FI121469B - Mikrotetraspora-lajista eristettyjä lämpöstabiileja ksylanaaseja ja menetelmä niiden käyttämiseksi - Google Patents

Description

Mikrotetraspora-lajista eristettyjä lämpöstäbiileja ksy-lanaaseja ja menetelmiä niiden käyttämiseksi

Keksinnön alue 5 Tämä keksintö koskee menetelmää Microtetraspora- lajista saadun lämpöstabiilin entsyymin käyttämiseksi ja uutta lämpöstabiilia ksylanaasientsyymiä, joka on eristetty Microtetraspora-lajista ja joka on aktiivinen suurella al-kalisella alueella ja korkeissa lämpötiloissa. Alkalisella 10 lämpöstabiililla ksylanaasilla on erityisesti käyttöä sellu- ja paperiteollisuudessa.

Keksinnön taustaa

Puu on monimutkainen materiaali, joka koostuu selluloosasta, hemiselluloosasta ja ligniinistä sekä muista 15 vähäisemmistä aineosista. Ligniini on liittyneenä selluloosaan ja hemiselluloosaan ja on luultavasti kovalenttisesti sitoutunut sekä selluloosaan että hemiselluloosaan.

Paperinvalmistusprosessissa ligniini yleensä poistetaan puumassasta, koska se antaa ruskehtavan värin, vä-20 hentää lujuutta ja antaa muita ei-toivottavia ominaisuuksia lopputuotteelle. Ligniinin poisto voidaan aikaansaada monilla tavoilla.

Suurin osa ligniinistä poistetaan aluksi puumassasta kemiallisella massan valmistuksella (esim. sulfaattime-25 netelmä). Seuraavassa valkaisuprosessissa kemiallinen sel-lumassa saatetaan tavallisesti reagoimaan kloorin ja muiden delignifioivien (ligniiniä poistavien) kemikaalien kanssa ligniinin poistamiseksi edelleen ja sitten saatetaan reagoimaan valkaisuaineiden kanssa ligniinin modifioi-30 miseksi sellumassasta, niin että saadaan stabiilia kirkastettua massaa. Käsittely kloorilla on kuitenkin ei-toi-vottava ympäristön kannalta, koska muodostuvat ulosvirtaukset sisältävät suuren määrän toksisia yhdisteitä (esim. kloorattuja fenoleja). Huoli massan klooria sisältävillä 35 kemikaaleilla valkaisun aiheuttamista vahingollisista ym- 2 päristövaikutuksista on ajanut teollisuuden etsimään vaih-toehtoisia valkaisumenetelmiä.

Kirjallisuudessa on kuvattu yrityksiä käyttää entsyymejä, jotka on saatu sieni- ja bakteerilähteistä, de-5 lignifikaation ja kirkastamisen lisäämiseen, niin että samalla vähennetään tai poistetaan kloorikemikaalien käyttöä. On kuitenkin löydetty hyvin vähän entsyymisysteemejä, jotka vaikuttavat selektiivisesti massaan, mutta eivät vaikuta haitallisesti massan selluloosasisältöön.

10 Ksylanaasit ovat hemiselluloosaentsyymejä, jotka katalysoivat ksylaanin, lehtipuun ja havupuun hemisellu-loosan tärkeimmän aineosan, hydrolyysiä, ja ne tavallisesti ovat liittyneinä kasvisoluseinämien selluloosa- ja lig-niiniaineosiin. Ksylanaasi on osoittautunut arvokkaaksi 15 entsyymiksi massan esivalkaisussa puumassan delignifikaation lisäämiseen, koska se helpottaa ligniinin poistumista massasta. Ehdotettu mekanismi tälle toiminnalle on, että sulfaattimassanvalmistuksen aikana ksylaani ensin solubi-lisoituu keittonesteeseen. Keiton myöhemmissä vaiheissa 20 ksylaani saostuu uudelleen sellukuiduille. Kun ksylanaase-ja käytetään massan esivalkaisussa, näiden uudelleen saostuneiden ksylaanifraktioiden osittainen hydrolyysi muuttaa massan pinnan läpäisevämmäksi ligniinin poistumista varten. Sen vuoksi ksylanaasiesivalkaisu johtaa pienempien 25 valkaisukemikaalimäärien käyttöön verrattuna ei-entsymaat- tiseen valkaisuun. Suurin osa entsyymivalmisteista, jotka on alussa kuvattu kirjallisuudessa, ovat aktiivisia happamilla pH-alueilla optimilämpötilojen saavuttaessa 50 °C.

Teollista käyttöä varten, erityisesti massavalkai- 30 suteollisuudessa, jossa prosessit tapahtuvat korkeissa lämpötiloissa ja alkalisessa pH:ssa, olisi huomattavan edullista, jos olisi saatavissa ksylanaaseja, jotka ovat aktiivisia korkeissa lämpötiloissa suurella pH-alueella, erityisesti pH:ssa 7-10, toisin kuin nyt tällä hetkellä 35 saatavissa olevat.

3

Ksylanaasit, jotka on puhdistettu Microtetraspora flexuosasta, ovat erinomaisia ehdokkaita massan esival-kaisuun, koska ne ovat aktiivisia korkeissa lämpötiloissa ja alkalisessa pH:ssa ja ne vaikuttavat massan hemisellu-5 loosa/selluloosamatriisiin, jonka kanssa ligniini on liittynyt tai sitoutunut, niin että entsyymikäsittelyn jälkeen ligniini vapautuu ja/tai muuttuu vapautuvaksi sopivan uuttoaineen avulla.

Hiljattain on identifioitu useita termofiilisiä 10 ksylanaaseja sieni- ja bakteerimikro-organismeista. On esimerkiksi eristetty termofiilinen ksylanaasi Actinoma-durasta, joka on uudelleen luokiteltu Microtetrasporaksi, jonka optimi-pH on 6,0 - 7,0 ja lämpötilaväli 70 - 80 °C (Holtz, C. et ai., Antonie van Leewenhoek, 59: 1 - 7, 15 1991). EP-hakemusjulkaisussa 0 473 545 esitetään, että bakteerikanta Thermomonospora fusca tuottaa termostabiile-ja ksylanaaseja, jotka ovat aktiivisia 10 - 90 °C:n, edullisesti 50 - 80 °C:n, lämpötiloissa suurella pH-alueella, so. noin 5-10, edullisen alueen ollessa 6,6 - 9,5. Li-20 säksi julkaisussa W0 92/18 612 esitetään ksylanaasientsyy-mi, joka on johdettu lajista Dictyoglomus, jonka aktiivisuus on suurella pH-alueella (5,0 - 9,0) ja lämpöstabiili-suus lämpötiloissa, jotka ovat välillä 60 - 90 °C.

Vaikka kirjallisuudessa on kuvattu lämpöstabiileja 25 ksylanaaseja, jotka ovat aktiivisia alkalisella alueella, on vielä tarve identifioida uusia ksylanaaseja, jotka ovat tehokkaampia massan delignifikaatiota ja kirkastamista koskevissa käyttösovellutuksissa verrattuna tavanomaisiin valkaisuaineisiin ja ksylanaaseihin, joita on nyt saata-30 vissa. Lisäksi hakijoiden keksinnön aikaan ei tiedetty monien Microtetraspora flexuosasta peräisin olevien alkalisella alueella optimaalisen ksylanaasiaktiivisuuden omaavien ksylanaasien olemassaolosta.

