JP2013515482A - 同時糖化発酵反応の効率を改善するための方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図3
Description
本出願は、2010年12月23日に出願された米国特許仮出願第61/289,917号の利益を主張し、その全体を参照として本明細書に組み込む。
本開示は、概して、同時糖化発酵反応により得られる生成物の収率を改善するための方法及び組成物を目的とする。
物)由来の培養ブロスである。特定の態様では、トリコデルマ・リーゼイ細胞は、天然β−キシロシダーゼ遺伝子が不活化されるか又は欠失するよう遺伝子操作されている。「天然β−キシロシダーゼ遺伝子が不活化されるか又は欠失するよう遺伝子操作されているトリコデルマ・リーゼイ細胞」には、予め不活化された原細胞又は親細胞だけでなく、天然β−キシロシダーゼ遺伝子が不活化又は欠失された子孫細胞も包含することは注意すべきである。
ことで、これらの有用なアルキル−β−キシロピラノシドの収量を増加させることができる。
るいは保持型β−キシロシダーゼの外来遺伝子を過剰発現するよう遺伝子操作されたトリコデルマ・リーゼイ細胞も提供する。トリコデルマ・リーゼイ細胞は、GH3、GH30、GH31、GH39、GH52、GH54、又はGH116ファミリーの酵素、例えば、XlnD、Fv30A、Fv30B、Fv39A、Fv39B、XynB、XylA、又はXyl1ポリペプチドから選択された酵素を発現するよう遺伝子組み換え操作することもできる。例えば、XlnDポリペプチドは、配列番号40、又は配列番号40の残基18〜804に相当するアミノ酸配列と少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%配列同一性を有する。Fv30Aポリペプチドは、配列番号42、又は配列番号42の残基20〜537に相当するアミノ酸配列と、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%配列同一性を有する。Fv30Bポリペプチドは、配列番号44、又は配列番号44の残基25〜485に相当するアミノ酸配列と、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%配列同一性を有する。Fv39Aポリペプチドは、配列番号46、又は配列番号46の残基20〜439に相当するアミノ酸配列と、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%配列同一性を有する。Fv39Bポリペプチドは、配列番号48、又は配列番号48の残基19〜456に相当するアミノ酸配列と、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%配列同一性を有する。XynBポリペプチドは、配列番号50に相当するアミノ酸配列と、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%配列同一性を有する。XylAポリペプチドは、配列番号52、又は配列番号52の残基19〜705に相当するアミノ酸配列と少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%配列同一性を有する。Xyl1ポリペプチドは、配列番号54、又は配列番号54の残基22〜500に相当するアミノ酸配列と少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%配列同一性を有する。
別段の記載がない限り、本明細書に引用されるすべての米国特許及び米国特許出願は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。量、濃度、又は他の値若しくはパラメータが、範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限値、又は好ましい下限値として与えられるとき、具体的に開示するすべての範囲又は数は、これらの範囲内で連続して形成されることは明白である。本明細書において数値範囲が引用される場合、別段の記載が無い限り、範囲は範囲の終点並びに範囲内のすべての整数及び分数を包含することが意図される。制限する範囲が引用された場合、本発明の範囲を具体的な値に限定することを意図しない。
セルロース系材料からの物質、すなわち発酵生成物の生成は、典型的には3つの主要な工程を包含する。これらの3つの工程とは、(1)前処理すなわち前加水分解工程、(2)酵素加水分解すなわち糖化工程、並びに(3)発酵、であり、発酵後に物質、すなわち発酵生成物を回収することができる。以下の例示はエタノール生成プロセスに関するものであるが、他の物質を生成するために類似のプロセスを使用できることは明らかである。
高等植物の細胞壁は、様々な炭水化物ポリマー(CP)成分から構成される。これらのCP成分は、共有結合及び非共有結合により相互作用し、堅固な細胞壁を形成しかつ膨圧に耐えるのに必要とされる構造一体性を植物にもたらす。植物に見られる主なCPはセルロースであり、セルロースは植物細胞壁の構造骨格を形成する。セルロースの生合成時に、ポリ−β−1,4−D−グルコース鎖は水素結合及び疎水性相互作用により自己集合してセルロースミクロフィブリルを形成し、セルロースミクロフィブリルは更に自己集合してより大きな繊維を形成する。セルロースミクロフィブリルはある程度不規則な繊維であり、かつ結晶化度の異なる領域を含有する。セルロースフィブリルの結晶化度は、任意の2本のセルロース鎖構成要素間の水素結合が、どれだけ緊密であるかによって変化する。結合密度がより疎である、すなわちグルコース鎖をより利用しやすい領域は、非晶質領域と呼ばれる。
(1)酵素成分を組み合わせることで、発酵ブロスの形態、あるいは不完全又は完全に単離又は精製されたポリペプチドの形態、のいずれかで作製される、組成物。
