JPH09512709A

JPH09512709A - 熱安定性キシラナーゼ

Info

Publication number: JPH09512709A
Application number: JP7528323A
Authority: JP
Inventors: エイボディー，エリザベス; エイキューヴァス，ウイリアム; コリオネン，マーヤ
Original assignee: ジェネンコアインターナショナルインコーポレーテッド
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 1997-12-22
Also published as: EP0926234A2; ES2146756T3; DE69516133D1; WO1995029998A1; CA2188558A1; BR9507540A; NZ285406A; AU684026B2; NO964549L; NZ332345A; FI964283A; EP0926234A3; CA2188874C; AU681031B2; EP0758378A1; HU9602980D0; CN1147271A; DE69521534D1; JPH11501502A; FI121469B

Abstract

(57)【要約】本発明は、微生物Microtetraspora flexuosaから精製した新しいキシラナーゼに関するものである。各々生化学的に特有なキシラナーゼは、熱安定性であり、アルカリ性条件下で最適活性を有する。本発明はまた、Microtetraspora flexuosaから得られる全酵素系または１種類以上の上記精製熱安定性キシラナーゼのいずれかを利用する方法に関するものである。これらの酵素は、パルプの脱リグニンおよび漂白を向上させる優れた候補である。さらに、漂白前にパルプを上述した酵素で処理すると、漂白工程に必要とされる塩素含有化学晶および／または過酸化物含有化学品の量を減少させられる。

Description

【発明の詳細な説明】熱定性キシラナーゼ発明の属する技術分野本発明は、広いアルカリ性範囲と高温に亘り活性である新しいMicrotetraspor a flexuosa 熱安定性キシラナーゼ酵素およびMicrotetraspora flexuosa菌株から得られた熱安定性酵素を用いた方法に関するものである。アルカリ性熱安定性キシラナーゼには、紙パルプ業界に特別な用途がある。発明の背景木は、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニン並びに他の少量の成分からなる複合物質である。リグニンは、セルロースおよびヘミセルロースに関連し、おそらくセルロースとヘミセルロースの両方に共有結合している。紙製造工程において、リグニンは、茶色がかった色を与え、強度を低減させ、他の望ましくない特徴を完成製品に付与するので、一般的に紙パルプから除去されている。リグニンの除去は様々な方法で行なうことができる。大部分のリグニンは、化学的パルプ化（例えば、クラフト工程）により紙パルプから最初に除去される。これに続く漂白工程において、化学パルプを機械的に塩素および他の脱リグニン化学物質と反応させて、さらにリグニンを除去し、次いで、漂白剤と反応させて、パルプからのリグニンを変性し、安定な光沢パルプを提供する。しかしながら、塩素による処理は環境的な見地から望ましくない。なぜならば、発生した排水は、多くの毒性化合物（例えば、塩素化フェノール）を含んでいるからである。塩素含有化学物質でパルプを漂白することにより生じる環境に有害な影響が関心を集めているために、この業界で代わりの漂白方法を探し始めた。塩素化学物質の使用を抑えるかまたは使用せずに、菌類源または細菌源由来の酵素を使用して脱リグニンおよび漂白を向上させる試みが文献に記載されている。しかしながら、パルプに選択的に作用するが、パルプのセルロース内容物には悪影響を与えない酵素系はほとんど見付かっていない。キシラナーゼは、広葉樹および針葉樹のヘミセルロースの主要成分であるキシランの加水分解を触発する酵素であり、植物の細胞壁のセルロース成分およびリグニン成分に通常関連している。キシラナーゼは、パルプを予め漂白して、パルプからのリグニンの除去を促進させることによる木材パルプの脱リグニンを向上させる有用な酵素であることが証明されている。この作用が提唱された機構は、クラフトパルプ工程中に、調製液中にキシランが最初に可溶化されることである。キシラナーゼをパルプの予備漂白に用いる場合、これらの再沈殿したキシラン分画が部分的に加水分解するために、パルプの表面が、リグニンの除去にとってより透過性となる。したがって、キシラナーゼにより予備漂白した結果、酵素を用いない漂白と比較して、漂白化学物質の使用量が減少する。文献に最初に記載された酵素試料のほとんどは、50℃に達する最適温度において酸性ｐＨ範囲で活性である。産業用途に関して、特に、高温およびアルカリ性ｐＨで工程が行なわれるパルプ漂白産業において、高温において、現在入手できるものよりも広いｐＨ範囲、特にｐＨ７−10で活性であるキシラナーゼが得られれば、非常に好ましい。 Microtetraspora flexuosaから精製したキシラナーゼが、パルプの予備漂白において優れた候補となっている。