4

Keksinnön yhteenveto Tämän keksinnön yhteydessä Microtetraspora flexuosa -mikro-organismeista on eristetty viisi uutta alkalista lämpöstabiilia ksylanaasia, jotka voivat kestää korkeita 5 lämpötiloja ja aikalisiä olosuhteita. Tämä on erityisen merkityksellistä massavalkaisukäyttösovellutuksissa. On myös todettu, että Microtetraspora flexuosa -mikro-organismien kokoviljelmälihaliemisupernatantilla on lämpötole-ranssi- ja alkalisuustoleranssiominaisuuksia, jotka tekevät 10 nämä ksylanaasiseokset erinomaisiksi ehdokkaiksi massaval-kaisukäyttösovellutuksissa. Näillä uusilla ksylanaaseilla ja kokoviljelmäsupernatanttiksylanaaseilla voi myös olla käyttöä muilla alueilla, kuten eläinten rehu- ja polttoaine teollisuuksissa .

15 Viisi uutta ksylanaasientsyymiä, jotka on eristetty

Microtetraspora flexuosasta ja nimetty tässä ksylanaasi l:ksi -ksylanaasi 5:ksi, on puhdistettu homogeenisiksi isoelektristen hopeavärjäysfokusointigeelien avulla mitattuna. Ksylanaasit on puhdistettu ioninvaihtokromatografiän 20 ja hydrofobisen vuorovaikutuskromatografiän yhdistelmällä.

Kukin puhdistettu ksylanaasi on karakterisoitu lämpöstabii-lina laajalla pH-alueella. Spesifisesti kukin ksylanaasi säilyttää yli 80 % aktiivisuudesta pH-alueella 6-9.

Keksinnön kohteena on ksylanaasi 1, jolle on tun-25 nusomaista, se mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Ksylanaaseja voidaan edelleen karakterisoida seuraavasti : ksylanaasi l:n näennäismoolimassa on noin 33 100 daltonia, pl noin 8,5, optimi-pH noin 7,0 - 7,5 ja sillä on 30 optimilämpötila-aktiivisuus noin 70 °C:ssa; ksylanaasi 2:n näennäismoolimassa on noin 13 300 daltonia, pl noin 7,5, optimi-pH noin 7,0 - 7,5 ja sillä on optimilämpötila-aktiivisuus noin 65 °C:ssa; ksylanaasi 3:n näennäismoolimassa on noin 31 000 35 daltonia, pl noin 6,2, optimi-pH noin 7,5 ja sillä on optimilämpötila-aktiivisuus noin 65 °C:ssa; 5 ksylanaasi 4:n näennäismoolimassa on noin 50 000 daltonia, pi noin 5,8, optimi-pH noin 7,5 ja sillä on opti-milämpötila-aktiivisuus noin 65 °C:ssa; ksylanaasi 5:n näennäismoolimassa on noin 35 000 5 daltonia, pi noin 5,3, optimi-pH noin 7,5 ja sillä on opti-milämpötila-aktiivisuus noin 70 °C:ssa.

Edellä kuvattuja Microtetraspora flexuosa -ksyla-naaseja voidaan selektiivisesti käyttää erilaisiin massoihin korkeammassa lämpötilassa ja aikalisissä olosuhteissa, 10 jolloin delignifikaatio lisääntyy, ligniinipitoisuus pienenee, kirkastusvaikutus lisääntyy ja massan selluloosasisäl-tö pysyy vahingoittumattomana. Sen vuoksi tämän keksinnön toisen aspektin mukaisesti keksinnön mukaista ksylanaasia ja mahdollisesti yhtä tai useampia edellä kuvatuista muista 15 uusista ksylanaasientsyymeistä käytetään kemiallisen massan käsittelyyn sellunkeiton tai happidelignifikaation jälkeen käsitellyn massan kirkastuksen lisäämiseen ja/tai deligni-fikaation lisäämiseen.

Vielä eräässä aspektissa tämä keksintö koskee mene-20 telmää massan delignifikaation ja/tai valkaisun lisäämiseksi, jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 2 esitetään.

Microtetraspora flexuosa -viljelylihaliemessä muodostuneiden luonnollisten raakatuotteina olevien kokosuper-25 natanttiksylanaaseja voidaan käyttää käsitellyn massan de lignif ikaation lisäämiseen ja valkaisuun. Tällöin Microtetraspora flexuosan kokosupernatantti on Microtetraspora fle-xuosan tuottamien kaikkien ksylanaasien, nimittäin 1-5, seos. Kokoksylanaasisupernatantti on lämpöstabiili ja alka-30 lisesti stabiili. Kokoksylanaasisupernatantin ominaisuudet ovat seuraavanlaiset: ksylanaasiaktiivisuudella on laaja pH-optimi 7-9, lämpötilaoptimi noin 70 °C - noin 80 °C (jolloin 40 % aktiivisuudesta säilyy 90 °C:ssa) ja puoliintumisaika 80 °C:ssa 90 minuuttia.

6

Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuviossa 1 kuvataan Microtetraspora flexuosan viiden puhdistetun ksylanaasin aktiivisuus-pH-profiili.

Kuviossa 2 kuvataan Microtetraspora flexuosan vii-5 den puhdistetun ksylanaasin aktiivisuus-lämpötilaprofiili.

Kuviossa 3 esitetään Microtetraspora flexuosan viiden puhdistetun ksylanaasin lämpötila-stabiilisuusprofiili.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Kuten edellä on mainittu, tämä keksintö koskee 10 yleisesti uutta ksylanaasia, joka on eristetty Microtetra-spora-lajista, sekä menetelmiä tämän uuden ksylanaasin käyttämiseksi. Kun tässä kuvattuja Microtetraspora fle-xuosasta saatuja ainutlaatuisia ksylanaaseja käytetään sopivissa pH-, lämpötila- ja annostusolosuhteissa, ne ovat 15 erityisen tehokkaita massan kirkastuksen ja delignifikaati-on lisäämisessä vaikuttamatta haitallisesti massan laatuun. Nämä uudet ksylanaasit ovat myös erinomaisia ehdokkaita käytettäviksi eläinrehussa ja lisäaineina maatalousjättei-siin alkoholipolttoaineiden tuotantoa varten.

20 Ennen kuin tätä keksintöä käsitellään yksityiskoh taisesti, määritellään ensin seuraavat termit.

Tässä käytettynä termi "ksylanaasi numero" viittaa yhteen viidestä puhdistetusta ksylanaasientsyymistä, jotka on eristetty Microtetraspora ssp -viljelylihaliemestä. Kul-25 lekin viidelle ksylanaasille ilmoitetut numerot vastaavat kunkin ksylanaasin isoelektrisiä fokusointiarvoja (pl-arvoja) pienimmän numeron (1) tarkoittaessa alkalisinta pl-arvoa ja suurimman numeron (5) tarkoittaessa vähiten alkalista pl-arvoa.