(4)その場で、例えばSSF反応時に生成される、酵素混合物。
本開示の酵素ブレンドは、1つ以上のセルラーゼを含み得る。セルラーゼは、セルロース(β−1,4−グルカン又はβ−D−グルコシド結合)を加水分解してグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖、及び同様物などを生成する酵素である。セルラーゼは、慣習的に3つの主要な部類:エンドグルカナーゼ(EC 3.2.1.4)(「EG」)、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ(EC 3.2.1.91)(「CBH」)、並びにβ−グルコシダーゼ(β−D−グルコシドグルコヒドロラーゼ;EC 3.2.1.21)(「BG」)に分類される(Knowles et al.,1987,Trends in Biotechnol.5(9):255〜261,and Schulein,1988,Methods of Enzymology 160:234〜242)。エンドグルカナーゼが主にセルロース繊維の非晶質部位に作用するのに対し、セロビオヒドロラーゼは結晶質のセルロースを分解することができる。
Walseth,1971,TAPPI 35:228,and of Wood,1971,Biochem.J.121:353〜362により最適化されたプロトコルを用い、Avicel PH−101からリン酸膨潤セルロース(PASC)を調製する。手短に言うと、代表的な方法によりAvicelを濃リン酸に可溶化させ、次いで冷脱イオン水を用いて沈殿させる。セルロースを回収した後、水で洗浄してpHを中性にし、固形分が1%になるように50mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)に希釈する。
FP=1−(試料のFl−セロビオースを含有する緩衝液のFl)/(緩衝液が酵素を含まない場合のFl−緩衝液がセロビオースを含有する場合のFl)
(式中、「FP」はフラクション生成物を意味し、「Fl」は蛍光ユニットを意味する)に従うフラクション生成物として表わす。
本開示の酵素ブレンドは、所望によりβ−グルコシダーゼを1つ以上含む。本明細書で使用するとき、用語、「β−グルコシダーゼ」は、EC 3.2.1.21に分類される又は属するβ−D−グルコシドグルコヒドロラーゼを指し、及び/又は限定するものではないが、グリコシルヒドロラーゼ(「GH」)ファミリー1、3、9又は48などといった、特定のGHメンバーである酵素を指す。特定の態様では、用語は、セロビオースの加水分解を触媒して、β−D−グルコースを放出させることのできる酵素を指す。
本開示の酵素ブレンドは、所望によりエンドグルカナーゼを1つ以上含む。用語、「エンドグルカナーゼ」は、EC 3.2.1.4.に分類される任意のポリペプチドを指す。
本明細書で使用するとき、用語、「セロビオヒドロラーゼ」は、EC 3.2.1.91に分類される任意のセロビオヒドロラーゼを指す。本開示の方法及び組成物には、1つ以上のセロビオヒドロラーゼ(「CBH」)を好適に含ませることができる。
特定の態様では、本開示の酵素ブレンドは全セルラーゼを含む。本明細書で使用するとき、用語、「全セルラーゼ」は、天然に生じるセルラーゼ含有組成物及び非天然に生じるセルラーゼ含有組成物の両方を指し、この組成物は:(1)セルロース内部のβ−1,4結合を切断し、より短いグルコオリゴ糖を生成する、エンドグルカナーゼ、(2)「エキソ型」で作用する方法で、より短いグルコオリゴ糖からセロビオース単位(例えば、セロビオース単位としては、β−1,4グルコース−グルコース二糖が挙げられる)を放出させる、セロビオヒドロラーゼ、並びに(3)短鎖セロオリゴ糖又はセロビオース(グルコース二量体)からのグルコースモノマーの放出を触媒する、β−1,4グルコシダーゼ二糖、を含む。
く形成される還元糖のアノマープロトンとして、軸配向又はエクアトリアルな配向に基づき、別個の化学シフトを有する。軸配向及びエクアトリアルな配向の形態の平衡混合物へ向かう、新しく形成される還元糖のアノマープロトンの変旋光は、加水分解反応と比較して速度が遅い。したがって、最初に形成された還元末端のアノマープロトンを、基質に存在している形態と比較し、1H−NMRにより配向決定することは、これらの保持型立体配置対反転型立体配置の機構について解析することを意味する。実験法は、例えば、Pauly et al.,1999,Glycobiology 9:93〜100に記載される。
様々な真菌及びバクテリアが、酵素によりヘミセルロースを加水分解することができる。セルロース分解と同様、ヘミセルロース加水分解は複数の酵素の共働作用を包含する。多くの場合、ヘミセルラーゼは遺伝的に3つのカテゴリに分類される:多糖鎖内の内部結合を攻撃するエンド型酵素、多糖鎖の還元又は非還元末端のいずれかからプロセシングを行なうエキソ型酵素、並びにリグニンのグリコシド結合を加水分解するアクセサリ酵素、アセチルエステラーゼ、及び/又はエステラーゼ。エステラーゼの例としては、クマリン酸エステラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼが挙げられる(Wong et al.,1988,Microbiol.Rev.52:305〜317;Tenkanen and Poutanen,1992,Significance of esterases in the degradation of xylans,in Xylans and Xylanases,Visser et al.,eds.,Elsevier,New York,N.Y.,pp.203〜212;Coughlan and Hazlewood,1993,Hemicellulose and hemicellulases,Portland,London,UK;Brigham et al.,1996,Hemicellulases:Diversity and applications,in Handbook on Bioethanol:Production and Utilization,Wyman,ed.,Taylor & Francis,Washington,D.C.,pp.119〜141)。