なぜならば、そのようなキシラナーゼは、高温およびアルカリ性ｐＨで活性であり、リグニンが関連するか結合したパルプのヘミセルロース／セルロースマトリックスに作用して、酵素処理後にリグニンが放出されるおよび／または適切な抽出剤により放出可能となる。最近、菌類および細菌微生物からいくつかの高温キシラナーゼが確認された。例えば、高温キシラナーゼが、最適ｐＨが6.0−7.0であり、温度範囲が70℃から 80℃までであるMicrotetraspora として再分類されたAcrimoaduraから単離された（Holtz,C.等、Antonie van Leewenhoek 59:1-7,1991）。ヨーロッパ特許第04 73545号には、細菌株Thermomonospora fusca が、広いｐＨ範囲、すなわち、約５−10、より好ましくは、6.6−9.5の範囲に亘り、10℃−90℃、好ましくは、50 ℃−80℃の温度で活性である熱安定性キシラナーゼを産生することが開示されている。さらに、国際特許出願第92/18612号には、広いｐＨ範囲（5.0−9.0）に亘り活性を有し、60℃から90℃までの温度範囲で熱安定性であるDictyoglomus 属由来のキシラナーゼ酵素が開示されている。アルカリ性範囲において活性である熱安定性キシラナーゼが文献に記載されているけれども、現在入手できる従来の漂白剤およびキシラナーゼと比較して、脱ニグリンおよびパルプの漂白に関連する用途においてより効率的な新しいキシラナーゼを確認する必要性がある。さらに、出願人の本発明の時点において、アルカリ性範囲で最適なキシラナーゼ活性を有するMicrotetraspora flexuosaからのキシラナーゼが多数存在することが知られていなかった。発明の概要本発明により、高温およびアルカリ性条件に耐えられる、Microtetraspora fl exuosa 微生物からの５種類の新しいアルカリ性で熱安定性のキシラナーゼを単離した。このことは、パルプの漂白用途において特に意味のあることである。Micr otetraspora flexuosa 微生物の全培養ブロス（broth）上澄が、これらのキシラナーゼ混合物をパルプの漂白用途における優れた候補にする耐熱性で耐アルカリ性の特性を有することも分かった。これらの新しいキシラナーゼおよび全培養上澄キシラナーゼには、動物飼料および燃料の業界のような他の分野においても用途が見出だされるかもしれない。本発明のある実施の形態により、ここではキシラナーゼ１からキシラナーゼ５までと命名した、Microtetraspora flexuosaから単離した５種類の新しいキシラナーゼ酵素を、銀染色等電点電気泳動ゲルにより測定して、均一となるまで精製した。キシラナーゼは、イオン交換クロマトグラフィーと疎水相互作用クロマトグラフィーとの組合せにより精製した。各々精製したキシラナーゼは、広いｐＨ範囲に亘り熱安定性であると特徴付けられる。特に、各々のキシラナーゼは、６ −９のｐＨ範囲において、80％よりも高い活性を維持する。キシラナーゼはさらに以下のように特徴付けられる：キシラナーゼ１は、約33 ,100ダルトンの見かけの分子量、約8.5のｐＩ、約7.0−7.5の最適ｐＨを有し、約70℃で最適活性温度を有する。キシラナーゼ２は、約13,300ダルトンの見かけの分子量、約7.5のｐＩ、約7.0−7.5の最適ｐＨを有し、約65℃で最適活性温度を有する。キシラナーゼ３は、約31,000ダルトンの見かけの分子量、約6.2のｐＩ、約7.5の最適ｐＨを有し、約65℃で最適活性温度を有する。キシラナーゼ４は、約50,000ダルトンの見かけの分子量、約5.8のｐＩ、約7.5の最適ｐＨを有し、約65℃で最適活性温度を有する。キシラナーゼ５は、約35,000ダルトンの見かけの分子量、約5.3のｐＩ、約7.5の最適ｐＨを有し、約70℃で最適活性温度を有する。上述したMicrotetraspora flexuosaキシラナーゼを高温およびアルカリ性条件で様々なパルプに選択的に施し、それによって、脱リグニンを向上させ、リグニン含有量を減少させ、増白効果を向上させ、パルプのセルロース含有量を処理前の状態に維持する。したがって、本発明の第２の実施の形態により、上述した新しいキシラナーゼ酵素１種類以上を施して、消化後または酸素脱リグニン後の化学パルプを処理して、処理したパルプの脱リグニンを向上させおよび／または増白効果を向上させる。さらに別の形態において、本発明は、処理したパルプの脱リグニンおよび漂白効果を向上させるための、Microtetraspora flexuosa培養ブロス中で産生された天然粗製全上澄の適用を指向している。この点に関して、Microtetraspora flex uosa の全上澄は、Microtetraspora flexuosaにより産生された全てのキシラナーゼ、すなわち、キシラナーゼ１から５の混合物である。全キシラナーゼ上澄の特徴は以下のとおりである：キシラナーゼ活性は、７から９までの広いｐＨ最適条件、約70℃から約80℃までの温度最適条件（90℃で活性の40％が維持されている）、80℃における90分の半減期を有している。図面の簡単な説明第１図は、Microtetraspora flexuosaからの５種類の精製キシラナーゼの活性ｐＨグラフを示している。第２図は、Microtetraspora flexuosaからの５種類の精製キシラナーゼの活性温度グラフを示している。