30 Termi "kokosupernatanttiksylanaasit" viittaa Mic rotetraspora ssp.:n viljelylihaliemeen, josta solut on aikaisemmin poistettu sentrifugoimalla. Siten kokoksyla- 7 naasisupernatantti sisältää edellä kuvattujen ksylanaasien 1-5 seoksen.

Termi "valkaisu" viittaa kemiallisten massojen käsittelyyn ja se voidaan osoittaa massan delignifikaatiolla 5 ja kirkastumisella. Erityisen käyttökelpoisista massoista on yleensä jo poistunut suunnilleen 90 - 99 % niiden ligniinistä ja ne käsitellään oleellisesti jäljelle jääneen ligniinin, joka käsittää kemiallisen modifioidun ligniinin, poistamiseksi.

10 Tämän kuvauksen mukaisesti Microtetraspora fle- xuosa:n viljelmien tuottamat viisi uutta ksylanaasia on eristetty näennäisen homogeenisesti ja karakterisoitu bio-kemiallisesti. Tämän kuvauksen mukaiset ksylanaasit voidaan johtaa mistä tahansa Microtetraspora ssp.:stä, joka alalla 15 tunnetaan. Edullisesti ksylanaasit saadaan Microtetraspora flexuosasta. Edullinen kanta on ATCC 35864, jota on helposti saatavissa American Type Culture Collectionista, Bethes-da, MD. Uusien ksylanaasien eristäminen käsittää solun ulkopuolisten ksylanaasien puhdistamisen ioninvaihtokromato-20 grafian (IEC) ja hydrofobisen vuorovaikutuskromatografiän (H(C) yhdistelmällä kummassa tahansa järjestyksessä puhdistettavan ksylanaasin mukaan. Microtetrasporasta eristettiin viisi ksylanaasia ja ne nimettiin numeroilla 1-5, jotka vastaavat kunkin ksylanaasin isoelektristä fokusointipis-25 tettä ksylanaasin 1 ollessa aikalisin ja ksylanaasin 5 vähiten alkalinen.

Nämä kaksi puhdistusmenetelmää, joita käytetään viiden kemiallisesti erilaisen ksylanaasin eristämiseen ja karakterisoimiseen, on esitetty yksityiskohtaisesti 30 jäljempänä. Molemmissa menetelmissä Microtetraspora fle- xuosa -solut poistetaan sentrifugoimalla ja viljelyliha-liemi väkevöidään käyttäen ultrasuodatusta. Ensimmäisessä menetelmässä ksylanaasi 1 (pl 8,5), ksylanaasi 2 (pl 7,5) ja ksylanaasi 4 (pl 5,8) erotetaan ja puhdistetaan. Soluvapaa 35 kokoviljelmälihaliemivalmiste pannaan anioninvaihtokolon- 8 niin, pestään ja eluoidaan suurenevalla suola- (NaCl-) gradientilla. Kun fraktiot on otettu talteen, ksylanaasi-aktiivisuus mitataan käyttäen remazol brilliant blue -värjätyn koivupuun ksylaanianalyysiä (RBB-ksylaanianalyysi), 5 Ksylanaasi 1 ja ksylanaasi 2 eluoituvat suoraan kolonnin läpi. Läpi tuleva ulosvirtaus yhdistetään ja panostetaan uudelleen hydrofobiseen vuorovaikutuskolonniin (fenyyli-Sepharose). Ksylanaasi 1 ja ksylanaasi 2 erottuvat toisistaan, kun kolonnia eluoidaan suurenevilla etyleeniglykoli-10 pitoisuuksilla. Ksylanaasi 4 sitoutuu anioninvaihtokolon-niin ja eluoituu suolagradientissa muiden sitoutuneiden ksylanaasien (ksylanaasien 3 ja 5) kanssa. Ksylanaasi 4 erotettiin muista ksylanaaseista HlCrllä (katso esimerkki 4 lisäyksityiskohtia varten). Puhdistettuja ksylanaaseja 15 1, 2 ja 4 analysoitiin edelleen isoelektrisellä fokusoin nilla ja massaspektrofotometrialla (MS) tai natriumdode-kyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla(SDS-PAGE).

Toisessa menetelmässä edellä kuvatulle soluvapaal-20 le kokoviljelmälihaliemelle suoritettiin HIC ensimmäisenä vaiheena ksylanaasin 3 (pl 6,2) ja ksylanaasin 5 (pl 5,3) puhdistamiseksi. Molemmat ksylanaasit eluoitulvat yhdessä samalla ammoniumsulfaatin pitoisuudella. Ksylanaasin 3 ja ksylanaasin 5 erottamiseksi toisistaan yhdistetylle eluoi-25 tuneelle aktiivientsyymiaineelle suoritettiin IEC. Ksylanaasi 3 eluoituu anioninvaihtokolonnista pienemmällä suolapitoisuudella kuin ksylanaasi 5. Molempia puhdistettuja ksylanaaseja karakterisoitiin edelleen isoelektrisellä fokusoinnilla ja MS:llä tai SDS-PAGE:11a.

30 Kukin ksylanaasi on erotettu toisesta sen ainutlaa tuisten biokemiallisten ominaisuuksien avulla, esim. moolimassan, pl:n, optimilämpötilan ja -pH:n, hydrofobisten ominaisuuksien ja lämpötilastabiilisuuden avulla. Kaikki viisi ksylanaasia voivat sietää korkeita lämpötiloja 35 (vaihtelevat 70 °C:sta 90 °C:seen) ja aikalisiä olosuh- 9 teitä (vaihtelevat noin pH:sta 7,0 10,0:een). Viidellä puhdistetulla ksylanaasilla on 80 °C:ssa puoliintumisaika, joka on välillä 35 minuuttia - 110 minuuttia (kuvio 3) . Kunkin viidestä homogeeniseksi puhdistetusta ksylanaasista 5 jatkokarakterisointi on kuvattu esimerkissä 5.

Toisessa toteutusmuodossa tämän keksinnön mukaisella ksylanaasilla on käyttöä massan delignifikaation ja/tai valkaisun lisäämisessä. Prosessi käsittää massan saattamisen kosketukseen keksinnön mukaisen ksylanaasin ja mahdol-10 lisesti yhden tai useamman muun edellä kuvatun puhdistetun ksylanaasin kanssa ja se riippuu sellaisista tekijöistä kuin pH, lämpötila, käsittelyaika, entsyymin annostus ja massan määrä ja tyyppi.

On edullista, että edellä esitetty prosessi toteu-15 tetaan lämpötilassa ja pH:ssa, jotka lisäävät entsymaattista aktiivisuutta. Lämpötilat voivat vaihdella suunnilleen 50 °C:sta 90 °C:seen alueen 70 - 85 °C ollessa edullinen. Edullinen pH prosessille on välillä noin 6 - 10, edullisesti noin 7 - noin 9, edullisimmin yli 7 - noin 9. 20 Tämän keksinnön mukaisille puhdistetuille ksylanaaseille on tunnusomaista, että ne ovat aktiivisia laajalla alkali-sella pH-alueella ja että niillä on korkea aktiivisuus edullisella pH-alueella noin 7 - noin 9.