本開示の酵素ブレンドは、所望により1つ以上のキシラナーゼを含有する。本明細書で使用するとき、用語、「キシラナーゼ」は、EC 3.2.1.8に分類される又は属する任意のキシラナーゼを指す。好適なキシラナーゼとしては、例えば、カルドセラム・サッカロリティカム(Caldocellum saccharolyticum)キシラナーゼ(Luthi et al.,1990,Appl.Environ.Microbiol.56(9):2677〜2683)、サーモトガ・マリティマキシラナーゼ(Winterhalter & Liebel,1995,Appl.Environ.Microbiol.61(5):1810〜1815)、サーモトガSp.株FJSS−B.1キシラナーゼ(Simpson et al.,1991,Biochem.J.277,413〜417)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)キシラナーゼ(BcX)(米国特許第5,405,769号)、アスペルギルス・ニガーキシラナーゼ(Kinoshita et al.,1995,J.Ferment.Bioeng.79(5):422〜428);ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)キシラナーゼ(Shareck et al.,1991,Gene 107:75〜82;Morosoli et al.,1986,Biochem.J.239:587〜592;Kluepfel et al.,1990,Biochem.J.287:45〜50);バチルス・ズブチルス(Bacillus subtilis)キシラナーゼ(Bernier et al.,1983,Gene 26(1):59〜65);セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi)キシラナーゼ(Clarke et al.,1996,FEMS Microbiol.Lett.139:27〜35)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)キシラナーゼ(Gilbert et al.,1988,J.Gen.Microbiol.134:3239〜3247);クロストリジウム・サーモセラムキシラナーゼ(Dominguez et al.,1995,Nat.Struct.Biol.2(7):569〜76);バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)キシラナーゼ(Nuyens et al.,2001,Appl.Microbiol.Biotech.56:431〜434;Yang et al.,1988,Nucleic Acids Res.16(14B):7187);クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)P262キシラナーゼ(Zappe et al.,1990,Nucleic Acids Res.18(8):2179)又はトリコデルマ・ハルジアナムキシラナーゼ(Rose et al.,1987,J.Mol.Biol.194(4):755〜756)が挙げられる。
本開示の酵素ブレンドは、所望によりβ−キシロシダーゼを1つ以上含む。
本開示の酵素ブレンドは、所望により1つ以上のL−α−アラビノフラノシダーゼを含む。
セルロース分解性を増感させる活性を有する数多くのポリペプチドを、上記酵素及び/又はセルロース分解性タンパク質と組み合わせて使用することで、バイオマス基質のセルロース成分を更に分解させることができる(例えば、Brigham et al.,1995,in Handbook on Bioethanol(Charles E.Wyman,ed.),pp.119〜141,Taylor & Francis,Washington D.C.;Lee,1997,J.Biotechnol.56:1〜24を参照されたい)。
本開示に従い、SSF反応時のAXP(例えば、EXP)形成を減少させるために、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素を使用する。したがって、一態様では、本開示は反転型β−キシロシダーゼポリペプチドを少なくとも1つ含む組成物に関する。他の態様では、本開示は、反転型β−キシロシダーゼポリペプチドを少なくとも1つ含む完全発酵培地を培養することを含む、SSF反応で所望の発酵生成物を生成する方法に関する。
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はFv43Dポリペプチドである。Fv43D(配列番号2)のアミノ酸配列は、図19B、及び図32の一段目に示す。配列番号2は、未成熟なFv43D配列である。Fv43Dは、配列番号2の残基1〜20に相当する(図19Bの下線箇所)予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号2の残基21〜350に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測される保存ドメイン残基を、図19Bにボールド体で示す。Fv43Dは、基質として、p−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測される触媒残基は、D37若しくはD71のいずれか、D155、及びE251である。
