NO174900B - Fremgangsmåte for fremstilling av bleket lignocellulosemateriale - Google Patents

Abstract

remgangsmåte for bleking av lignocellulosemateriale, omfattende en oksygenblekebehandling og en enzymatisk behandling med en i alt vesentlig cellulasefri xylanase, hvilken fremgangsmåte er forlikelig med, og kan innbefattes i konvensjonelle blekesekvenser. Fremgangsmåten gir en delignifisert og bleket masse ved bruk av lavere mengder av klorholdige forbindelser, og gjar det mulig å eliminere bruk av elementærklor og derved redusere det forurensende avløp fra en massefabrikk som anvender fremgangsmåten. Det kan også oppnåes en heyere grad av delignifisering mens det opprettholdes akseptable massestyrke-egenskaper.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for bleking av lignocellulosemateriale ved anvendelse av en oksygenbehandling og en enzymatisk behandling med xylanase.

Lignocellulosemateriale i fiberform er i vid kommersiell anvendelse som råmateriale for fremstilling av papir, papp, bygningsplater etc. Råmaterialet er vanligvis tre hvis hovedkomponenter er cellulose og et tredimensjonalt makro-molekyl - lignin - som ansees å være innleiret i en matriks av cellulose- og hemicellulosepolysakkarider. Det er generelt akseptert at den bindingen som eksisterer mellom de forskjellige komponentene blir etablert ved bindinger av for-skjellig kjemisk karakter. For eksempel tenker man seg blokker av lignin sammenbundet med hemicellulosekjeder, idet hemicellulosen er en annen komponent i lignocellulose-materialet. I hardved er den dominerende hemicellulosen glucuronoksylan, som omfatter en polymer av D-xylose og som heretter refereres til som xylan.

For å frembringe sterke og blekbare papirdannende fibre må lignocellulosematerialet behandles for å fjerne lignin, og den første delen av denne behandlingen foregår vanligvis i en koker i nærvær av kjemikalier så som natriumhydroksyd og natriumsulfid (for å frembringe kraftmasse), eller sulfitter, vanligvis natrium- eller magnesium-, (for å frembringe sulfittmasse), og således fremstille kjemiske masser. Fjerningen av lignin refereres til som delignifisering. Lignininnholdet i tremasser måles ved en permanganat-oksydasjonstest ifølge en standard metode fra the Technical Association of the Pulp and Paper Industry (TAPPI), og angis som kappa-tall. Den kjemiske massen fra kokeren inneholder fremdeles en betydelig mengde restlignin på dette trinnet, og i noen tilfeller er den egnet for fremstilling av bygnings-eller emballasjepapir uten ytterligere rensing. For de fleste anvendelser, så som fremstilling av trykke-, skrive-og sanitærpapir, er massen imidlertid for mørk i farge og må gjøres lysere ved bleking. Det er på dette punkt at fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse kan anvendes, d.v.s. i fremgangsmåten for bleking av lignocellulose-materiale, idet nevnte materiale er referert til heri tidligere som kjemisk masse. De første bleketrinnene resulterer også i ytterligere delignifisering.

Den konvensjonelle fremgangsmåten for ytterligere de-lignif isering og bleking av masse har vært å anvende flere forskjellige flertrinns blekesekvenser, omfattende alt fra tre til seks trinn, eller etapper, og med eller uten vasking mellom trinnene. Hensikten med blekingen er å gi en masse, i tilfelle kjemiske masser, med tilstrekkelig høy hvithet og styrke for fremstilling av papir- og silkepapirprodukter. Karakteristisk fremstilles masser med hvithet på 85% til 90% ISO. Masser med høyere hvithet kan oppnåes fra visse ublekede massetyper, men til høyere kostnader og med risiko for eller på bekostning av tap av massens styrkeegenskaper. Den asymptotiske grensen for hvitheten som man nærmer seg for en gitt massetype ved konvensjonelle blekefremgangsmåter, refereres til heri som hvithetstaket. Hvithetstaket er det hvithetsnivået, over hvilken hvithet ytterligere bleking ville bli betraktet som for ødeleggende for massens kvalitet, prohibitivt uøkonomisk, eller uoppnåelig for visse materialer.

Tradisjonelt har blekesekvensene vært basert på anvendelse av klor og klorholdige forbindelser, i en eller annen form. Noen av de klorholdige forbindelsene som anvendes er klor betegnet C, klordioksyd betegnet D, og hypo-kloritter betegnet H, vanligvis natriumhypokloritt. Klor, med eller uten tilblanding av klordioksyd, anvendes vanligvis for å initiere bleking av kjemisk masse, etterfulgt av ekstraksjon av den klorbehandlede massen i et vandig alkalisk medium, tilsammen betegnet C-E. Klorforbruket (eller mengden av klor pluss klordioksyd, med klordioksyd uttrykt på klor-oksydasjonsekvivalentbasis) i C-trinnet er proporsjonalt med lignininnholdet (kappa-tallet) for den massen som behandles. Det alkaliske ekstraksjonstrinnet anvendes for å solubilisere og fjerne en større andel av det klorerte og oksyderte rest-ligninet, og også noe hemicellulose blir fjernet.

Etter at man har fått strengere miljømessige bestemmel-ser for å bekjempe vann- og luftforurensningsproblemer i sammenheng med klorholdige blekekjemikalier, sammenkoblet med betydelige gjenvinningssystemer som er nødvendige for fjerning av klorholdige avfallsprodukter, ligger det en betydelig fordel i å redusere og fortrinnsvis å unngå slike kjemikalier i blekefremgangsmåtene. Dersom dessuten klor-holdig avfall blir resirkulert gjennom et gjenvinningssystem for kraftmassesvartlut, vil man ødelegge inndamperen og ovnen. En anrikning av natriumklorid vil også finne sted, og forårsake ødeleggelser på ovnen. Masse- og papirindustrien har derfor rettet sin oppmerksomhet mot andre blekekjemikaler som kanskje kan unngå disse problemene.

Et av de betydelige fremskrittene i industrien i de seneste to ti-årene har sammenheng med anvendelse av oksygen som delignifiserings- og blekemiddel. Én anvendelse er bruk av oksygen i forbindelse med et konvensjonelt alkalisk ekstraksjonstrinn, betegnet Eo, som følger etter kloreringen. Det alkaliske ekstraksjonstrinnet som følger etter kloreringstrinnet kan inneholde andre oksydasjonsmidler, så som peroksyd (p) eller hypokloritt (h) i kombinasjon med eller istedenfor oksygenet. Slike trinn betegnes derfor med Epo, Eho, Ep eller Eh, og alle refereres vanligvis til som oksydativ ekstraksjon.