第３図は、Microtetraspora flexuosaからの５種類の精製キシラナーゼの温度安定性グラフを示している。発明の詳細な説明上述したように、本発明は概して、Microtetraspora flexuosa菌株から精製され単離された新しいキシラナーゼおよびこれら新しいキシラナーゼを使用する方法に関するものである。適切なｐＨ、温度、および使用量の条件で適用したときに、Microtetraspora flexuosaからのこれら独特のキシラナーゼは、パルプの品質に悪影響を与えることなく、パルプの脱リグニンおよび増白を向上させるのに特に効果的である。これらの新しいキシラナーゼは、動物飼料、およびアルコール燃料の製造に関する農業廃棄物への添加剤として、優れた候補となっている。本発明を詳細に説明する前に、以下の用語を最初に定義する。ここに用いているように、「キシラナーゼ数」は、Microtetraspora ssp 培養ブロスから単離した５種類の精製キシラナーゼのうちの１つを示すものである。５種類のキシラナーゼの各々に割り当てられた数は各々のキシラナーゼの等電点電気泳動（ｐＩ）値に対応し、最小数（１）は最大のアルカリ性ｐＩ値を示し、最大数（５）は最小のアルカリ性ｐＩ値を示す。「全上澄キシラナーゼ」は、細胞が遠心分離により事前に除去されたMicrotet raspora ssp の培養ブロスを示す。したがって、全キシラナーゼ上澄は、上述したように、キシラナーゼ１から５までの混合物を含有する。「漂白」は、化学パルプの処理を意味し、これをパルプの脱リグニンおよび増白により実施してもよい。特に適したパルプは、一般的に約90％から約99％までのリグニンがすでに除去されており、化学変性リグニンを含む残留リグニンを実質的に除去するように処理される。本発明によると、Microtetraspora flexuosaの培養中で産生された５種類の新しいキシラナーゼを、見かけ上均一となるまで単離して、生化学的に特徴付ける。本発明のキシラナーゼは、この業界で知られているいかなるMicrotetraspora ssp から由来していてもよい。好ましくは、キシラナーゼはMicrotetraspora fl exuosa から由来するものである。好ましい株は、メアリーランド州、ベセスダのアメリカンタイプカルチャーコレクションから容易に入手できるＡＴＣＣ35864 である。新しいキシラナーゼの単離には、精製するキシラナーゼに依存していずれかの順序の、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）および疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の組合せによる細胞外キシラナーゼの精製がある。５種類のキシラナーゼをMicrotetraspora から単離して、各々のキシラナーゼの等電点電気泳動点に対応して、１から５までの番号を付けた。キシラナーゼ１はアルカリ性が最も強く、キシラナーゼ５はアルカリ性が最も弱い。５種類の化学的に異なるキシラナーゼを単離して特徴付ける２種類の精製方法を以下詳細に記載する。Microtetraspora flexuosa細胞を、遠心分離により除去して、細胞ブロスを限外濾過を用いて濃縮する。第１の方法において、キシラナーゼ１（ｐＩ 8.5）、キシラナーゼ２（ｐＩ 7.5）、およびキシラナーゼ４（ｐＩ 5.8）を分離して精製する。細胞を含まない全培養ブロス試料を陰イオン交換カラムに通して、洗浄し、増加塩（ＮａＣｌ）傾斜により溶離する。分画を採集した後、レマゾールブリリアントブルー染色ブリッヒウッドキシランアッセイ（ＲＢＢ−キシランアッセイ）を用いて、キシラナーゼ活性を測定する。キシラナーゼ１およびキシラナーゼ２がカラムの破過体で溶離する。排水破過体を集積し、疎水相互作用カラム（フェニルセファロース）に再度充填する。このカラムを濃度の増加するエチレングリコールにより溶離することにより、キシラナーゼ１およびキシラナーゼ２を互いに分離する。キシラナーゼ４は陰イオン交換カラムに結合し、他の結合キシラナーゼ（キシラナーゼ３および５）による塩傾斜中に溶離する。キシラナーゼ４をＨＩＣ（以下詳細に記載する実施例４を参照のこと）により他のキシラナーゼから分離した。精製したキシラナーゼ１、２および４をさらに、等電点電気泳動および質量分析法（ＭＳ）またはドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドケル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。第２の方法において、上述した細胞を含まない全培養ブロスに最初の工程としてＨＩＣを行ない、キシラナーゼ３（ｐＩ 6.2）およびキシラナーゼ５（ｐＩ 5.3）を精製した。両方のキシラナーゼが、硫酸アンモニウムの同一の濃度で共に溶離する。キシラナーゼ３およびキシラナーゼ５を互いに分離するために、集積した溶離活性酵素材料にＩＥＣを行なった。キシラナーゼ３が、キシラナーゼ５よりも低い濃度で陰イオン交換カラムから溶離する。両方の精製キシラナーゼをさらに、等電点電気泳動およびＭＳまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付けた。