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はPf43Aポリペプチドである。Pf43A(配列番号8)のアミノ酸配列は、図22B、及び図32の四段目に示す。配列番号8は未成熟なPf43A配列である。Pf43Aは、配列番号8の残基1〜20に相当する(図22Bの下線箇所)予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号8の残基21〜445に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。図22B中、予想触媒ドメイン残基はボールド体、予想炭水化物結合ドメイン残基は大文字、触媒ドメイン及び炭水化物結合ドメインを分離する予想リンカー残基はイタリック体である。Pf43Aは、基質として、p−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測される触媒残基は、D32若しくはD60のいずれか、D145、及びE196である。
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はFv43Eポリペプチドである。Fv43E(配列番号10)のアミノ酸配列は、図23B、及び図32の九段目に示す。配列番号10は、未成熟なFv43E配列である。Fv43Eは、配列番号10の残基1〜18に相当する(図23Bの下線箇所)予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号10の残基19〜530に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測される触媒ドメイン残基は、図23Bにボールド体で示す。Fv43Eは、基質として、p−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース及び混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測される触媒残基は、D40若しくはD71のいずれか、D155、及びE242である。
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はFv43Bポリペプチドである。Fv43B(配列番号12)のアミノ酸配列は、図24B、及び図32の六段目に示す。配列番号12は、未成熟なFv43B配列である。Fv43Bは、配列番号12の残基1〜16に相当する(図24Bの下線箇所)予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号12の残基17〜574に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測される触媒ドメイン残基を、図24Bにボールド体で示す。Fv43Bは、p−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド及び/又はp−ニトロフェニル−α−L−アラビノフラノシドを基質として用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性及びL−α−アラビノフラノシダーゼ活性の両方を有することが示された。Fv43Bは、他のキシロシダーゼ酵素の存在下で、分枝鎖アラビノキシロオリゴマーからアラビノースを放出させ、オリゴマー混合物からのキシロースの放出を増加させることが示された。予測される触媒残基は、D38若しくはD68のいずれか、D151、及びE236である。
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はAf43Aポリペプチドである。Af43A(配列番号14)のアミノ酸配列は、図25B、及び図32の七段目に示す。配列番号14は、未成熟なAf43A配列である。予測される保存ドメイン残基を、図25Bにボールド体で示す。Af43Aは、p−ニトロフェニル−α−L−アラビノフラノシドを用いるアッセイにおいて、並びにエンドキシラナーゼの作用により生成されたオリゴマーのセットを変換することで放出されるアラビノースにより、L−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示された。予測される触媒残基は、D26若しくはD58のいずれか、D139、及びE227である。
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はFo43Aポリペプチドである。Fo43A(配列番号24)のアミノ酸配列は、図31B、及び図32の2段目に示す。配列番号24は、未成熟なFo43A配列である。Fo43Aは、配列番号24の残基1〜17に相当する(図31Bの下線箇所)予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号24の残基21〜348に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測される保存ドメイン残基を、図31Bにボールド体で示す。Fo43Aは、基質として、p−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測される触媒残基は、D37若しくはD72のいずれか、D159、及びE251である。
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はGz43Aポリペプチドである。Gz43A(配列番号22)のアミノ酸配列は、図30B、及び図32の三段目に示す。配列番号22は、未成熟なGz43A配列である。Gz43Aは、配列番号22の残基1〜18に相当する(図30Bの下線箇所)予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号22の残基19〜340に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測される保存ドメイン残基を、図30Bにボールド体で示す。Gz43Aは、基質として、p−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測される触媒残基は、D33若しくはD68のいずれか、D154、及びE243である。