Den andre hovedanvendelsen for oksygen er først og fremst for delignifisering som følger etter massekokeren og som kommer foran blekingen og betegnes 0. Oksygen brukt på denne måten anvendes på ubleket masse i alkalisk medium under trykk. Selv om anvendelsen av oksygen har gitt alternative metoder for delignifisering og bleking, har den bare begrenset anvendelse, ettersom den alvorlig påvirker graden av polymerisering av cellulosen, hvilket betraktes som en ulempe. Polymeriseringsgraden for cellulosen er en indikasjon på massestyrken, og måles som masseviskositet ved en TAPPI standard metode. Et nødvendig kriterium for et bleketrinn er at den resulterende masseviskositeten ikke må reduseres vesentlig. Vanligvis sørger man for at bare ca. opptil 50% av den lignin som er tilbake etter kokingen, kan fjernes i dette trinnet, med et tålbart tap av masseviskositet. For-søk på delignifisering i høyere grad i dette trinnet skjer på bekostning av ytterligere viskositetstap. Tilstedeværelse av magnesiumion i dette trinnet er kjent for å hjelpe til å

minimalisere disse viskositetstapene. Tap av masseviskositet

antas å skrive seg fra den kjemiske modifisering (nedbryting) av cellulose- og hemi-celluloseandelene.

Anvendelser for bruk av oksygendelignifisering har bi-dratt til en reduksjon i bruken av klorholdige forbindelser i blekeoperasjoner, siden kjemikalieforbruket i kloreringstrinnet er basert på massens lignininnhold, og dette lignininnholdet reduseres betydelig (ca. 40% til 50%) ved delignifisering med oksygen.

Enzymer er blitt studert for anvendelse ved behandling av lignocellulosemateriale. For eksempel er det blitt vist at ligninolyttiske enzymer, spesielt fra hvit forråtnelses-sopp, vil bryte ned lignin i varierende grad. Cellulase-enzymer er også vel kjent for å bryte ned cellulose og er av kommersiell interesse i matvareindustrien og ved fremstilling av alkohol. Ved fremstilling av masse for papirfremstilling ville virkningen av cellulaseenzym være ødeleggende, på grunn av den resulterende reduksjon i cellulosens polymeriserings-grad som ville foregå.

Med tanke på hemicellulosekomponenten i lignocellulose-materialet er det blitt gjort studier av virkningen av xyla-naseenzym på tremasse. Som ventet reagerer xylanasen selektivt med xylanet i hemicellulosen.

Fransk patentsøknad nr. 2.557.894 (publisert 1985) beskriver en fremgangsmåte for behandling av bleket kraftmasse fra hardved eller en bleket kjemisk sulfittmasse fra løsved, med en enzymløsning inneholdende xylanase for å redusere mengden av påfølgende nødvendig hollender-behandling eller raffinering for papirfremstilling. Spesielt store enzym-mengder var nødvendig for behandling av den blekte massen for å frembringe den ønskede virkningen. Dessuten var den xylanasen som ble utskilt av basidiomycetesoppen Sporotrichum dimorphosporum for anvendelse til å redusere raffineringen, ikke cellulasefri, og den ødeleggende cellulaseaktiviteten ble undertrykket ved tilsetning av kvikksølv(II)-klorid til prosessen. På grunn av de kjente toksiske og andre skadelige virkninger som er forbundet med eksponering for kvikksølv-holdige forbindelser, er deres anvendelse ikke akseptabel.

Chauvet et al. (Proceedings of the International Symposium on Wood and Pulping Chemistry, Paris, s. 325, 1987) rapporterte om anvendelse av et xylanasepreparat fremstilt av basidomycete-soppen Sporotrichum dimorphosporum for anvendelse for forbehandling for et konvensjonelt bleketrinn for kjemisk masse, C/D-E-D-E-D. Det rå enzymkomplekset behandles med kvikksølv(II)-klorid for å inaktivere alle polysakkari-dase-, unntatt xylanase-, aktivitetene. Massebehandlingen omfatter en enzymatisk behandling etterfulgt av vasking og påfølgende gjennombløting i vandig syre som resulterer i en opptil 14% kappa-tall reduksjon for hardvedprøven. Massestyrken ble ikke modifisert.

Anvendelsen av xylanase og kraftmasse fra hardved og løsved med den hensikt å forbedre hvitheten og kappa-tall reduksjonen etter påfølgende kjemisk behandling med hydrogenperoksyd eller i en blekesekvens, bli diskutert av Viikari et al. (Proceedings of The International Symposium on Wood and Pulping Chemistry, Paris, 1987). Xylanasene fremstilles ved fermentering av en soppstamme av arten Aspergillis awamori eller ved fermentering av bakteriestammer av Streptomyces olivochromogenes eller Bacillus subtilis. Xylanasene har både xylanase- og xylosidase-aktiviteter, unntatt xylanasen fra sistnevnte bakterie som er xylosidasefri. Enzymprepa-ratene inneholder spor av cellulaseaktivitet. En liten hvit-hetsøkning på 1,0 til 3,4 hvithetspoeng observeres ved både hardved- og løsvedmasse etter hydrogenperoksydbehandling som følger etter den enzymatiske behandlingen. I mange tilfeller ble den resulterende masseviskositeten bevart eller bare noe lavere. Det er ingen indikasjon med hensyn til virkningen av enzymbehandlingen alene på masseegenskapene.

Paice et al. (Biotech. and Bioeng., bind 32, s. 235-239, 1988) beskriver en behandling av en ubleket hardvedmasse med en trinnvis xylanasebehandling etterfulgt av en behandling med 1% natriumhydroksyd på massen. Denne to-trinns behandlingen ga en hvithetsøkning og reduksjon i kappa-tallet. Også noe av, men ikke hele hvithetsforbedringen beholdes etter påfølgende C-E-D bleking. Xylanasen var angivelig cellulasefri og fremstilt av en E. coli klon.

Overraskende har vi nu funnet at kjemisk masse kan delignifiseres og blekes mer effektivt i sekvenser som omfatter et oksygen-delignifiseringstrinn og en xylanasebehandling.