各々のキシラナーゼは、各々の特有な生化学的特徴、例えば、分子量、ｐＩ、最適温度およびｐＨ、疎水性特性、並びに温度安定性により、互いに区別されている。５種類のキシラナーゼ全ては、高温（70℃から90℃までの範囲）およびアルカリ性条件（ｐＨ7.0からｐＨ10.0までの範囲）に耐えることができる。５種類の精製キシラナーゼは、80℃における35分から110分までの半減期を有している（第３図）。均一となるまで精製した５種類のキシラナーゼの各々の特徴付けを実施例５に記載する。別の実施の形態において、本発明のキシラナーゼには、パルプの漂白および／または脱リグニンを向上させる用途がある。この工程は、パルプを全上澄キシラナーゼ、または１種類以上の上述した精製キシラナーゼと接触させる工程を含み、ｐＨ、温度、処理時間、酵素の使用量およびパルプの品質並びに種類のような要因に依存する。上述した工程を、酵素活性を高める温度とｐＨで行なうことが好ましい。温度は約50℃から約90℃までの範囲であってよく、70−85℃が好ましい。工程の好ましいｐＨは、約６−10、好ましくは約７から約９まで、最も好ましくは７より大きく約９までの範囲に及ぶ。本発明の精製キシラナーゼは、広いアルカリ性ｐＨ範囲に亘り活性であるだけでなく、約７から約９までの好ましいｐＨ範囲で高い活性を有することが特徴的である。本発明の精製キシラナーゼを適用する好ましい処理期間は、例えば、望む結果、処理するパルプの量と品質、酵素の濃度のような要因に依存して、約30分から約４時間までである。適切な酵素使用量は、乾燥パルプ１ｇ当たり約0.10から200ユニットまで、より好ましくは、0.50から50ユニットまでである。酵素試料のキシラナーゼ活性を以下のように決定する：1.8ｍｌのキシラン溶液に（0.6％のシグマ番号Ｘ−0627 、0.05Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液中で調製され、酢酸によりｐＨ5.3に調節された）、同一の緩衝液中の0.200ｍｌの適した希釈酵素を加える。この溶液を正確に30分間に亘り40℃で保温する。次いで、３ｍｌのＤＮＳ試薬（３，５−ジニトロサリチレート 10ｇ／１；酒石酸Ｎａ，Ｋ 300ｇ／ｌ）を加えることにより、反応を停止させ、この試料を５分間に亘り沸騰させることにより色を呈させる。次いで、540 ｎｍの波長で吸光度を測定する。ある酵素単位が、アッセイ条件下で１分間当たりのキシロースで計算して、１マイクロモルの還元糖を遊離する。活性は、アッセイ条件下の還元糖４マイクロモルを遊離させる酵素希釈物から計算する。本発明を、高品質のパルプに適用しても、または加工した様々なパルプ、すなわち、様々な方法で事前に処理してリグニンの含有量が減少されており、本発明による工程で処理して、化学方法によりリグニンの除去がさらに向上したパルプの品質を向上させるのに用いてもよい。本発明を用いて硬木および軟木のクラフトパルプを処理してパルプの増白およびリグニンの除去を向上させてもよい。本発明は、化学パルプ、すなわち、硫酸塩（クラフト）工程におけるような様々な化学処理によりリグニン成分が化学的に変性されたパルプに特に適用され、好ましくはクラフトパルプに適用される。好ましい方法において、本発明の酵素は、クラフト消化または酸素脱リグニンの後であるが、漂白の前にパルプに適用されるものである。クラフト消化および酸素脱リグニンの両方の工程を同一のパルプに行なった場合、酵素は、クラフト消化の後であり、酸素脱リグニンの前または後に適用する。本発明はまた、オゾン漂白したパルプにも適用できる。得られたパルプを処理して、適切な抽出剤を用いて放出可能なリグニン成分を除去する。別の実施の形態において、本発明の酵素で処理したパルプを続いて、塩素、二酸化塩素および過酸化物のようなリグニン分解化学物質で処理して、さらに適切な抽出剤により抽出してもよい。さらに別の実施の形態において、酵素処理したパルプを適切な抽出剤で処理して、続いて、リグニン分解を行ない、最後に適切な抽出剤で処理してもよい。このような抽出剤は、影響を受けたリグニン成分を実質的に可溶性にし、適切な抽出剤の例としては、限定されるものではないが、アルカリ金属水酸化物（Ｅ）のような塩基、ＤＭＦ、ジオキサン、アセトン、およびアルコールが挙げられる。水酸化物により抽出剤を過酸化水素（Ｅｐ）または酸素（Ｅｏ）と組み合わせてもよい。次いで、得られたパルプをさらに、二酸化塩素（ＤＥＤ）または過酸化物（Ｐ−Ｐ）のような化学漂白順序により所望の白色度まで漂白して、それによって、同一の順序によるが酵素処理を用いないで同様の白色度まで漂白したパルプと比較した場合に化学物質の実質的な節約を観察してもよい。塩素含有化学物質または過酸化物の減少をそのような方法により行なう。さらに、上述した酵素により本発明を行なうことにより、同量の漂白化学物質をパルプに適用して、処理したパルプの白色度を高めてもよい。別の実施の形態において、本発明は、上述した精製酵素またはMicrotetraspor a ssp からの全キシラナーゼ上澄の様々な産業環境への適用を考慮するものである。