他の態様では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスB3ポリペプチドである。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスXynB3の配列を、配列番号25として表わす。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスXynB3は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスT−6由来の、アミノ酸残基535個のGH43ファミリーの酵素である。酵素は、キシロオリゴマーの非還元末端からキシロース単位を1つ切断させる、活性には、3つの触媒性残基D15、D128、及びE187が不可欠であることが見出された(Shallom et al.,2005,Biochemistry,44:387〜397)。
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はビブリオsp XloAポリペプチドである。ビブリオsp XloAはビブリオsp.のXY−214株由来のβ−1,3−キシロシダーゼである。
本開示に従うと、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素を使用することで、SSF反応時のAXP生成(例えば、EXP)が改善又は増加される。したがって、本開示は、一態様では、保持型β−キシロシダーゼポリペプチドを少なくとも1つ含む組成物に関する。他の態様では、本開示は、完全発酵培地を培養することを含む、所望のAXP化合物の生成方法あるいはSSF反応時のAXP生成物の量を改善するすなわち増加させる方法に関し、完全発酵培地には保持型β−キシロシダーゼポリペプチドを少なくとも1つ含む。
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素は、XlnDポリペプチドである。XlnD(配列番号40)のアミノ酸配列は、図35Bに示すものである。配列番号40は、未成熟なXlnD配列である。XlnDは、配列番号40の残基1〜17に相当する(図35Bの下線箇所)予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号40の残基18〜804に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はFv30Aポリペプチドである。XlnD(配列番号42)のアミノ酸配列を図36Bに示す。配列番号42は、未成熟なFv30A配列である。XlnDは、配列番号42の残基1〜19に相当する(図36Bの下線箇所)予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号42の残基20〜537に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はFv30Bポリペプチドである。Fv30B(配列番号44)のアミノ酸配列を図37Bに示す。配列番号44は、未成熟なFv30B配列である。Fv30Bは、配列番号44の残基1〜24に相当する(図37Bの下線箇所)予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号44の残基25〜485に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はFv39Aポリペプチドである。Fv39A(配列番号46)のアミノ酸配列を図38Bに示す。配列番号46は、未成熟なFv39A配列である。Fv39Aは、配列番号46の残基1〜19(図38Bの下線箇所)に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号46の残基20〜439に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はFv39Bポリペプチドである。Fv39B(配列番号48)のアミノ酸配列を図39Bに示す。配列番号48は、未成熟なFv39B配列である。Fv39Bは、配列番号48の残基1〜18に相当する(図39Bの下線箇所)予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号48の残基19〜456に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はXynBポリペプチドである。XynB(配列番号50)のアミノ酸配列を図40Bに示す。XynBは、SignalPアルゴリズム(右記URLで利用可能:http://www.cbs.dtu.dk)により予想されるシグナル配列を有さない。
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はXylAポリペプチドである。XylA(配列番号52)のアミノ酸配列を図41Bに示す。XynAは、SignalPアルゴリズム(右記URLで利用可能:http://www.cbs.dtu.dk)により予想されるシグナル配列を有さないが、Uniprotアルゴリズム(右記URLで利用可能:http://www.uniprot.org/uniprot)から予想されるシグナル配列(配列番号52の残基1〜18に相当する(下線部))は有する。シグナル配列の切断により、配列番号52の残基19〜705に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はXyl1ポリペプチドである。Xyl1(配列番号54)のアミノ酸配列を図42Bに示す。配列番号54は、未成熟なXyl1配列である。Xyl1は配列番号54の残基1〜21(図42B中下線部)に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号54の残基22〜500に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