Det er derfor et formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for å øke graden av delignifisering av lignocellulosemateriale, uten at det fører til ytterligere signifikant viskositetstap.

Det er dessuten et formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for bleking av lignocellulose-materiale ved bruk av lavere mengder klor-holdige blekemidler enn det som anvendes konvensjonelt, eller i hovedsak å eliminere anvendelse av elementær klor, og således fremskaffe en mer miljømessig akseptabel fremgangsmåte.

Det er dessuten et ytterligere formål med den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for delignifisering og bleking av lignocellulosemateriale som effektivt vil heve hvithetstaket for nevnte materiale.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte for bleking og delignifisering av et lignocellulosemateriale som har xylanasehydrolyserbare xylosidiske bindinger, ved behandling av materialet med en tilstrekkelig mengde xylanase til å bevirke hydrolyse av de nevnte bindinger, karakterisert ved at det anvendes xylanase som i alt vesentlig er cellulasefri og at nevnte fremgangsmåte omfatter et trinn for behandling av nevnte lignocellulosemateriale i et alkalisk medium, før eller etter behandling med nevnte xylanase, med oksygen eller en oksygenholdig gass, og at lignocellulose-materialet etter disse behandlinger eventuelt blir behandlet i vandig medium med klor og/eller klordioksyd, deretter underkastet en ekstraksjon eller oksydativ ekstraksjon, i vandig medium med alkalibase, og deretter behandlet i vandig medium med klordioksyd, eller lignocellulose-materialet blir etter behandlingene med xylanase og oksygen eller oksygenholdig gass eventuelt behandlet i vandig medium med klordioksyd, og deretter behandlet i vandig alkalisk medium med hydrogenperoksyd.

I fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse kan behandlingen med xylanase komme foran behandlingen med oksygen eller en oksygenholdig gass. I den vanligvis foretrukne utførelse av fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse kommer behandlingen med oksygen eller en oksygenholdig gass foran behandlingen av xylanase.

Behandlingen av lignocellulosemateriale med oksygen eller en oksygenholdig gass blir utført på et massemateriale i vandig oppslemming ved en konsistens som er valgt i området fra ca. 3% til ca. 35 vekt%, fortrinnsvis fra ca. 10% til ca. 30 vekt%, med oksygen eller en oksygenholdig gass ved et partialtrykk av oksygen på fra 207-1724 kN/m<2> overtrykk, spesielt 276-1034 kN/m<2> overtrykk, og ved en temperatur i området fra 70°C til 170°C, fortrinnsvis fra 100°C til 150°C, mer foretrukket fra 110°C til 130°C, i en periode fra 10 til 90 minutter, fortrinnsvis fra 20 til 60 minutter.

Den oksygenholdige gassen som anvendes i fremgangsmåten vil vanligvis være luft. Anvendelse av luft krever anvendelse av høyere trykk enn med oksygen. For eksempel vil man anvende luft ved 1034-1724 kN/m<2> overtrykk, mens oksygen er effektivt ved trykk på 207-1034 kN/m<2> overtrykk. Det kan også tillates at oksygengass kan dannes in situ. Oksygen kan leveres ved dekomponering av hydrogenperoksyd og aktivatorer så som nitrogendioksyd kan anvendes ved oksygenbehandlingen.

Behandling med oksygen eller en oksygenholdig gass ut-føres i nærvær av 1% til 20 vekt% (basert på nevnte materiale) av en alkali- eller jordalkalibase. Fortrinnsvis er basen natrium-hydroksyd og anvendes i en mengde i området 1% til 10 vekt%.

Et viskositetskonserveringsmiddel som magnesiumion i en mengde i området 0,05% til 1,0 vekt% kan tilsettes til oksygenbehandlingen som definert heri tidligere. Egnede magnesiumholdige forbindelser omfatter magnesiumsulfat, magnesiumoksyd, magnesiumkarbonat og magnesiumhydroksyd. Andre egnede tilsetninger for å bevare viskositeten kan om-fatte kompieksdannende midler, så som aminoalkylfosfonater og polyaminopolykarboksylater.

Behandlingen av lignocellulosematerialet med i alt vesentlig cellulasefri xylanase gjennomføres ved en konsistens på 1% til 20 vekt%, fortrinnsvis 2% til 12%, ved en konsentrasjon av xylanase i området 1 til 500 IU/ml ved en temperatur i området 20"C til 80°C i en periode på 1 til 48 timer. Fortrinnsvis er temperaturen ca. 50°C. Videre blir behandlingen utført i et vandig medium ved en pH på ca. 4 til ca. 8. Mediet er eventuelt bufret for å kontrollere pH. Egnede buffere omfatter, men er ikke begrenset til, acetat-buffer og acetat/citratbuffer.

I fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse karakteriseres xylanasen som i alt vesentlig cellulasefri. Med uttrykket "i alt vesentlig cellulasefri" menes at det ikke er tilstrekkelig cellulase tilstede til å gjennomføre ufordelaktig hydrolyse av glukosid-bindinger. Denne hydro-lysen ville være ødeleggende og uønsket ved behandlingen av lignocellulosemateriale med den hensikt å forbedre egenskapene for nevnte materiale i samsvar med fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse definert her. Den cellulasemengden som kan tolereres avhenger av det spesielle formålet ved praktiseringen av denne oppfinnelse.

I et trekk av fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse blir oksygenbehandlingen og xylanasebehandlingen som beskrevet heri tidligere, etterfulgt av en eller flere ytterligere behandlinger valgt fra gruppen bestående av

(i) behandling i vandig medium med klor, klordioksyd eller blandinger derav, (ii) behandling i vandig medium med klordioksyd, (iii) behandling i vandig alkalisk medium med et peroksyd, (iv) behandling i vandig medium med hypokloritt,

(v) behandling i vandig medium med ozon,

(vi) behandling i vandig medium med nitrogendioksyd.

Nevnte ene eller flere ytterligere behandlinger kan komme foran oksygen- og xylanasebehandlingen, eller kan anvendes som mellomliggende behandling mellom oksygen- og xylanasebehandlingen eller kan følge etter oksygen- og xylanasebehandlingen, eller kan anvendes som en kombinasjon av disse alternative behandlingene.

I fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse følger den nevnte ene eller flere ytterligere behandlinger fortrinnsvis etter oksygen- og xylanasebehandlingen.