具体的には、Microtetraspora ssp 内で産生され、上述した精製キシラナーゼおよび全キシラナーゼ上澄を用いて、(1)アルコール燃料および他の重要な工業用化学物質の製造のために農業廃棄物を酵素的に分解するか、または(2)動物飼料または飼料成分を酵素的に変性するか、もしくはヘミセルロース分画のin v ivoの分解のために動物飼料に加えてもよい。本発明とその利点をさらに説明するために、以下の特定の実施例を示すが、それらの実施例は説明のためのものであり、限定を目的とするものではない。実施例１Ｄ−Ｅ−Ｄ漂白の前の酸素脱リグニンを行なった軟木クラフトの酵素処理酸素脱リグニンを行なった軟木クラフトパルプ、カッパ番号16.4を、以下の条件下でMicrotetraspora flexuosa由来の全上澄キシラナーゼにより処理した：酵素使用量５ＤＮＳＵ／ｇパルプｄ．ｓ．ｐＨ 7.5、８、９または10 温度 70℃、80℃または90℃ 反応時間２時間パルプの精度 10％酵素溶液をパルプ混合物に加える前に、パルプのｐＨを硫酸により所望の値に調節し、パルプ混合物を電子レンジ内で予熱して、必要な反応温度に到達させた。ｐＨの調節とパルプ混合物の予熱後、酵素をパルプ混合物中に完全に混ぜ合わせ、所望の温度の水浴中に２時間保持した。酵素処理後、パルプ混合物をブフナー漏斗中で濾過して、パルプを水で洗浄した。対照パルプを、酵素を加えずに、上述したような各々のｐＨと温度との組合せで処理した。化学漂白酵素処理または対照処理後、パルプ試料を漂白順序Ｄ−Ｅ−Ｄを用いて化学的に漂白した。両方のＤ（二酸化塩素）段階において、100％の二酸化塩素を用いた。化学漂白における反応条件は以下のとおりである：化学漂白後、パルプ試料をＳＯ₂水により室温で3.5のｐＨ値まで酸性にした。漂白したパルプをＳＣＡＮ−Ｃ11:75により白色度（ＩＳＯ）について分析した。脱リグニンを、苛性ソーダ抽出段階後にカッパ数の変化として測定した。小さいカッパ数が、パルプ中に少量のリグニンしか存在しないことを示すので、望ましい。カッパ数は、この実施例における特定の条件下での水分を含まないパルプ１ｇにより消費された0.1Ｎの過マンガン酸カリウム溶液の容量（ミリリットル）である。結果を、加えた過マンガン酸塩の50％消費まで修正する。以下の標準方法を用いた：ＴＡＰＰＩ試験方法、（Tappi,Atlanta,GA）Vol.1,1988「Kappa numb er of pulp-T236 cm85」）。結果を表２に示す。上記表２に示した結果は、対照パルプの74.4％の白色度レベルで、化学漂白前にｐＨ7.5および70℃の温度の酵素処理により、最終のパルプの白色度が4.9％ユニット増加したことを示している。さらに、80℃の温度とアルカリ性ｐＨ7.5において、Microtetraspora flexuos a 由来の全上澄キシラナーゼで処理した酸素脱リグニン軟木パルプはまだ、対照パルプと比較して、最終のパルプの白色度が著しく増加している。極端な温度（ 90℃）およびアルカリ性条件（ｐＨ7.5）でさえも、全上澄キシラナーゼは活性を維持しており、対照パルプと比較して、処理したパルプは0.4％のＩＳＯユニットが増加しているのが分かる。高アルカリ性条件において、すなわち、ｐＨ9.0、70℃において、対照パルプと比較して、著しくパルプの白色度が増した。さらに、極端なアルカリ性条件、すなわち、ｐＨ10、70℃において、全上澄キシラナーゼはまだ活性であり、対照パルプと比較して、0.9％ＩＳＯユニットの増加が見られた。カッパ数から分かるように、抽出段階の脱リグニンは、アルカリ性ｐＨ条件および高温でさえも酵素処理により著しく向上できる。実施例２過酸化物漂白前の酸素脱リグニンを行なった軟木クラフトの酵素処理酸素脱リグニンを行なった軟木クラフトパルプ、カッパ番号15.7を、以下の条件下でMicrotetraspora flexuosa由来の全上澄キシラナーゼにより処理した：酵素使用量 10 ＤＮＳＵ／ｇパルプｄ．ｓ．ｐＨ７温度 50℃、60℃、70℃または80℃ 反応時間２時間パルプの精度 10％酵素溶液をパルプ混合物に加える前に、パルプのｐＨを硫酸により所望の値に調節し、パルプ混合物を電子レンジ内で予熱して、必要な反応温度に到達させた。ｐＨの調節とパルプ混合物の予熱後、酵素をパルプ混合物中に完全に混ぜ合わせ、所望の温度の水浴中に２時間保持した。酵素処理後、パルプ混合物をブフナー漏斗中で濾過して、パルプを水で洗浄した。対照パルプを、酵素を加えずに、上述したような各々のｐＨと温度との組合せで処理した。化学漂白酵素処理または対照処理後、パルプ試料をＥＤＴＡで処理して、キレート化し、パルプの過酸化物漂白に有害な金属イオンを除去した。キレート化段階における反応条件は以下のとおりである：ＥＤＴＡ 0.2％のパルプｄ．ｓ．温度 85℃ ｐＨ 4 パルプの精度 3％キレート化段階後、順序Ｐ−Ｐを用いて、パルプを化学的に漂白した。化学的漂白に用いた反応条件を以下の表に示す。化学漂白後、パルプ試料をＳＯ₂水により室温で3.5のｐＨ値まで酸性にした。漂白したパルプを、ＳＣＡＮ−Ｃ11:75により白色度（ＩＳＯ）について分析した。脱リグニンを、Ｐ２段階の後にカッパ数の変化として測定した。結果を表４に示す。この表は、過酸化物漂白後の最終のパルプの白色度が、過酸化物処理する前の対照パルプと比較して、70℃でｐＨ７でのMicrotetraspora flexuosaからの全上澄キシラナーゼでパルプを処理することにより、著しく増加することを示している。