6.6.1.核酸及び発現ベクター
反転型β−キシロシダーゼポリペプチド又は他の糖化酵素(1つ又は複数)(例えば、セルラーゼ又はヘミセルラーゼ)を含む、SSFに使用する酵素(「SSF酵素」)をコードしている天然又は合成ポリヌクレオチド断片を、非同一性の核酸コンストラクト又はベクターに組み込むことができる。次いで、これらのベクターを、好適な宿主細胞(例えば、糸状真菌、酵母、又はバクテリア細胞など)に導入又は複製することができる。本明細書で開示されるベクター及び方法を使用して、1つ以上のSSF酵素を発現させることができる。導入された細胞内で複製可能でありかつ実行可能であるならば、任意のベクターを使用することができる。多くの好適なベクター及びプロモータが当業者に既知であり、その内の多くのものは市販されている。クローニングベクター及び発現ベクターは、例えば、Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(CSHL Press)及びAusubel et al.,2002,Short Protocols in Molecular Biology(Current Protocols)などの文献に明示的に記載されてきた。これらの文献が対照とする各発現ベクターの内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。真菌宿主セルセア(cellsare)に好適な、他の例示的な発現ベクターは、van den Hondel et al.,1991,Bennett and Lasure(eds.)More Gene Manipulations in Fungi.Academic Press,pp.396〜428.に記載されている。
本明細書に記載の方法に使用するために、対象とするSSFタンパク質を発現するよう遺伝子操作されている宿主細胞を、本開示により提供する。好適な宿主細胞としては、任意の微生物が挙げられる(例えば、バクテリア、原生生物、藻類、真菌(例えば、酵母、又は糸状菌)、又は任意の他の微生物)。好適な宿主細胞は、好ましくはバクテリア、酵母、又は糸状菌細胞である。
特定の態様では、組み換えSSF酵素が宿主細胞の培養培地に分泌されるよう、シグナル配列を用い、組み換えSSF酵素を設計する。特定の態様では、対象とするSSF酵素は発酵ブロスの形態で回収される。本明細書で使用するとき、用語「発酵ブロス」は、発酵により生成され、かつ次いで全く又はほとんど回収及び/又は精製されていない酵素調製物を指す。例えば、微生物培養物は、炭素を制限した条件下でインキュベーションすることでタンパク質を合成(例えば、酵素を発現)させると、増殖して飽和状態になる。細胞培養培地中に酵素が分泌されたならば、発酵ブロスは、対象とするSSF酵素を回収することができるブロスになる。例えば、発酵ブロスは、発酵終了時に得られる発酵材料の、分画されていない又は分画された含有物を含有し得る。典型的には、発酵ブロスは分画されておらず、使用した培養培地、並びに微生物細胞(例えば、糸状菌細胞)を例えば遠心沈降により除去した後に存在する細胞片、を含む。特定の実施形態では、発酵ブロスは使用した細胞培養培地、細胞外酵素、及び微生物細胞の生細胞若しくは死細胞を含有する。一部の実施形態では、発酵ブロスは微生物細胞を除去するために、使用した細胞培養培地及び細胞外酵素を含むように分画される。
本開示のSSF法は、「発酵微生物」を使用することで、付随する糖化反応で生成された糖及び/又は系に加えられた糖から発酵生成物(例えば、エタノール)を生成する。エタノールを生成することのできる発酵微生物は、しばしばエタノロジェン(ethanologen)と呼ばれる。
一部の態様では、本開示のSSF反応又は方法は、発酵培地又は完全発酵培地で実施される。本明細書で使用するとき、用語、「発酵培地」は、SSF反応を行う前に、反応に必要とされるすべての成分が存在している培地を指す。したがって、発酵培地は、例えば不完全な糖化プロセスから得られる培地であり得る。他の実施形態では、発酵培地は、SSF反応を行なうのに必要とされるすべての成分を含有している培地であり得る。この場合、発酵培地は「完全発酵培地」とも呼ばれる。加えて、更に他の実施形態では、発酵培地は、SSF反応の進行中又は反応下で、特定の糖化生成物を含有することのできるような培地であり得る。
特定の態様では、本開示のSSF反応は、25℃〜50℃の温度で実施される。例えば、SSF反応は、25℃以上、28℃以上、30℃以上、32℃以上、35℃以上、又は38℃以上の温度で実施される。例えば、SSF反応は、50℃以下、45℃以下、40℃以下、38℃以下、35℃以下、又は30℃以下の温度で実施される。例えば、SSF反応は、28℃〜45℃、例えば30℃〜40℃、32℃〜38℃の範囲の温度で実施される。例示的な実施形態では、SSF反応は、32℃〜35℃の温度で実施される。他の実施形態では、SSF反応は約32℃の温度で実施される。実施されるSSF反応の温度は、例えば、反応時に調節して上昇させても低下させてもよい。