I et ytterligere trekk i fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter nevnte fremgangsmåte ytterligere en behandling av nevnte blekede lignocellulose-materiale som skriver seg fra i det minste oksygen- og xylanasebehandlingen som beskrevet heri tidligere, med en ytterligere behandling valgt fra gruppen bestående av (i) ekstraksjon i vandig medium med alkalibase, og (ii) oksydativ ekstraksjon i vandig medium med

alkalibase

Det foretrekkes at oksygen- og xylanasebehandlingen etterfølges av ytterligere behandlinger omfattende i rekke-følge (i) behandling i vandig medium med klor, klordioksyd eller blandinger derav (ii) ekstraksjon eller oksidativ ekstraksjon i vandig medium med alkalibase og

(iii) behandling i vandig medium med klordioksyd.

I en ytterligere foretrukket utførelse etterfølges oksygen- og xylanasebehandlingen av ytterligere behandlinger omfattende i rekkefølge (i) behandling i vandig medium med klordioksyd, og (ii) behandling i vandig alkalisk medium med hydrogenperoksyd.

Det skal forståes at i fremgangsmåten ifølge denne foretrukne utførelsen av den foreliggende oppfinnelse, så vel som i fremgangsmåten ifølge de trekkene og foretrukne utførelsene som er beskrevet heri tidligere, kan xylanasebehandlingen

komme foran oksygenbehandlingen dersom intet annet er sagt.

I et ytterligere trekk tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse et bleket lignocellulosemateriale fremstilt ved fremgangsmåtene som definert heri tidligere.

Ved utførelsen av fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse er de ytterligere behandlingene kjent i teknologien for massebleking, både enkeltvis og i mange tilfelle i rekkefølge, og kan utføres på hvilken som helst fornuftig måte som vanligvis anvendes eller kjennes i teknologien. Foretrukne fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelse for fremstilling av bleket masse omfatter de sekvensene som er definert ved O-X-C/D-E-D (hvori X betyr xylanasebehandling og C/D betyr behandling med klor, klordioksyd eller blandinger derav), og ekstraksjonstrinnet (E) er eventuelt en oksydativ ekstraksjon som definert heri tidligere. Alter-nativt kan fremgangsmåten defineres ved sekvensen O-X-D-P, hvori ingen behandling med elementært klor er innbefattet.

På grunn av karakteren av fremstillingen av klordioksyd er det som oftest klor til stede som ikke behøver å fjernes, og er ikke ødeleggende for fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Xylanasen som anvendes ved utførelse av den foreliggende oppfinnelse er i alt vesentlig cellulasefri og fremstilles ved fermentering av en hvilken som helst egnet xylanase-produserende mikroorganisme, så som en xylanaseproduserende bakterie. Mikroorganismen kan være en naturlig forekommende stamme eller en mutant derav, eller en stamme frembrakt ved genteknologi, d.v.s. en rekombinant stamme, for å øke produk-sjonen av xylanase og/eller produsere en renere xylanase-blanding, for eksempel i alt vesentlig cellulasefri.

Fortrinnsvis fremstilles xylanasen i alt vesentlig cellulasefri fra en mikroorganisme av arten Escherichia coli, Bacillus subtilis eller av slekten Streptomyces, idet nevnte mikroorganisme er blitt genetisk manipulert slik at den ut-viser betydelig cellulasenegativ aktivitet. Mer foretrukket fremstilles xylanasen i alt vesentlig cellulasefri fra en rekombinant xylanasegenholdig mikroorganisme av arten Streptomyces lividans.

For eksempel beskriver Mondus et al, (Gene, bind 49(3), s. 323-329, 1987) fremstilling av en genetisk manipulert rekombinant mikroorganisme av slekten Streptomyces og fremstilling av i alt vesentlig cellulasefri xylanase derav, som er egnet for anvendelse i den foreliggende oppfinnelse. De rekombinante mikroorganismene kan fremstilles ved innføring av et hybrid plasmid i en mutant stamme av en verts mikroorganisme av slekten Streptomyces, idet nevnte stamme karakteriseres ved at den har cellulasenegativ aktivitet, idet nevnte hybridplasmid konstrueres ved innsetting av et xylanasegen i et egnet vektorplasmid. Hybridplasmidet er i stand til å indusere den ekstracellulære sekresjonen av cellulasefri xylanase i en verts mikroorganisme i hvilken nevnte plasmid er blitt innført. Hyridplasmidet kan konstrueres ved en hvilken som helst vanlig metode, så som ligering, for innsetting av det nødvendige DNA fragmentet, xylanasegenet, i et vektorplasmid. Xylanasegenet kan leveres fra den kjente stammen Streptomyces lividans 1326. Et egnet vektorplasmid er det kjente pIJ702, som kan skaffes fra Streptomyces lividans 3131.

Hybridplasmidet kan innføres i vertsmikroorganismen ved teknikkene for protoplastfusjon eller transduksjon eller transformasj on.

I en foretrukket utførelse av den foreliggende oppfinnelse oppnåes derfor xylanase som er i alt vesentlig cellulasefri for anvendelse ved xylanasebehandlingen av lignocellulosematerialet, ved homolog kloning av et xylanase (xln) gen av Streptomyces lividans 66 (1326-stammen). Xylanasegenet kan klones ved funksjonell komplementering av den xylanasenegative, cellulasenegative dobbelte mutantstammen Streptomyces lividans 10-164 ved bruk av flerkopi-plasmidet pIJ702. Denne kloningsfremgangsmåten er fullstendig beskrevet av F. Mondue et al., Gene 49 (3) s. 323-329

(1987) for å frembringe en slik klon Streptomyces lividans IAF28.

Streptomyces lividans 3131 som har plasmidet pIJ702 er i depot i the American Type Culture Collection under aksesjonsnummer APCC 35287. En deponering av Streptomyces lividans 1326, og av den dobbelte mutantstammen Streptomyces lividans 10-164 er blitt gjort i the National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited, Aberdeen, UK februar 1990, under aksesjonsnummer henholdsvis NCIMB ... og NCIMB ...

Ekspresjonen av xylanase (xln) genet og fremstillingen av xylanase fra klonen Streptomyces lividans IAF18 på naturlige substrater er beskrevet av J-L Bertrand et al., Biotechnol. Bioengineering, 33, s. 791-794 (1989). Rensingen og egenskapene for det oppnådde xylanaseenzymet i dette tilfelle er beskrevet av R. Morosoli et al., Biochem. J. 239, s. 587-592 (1986).