Edullinen käsittelyaika käytettäessä tämän keksin-25 nön mukaista puhdistettua ksylanaasia on noin 30 minuuttia - noin 4 tuntia esimerkiksi sellaisten tekijöiden, kuin haluttujen tuloksien käsiteltävän massan määrän ja laadun ja entsyymin pitoisuuden mukaan.

Sopiva entsyymiannostus on noin 0,10 - 200 yksik-30 köä/g kuivaa massaa, edullisemmin 0,50 - 50 yksikköä/g.

Entsyymivalmisteiden ksylanaasiaktiivisuus määritetään seuraavasti: 1,8 ml:aan ksylaaniliuosta (0,6 %, Sigma nro X-0627, valmistettu 0,05 m natriumasetaattipuskuriin ja säädetty pH-arvoon 5,3 etikkahapolla) lisätään 0,200 ml 35 sopivasti laimennettua entsyymiä samassa puskurissa. Liu- 10 osta inkuboidaan 40 °C:ssa tasan 30 minuuttia. Sen jälkeen reaktio pysäytetään lisäämällä 3 ml DNS-reagenssia (3,5-dinitrosalisylaattia 10 g/1; Na,K-tartraattia 300 g/1), ja väri kehitetään keittämällä näytettä 5 mi-5 nuuttia. Sitten mitataan absorbanssi aallonpituudella 540 nm. Yksi entsyymiyksikkö vapauttaa yhden mikromoolin pelkistäviä sokereita laskettuna ksyloosina minuutissa analyysiolosuhteissa. Aktiivisuus lasketaan entsyymilai-mennoksesta, joka vapauttaa 4 mikromoolia pelkistävää so-10 keriä analyysiolosuhteissa.

Tätä keksintöä voidaan käyttää parantamiseen tai edesauttamiseen parannettaessa mitä tahansa useista erilaisista prosessoiduista massoista, so. massoista, jotka on jo aikaisemmin käsitelty millä tahansa eri tavalla 15 niiden ligniinipitoisuuden pienentämiseksi ja joita käsitellään keksinnön mukaisessa prosessissa ligniinin poistumisen edelleen lisäämiseksi kemiallisilla menetelmillä. Tätä keksintöä voidaan käyttää lehtipuun ja havupuun sul-faattimassojen käsittelyyn massojen ligniinin poistamisen 20 ja kirkastumisen lisäämiseen. Keksintö on erityisen käyttökelpoinen kemiallisille massoille, so. massoille, joissa ligniinikomponenttia on kemiallisesti modifioitu erilaisilla kemiallisilla käsittelyillä, kuten sulfaatti-(kraft-) menetelmissä ja happidelignifikaatiossa, ja sitä 25 käytetään edullisesti sulfaattimassoille. Edullisessa menetelmässä tämän keksinnön mukaisia entsyymejä käytetään massaan sulfaattikeiton tai happilignifikaation jälkeen mutta ennen valkaisua. Siinä tapauksessa, että samalle massalle suoritetaan sekä sulfaattikeitto että happidelig-30 nifikaatio, entsyymiä käytetään sulfaattikeiton jälkeen ennen happidelignifikaatiota tai happidelignifikaation jälkeen. Tämä keksintö on käyttökelpoinen myös otsonival-kaistuille massoille.

Saatua massaa käsitellään vapautuvan ligniinikom-35 ponentin poistamiseksi käyttäen sopivaa uuttoainetta.

11

Toisessa toteutusmuodossa massaa, joka on käsitelty tämän keksinnön mukaisilla entsyymeillä, voidaan seuraavaksi käsitellä ligniiniä hajottavilla kemikaaleilla, kuten kloorilla, klooridioksidilla ja peroksidilla, ja edelleen 5 uuttaa sopivalla uuttoaineella. Vielä eräässä toteutus- muodossa entsyymikäsiteltyä massaa voidaan käsitellä sopivalla uuttoaineella, minkä jälkeen suoritetaan ligniinin hajotus ja loppukäsittely sopivalla uuttoaineella. Tällaiset uuttoaineet oleellisesti solubilisoivat vahin-10 goittuneen ligniinikomponentin, ja sopivia uuttoaineita ovat näihin kuitenkaan rajoittumatta emäkset, kuten alka-limetallihydroksidit (E) , DMF, dioksaani, asetoni ja alkoholi. Hydroksidiuutot voidaan yhdistää vetyperoksidin (Ep) tai hapen (E0) kanssa. Saatua massaa voidaan sitten 15 edelleen valkaista kemiallisella valkaisusarjalla, kuten klooridioksidilla (DED) tai peroksidilla (P-P), halutun kirkkaaksi, jolloin todetaan oleelliset säästöt kemikaaleissa verrattuna massaan, joka on valkaistu yhtä kirkkaaksi samalla sarjalla mutta käyttämättä entsyymikäsitte-20 lyä. Klooripitoisten kemikaalien tai peroksidin pelkistys aikaansaadaan tällä tavalla. Lisäksi toteutettaessa tätä keksintöä edellä esitetyillä entsyymeillä massalle voidaan käyttää samaa määrää valkaisukemikaaleja ja kuitenkin saavuttaa suurempi kirkkaus käsitellyssä massassa.

25 Eräässä toteutusmuodossa Microtetraspora ssp.:stä saatujen edellä kuvattujen puhdistettujen entsyymien tai kokoksylanaasisupernatantin lisäkäyttösovellutuksia erilaisissa teollisissa puitteissa. Erityisesti Microtetraspora ssp.:n tuottamia ja edellä kuvattuja puhdis-30 tettuja ksylanaaseja tai kokoksylanaasisupernatanttia voidaan käyttää (1) maatalousjätteiden entsymaattiseen hajottamiseen alkoholipolttoaineiden ja muiden tärkeiden teollisuuskemikaalien tuottamista varten tai (2) eläinrehujen tai rehukomponenttien entsymaattiseen modifi- 12 oimiseen, tai niitä voidaan lisätä eläinrehuihin hemisel-luloosafraktion in vivo -hajottamiseksi.

Tämän keksinnön ja sen etujen valaisemiseksi edelleen esitetään seuraavat spesifiset esimerkit, jolloin 5 ymmärretään, että näiden tarkoitetaan olevan ainoastaan valaisevia eikä rajoittavia.

Esimerkki 1

Hapella delignifioidun havupuusulfaattimassan ent-syymikäsittely ennen D-E-D-valkaisua 10 Hapella delignifioitua havupuusulfaattimassaa, jon ka kappa-luku oli 16,4, käsiteltiin kokosupernatanttiksy-lanaaseilla, jotka oli johdettu Mlcrotetraspora flexuosas-ta, seuraavissa olosuhteissa:

Entsyymiannostus 5 DNS U/g massan kuiva-ainetta 15 pH 7,5, 8, 9 tai 10

Lämpötila 70 °C, 80 °C tai 90 °C

Reaktioaika 2 tuntia

Massan konsistenssi 10 % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Ennen entsyymiliuoksen lisäämistä massaseokseen 2 massan pH säädettiin haluttuun arvoon rikkihapolla ja mas- 3 saseosta esikuumennettiin mikroaaltouunissa vaaditun reak- 4 tiolämpötilan saavuttamiseksi. Massaseoksen pH:n säätämi 5 sen ja esikuumennuksen jälkeen entsyymi sekoitettiin pe- 6 rusteellisesti massaseokseen ja pidettiin 2 tuntia vesi- 7 hauteessa halutussa lämpötilassa.