80℃の高温で、全上澄キシラナーゼは活性を維持しており、参照パルプと比較して、処理したパルプでは0.4％ＩＳＯユニットだけ増加したのが分かった。カッパ数によると、脱リグニンは酵素処理により著しく向上した。実施例３Ｄ−Ｅ−Ｄ漂白の前の酸素脱リグニンを行なった硬木クラフトの酵素処理酸素脱リグニンを行なった硬木クラフトパルプ、カッパ番号10.9を、以下の条件下でMicrotetraspora flexuosa由来の精製キシラナーゼ１またはキシラナーゼ２により処理した：酵素使用量３ＤＮＳＵ／ｇパルプｄ．ｓ．ｐＨ 5、7または8 温度 70℃または90℃ 反応時間２時間パルプの精度 10％酵素溶液をパルプ混合物に加える前に、パルプのｐＨを硫酸により所望の値に調節し、パルプ混合物を電子レンジ内で予熱して、必要な反応温度に到達させた。ｐＨの調節とパルプ混合物の予熱後、酵素をパルプ混合物中に完全に混ぜ合わせ、所望の温度の水浴中に２時間保持した。酵素処理後、パルプ混合物をブフナー漏斗中で濾過して、パルプを水で洗浄した。対照パルプを、酵素を加えずに、上述したような各々のｐＨと温度との組合せで処理した。化学漂白酵素処理または対照処理後、漂白順序Ｄ−Ｅ−Ｄを用いて、パルプ試料を化学的に漂白した。両方のＤ（二酸化塩素）の段階で、100％の二酸化塩素を用いた。化学漂白に用いた反応条件は以下のとおりである：化学漂白後、パルプ試料をＳＯ₂水により室温で3.5のｐＨ値まで酸性にした。漂白したパルプをＳＣＡＮ−Ｃ11:75により白色度（ＩＳＯ）について分析した。脱リグニンをＥ段階の後にカッパ数の変化として測定した。結果を表６に示す。表６の結果は、化学漂白の前に、パルプをｐＨ７の70℃の温度でMicrotetrasp ora flexuosa からの精製キシラナーゼ１またはキシラナーゼ２で処理することにより、Ｄ−Ｅ−Ｄ漂白後の最終のパルプの白色度が著しく増加することを示している。90℃の高温とアルカリ性ｐＨ（ｐＨ8.0）でさえも、キシラナーゼ２は活性を維持し、対照パルプと比較して、0.3％ＩＳＯの増加を示した。ｐＨ７の70℃での反応条件下では、Ｅ段階の脱リグニンは酵素処理により明白に向上している。ｐＨ８の90℃での極端な条件下でさえも、Ｅ段階後にカッパ数を酵素処理により減少できる。実施例４ Microtetraspora flexuosaにより産生された５種類のキシラナーゼの精製キシラナーゼアッセイレマゾールブリリアントブルー染色樺木キシラン（ＲＢＢ−キシラン）基体（オーストラリアのメガザイムがこの基体の商業的供給社である）を用いて、キシラナーゼの存在を測定した。200ｕｌの試料を250ｕｌの基体溶液（50ｍＭのクエン酸ナトリウム中２％［ｗ／ｖ］ＲＢＢ−キシラン、ｐＨ6.5）と混合し、10分間に亘り37℃で保温した。未消化キシランが、１ｍｌの95％エタノールの添加により沈殿し、遠心分離により除去される。溶液中に残留する放出染料が、分光光度法（ＯＤ590）により対照としてエタノールに対して定量され、キシラナーゼ活性に対して比例している。活性は、標準曲線を用いて定量してもよく、ＸＡＵ／ｍｌと報告されている（ミリリットル当たりのキシラナーゼ活性ユニット）。多数のキシラナーゼの存在を検出し、それらの等電点（ｐＩ）を測定するゲルオーバーレイ方法を、ＲＢＢ−キシラン基体を用いて開発した。等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル（ｐＨ傾斜３−９）を溶融アガロースと基体懸濁液（50ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ6.5中の４％の［ｗ／ｖ］アガロース、７ｍｇ／ｍｌＲＢＢ−キシラン、0.5％［ｖ／ｖ］グリセロール）に重ねて、37℃で保温した。約１時間後、キシラナーゼ活性が透明ゾーンで明白になる。ゲルを完全に乾燥させて、貯蔵してもよい。キシラナーゼのｐＩを、銀染色ｐＩ標準物を含有する同様に行なったＩＥＦゲルの比較により測定する。試料 Microtetraspora flexuosaＡＴＣＣ35864発酵ブロス（約14ＸＡＵ／ｍｌ）を限外濾過（アミコンスターセル、350ｍｌ、ＰＭ−10膜）を用いて５倍に濃縮した。全ての試料をフィルタ殺菌した。タンパク質の濃度はＢＣＡ法（Pierce）により12.5ｍｇ／ｍｌであった。ケルオーバーレイ分析により、５種類のキシラナーゼの存在を測定した：ｐＩ8.5、7.5、6.2、5.8および5.3。これら５種類のキシラナーゼを本明細書において、それぞれ、キシラナーゼ１−５と称する。精製方法イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）および疎水相互作用クロマトグラフィー（それぞれ、ＩＥＣおよびＨＩＣ）の組合せを用いて、以下のように５種類のキシラナーゼ全てを精製した：キシラナーゼ１および２の精製第１の工程として、ＩＥＣを用いて、キシラナーゼ１および２を精製した。濃縮試料を10ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ9.0（緩衝液Ａ）に対して完全に透析した。ファーマシアＦＰＬＣシステムを用いて、１ｍｌ／分で緩衝液Ａにより平衡にした72ｍｌのＱ−セファロースＨＰ（ファーマシア）を充填した標準クロマトグラフィーカラム（ファーマシアＣ16／40）に50ｍｌを適用した。