Ved fermenteringen av de xylanase-produserende mikroorganismene er det nødvendig med en karbonkilde i kultur-mediet som kan påvirke produksjonshastigheten for xylanase. Ved fremstilling av i alt vesentlig cellulasefri xylanase ved fermentering av en rekombinant mikroorganisme av arten Streptomyces lividans, kan mediet for anvendelse ved fermenteringen inneholde for eksempel høy, hvetehalm, maisskrotter, xylan og/eller brukt bryggerikorn som hovedkarbonkilde, sammen med egnede overflateaktive stoffer så som olivenolje og/eller Tween 80 (varemerke), som beskrevet av Kluepfel et al. i Proceedings of the 6th Canadian Bioenergy R & D Seminar, Vancouver, Canada (1987).

Når en enzymblanding som inneholder xylanase også inneholder betydelige mengder cellulase, blir cellulasen fjernet ved en hvilken som helst metode som er kjent for rensing av xylanase, eller cellulasen blir selektivt gjort inaktiv ved en hvilken som helst akseptabel kjemisk eller mekanisk behandling.

Xylanasen kan anvendes slik som den fremstilles i fer-menter ingsmediet, eller som en konsentrert blanding derav, eller som en blanding fremstilt enten fra en mer konsentrert blanding av xylanasen eller et tørket preparat av xylanase.

Xylanasebehandlingen av lignocellulosemateriale ifølge den foreliggende oppfinnelsen utføres med eller uten om-røring. Ved slutten av tidsperioden for nevnte xylanasebehandling kan det resulterende behandlede materiale anvendes direkte eller fortykket, og nevnte behandlede materiale deretter anvendes for videre bearbeiding. Eventuelt er tatt med en vasking.

I et ytterligere trekk av fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse blir et filtrat som inneholder aktive xylanaserester fra fortykkingen og/eller vaskingen som følger etter xylanasebehandlingen, fortrinnsvis resirkulert ved å anvende nevnte filtrat på det materialet som skal behandles med xylanase.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tilveiebringer et bleket produkt med tilfredsstillende hvithet og viskositet som er likeverdig med eller bedre enn det som observeres for masser som er bleket i samme utstrekning ved konvensjonelle metoder. Høyere hvithetsnivå kan også oppnåes i praksis ved bruk av fremgangsmåten beskrevet heri, for så vidt som disse hvithetsnivåene bare kunne oppnåes på bekostning av betydelig høyere anvendelse av klorholdige kjemikalier og/eller ødeleggende tap av viskositet.

Fremgangsmåten beskrevet heri frembringer en bleket masse ved bruk av lavere mengder av klorholdige forbindelser, og muligheten til i hovedsak å eliminere anvendelse av elementærklor, og derved redusere det forurensende avløpet fra en massefabrikk som anvender fremgangsmåten.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse gir muligheter for å resirkulere mer organisk materiale som blir fjernet fra det opprinnelige lignocellulose råmateriale til gjenvinningsprosessen i en fabrikk, og således redusere forurensningsbelastningen fra blekeprosessen.

I denne beskrivelsen er alle forhold og prosentsatser etter vekt av ovnstørket materiale, dersom intet annet er sagt.

Testene for karakterisering av det behandlede materiale i denne oppfinnelsen ble utført ved følgende standardmetoder.

Oppfinnelsen illustreres dessuten ved følgende eksempler.

Eksemplene 1 og 2 beskriver fremstilling av Streptomyces lividans klon IAF18.

EKSEMPEL 1

Kromosomal DNA ble ekstrahert fra Streptomyces lividans 66 (stamme 1326) og delvis spaltet med Sau3A. De resulterende fragmentene ble fraksjonert på en lineær 10 til 40% sukrose-gradient. De anrikede fraksjonene som inneholdt 4 til 10 kb-fragmenter ble slått sammen før etanoluttelling. Vektorplasmid pIJ702 fremstilt fra Streptomyces lividans 3131, ble spaltet fullstendig med Bglll og enzymet ble fjernet ved fenol/kloroform-ekstraksjon. Plasmidet ble felt ut med etanol og defosforylert som beskrevet av Kendall og Cullum (Gene; 29, 315 (1984). For ligering ble en blanding av delvis spaltede kromosomale Streptomyces lividans DNA fragmenter og defosforylert pIJ702 i et forhold på 5:1 behandlet med 0,1 enheter av T4 DNA ligase over natten ved romtemperatur ved en konsentrasjon på 37,5 \ ig/ml.

Streptomyces lividans 1326 ble mutert ved anvendelse av N-metyl-N'-nitro-N-nitroguanidin (Delic et al., Mutation Res.; 9. 167 (1970), og en dobbelt mutant B- l,4-D-glukan glukanhydrolase (endocellulase)-negativ og xylanase negativ ble utvalgt. Den doble mutanten ble utvalgt på et fast minimalt medium som inneholdt 1% karboksymetylcellulose som hovedkarbon-kilde. Visualisering av endocellulaseaktiviteten ble oppnådd ved farging med kongorødt ifølge Teather and Wood, op. eit. Bestemmelsen av xylanase-negative mutanter ble utført på samme måten ved å erstatte karboksymetyl-cellulosen med 1% xylan fra havrespelt. Fargingen med kongo-rødt ble funnet å være anvendbar også for bestemmelse av xylanaseaktivitet. I begge tilfeller ble fravær av av-fargingssoner tatt som en indikasjon på fravær av enzym-produksjon. Dobbeltmutanten Streptomyces lividans 10-164 var svært stabil, syntes å gi det høyeste transformasjonsutbytte og ble derfor utvalgt som den mer foretrukne vertsmikroorganismen for utvikling av ekspresjonssystemet.

Protplasting og transformasjon av den doble mutanten Streptomyces lividans 10-164 ble gjennomført som beskrevet av Chapter et al. (Curr. Topics Microbiol. Immunol., 97, 69

(1982)). Transformerte protoplaster ble utplatet på R5 medium supplementert for melanin ekspresjon og overlagret med 3 ml av R5 medium som inneholdt 0,6% agar ved 42°C. Trans-formanter ble utvalgt på tiostreptonbestandighet etter 16 timer ved 30°C ifølge fremgangsmåten til Kendall and Cullum, op. eit. (1984). Screening av xylanasepositive kloner ble utført ved bruk av et minimumsmedium supplementert med RBB-xylan som ble fremstilt ifølge Biely et al. (Anal. Biochem.; 144, 142 (1985). Kolonier som frembringer xylanase, hydro-lyserer dette substratet og frembringer klare soner.