8

Entsyymikäsittelyn jälkeen massaseos suodatettiin 9

Buchner-suppilossa ja massa pestiin vedellä.

10

Vertailumassoja käsiteltiin kussakin pH/lämpötila- 11 yhdistelmässä, kuten edellä on kuvattu, lisäämättä yhtään entsyymiä.

Kemiallinen valkaisu

Entsyymi- tai vertailukäsittelyn jälkeen massa-näytteet valkaistiin kemiallisesti käyttäen valkaisusar- 13 jaa D-E-D. Molemmissa D-vaiheissa (klooridioksidi) käytettiin 100 % klooridioksidia.

Reaktio-olosuhteet kemiallisessa valkaisussa olivat seuraavanlaiset: 5

Taulukko 1

Valkaisuvaihe Reagenssi, % Reaktio-olosuhteet massan kuiva- T, °C t, min Kons., % ainetta 10 D 2,6 (akt. Cl2) 55 45 3 E 1,5 (NaOH) 60 90 10 D 2,0 (akt. Cl2) 70 180 10

Kemiallisen valkaisun jälkeen massanäytteet teh-15 tiin happamiksi S02-vedellä pH-arvoon 3,5 huoneenlämpötilassa.

Valkaistuista massoista analysoitiin kirkkaus (ISO) SCAN-C11:57:n mukaisesti. Delignifikaatio mitattiin kappa-luvun muutoksena emäksisen uuttovaiheen jälkeen. Pienempi 20 kappa-luku on toivottava, koska se osoittaa, että massassa on läsnä pienempi määrä ligniiniä.

Kappa-luku on kosteutta sisältämättömän yhden mas-sagramman kuluttama 0,1 N kaliumpermanganaattiliuoksen tilavuus (millilitroina) tässä esimerkissä esitetyissä 25 olosuhteissa. Tulokset on korjattu lisätyn permanganaatin 50-%:iseksi kulutukseksi. Käytettiin seuraavaa standardi-menetelmää: TAPPI Test methods (Tappi, Atlanta, GA), Voi. 1, 1988 "Kappa number of pulp - T236 cm85"). Tulokset on esitetty taulukossa 2.

14

Taulukko 2

Massa Entsyymi/vertailu- Lopullinen Kappa-luku

käsittely kirkkaus vaiheen E

pH T, °C %, ISO jälkeen 5 Vert. 7,5 50 74,4 7,2 7.5 70 74,3 7,2 7.5 80 74,5 7,1 7.5 90 74,4 7,2 8 70 74,4 7,2 10 9 70 74,3 7,2 10 70 74,3 7,2

Entsyy- 7,5 70 79,2 5,2 mikäsi- telty 15 7,5 80 76,0 6,5 7.5 90 74,7 7,1 8 70 77,9 5,6 9 70 76,0 6,5 10 70 75,2 6,8 20

Taulukossa 2 edellä kuvatut tulokset osoittavat, että vertailumassan kirkkausasteella 74,4 % lopullisen massan kirkkaudessa saavutetaan 4,9 %:n yksikkölisäys entsyymikäsittelyllä pH:ssa 7,5 ja 70 °C:n lämpötilassa 25 ennen kemiallista valkaisua.

Lisäksi niinkin korkeissa lämpötiloissa kuin 80 °C ja alkalisessa pH:ssa 7,5 hapella delignifioiduissa havu-puunäytteissä, jotka on käsitelty Microtetraspora flexu-osasta saaduilla kokosupernatanttiksylanaaseilla, on vielä 30 merkittävä lisäys lopullisen massan kirkkaudessa vertailu-massaan verrattuna. Äärimmäisissäkin lämpötiloissa (90 °C) ja aikalisissä olosuhteissa (pH 7,5) kokosupernatanttiksy-lanaasit pysyvät aktiivisina ja käsitellyssä massassa todetaan 0,4 %:n lisäys ISO-yksiköissä vertailumassaan ver-35 rattuna.

15

Erittäin aikalisissä olosuhteissa, so. pH:ssa 9,0, 70 °C:ssa saavutetaan merkittävä massan kirkastuminen vertailumassaan verrattuna. Lisäksi äärimmäisen aikalisissä olosuhteissa, so. pH:ssa 10, 70 °C:ssa kokosuperna-5 tanttiksylanaasit ovat edelleen aktiivisia ja massassa todetaan 0,9 %:n lisäys ISO-yksiköissä vertailumassaan verrattuna.

Kuten kappa-luvuista voidaan nähdä, uuttovaiheen delignifikaatiota voidaan merkittävästi lisätä entsyymi-10 käsittelyllä jopa aikalisissä pH-olosuhteissa ja korkeissa lämpötiloissa.

Esimerkki 2

Hapella delignifioidun havupuusulfaattimassan ent-syymikäsittely ennen peroksidivalkaisua 15 Hapella delignifioitua havupuusulfaattimassaa, jon ka kappa-luku oli 15,7, käsiteltiin kokosupernatanttiksy-lanaasientsyymillä, joka oli johdettu Microtetraspora flexuosasta, seuraavissa olosuhteissa:

Entsyymiannostus 10 DNS U/g massan kuiva-ainetta 20 pH 7

Lämpötila 50 °C, 60 °C, 70 °C tai 80 °C

Reaktioaika 2 tuntia

Massan konsistenssi 10 % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Ennen entsyymiliuoksen lisäämistä massaseokseen 2 massan pH säädettiin haluttuun arvoon rikkihapolla ja mas- 3 saseosta esikuumennettiin mikroaaltouunissa vaaditun reak- 4 tiolämpötilan saavuttamiseksi. Massaseoksen pH:n säätämi 5 sen ja esikuumennuksen jälkeen entsyymi sekoitettiin pe- 6 rusteellisesti massaseokseen ja pidettiin 2 tuntia vesi- 7 hauteessa halutussa lämpötilassa.

8

Entsyymikäsittelyn jälkeen massaseos suodatettiin 9

Buchner-suppilossa ja massa pestiin vedellä. Vertailumas- 10 soja käsiteltiin kussakin pH/lämpötilayhdistelmässä, ku- 11 ten edellä on kuvattu, lisäämättä yhtään entsyymiä.

16

Kemiallinen valkaisu

Entsyymi- tai vertailukäsittelyn jälkeen massa-näytteet käsiteltiin EDTA:11a massan peroksidivalkaisussa haitallisten metalli-ionien kelatoimiseksi ja poistami-5 seksi.