発酵生成物は発酵微生物により生成される任意の物質であり得る。特定の態様では、物質はアルコールである。用語「アルコール」には、ヒドロキシル基を1つ以上含有する物質が包含されることが理解されるであろう。特定の態様では、アルコールはアラビニトールである。他の態様では、アルコールはブタノールである。他の態様では、アルコールはエタノールである。他の態様では、アルコールはグリセロールである。他の態様では、アルコールはメタノールである。他の態様では、アルコールは1,3−プロパンジオールである。更に他の態様では、アルコールはソルビトールである。更に他の態様では、アルコールはキシリトーである。例えば、Gong et al.,1999,Ethanol production from renewable resources,in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Scheper,ed.,Springer−Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207〜241;Silveira and Jonas 2002,Appl.Microbiol.Biotechnol.59:400〜408;Nigam,and Singh,1995,Process Biochem.30(2):117〜124;Ezeji et al.,2003,World J.Microbiol.Biotechnol.19(6):595〜603を参照されたい。
本開示のSSFプロセスを実施するにあたり、任意の好適なセルロース系基質又は原材料を使用することができる。基質は所望される発酵生成物に基づいて選択することができ、すなわち、基質は発酵から得られるものであり、選択されるプロセスは当該技術分野において周知のものである。
SSF反応に先立ち、キシラン、ヘミセルロース、セルロース及び/又はリグニン材料を、より酵素で処理しやすいものにするために、ひいては本開示の方法により、より糖化及び発酵しやすくするために、好ましくはバイオマス(例えば、リグノセルロース系材料)には前処理工程を行う。
7.1.材料&方法
7.1.1.基材
以下は本実施例で使用される基質の一覧である。基質を予め処理したセルロース、キシラン、及びリグニン組成物も同様に列挙する。標準的なバイオマス解析手順用のNRELプロトコルに記載の標準的なアッセイを用い、組成解析を実施する(右記URLで利用可能:http://www.nrel.gov/biomass/pdfs/42618):
希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸。トウモロコシの穂軸は、例えば米国特許公開第2007−0031918−A1号、同第2007−0031919−A1号、同第2007−0031953−A1号、同第2007−0037259−A1号、及びPCT特許出願公開第06/110901A2号に記載の方法及び加工範囲に従って、酵素加水分解に先立ち前処理した(別段の記載が無い限り)。基質組成物は:34.8%セルロース、29.2%キシラン、12.8%リグニンを含む。
以下は本実施例で使用される酵素及び酵素混合物の一覧である。
229株:変異導入し、セルロース産生能の高さについて選別することで、RL−P37から誘導される、トリコデルマ・リーゼイ株(Sheir−Neiss and Montenecourt,1984,Appl.Biotechnol.20:46〜53)を、PEG介在型の形質転換法(例えば、Penttila et al.,1987,Gene 61(2):155〜64を参照されたい)を用い、β−グルコシダーゼ発現カセット(cbh1プロモータ、トリコデルマ・リーゼイβ−グルコシダーゼ1遺伝子、cbh1ターミネータ、及びamdSマーカー(アスペルギルス・ニデュランスアセトアミダーゼ)から構成)、及びエンドキシラナーゼ発現カセット(cbh1プロモータ、トリコデルマ・リーゼイxyn3、及びcbh1ターミネータから構成)により同時形質転換した。多数の形質転換体を単離し、β−グルコシダーゼ生成及びエンドキシラナーゼ生成について試験した。トリコデルマ・リーゼイ株229として表される形質転換体は、本明細書に記載の特定の実験で使用した。
7.1.4.1.ザイモモナス・モビリス
背景:ザイモモナス・モビリスのZW1株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関のZM4株(ATCC 31821,Manassas,VA)と類似の野生種株である。ザイモモナス・モビリス組み換え株ZW705は、以下に要約するようにZW801−4株から作製した。ザイモモナス・モビリス株ZW801−4の培養物を次のようなストレス条件下で増殖させた。ZW801−4は、米国特許公開第2008/0286870号に記載のような、キシロースを利用するザイモモナス・モビリス組み換え株である。ZW801−4株は、米国特許第2008/0286870号にすべて記載されるようにZW800株から誘導され、同様にZW658株から誘導される。連続的な遺伝子転位イベントにより、ZW1(ATCC#31821)のゲノムに、キシロース異性化酵素、キシルロキナーゼ(xylulokinase)トランスアルドラーゼ、及びトランスケトラーゼをコードしている4つのキシロース利用遺伝子を含有している、2つのオペロン、PgapxylAB及びPgaptaltktを組み込み、続いてキシロースを含有する選択培地で適応工程を実施することで、ZW658を作製した。ZW658は、ATCC #PTA−7858として登録されている。ZW658では、宿主により介在される、ダブルクロスオーバーな相同組み換えを用い、かつZW800を作製するための選択マーカーとしてスペクチノマイシン耐性を用いることで、挿入により、グルコース−フルクトース酸化還元酵素コード遺伝子が不活化されるかした。ZW801−4を作製するために、Creリコンビナーゼを用い部位特異的な組み換えを行い、loxP部位に結合していたスペクチノマイシン耐性マーカーを除去した。