To xylanase-produserende kloner ble utvalgt og betegnet Streptomyces lividans IAF18 og IAF30. Analyse ved agarose-gel-elektroforese av det plasmidiske DNA materialet som ble funnet i Streptomyces lividans IAF18 og IAF3 0 viste at alle de plasmidene som ble funnet, var større enn pIJ702, det vil si at plasmidene pIAF18 og pIAF30 hadde innskudd på henholdsvis 5,7 og 6,7 kb. Disse hybridplasmidene ble brukt til å retransformere den doble mutanten Streptomyces lividans 10-164. I alle tilfellene var 100% av transformantene positive for den enzymatiske aktiviteten som tidligere ble oppnådd, hvilket viste at det presumptive xylanase (xln) genet var plasmid sammenbundet. Restriksjonskartlegging av plasmidene pIAF18 og pIAF30 åpenbarte en uoverensstemmelse mellom de to innskuddene med hensyn til restriksjonsseter. Southern blotting ved bruk som gensøker av BamHI-SphI restriksjons-fragmentet internt på innskuddet pIAF18 viste imidlertid at ca. 2kb av DNA var felles for de to innskuddene.

Ekspresjonen av xln genet ble studert ved neddykkede kulturer av de forskjellige klonene i TSB (trypticase soya medium) og i xylanmedium og sammenlignet med stammene Streptomyces lividans 1326 og 3131 av den ville typen. Xylanmediet, referert til som N13, består av: xylan (fra havrespelt; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, U.S.A.), 10 g; (NH4)2S04, 1,4 g; K2HP04, 2,5 g; KH2P04, 1,0 g; gjær ekstrakt (Difco), 2 g; proteosepepton (Difco) lg; MgS04.7H20, 0,3 g; CaCl2.3H20, 0,3 g; Tween 80, 2 ml; og 1 ml av en spormetall-løsning inneholdende CoCl2.6H20 (200 mg), FeS04.7H20 (500 mg), MnS04.H20 (160 mg) og ZnS04.7H20 (140 mg), alle løst i 100 ml destillert vann surgjort til pH 3. En inkuberingstemperatur på 34°C ble valgt da den ga et godt forhold mellom vekst og xylanase aktivitet (Kluepfel et al., Appl..Microbiol. Biotechnol.; 24 230 (1986). Resultatene er vist i tabell 1 for 48 timer og 72 timer inkubering

Stammen av vill-type, med eller uten plasmidet pIJ702, frembrakte ingen enzymaktivitet når den ble dyrket i TSB, og de mengdene som ble produsert i xylanmediet varierte mellom 3 og 6 IU/ml i kulturfiltrat. Klonene IAF18 og IAF3 0 viste signifikant aktivitet i TSB(0,9-4,5 IU/ml) endog i fravær av noe som helst induksjonsmiddel. Klonene IAF18 og IAF3 0 dyrket i xylanmedium frembrakte svært høye xylanaseinnhold, IAF18 oppnådde for eksempel 380 IU/ml. I den intracellulære fraksjonen av alle kulturene ble det påvist bare spormengder av xylanaseaktivitet, hvilket indikerte en effektiv sekresjon.

Konsentrater av kultursupernatanten av stammen Streptomyces lividans 3131, og klonene IAF18 og IAF30 ble etter induksjon med xylan analysert for sekretert xylanase med SDS-9% PAGE etter farging med Coomassie blått. De xylanaselignende produktene fra disse klonene hadde en estimert Mr på 43.000. Denne verdien tilsvarte nøyaktig Mr for den naturlige rensede xylanasen isolert fra Streptomyces lividans 1326 (Morosoli et al., 1986) hvilket viste at begge klonene hadde innskudd som kodet i det minste for det kom-plette strukturelle genet. Dessuten ble identiteten for disse proteinene bekreftet immunologisk i Western-blotting-eksperimenter ved bruk av antixylanase antistoffer.

EKSEMPEL 2

Den genetiske stabiliteten for Streptomyces lividans IAF18 ble undersøkt ved å teste enzymproduksjonen i TSB og medium M13 som inneholdt 1% xylan (definert heri ovenfor) både i nærvær og i fravær av thiostrepton. I begge media forble det oppnådde enzymnivået konstant under i det minste 10 på hverandre følgende overføringer og ble ikke påvirket ved fravær av dette antibiotikum. Flerkopigeneffekten ble observert i TSB hvor ca. 2 IU/ml ble målt konsekvent etter 24 timer og nådde 10 IU/ml etter 48 timer. Dette produksjons-nivået holdt seg stabilt i flere døgn og kan forklares ved enzymets gode stabilitet ved 34°C.

Tilsetning av glukose til mediet M13 viste klart under-trykking av katabolitter, og enzymproduksjonen startet når dette sukkeret var forbrukt, mens xylose som hovedkarbonkilde i det samme mediet ga et ekstra cellulært xylanasenivå på 800 IU/ml som oppnådd ved bruk av xylan alene, som vist i tabell 2.

Tabell 3 viser en sammenligning av enzymproduksjonen mellom vill-type stammen Streptomyces lividans 132 6 og klonen Streptomyces lividans IAF18 på medium M13 som inneholdt 1% og 2% xylan. Førstnevnte ga 28 IU/ml med begge konsentrasjoner mens sistnevnte sekreterte henholdsvis 1300 og 1600 IU/ml av xylanase.

EKSEMPEL 3

Det følgende eksempel på en C/D-E-D-E-D sekvens blir fremlagt med det formål å sammenligne med sekvenser ifølge den foreliggende oppfinnelse.

150 g på ovnstørket basis av en ubleket kraftmasse av hardved med kappa-tall 14,1, viskositet 49,1 mPa.s og hvithet 34,3% ISO ble bleket ved en konvensjonell C/D-E-D-E-D blekesekvens. Kjemikalieforbruket var som følger: C/D trinn: 2,81% klor, 0,12% klordioksyd ved 50°C i 30

minutter på masse ved 3,0% konsistens. Ei-trinn: 1,56% natriumhydroksyd ved 70°C i 60 minutter

på masse ved 10% konsistens.

Dx-trinn: 0,8% klordioksyd, 0,45% natriumhydroksyd ved

70°C i 3 timer ved 6,0% konsistens.