Reaktio-olosuhteet kelatointivaiheessa olivat seuraavanlaiset : EDTA 0,2 % massan kuiva-ainetta

Lämpötila 85 °C

10 pH 4

Massan konsistenssi 3 %

Kelatointivaiheen jälkeen massat valkaistiin kemiallisesti käyttäen sarjaa P-P. Kemiallisessa valkaisussa käytetyt reaktio-olosuhteet on esitetty seuraavassa tau-15 lukossa.

Taulukko 3

Valkaisu- Reagenssi % massan Reaktio-olosuhteet vaihe kuiva-ai- T, °C t, h Kons., % 20 neesta P1 H202 3,5 (H202) 85 4 10 pH lopussa 10.5 - 11 P2 H202 1,5 (H202) 85 4 10 25 pH lopussa 10.5 - 11

Kemiallisen valkaisun jälkeen massanäytteet tehtiin happamiksi S02-vedellä pH-arvoon 3,5 huoneenlämpöti-30 lassa.

Valkaistuista massoista analysoitiin kirkkaus (ISO) SCAN-C11:57:n mukaisesti. Delignifikaatio mitattiin kappa-luvun muutoksena P2-vaiheen jälkeen. Tulokset on esitetty taulukossa 4.

17

Taulukko 4

Massa Entsyymi/vertailu- Lopullinen Kappa-luku käsittely kirkkaus vaiheen P2 pH T, °C %, ISO jälkeen 5 Vert. 7 50 76,1 2,9 7 60 76,0 2,9 7 70 76,0 2,9 7 80 75,9 2,9

Entsyy- 7 50 76,9 2,7 10 mikäsi- telty 7 60 77,2 2,7 7 70 78,4 2,6 7 80 76,3 2,8 15

Taulukko havainnollistaa sitä, että lopullisen massan kirkkaudessa saavutetaan merkittävä lisäys perok-sidivalkaisun jälkeen, kun massaa käsitellään Microtetra-spora flexuosasta saaduilla kokosupernatanttiksylanaaseil-20 la 70 °C:ssa ja pH:ssa 7, ennen kemiallista valkaisua, vertailumassaan verrattuna. Niinkin korkeissa lämpötiloissa kuin 80 °C kokosupernatanttiksylanaasit pysyvät aktiivisina ja käsitellyssä massassa todetaan 0,4 %:n lisäys ISO-yksiköissä vertailumassaan verrattuna.

25 Kappa-lukujen mukaan entsyymikäsittely selvästi lisää delignifikaatiota.

Esimerkki 3

Hapella delignifioidun lehtipuu-kraft-massan entsyymikäsittely ennen D-E-D-valkaisua 30 Hapella delignifioitua lehtipuu-kraft-massaa, jonka kappa-luku oli 10,9, käsiteltiin puhdistetulla ksylanaa-silla 1 tai ksylanaasilla 2, jotka oli johdettu Microtet-raspora flexuosasta, seuraavissa olosuhteissa: 18

Entsyymiannostus 3 DNS U/g massan kuiva-ainetta pH 5, 7 tai 8

Lämpötila 70 °C tai 90 °C

Reaktioaika 2 tuntia 5 Massan konsistenssi 10 %

Ennen entsyymiliuoksen lisäämistä massaseokseen massan pH säädettiin haluttuun arvoon rikkihapolla ja mas-saseosta esikuumennettiin mikroaaltouunissa vaaditun reak-tiolämpötilan saavuttamiseksi. Massaseoksen pH:n säätämi-10 sen ja esikuumennuksen jälkeen entsyymi sekoitettiin perusteellisesti massaseokseen ja pidettiin 2 tuntia vesi-hauteessa halutussa lämpötilassa.

Entsyymikäsittelyn jälkeen massaseos suodatettiin Buchner-suppilossa ja massa pestiin vedellä. Vertailumas-15 so ja käsiteltiin kussakin pH/lämpötilayhdistelmässä, ku ten edellä on kuvattu, lisäämättä yhtään entsyymiä. Kemiallinen valkaisu

Entsyymi- tai vertailukäsittelyn jälkeen massa-näytteet valkaistiin kemiallisesti käyttäen valkaisusar- 20 jaa D-E-D. Molemmissa D-vaiheissa (klooridioksidi) käy tettiin 100 % klooridioksidia.

Kemiallisessa valkaisussa käytetyt reaktio-olosuhteet olivat seuraavanlaiset: 25 Taulukko 5

Valkaisuvaihe Reagenssi, % Reaktio-olosuhteet massan kuiva- T, °C t, min Kons., % ainetta D 2,3 (akt. Cl2) 45 120 10 30 E 1,2 (NaOH) 70 140 10 D 1,0 (akt. Cl2) 70 220 10

Kemiallisen valkaisun jälkeen massanäytteet tehtiin happamiksi S02-vedellä pH-arvoon 3,5 huoneenlämpöti-35 lassa.

19

Valkaistuista massoista analysoitiin kirkkaus (ISO) SCAN-Cll:57:n mukaisesti. Delignifikaatio mitattiin kappa-luvun muutoksena vaiheen E jälkeen. Tulokset on esitetty taulukossa 6.

5

Taulukko 6

Massa Entsyymi/vertailu- Lopullinen Kappa-luku

käsittely kirkkaus vaiheen E

pH T, °C %, ISO jälkeen 10 Vert. 5 90 83,0 3,6 7 70 83,0 3,6 8 90 83,3 3,5

Ksyla- 5 90 83,4 3,5 naasi 1 15 7 70 85,1 2,8 8 90 83,5 3,4

Ksyla- 5 90 83,6 3,4 naasi 2 7 70 84,8 2,9 20 8 90 83,6 3,4

Taulukon 6 tulokset osoittavat, että lopullisen massan kirkkaudessa D-E-D-valkaisun jälkeen saavutetaan merkittävä lisäys käsittelemällä massaa Mlcrotetraspora 25 flexuosasta saadulla puhdistetulla ksylanaasilla 1 tai ksylanaasilla 2 70 °C:n lämpötilassa pH:ssa 7 ennen kemiallista valkaisua. Niinkin korkeissa lämpötiloissa kuin 90 °C ja alkalisessa pHrssa (pH 8,0) ksylanaasi 2 pysyy aktiivisena ISO-lisäyksen ollessa 0,3 % vertailumassaan 30 verrattuna.

Reaktio-olosuhteissa pH 7 / 70 °C entsyymikäsitte-ly selvästi lisää vaiheen E delignifikaatiota. Äärimmäi-sissäkin olosuhteissa, pH 8 / 90 °C, entsyymikäsittelyllä voidaan aikaansaada kappa-luvun pieneneminen vaiheen E 35 jälkeen.