このカラムを 50ｍｌの緩衝液Ａで洗浄し、次いで、緩衝液Ａから緩衝液Ａ中の0.25ＭのＮａＣｌまで、400ｍｌの線形に増加する塩傾斜により溶離した。カラムから残りの結合タンパク質を緩衝液Ａ中の２ＭのＮａＣｌにより洗い流した。10ｍｌの分画を集積し、前述したように分析した。キシラナーゼ１および２を最初の流れによりカラムから共に溶離し、一方、タンパク質の大部分の残りはカラムに結合していた。（キシラナーゼ１および２は未結合カラム分画を示す）。疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を第２の工程として用いて、キシナラーゼ１および２を精製して単離した。活性分画を採集し、２Ｍの硫酸アンモニウムを添加することにより、0.2Ｍの最終硫酸アンモニウム濃度にした。50ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ6.5を加えて、10ｍＭの最終濃度にし、物質（約1 00ｍｌ）を、0.5ｍｌ／分で、0.2Ｍの硫酸アンモニウム−10ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ6.5（緩衝液Ｂ）で平衡にした36ｍｌのフェニルセファロースＣＬ −４Ｂ（ファーマシア）を充填した標準クロマトグラフィーカラム（ファーマシアＣ16／20）に適用した。カラムを60ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄して、10ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ6.5（緩衝液Ｃ）まで70ｍｌで塩濃度を徐々に減らし、緩衝液Ｃ中の10％（ｖ／ｖ）のエチレングリコール（ＥＧ）で50ｍｌで徐々に減らし、200ｍｌの線形傾斜10−32％のＥＧを適用し、32％のＥＧの80ｍｌで洗浄し、1 50ｍｌの傾斜32−38％のＥＧを適用し、最後に50％のＥＧまで70ｍｌで徐々に増やして、カラムを完全に洗浄した。10ｍｌの分画を採集し、上述したように分析した。これらの条件下で、均一なキシラナーゼ２が32％のＥＧ洗浄により溶離し、一方均一なキシラナーゼ１が32−38％のＥＧ傾斜の最後に溶離する。キシラナーゼ４の精製キシラナーゼ１および２を精製するための上述した第１の工程（ＩＥＣ）を用いて、キシラナーゼ４および５を緩衝液Ａ中の約0.16ＭのＮａＣｌで共に溶離する。活性分画を採集し、上述したように、0.4Ｍの硫酸ナトリウム−10ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ6.5（緩衝液Ｄ）にした。物質約100ｍｌを１ｍｌ／分で、緩衝液Ｄにより平衡にした上述したＨＩＣカラムに適用した。このカラムを50ｍｌの緩衝液で洗浄し、130ｍｌの線形傾斜緩衝液Ｄから緩衝液Ｃにより溶離し、その直後に200ｍｌの線形傾斜緩衝液Ｃから50％のＥＧまで溶離した。10ｍｌの分画を採集し、上述したように分析した。キシラナーゼ４は約20％のＥＧで溶離する。キシラナーゼ３および５の精製キシラナーゼ３および５の場合、ＨＩＣを第１の工程として用いた。２Ｍの硫酸アンモニウムおよび50ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ6.5（上記）を加えることにより、濃縮試料を緩衝液Ｃ中の0.5Ｍの硫酸アンモニウムとした。物質を濾過してわずかな沈殿物を除去して、50ｍｌの容積を１ｍｌ／分で、緩衝液Ｃ（緩衝液Ｅ）中の0.5Ｍの硫酸アンモニウムにより平衡にした上記ＨＩＣカラムに適用した。次に、カラムを87.5ｍｌの緩衝液Ｅで洗浄し、147ｍｌの線形傾斜緩衝液Ｅから緩衝液Ｃまでにより溶離した。10ｍｌの分画を採集して、上述したように分析した。キシラナーゼ３および５を約0.05の硫酸アンモニウムで共に溶離した。ＩＥＣを用いてキシラナーゼ３および５を単離して精製した。活性ＨＩＣ分画を集積し（70ｍｌ）、10ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ8.0（緩衝液Ｆ）に対して完全に透析し、上述した方法により約20ｍｌに濃縮した。物質を、緩衝液Ｆにより平衡にした上述したＩＥＣカラムに１ｍｌ／分で適用した。カラムを150ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄し、150ｍｌの線形傾斜緩衝液Ｆから緩衝液Ｆ中の0.25ＭのＮａＣｌまでにより溶離した。10ｍｌの分画を採集し、上述したように分析した。キシラナーゼ３は約0.05ＭのＮａＣｌで溶離したが、キシラナーゼ５は約0.15ＭのＮａＣｌで溶離した。実施例５ Microtetraspora flexuosaにより産生された５種類のキシラナーゼの特徴付け精製後、各々のキシラナーゼに等電点電気泳動および以下の方法による分子量測定を行なった。キシラナーゼの生化学的特徴付けの結果を表７に列記する。製造社の指示によりファストシステム（ファーマシアバイオテック）を用いて、等電点電気泳動技術を実施した。ｐＩ測定に用いたマーカーは、ブロードｐＩキットｐＨ3.5−9.3（ファーマシアバイオテック）であった。