E2-trinn: 0,4% natriumhydroksyd ved 70°C i 60 minutter

på masse ved 10% konsistens.

D2-trinn: 0,1% klordioksyd ved 70°C i 3 timer på masse ved 6,0% konsistens.

Etter det siste klordioksyd-trinnet hadde massen følgende egenskaper:

EKSEMPEL 4

Det følgende eksemplet på en 0-C/D-E-D sekvens er fremlagt for det formål å sammenligne med sekvenser ifølge den foreliggende oppfinnelse.

150 g, ovnstørket basis, av en ubleket hardved kraftmasse med kappa-tall 14,1, viskositet 49,1 mPa.s og hvithet 34,3% ISO ble slått sammen med 2,5% natriumhydroksyd og tilstrekkelig vann til å gi en konsistens på 10% under omrøring i en Hobart-mikser. Massen ble deretter overført til en oksygen-reaktor for midlere konsistens. I reaktoren ble massen behandlet med oksygengass ved et overtrykk på

414 kN/m<2> ved en temperatur på 100"C i en periode på 60 minutter. Massen ble funnet å ha en slutt-pH på 11,4. Etter fortynning til 4% konsistens ble massen filtrert, vasket med vann ved 1% konsistens og filtrert igjen. Den vaskede massen hadde følgende egenskaper:

Den oksygenbehandlede massen ble deretter ytterligere bleket ved C/D-D-E-D sekvensen, idet kjemikalieforbruket og betingelsene var som følger:

Massen bleket med O-C/D-E-D sekvensen hadde følgende egenskaper:

EKSEMPEL 5

Det følgende eksemplet på en X-C/D-E-D sekvens er fremlagt med den hensikt å sammenligne med sekvenser ifølge den foreliggende oppfinnelse. Trinnet for xylanasebehandlingen vil bli betegnet med "X" i sekvensene. 50 g av den ublekede hardved kraftmassen i eksempel 3, kappa-tall 14,1, viskositet 49,1 mPa.s og hvithet 34,3% ISO, ble behandlet med cellulosefri xylanase fremstilt fra den forannevnte klonen Streptomyces lividans IAF18 beskrevet i eksemplene 1 og 2.

Behandlingen ble utført ved 3% massekonsistens ved 50°C i 16 timer med omrøring ved 250 omdr. pr. min. i bufret vandig 0,1 M natriumacetatløsning, pH 5, og en xylanase-konsentrasjon på 150 IU/ml. Etter enzymbehandlingen ble massen filtrert, vasket ved 1% konsistens og filtrert igjen.

Den vaskede massen hadde følgende egenskaper

Den xylanasebehandlede massen ble deretter ytterligere bleket ved C/D-E-D sekvensen. Kjemikalieforbruket og betingelsene var som følger:

Massen bleket med X-C/D-E-D sekvensen hadde følgende egenskaper:

EKSEMPEL 6

Det følgende eksemplet er gitt bare for sammenlignings-formål.

Den ublekede hardved kraftmassen i eksempel 4 ble underkastet en oksygenbehandling som i eksempel 4. Den oksygenbehandlede massen ble deretter behandlet under betingelsene for xylanasebehandlingen som beskrevet i eksempel 5, unntatt at ingen xylanase var til stede. Massen ble deretter filtrert, vasket med vann ved 1% konsistens og filtrert. Den vaskede massen hadde følgende egenskaper:

Man kan således se at den oksygenbuffersekvensbehandlede massen hadde samme kappa-tall og viskositetsegenskaper som den oksygenbehandlede massen i eksempel 4. Buf forbehand-lingen hadde i alt vesentlig virkning på disse masseegen-skaper.

EKSEMPEL 7

Det følgende er et eksempel på en O-X-C/D-E-D sekvens.

Den ublekede hardved kraftmassen i eksempel 4 ble underkastet en oksygenbehandling som i eksempel 4. Den oksygenbehandlede massen ble deretter underkastet en xylanasebehandling som i eksempel 5. Etter vasking hadde den oksygen-xylanase behandlede massen følgende egenskaper:

Den oksygen-xylanase massen ble deretter ytterligere bleket med C/D-E-D sekvensen. Kjemikalieforbruket og betingelsene var som følger:

Massen bleket med O-X-C/D-E-D hadde følgende egenskaper:

Kappa-tallet oppført for oksygenbehandlingen alene i eksempel 4 er 8,3, som er en 41% reduksjon fra det ublekede kappa-tallet. Kappa-tallet oppført for xylanasebehandlingen alene i eksempel 5 er 10,8, som er en 2 3% reduksjon fra det ublekede kappa-tallet. For sammenligning ga oksygen-xylanase-sekvensbehandlingen i eksempel 7 en masse med kappa-tall 5,3, som er en 62% reduksjon fra det ublekede kappa-tallet, og demonstrerer overbevisende en synergistisk virkning mellom de to behandlingene basert på deres enkelt-ytelser, som dersom de ganske enkelt ble lagt sammen skulle ha gitt et kappa-tall på 6,4, som tilsvarer en 55% reduksjon.

Kjemikalieforbruket for C/D-trinnet, E-trinnet, og D-trinnet er også alle signifikant redusert etter påfølgende bleking av den O-X-behandlede massen som vist i eksempel 7 for en O-X/D-E-D sekvens, sammenlignet med de kjemikalieforbrukene som var nødvendige for bleking til en sammenlign-bar eller endog lavere slutthvithet i hvilken som helst av sekvensene C/D-E-D-E-D, O-C/D-E-D eller X-C/C-E-D som vist ved henholdsvis eksemplene 3, 4 eller 5.

EKSEMPEL 8

Det følgende er et eksempel på en O-X-C/D-E-D sekvens.

Den ublekede hardved kraftmassen i eksempel 4 ble underkastet en xylanasebehandling som i eksempel 5, etterfulgt av en oksygenbehandling som i eksempel 4. Den X-O-blekede massen hadde følgende egenskaper:

Den X-O-behandlede massen ble deretter ytterligere bleket med C/D-E-D sekvensen. Kjemikalieforbruket og betingelsene var som følger:

Massen bleket med X-O-C/D-E-D sekvensen hadde følgende egenskaper:

Kappa-tallet oppført for den X-O behandlede massen i dette eksempel 8 er den samme som den som ble oppnådd for den 0-X behandlede massen i eksempel 7, og viser at den synergistiske virkningen mellom de to behandlingene er til stede uten hensyn til rekkefølgen mellom de nevnte behandlingene. Forbedret hvithet og betydelig forbedret viskositet oppnåes også for denne X-O behandlede massen sammenlignet med 0-X behandlingen eller 0 behandlingen alene.