20

Esimerkki 4

Microtetraspora flexuosan tuottamien viiden ksyla-naasin puhdistus

Ksylanaasianalyysit 5 Ksylanaasin läsnäolo määritettiin käyttäen remazol brilliant blue -värjättyä koivupuuksylaani- (RBB-ksylaa-ni-) substraattia (Megazyme, Australia, on substraatin kaupallinen toimittaja). 200 μΐ näytteitä sekoitetaan 250 μ1:η kanssa substraattiliuosta (2 % [paino/tilavuus] 10 RBB-ksylaania 50 mM natriumsitraatissa, pH 6,5) ja inku-boidaan 37 °C:ssa 10 minuuttia. Hajoamaton ksylaani seostetaan lisäämällä 1 ml 95-%:ista etanolia ja poistetaan sentrifugoimalla. Liuokseen jääneen vapautuneen väriaineen määrä määritetään spektrofotometrialla (OD590) sokeakokeena 15 käytettävää etanolia vastaan ja se on verrannollinen ksy-lanaasiaktiivisuuteen. Aktiivisuus voidaan määrittää käyttäen standardikäyrää, ja se ilmoitetaan yksikkönä XAU/ml (ksylanaasiaktiivisuusyksikköä millilitraa kohti).

Geelipäällystysmenetelmä monien ksylanaasien läs-20 näolon toteamiseksi ja niiden isoelektristen pisteiden (pl) määrittämiseksi kehitettiin myös RBB-ksylaanisubst-raattia käyttäen. Isoelektriset fokusointigeelit (IEF-geelit) (pH-gradientti 3 - 9) päällystetään sulatetun agaroosin / substraatin suspensiolla (4 % [paino/tilavuus] 25 agaroosia, 7 mg/ml RBB-ksylaania, 0,5 % [tilavuus/tila-vuus] glyserolia 50 mM natriumsitraatissa, pH 6,5) ja in-kuboidaan 37 °C:ssa. Noin 1 tunnin kuluttua ksylanaasiak-tiivisuus ilmenee kirkastuvina alueina. Geelien annetaan kuivua täysin ja ne voidaan varastoida. Ksylanaasi-pl mää-30 ritetään vertaamalla hopeavärjättyjä pl-standardeja sisältävien samalla tavalla ajettujen IEF-geelien kanssa.

Näyte

Microtetraspora flexuosa ATCC 35864 -fermentointi-lihaliemi (n. 14 XAU/ml) väkevöitiin 5-kertaiseksi käyt-35 täen ultrasuodatusta (Amicon stir-cell, 350 ml, PM-10- 21 membraanl). Kaikki näytteet suodatussteriloitiin. Proteiinipitoisuus oli 12,5 mg/ml BCA-menetelmän mukaan (Pierce). Geelipäällystysanalyysillä määritettiin viiden ksy-lanaasin, pl 8,5, 7,5, 6,2, 5,8 ja 5,3, läsnäolo. Näihin 5 viiteen ksylanaasiin viitataan kaikkialla tässä selityk-sesessä vastaavasti ksylanaaseina 1-5.

Puhdi stusmenetelmät

Kaikkien viiden ksylanaasin puhdistamiseen käytettiin ioninvaihtokromatografian (IEC) ja hydrofobisen vuo-10 rovaikutuskromatografian (IEC ja vastaavasti HIC) yhdistelmää seuraavasti:

Ksylanaasien 1 ja 2 puhdistus

Ensimmäisessä vaiheessa käytettiin lEC:ä ksylanaasien 1 ja 2 puhdistamiseen. Väkevöity näyte dialysoitiin 15 täydellisesti 10 mM tris-HCl:a vastaan, pH 9,0 (puskuri A). 50 ml pantiin tavanomaiseen kromatografiakolonniin (Pharmacia C 16/30), joka oli täytetty 72 ml:11a Q-Sepha-rose HP:tä (Pharmacia), joka oli tasapainotettu puskurilla A nopeudella 1 ml/min käyttäen Pharmacia FPLC -systee-20 miä. Kolonni pestiin 50 ml:11a puskuria A, sitten eluoi-tiin 400 ml:11a lineaarisesti kasvavaa suolagradienttia, puskurista A 0,25 M NaCl:iin puskurissa A. Kolonni pestiin jäljelle jääneestä sitoutuneesta proteiinista 2 M NaCl:lla puskurissa A. Kerättiin 10 ml:n fraktioita ja ne 25 analysoitiin, kuten aikaisemmin on kuvattu.

Ksylanaasit 1 ja 2 eluoituivat yhdessä kolonnista läpi alkuvirtauksen kanssa, kun taas suurin osa jäljelle jääneestä proteiinista sitoutui kolonniin. (Ksylanaasit 1 ja 2 edustavat sitoutumattomia kolonnifraktioita.) 30 Hydrofobista vuorovaikutuskromatografiaa (HIC) käytettiin toisena vaiheena ksylanaasien 1 ja 2 puhdistamiseen ja eristämiseen. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja saatettiin 0,2 M:n lopulliseen ammoniumsulfaattipitoi-suuteen lisäämällä 2 M ammoniumsulfaattia. Lisättiin 50 mM 35 natriumsitraattia, pH 6,5, 10 mM:n lopulliseen pitoisuu- 22 teen ja aine (n. 100 ml) pantiin tavanomaiseen kromato-grafiakolonniin (Pharmacia C 16/20), joka oli täytetty 36 ml:11a Phenyl Sepharose Cl-4B:tä (Pharmacia), joka oli tasapainotettu 0,2 M ammoniumsulfaatilla - 10 mM natrium-5 sitraatilla, pH 6,5 (puskuri B), nopeudella 0,5 ml/min. Kolonnin pestiin 60 ml:11a puskuria B, sitten eluoitiin vähentäen asteittain suolapitoisuutta 10 mM:ksi natrium-sitraatiksi, pH 6,5 (puskuri C), 70 ml:n aikana, vähentäen asteittain 10-%:iseksi (tilavuus/tilavuus) etyleenigly-10 koliksi (EG) puskurissa C 50 ml: n aikana, käyttämällä 200 ml lineraaligradienttia 10 - 32 % EG:tä, pesten 32-%:isessa EG:ssä 80 ml:n aikana, käyttämällä 150 ml gra-dienttia 32 - 38 % EG:tä ja lopuksi lisäämällä asteittain 50-%:iseksi EG:ksi 70 ml:n aikana kolonnin pesemiseksi 15 täydellisesti. Kerättiin 10 ml:n fraktioita ja ne analysoitiin kuten edellä. Näissä olosuhteissa homogeeninen ksylanaasi 2 eluoituu 32-%:isella EG-pesuliuoksella, kun taas homogeeninen ksylanaasi 1 eluoituu 32 - 38-%:isen EG-gradientin hännän päähän.

20 Ksylanaasin 4 puhdistus Käyttämällä edellä kuvattua ensimmäistä vaihetta (IEC) ksylanaasien 1 ja 2 puhdistukseen ksylanaasit 4 ja 5 eluoituvat yhdessä n. 0,16 M NaCl:lla puskurissa A. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja tehtiin 0,4 M ammoniumsul-25 faatiksi - 10 mM natriumsitraatiksi, pH 6,5 (puskuri D), kuten edellä. Aine, n. 100 ml, vietiin nopeudella 1 ml/min edellä kuvattuun HIC-kolonniin, joka oli tasapainotettu puskurilla D. Kolonni pestiin 50 ml:11a puskuria D, eluoitiin 130 ml:11a lineaarigradienttia puskurista D puskuriin 30 C ja heti sen jälkeen 200 ml:11a lineaarigradienttia puskurista C 50-%:iseksi EG:ksi. Kerättiin 10 ml:n fraktioita ja ne analysoitiin kuten edellä. Ksylanaasi 4 eluoituu n. 20-%:isessa EG:ssä.