指示にしたがって、ファストシステム展開銀染色により、タンパク質を視覚化した。分子量は、２種類の方法：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および質量分析法（ＭＳ）により測定した。ＳＤＳ −ＰＡＧＥおよびそれに続く銀染色による視覚化は、上述したようにファストシステムを用いて行なった。使用した分子量マーカーはシグマケミカル社（ミズーリ州、セントルイス）からのものであった。質量分析法は、チャールズエバンスアンドアソシエーツ（301 Chespeake Drive，Redwood City，CA 94063）により行なった。最適ｐＨは、緩衝液が測定したｐＨ範囲、すなわち、ｐＨ4.5−12.0に依存して変化することを除いて、前述したＲＢＢアッセイを用いることにより行なう（第１図参照）。アッセイの選択したｐＨにとって適切な緩衝液を調製することは当業者に知られている。熱安定性は、活性の半分が維持される所定の温度での時間を示す。活性は、約 18−37℃で測定する。試料を所定の温度で保温し、ＲＢＢアッセイを用いて活性を測定する。半減期は、活性の半分が失われる時間を分で表したものである（第３図参照）。最適温度は、活性が最高となった温度である。第２図は、ＲＢＢアッセイを用いて測定したキシラナーゼ１−５の温度分布を示す。第１図および第２図の両方において、最大活性％は、100％の値とされた最高活性測定に関し、他の全ての数は、その標準化に関して測定されたものである。本明細書に記載された全ての公報および特許出願をここに引用する。本発明を完全に記載したので、多くの変更を請求の範囲および精神から逸脱せずに行なえることが当業者は明白である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者キューヴァス，ウイリアムエイアメリカ合衆国カリフォルニア州 94080 サウスサンフランシスコキンボールウェイ 180 ジェネンコアインターナショナルインコーポレーテッド (72)発明者コリオネン，マーヤフィンランド国エフアイエヌ−02700 カウニアニネンファルコナオハンティク６エイ８

Claims

【特許請求の範囲】１．分子量が約33,100ダルトンであり、ｐＩが約8.5であり、最適ｐＨが約7.0から約7.5までであり、最適活性温度が約70℃であると生化学的に特徴付けられたM icrotetraspora 属から単離されたキシラナーゼ。２．分子量が約13,300ダルトンであり、ｐＩが約7.5であり、最適ｐＨが約7.0から約7.5までであり、最適活性温度が約65℃であると生化学的に特徴付けられたM icrotetraspora 属から単離されたキシラナーゼ。３．分子量が約31,000ダルトンであり、ｐＩが約6.2であり、最適ｐＨが約7.5であり、最適活性温度が約65℃であると生化学的に特徴付けられたMicrotetraspor a 属から単離されたキシラナーゼ。４．分子量が約50,000ダルトンであり、ｐＩが約5.8であり、最適ｐＨが約7.5であり、最適活性温度が約65℃であると生化学的に特徴付けられたMicrotetraspor a 属から単離されたキシラナーゼ。５．分子量が約35,000ダルトンであり、ｐＩが約5.3であり、最適ｐＨが約7.5であり、最適活性温度が約70℃であると生化学的に特徴付けられたMicrotetraspor a 属から単離されたキシラナーゼ。６．パルプの脱リグニンおよび／または漂白を向上させる方法であって、脱リグニンおよび／または漂白が向上するような温度、ｐＨおよび酵素濃度で、パルプをMicrotetraspora spp.菌株中で産生された１種類以上の精製キシラナーゼと接触させる工程からなることを特徴とする方法。７．前記精製キシラナーゼが、分子量が約33,100ダルトンであり、ｐＩが約8.5 であり、最適ｐＨが約7.0から約7.5までであり、最適活性温度が約70℃であると生化学的に特徴付けられた請求の範囲第６項記載の方法。８．前記精製キシラナーゼが、分子量が約13,300ダルトンであり、ｐＩ約7.5であり、最適ｐＨが約7.0から約7.5までであり、最適活性温度が約65℃であると生化学的に特徴付けられた請求の範囲第６項記載の方法。９．前記精製キシラナーゼが、分子量が約31,000ダルトンであり、ｐＩが約6.2 であり、最適ｐＨが約7.5であり、最適活性温度が約65℃であると生化学的に特徴付けられた請求の範囲第６項記載の方法。 10．前記精製キシラナーゼが、分子量が約50,000ダルトンであり、ｐＩが約5.8 であり、最適ｐＨが約7.5であり、最適活性温度が約65℃であると生化学的に特徴付けられた請求の範囲第６項記載の方法。 11．前記精製キシラナーゼが、分子量が約35,000ダルトンであり、ｐＩが約5.3 であり、最適ｐＨが約7.5であり、最適活性温度が約70℃であると生化学的に特徴付けられた請求の範囲第６項記載の方法。 12．パルプの脱リグニンおよび／または漂白を向上させる方法であって、脱リグニンおよび／または漂白が向上するような温度、ｐＨおよび酵素濃度で、パルプをMicrotetraspora flexuosa中で産生された全キシラナーゼ上澄と接触させる工程からなり、前記キシラナーゼ上澄が７−９の最適ｐＨ、および約70℃−80℃の最適温度を有することを特徴とする方法。