Slutthvitheten oppnådd i denne X-O-C/D-E-D sekvensen er 91,6% ISO, hvilket illustrerer den effektive hevningen av hvithetstaket for massen ved bruk av reduserte mengder klor og klorholdige blekekjemikalier og uten å medføre uønskede side-virkninger.

EKSEMPEL 9

Det følgende er et eksempel på en O-X-D-E-D sekvens.

Den ublekede hardved kraftmassen i eksempel 4 ble underkastet en oksygenbehandling som i eksempel 4. Den oksygenbehandlede massen ble deretter underkastet en xylanasebehandling som i eksempel 5. Den resulterende massen hadde følgende egenskaper:

Den oksygen-xylanase-behandlede massen ble ytterligere bleket med D-E-D sekvensen, kjemikalieforbruket og betingelsene var som følger:

Massen bleket med O-X-D-E-D sekvensen hadde følgende egenskaper:

Dette eksempel 9 viser igjen den synergistiske virkningen mellom oksygen- og xylanasebehandlingene, hvorved en 67% reduksjon av det ublekede kappa-tallet oppnåes i dette tilfelle. Det oppnåes også en forbedret hvithet med god viskositet etter 0-X behandlingen.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse som illustrert ved eksempel 9 gir anledning til å oppnå en fullstendig bleket masse med høy hvithet uten bruk av elementært klor og med fortsatt god viskositet, med hva som ville bli betraktet av en fagmann i denne teknologien som relativt lavt forbruk av klordioksyd.

EKSEMPEL 10

Det følgende er et eksempel på en 0-X-D-P sekvens.

Den ublekede hardved kraftmassen i eksempel 4 ble underkastet en oksygenbehandling som i eksempel 4 etterfulgt av en xylanase behandling som i eksempel 5. Den 0-X blekede massen hadde følgende egenskaper:

Den 0-X blekede massen ble deretter ytterligere bleket ved D-P sekvensen, kjemikalieforbrukene og betingelsene var som følger:

Massen bleket med 0-X-D-P sekvensen hadde følgende egenskaper:

I dette tilfelle ble oppnådd en fullstendig bleket masse med høy hvithet ved bruk av bare fire behandlingstrinn, og igjen intet elementærklor.

EKSEMPEL 11

Den ublekede hardved kraftmassen i eksempel 4 ble underkastet en O-X-C/D-E-D sekvensbehandling som beskrevet i eksempel 7, unntatt at kjemikalieforbruket i sluttrinnet D var 0,5% klordioksyd, 0,1% natriumhydroksyd på masse. Den O-X-C/D-E-D blekede massen hadde følgende egenskaper:

Eksempel 11 demonstrerer ytterligere de fordelene som er beskrevet i eksempel 7 for fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse. Spesielt i dette eksemplet er den svært høye hvitheten som er oppnådd (91,7% ISO) ved et godt viskositetsnivå (25,1 mPa.s).

EKSEMPEL 12

Den ublekede hardved kraftmassen i eksempel 4 ble underkastet en X-O-C/D-E-D sekvensbehandling som beskrevet i eksempel 8, unntatt at det ble anvendt et kjemikalieforbruk i sluttrinnet D på 0,08% klordioksyd på masse. Den X-O-C/D-E-D massen følgende egenskaper:

Eksempel 12 demonstrerer ytterligere de fordelene som er beskrevet i eksempel 8 for fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse.

Det vasketrinnet som følger etter xylanasebehandlingen som er beskrevet heri tidligere i eksempel 5, betraktes som valgfritt, men vanligvis blir det anbefalt at for forlenget lagring av den enzymbehandlede massen bør vaskingen taes med, og enzymet denatureres.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for bleking og delignifisering av et lignocellulosemateriale som har xylanasehydrolyserbare xylosidiske bindinger, ved behandling av materialet med en tilstrekkelig mengde xylanase til å bevirke hydrolyse av de nevnte bindinger, karakterisert ved at det anvendes xylanase som i alt vesentlig er cellulasefri og at nevnte fremgangsmåte omfatter et trinn for behandling av nevnte lignocellulosemateriale i et alkalisk medium, før eller etter behandling med nevnte xylanase, med oksygen eller en oksygenholdig gass, og at lignocellulose-materialet etter disse behandlinger eventuelt blir behandlet i vandig medium med klor og/eller klordioksyd, deretter underkastet en ekstraksjon eller oksydativ ekstraksjon i vandig medium med alkalibase, og deretter behandlet i vandig medium med klordioksyd, eller lignocellulose-materialet blir etter behandlingene med xylanase og oksygen eller oksygenholdig gass eventuelt behandlet i vandig medium med klordioksyd, og deretter behandlet i vandig alkalisk medium med hydrogenperoksyd.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte lignocellulose-materiale blir behandlet i vandig oppslemming med en konsistens på 3-35 vekt% med oksygen eller en oksygenholdig gass ved et oksygen-partialtrykk på 2 07 til 1724 kN/m<2> overtrykk ved 70 til 170°C i 10 til 90 minutter.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert ved at nevnte lignocellulose-materiale blir behandlet i vandig oppslemming med en konsistens på 1 til 20 vekt% med 1 til 500 IU/ml av xylanase ved 20 til 80°C i 1 til 48 timer.

4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at det blekede lignocellulose-materiale blir underkastet en ekstraksjon, eller oksydativ ekstraksjon, i vandig medium med alkalibase.

5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at det tilføyes et vaske-trinn eller fortykkingstrinn etter behandlingen med xylanase for å gi et filtrat som inneholder resterende aktiv xylanase som blir resirkulert ved å tilføre nevnte filtrat til det lignocellulosemateriale som skal behandles med xylanase.

6. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at nevnte xylanase leveres fra en rekombinant mikroorganisme fremstilt ved innføring av et hybridplasmid i en mutantstamme-vert av Streptomyces lividans som har betydelig cellulasenegativ aktivitet, idet nevnte hybrid-plasmid blir konstruert ved innsetting av et xylanase(xln;-gen levert fra Streptomyces lividans 66 i vektorplasmidet pIJ702.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte vertsstamme er dobbeltmutantstammen Streptomyces lividans 10-164 som har betydelig xylanase-negativ aktivitet.