23

Ksylanaasien 3 ja 5 puhdistus

Ksylanaasien 3 ja 5 tapauksessa HIC:ä käytettiin ensimmäisenä vaiheena. Väkevöity näyte tehtiin 0,5 M am-moniumsulfaatiksi puskurissa C lisäämällä 2 M ammonium-5 sulfaattia ja 50 mM natriumsitraattia, pH 6,5 (kuten edellä). Aine suodatettiin mahdollisten pienten sakkamää-rien poistamiseksi ja 50 ml:n tilavuus vietiin nopeudella 1 ml/min edellä kuvattuun HIC-kolonniin, joka oli tasapainotettu 0,5 M ammoniumsulfaatilla puskurissa C (pusku-10 ri E). Seuraavaksi kolonni pestiin 87,5 ml:11a puskuria E, sitten eluoitiin 147 ml:11a lineaarigradienttia puskurista E puskuriin C. Kerättiin 10 ml:n fraktioita ja ne analysoitiin kuten edellä. Ksylanaasit 3 ja 5 eluoituivat yhdessä n. 0,05 ammoniumsulfaatilla.

15 Ksylanaasien 3 ja 5 erottamiseen ja puhdistamiseen käytettiin IEC:ä. Aktiiviset HIC-fraktiot yhdistettiin (70 ml), dialysoitiin täydellisesti 10 mM tris-HCl:a vastaan, pH 8,0 (puskuri F), ja väkevöitiin n. 20 ml:ksi edellä esitetyllä menetelmällä. Aine vietiin nopeudella 20 1 ml/min edellä kuvattuun IEC-kolonniin, joka oli tasapai

notettu puskurilla F. Kolonni pestiin 150 ml:11a puskuria F ja eluoitiin 150 ml:11a lineaarigradienttia puskurista F 0,25 M NaCl:iin puskurissa F. Kerättiin 10 ml:n fraktioita ja ne analysoitiin kuten edellä. Ksylanaasi 3 eluoitui n. 25 0,05 M NaCl:lla, kun taas ksylanaasi 5 eluoitui n. 0,15 M

NaCl:11a.

Esimerkki 5

Microtetraspora flexuosan tuottamien viiden ksyla-naasin karakterisointi 30 Puhdistuksen jälkeen kullekin ksylanaasille suori tettiin isoelektrinen fokusointi ja moolimassan määritys seuraavien menetelmien mukaisesti. Ksylanaasien biokemiallisen karakterisoinnin tulokset on lueteltu taulukossa 7.

24

Isoelektrisen fokusoinnin menetelmät toteutettiin käyttäen PhastSystemiä (Pharmacia Biotech) valmistajan ohjeiden mukaisesti, pl-määritykseen käytetyt leimat olivat laajan pl:n kitti, pH 3,5 - 9,3 (Pharmacia Biotech).

5 Proteiinien visualisointi toteutettiin PhastSystem-kehi- tyshopeavärjäyksen avulla ohjeiden mukaisesti.

Moolimassan määritykset toteutettiin kahdella menetelmällä: natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigee-lielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja massaspektroskopialla 10 (MS). SDS-PAGE ja sitä seuraava visualisointi hopeavärjä- yksen avulla toteutettiin käyttäen Phast-systeemiä, kuten edellä. Käytetyt moolimassaleimat saatiin Sigma Chemical Co.:lta (St. Louis, MO). Massaspektroskopia suoritettiin Charles Evans ja Associatesin mukaan (301 Chesapeake Dri-15 ve, Redwood City, CA 94063).

Taulukko 7

Microtetraspora flexuosa

Ksylanaasit 20 Nro pl Moolimas- pH Lämpötila sa, (kD)- Optimi Stabii- Optimi Stabiili-menetelmä lisuus (°C) suus, puo liintumisaika 25 80°C:ssa (min) 1 8,5 33,1-MS 7,0-7,5 6-8,5 70 110 2 7,5 13,3-MS 7,0-7,5 6-8 65 45 3 6,2 31,0-SDS 7,5 6-9 65 30 30 4 5,8 50,0-SDS 7,5 6-9 65 90 5 5,3 35,0-SDS 7,5 6-9 70 30 pH-optimi määritetään käyttäen edellä kuvattua RBB-analyysiä, paitsi että puskurit vaihtelevat mitattujen pH-35 alueiden, so. pH 4,5 - 12,0, mukaan (katso kuvio 1). Alan ammattimies pystyy valmistamaan sopivan puskurin analyysin valittua pH:ta varten.

25 Lämpötilastabilisuus kuvaa ilmoitetussa lämpötilassa aikaa, jossa puolet aktiivisuudesta säilyy. Aktiivisuus mitataan suunnilleen 18 - 37 °C:ssa. Näytettä in-kuboidaan ilmoitetussa lämpötilassa ja aktiivisuus mita-5 taan käyttäen RBB-analyysiä. Puoliintumisaika on minuutteina annettu aika, jossa puolet aktiivisuudesta katoaa (katso kuvio 3).

Lämpötilaoptimi on lämpötila, jossa todetaan suurin aktiivisuus. Kuviossa 2 esitetään ksylanaasien 1-5 10 lämpötilaprofiili RBB-analyysiä käyttäen mitattuna. Molem missa kuvioissa 1 ja 2 maksimiaktiivisuuden prosentuaalinen osuus liittyy suurimman aktiivisuuden mittaukseen, jolle on annettu arvo 100 %, ja kaikki muut luvut on mitattu suhteessa tähän standardisointiin.

15 Kaikki tässä selityksessä mainitut julkaisut ja patenttihakemukset sisällytetään tähän viittauksella siltä osalta, kuin kukin yksittäinen julkaisu tai patenttihakemus erityisesti ja yksittäin mainittiin sisällytetyksi viitteellä. Keksinnön nyt ollessa täysin kuvattu alan am-20 mattimiehelle on ilmeistä, että siihen voidaan tehdä monia muutoksia ja modifikaatioita poikkeamatta oheisten patenttivaatimusten ajatuksesta tai piiristä.

Claims (3)

26

1. Ksylanaasi, joka on eristetty Microtetraspora-lajista, tunnettu siitä, että sillä biokemiallisesti 5 karakterisoidaan olevan moolimassa noin 33 100 daltonia, pl noin 8,5, optimi-pH noin 7,0 - noin 7,5, ja sillä on noin 70 °C:n optimilämpötila-aktiivisuus.

2. Menetelmä massan delignifikaation ja/tai valkaisun lisäämiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsit- 10 tää mainitun massan saattamisen kosketukseen patenttivaatimuksen 1 mukaisen puhdistetun ksylanaasin kanssa sellaisessa lämpötilassa, pH:ssa ja entsyymipitoisuudessa, että delignif ikaation ja/tai valkaisun lisäys toteutuu.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen ksylanaasin käyt-15 tö massan delignifikaation ja/tai valkaisun lisäämiseksi. 27