettävissä.

Esimerkki 9 5 Seuraava kuvaus on esimerkki O-X-D-E-D-sarjasta.

Esimerkin 4 mukaiselle valkaisemattomalle lehtipuun sulfaattiselluloosamassalle tehtiin esimerkin 4 mukainen happikäsittely. Happikäsitellylle massalle tehtiin sitten ksylanaasikäsittely esimerkin 5 mukaisesti. Saadulla mas-10 salia oli seuraavat ominaisuudet:

Kappaluku 4,6 (67 % pienempi kuin valkaisematon) Viskositeetti 24,1 mPa.s

Valkoisuusaste 60,8 % ISO

Hapella ja ksylanaasilla käsitelty massa valkais-15 tiin edelleen sarjalla D-E-D. Kemikaalien annostus ja olosuhteet olivat seuraavat:

Dx vaihe: 0,5 % klooridioksidia, 0,25 % natrium- hydroksidia 70 eC:ssa 3 tunnin ajan massan sakeuden ollessa 6 %.

20 E vaihe: 0,3 % natriumhydroksidia 70 °C:ssa 60 mi nuutin ajan massan sakeuden ollessa 10 %. D2 vaihe: 0,1 % klooridioksidia 70 °C:ssa 3 tunnin ajan massan sakeuden ollessa 6 %.

Sarjalla 0-X-D-E-D valkaistulla massalla oli seu-25 raavat ominaisudet:

Valkoisuusaste 90,3 % ISO

Viskositeetti 22,4 mPa.s Tämä esimerkki 9 osoittaa jälleen happi- ja ksylanaasikäsittely j en välisen yhteisvaikutuksen, jonka avulla 30 tässä tapauksessa valkaisemattoman massan kappaluku saatiin alenemaan 67 %. O-X-käsittelyn jälkeen saadaan myös parempi valkoisuusaste ja tämän mukana hyvä viskositeetti.

Esimerkin 9 kuvaama tämän keksinnön mukainen menetelmä tarjoaa mahdollisuuden saada korkean valkoisuuden 35 omaavaa täysin valkaistua massaa käyttämättä ollenkaan ai- 28 94265 kuaineesta koostuvaa klooria, hyvä viskositeetti samalla säilyttäen, käyttämällä sellaisia klooridioksidimääriä, jotka ammattimiehen arvioon perustuen olisivat suhteellisen alhaisia.

5 Esimerkki 10

Seuraava kuvaus on esimerkki O-X-D-P-sarjasta.

Esimerkin 4 mukaiselle valkaisemattomalle lehtipuun sulfaattiselluloosamassalle tehtiin esimerkin 4 mukainen happikäsittely, jota seurasi ksylanaasikäsittely esimerkin 10 5 mukaisesti. O-X-valkaistulla massalla oli seuraavat omi naisuudet :

Kappaluku 4,6 (67 % pienempi kuin valkaisematon)

Viskositeetti 24,1 mPa.s

Valkoisuusaste 60,8 % ISO

15 O-X-valkaistu massa valkaistiin edelleen sarjalla D-P. Kemikaalien annostus ja olosuhteet olivat seuraavat: D vaihe: 1 % klooridioksidia, 0,2 % natriumhydroksi- dia 70 eC:ssa 3 tunnin ajan massan sakeuden ollessa 6 %.

20 P vaihe: 0,1 % vetyperoksidia, 0,25 % natriumhydrok- sidia 70 °C:ssa 60 minuutin ajan massan sakeuden ollessa 10 %.

Sarjalla 0-X-D-P valkaistulla massalla oli seuraavat ominaisudet:

. 25 Valkoisuusaste 90,9 % ISO

Viskositeetti 20,3 mPa.s Tässä tapauksessa korkean valkoisuusasteen omaava täysin valkaistu massa saatiin käyttäen vain neljää käsittelyvaihetta ja edelleen ilman alkuaineesta koostuvaa 30 klooria.

·φ Esimerkki 11 «

Esimerkin 4 mukaiselle valkaisemattomalle lehtipuun sulfaattiselluloosamassalle tehtiin sarjan 0-X-C/D-E-D-käsittely esimerkissä 7 luonnehditulla tavalla, paitsi 35 että viimeisen D-vaiheen kemikaaliannostukset olivat 0,5 lii M,i liiti mi m „ 94265 % klooridioksidia ja 0,1 % natriumhydroksidia massasta. O-X-C/D-E-D-valkaistulla massalla olivat seuraavat ominaisuudet

Valkoisuusaste 91,7 % ISO 5 Viskositeetti 25,1 mPa.s

Esimerkki 11 osoittaa edelleen esimerkissä 7 esitetyt tämän keksinnön mukaisen menetelmän edut. Erityisesti tässä tapauksessa saadaan hyvin korkea valkoisuusaste (91,7 % ISO) hyvällä viskositeettitasolla (25,1 mPa.s).

10 Esimerkki 12

Esimerkin 4 mukaiselle valkaisemattomalle lehtipuun sulfaattiselluloosamassalle tehtiin sarjan X-O-C/D-E-D-käsittely esimerkissä 8 luonnehditulla tavalla, paitsi että viimeisessä D-vaihessa massaan lisättiin 0,08 % kloo-15 ridioksidia. X-O-C/D-E-D-valkaistulla massalla olivat seuraavat ominaisuudet:

Viskositeetti 24,1 mPa.s

Valkoisuusaste 60,8 % ISO

Esimerkki 12 osoittaa edelleen esimerkissä 8 esite-20 tyt tämän keksinnön mukaisen menetelmän edut.

Edellä esimerkissä 5 kuvattu ksylanaasikäsittelyä seuraavaa pesuvaihetta pidetään valinnaisena, mutta yleensä suositellaan, että varastoitaessa entsyymikäsiteltyä massaa pitkään olisi pesu liitettävä mukaan ja entsyymi 25 denaturoitava.

Claims (10)

94265

1. Menetelmä lignoselluloosamateriaalin valkaisemi-seksi, jossa on ksylanaasilla hydrolysoituvia ksylosidisiä 5 sidoksia, tunnettu siitä, että mainittu lignosel-luloosamateriaali käsitellään (a) hapella tai happea sisältävällä kaasulla happi-käsittelyssä, joka suoritetaan emäksisessä väliaineessa, mainitun materiaalin delignifioitumisen ja/tai valkaistu- 10 misen aikaansaamiseksi ja (b) riittävällä määrällä olennaisesti sellulaasia sisältämätöntä ksylanaasia ksylanaasikäsittelyssä mainittujen hydrolysoituvien ksylosidisten sidosten hydrolyysin aikaansaamiseksi mainitussa materiaalissa; 15 jolloin saadaan valkaistua lignoselluloosamateriaalia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että lignoselluloosamateriaalia käsitellään veteen tehtynä suspensiona, jonka sakeus on 3 - 35 paino-%, hapella tai happea sisältävällä kaasulla 20 hapen osapaineen ollessa 207 - 1724 kN/m2 paineyksikköä 70 - 170 °C:ssa 10 - 90 minuutin ajan.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lignoselluloosamateriaalia käsitellään veteen tehtynä suspensiona, jonka sakeus on .. 25 1 - 20 paino-%, 1 - 500 IU:lla/ml ksylanaasia 20 - 80 °C;ssa 1-48 tunnin ajan.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lignoselluloosa-materiaali altistetaan myös ainakin yhdelle seuraavista 30 käsittelyistä; .· käsittely vesipitoisessa liuoksessa kloorilla ja/- tai klooridioksidilla; käsittely emäksisessä liuoksessa peroksidin läsnäollessa; ja 35 käsittely vesipitoisessa liuoksessa hypokloriitil la, otsonilla tai typpidioksidilla. il i. - IB. g Iil I i i »| i 94265

5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valkaistulle lig-noselluloosamateriaalille suoritetaan uutto tai hapettava uutto vesipitoisessa liuoksessa alkaliemäksellä.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ksylanaasilla ja hapella tai happea sisältävällä kaasulla suoritettujen käsittelyjen jälkeen lignoselluloosamateriaali käsitellään vesipitoisessa liuoksessa kloorilla ja/tai klooridioksidilla, tälle 10 materiaalille suoritetaan sitten uutto tai hapettava uutto vesipitoisessa liuoksessa alkaliemäksellä, ja käsitellään sitten vesipitoisessa liuoksessa klooridioksidilla.

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ksylanaasilla ja hapella tai 15 happea sisältävällä kaasulla suoritettujen käsittelyjen jälkeen lignoselluloosamateriaali käsitellään vesipitoisessa liuoksessa klooridioksidilla, ja käsitellään sitten vesipitoisessa emäksisessä liuoksessa vetyperoksidilla.

8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukainen 20 menetelmä, tunnettu siitä, että ksylanaasikäsit- telyn jälkeen lisätään pesuvaihe tai sakeutusvaihe sellaisen jäljellejäänyttä aktiivista ksylanaasia sisältävän suodoksen saamiseksi, jota voidaan käyttää uudelleen lisäämällä mainittua suodosta ksylanaasilla käsiteltävään 25 lignoselluloosamateriaaliin. * ·

9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ksyla-naasi on saatu rekombinanttimikro-organismista, joka on tuotettu viemällä hybridiplasmidi Streptomyces lividans - 30 mutantti-isäntäkantaan, jolla on olennaisesti sellulaasi- negatiivinen aktiivisuus, mainitun plasmidin ollessa valmistettu liittämällä Streptomyces lividans 66 -kannasta saatu ksylanaasi(xln)geeni vektoriplasmidiin pIJ702.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että isäntäkanta on Streptomyces lividans 10-164 -kaksoismutanttikanta, jolla on olennaisesti ksylanaasinegatiivinen aktiivisuus. 94265