ザイモモナス・モビリスZW705株及びZW1株は、20%グリセロールストックとして−80℃で凍結させて維持する。種培養のため、2mLの凍結ストックを解凍し、5g/Lの酵母エキス、4g/Lのリン酸水素カリウム、1g/Lの硫酸マグネシウム、及び100g/Lのグルコースを含有している45mLの培地(pH 5.8)に接種した。開始OD 600nmは0.4だった。蓋をした50mLのチューブ内で、OD 600nmが約2.5になるまで32℃で培養物を増殖させ、次いで200g/Lのグルコース、4g/Lのリン酸水素カリウム、2g/Lの硫酸マグネシウム、及び20g/Lの酵母エキスを含有している最終的な種培養培地(pH 5.8)に培養物を接種した。pH制御下で、発酵槽を撹拌しながら、OD 600nmが約10になり、かつ残存グルコース濃度が約80g/Lになるまで、32℃にて培養物を増殖させた。SSF発酵体積の10%に相当する体積の種培養物(OD 600nmは約10)を使用して、SSFを開始した。
C6炭糖(すなわちブドウ糖)のみをエタノール(EtOH)へと発酵することのできるTHERMOSACC(登録商標)ドライ酵母(Ethanol Technology,Milwaukee,WI)を、酵母エタノロジェンとして使用した。接種前に、ドライ酵母を滅菌脱イオン水により2〜3時間水和した。
バッチ式プロセス及びフェドバッチ式プロセスを用い、500mLのSixforsバイオリアクター中で、合成糖を用いるザイモモナス・モビリス発酵を3日間にわたって実施した。合成糖はグルコース及びキシロースからなる。バッチ式プロセスでは、最初に約80g/Lグルコース及び70g/Lキシロースの濃度で糖を充填した。フェドバッチ式プロセスでは、まず、濃縮した糖原液を調製し、次いでシリンジポンプを用い原液をバイオリアクタに供給した(PHD2000,Harvard Apparatus,Holliston,MA)。最終的に、3日目の時点で約80g/Lグルコース及び70g/Lキシロースに相当する糖が充填されるよう、流速を設定し、調節した。バッチ式プロセス又はフェドバッチ式プロセスの際、まず始めにザイモモナス接種材料を反応混合物に10重量%充填し、33℃及びpH 5.5で、発酵を嫌気的に実施した。
好適なザイモモナス・モビリス組み換え体及び酵母発酵条件を用い、SSFフラスコ反応を嫌気的に実施した。別途記載のない限り、希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸、バガス、又はクラフトパルプ基質を、それぞれ固形分充填量25重量%、20重量%、10重量%で用い、組み換えザイモモナスSSF実験を、33℃、pH 5.8で実施した。固形分25重量%(乾燥重量12.5g)、固形分20重量%(乾燥重量10.0g)、又は固形分10重量%(乾燥重量5.0g)の各基質を、まず始めにそれぞれ125mLの三角フラスコに充填し、続いて、基質のpHを5.8に滴定するのに必要とされる量の6N硫酸と予め混合した脱イオン水を加えた。それぞれのバイオマス基質に、上記のセルラーゼ及びヘミセルラーゼ酵素を、セルラーゼタンパク質mg/セルロースg、及びヘミセルラーゼタンパク質mg/キシランgに基づく量で加えた。任意の追加の栄養素は加えずに、10重量%のザイモモナス・モビリスZW705株(組み換え体)又はZW1株(野生型)接種材料(5g)を反応混合物に加え、発酵を開始した。THERMOSACC(登録商標)ドライ酵母SSFに関しては、38℃及びpH 5.0で反応を実施した。接種酵母の濃度は0.1体積/体積%であり、いかなる追加の栄養素も加えなかった。フラスコにふたをするために使用したゴムストッパーから、23ゲージの針を突き出させ、嫌気性環境及びCO2脱ガスを維持した。実施したすべてのSSFで、発酵開始時のフラスコ中の合計反応物重量は50gであり、反応混合物は、前処理した基質、水、硫酸、酵素、及びザイモモナス細胞若しくは酵母細胞のいずれか、から構成された。シェーカーインキュベータ(New Brunswick Scientific,Innova 44,Edison,New Jersey)内で、100RPMで3日間にわたってフラスコを撹拌した。
SHFの実行には、糖化段階と、それに続く発酵段階を包含した。糖化条件は、酵素の種類及び/又は濃度、セルロースの充填、及びpHに特定の変更を加えたことを除き、NREL Laboratory Analytical Procedure(Selig et al.,2008,Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass Laboratory Analytical Procedure(LAP),Technical Report NREL/TP−510−42629を参照されたい)に基づいた。希アンモニアで前処理した、固形分25重量%(乾燥重量12.5g)のトウモロコシの穂軸、又は固形分10重量%(乾燥重量5.0g)の広葉樹の混合パルプを125mLの三角フラスコに充填した。次いで、このフラスコに、基質のpHを5.3に滴定するのに必要とされる量の6N硫酸と予混合した脱イオン水を加えた。セルラーゼ及びヘミセルラーゼ酵素を、それぞれのバイオマス基質に、タンパク質mg/セルロースg、及びタンパク質mg/キシランgに基づく量で加え、糖化工程を開始した。すべてのザイモモナスSHFの実施に関し、温度50℃及びpH 5.30を3日間の持続的な糖化に用い、続く発酵工程では、SSFプロセス(上記)に記載のものと同様の条件を用いた。水酸化ナトリウムを使用して、pHを5.3から5.8へと上昇させた。続いて10重量%のザイモモナス接種材料を添加して発酵を開始させた。
希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸基質(最終固形分25重量%が得られる量)を均等に8バッチに分け、30時間の時点で最終バッチが充填されるようフェドバッチ式にバイオリアクターに供給したことを除き、SSFプロセス(上記)に記載のものと同様の条件でフェドバッチ式SSF実験を実施した。
予め設定した時間間隔で発酵試料を採取し、Waters HPLC系(Alliance system,Waters Corp.,Milford,MA)を用い、エタノール、残存糖類、エチル−β−キシロピラノシド(EXP)、及び他の代謝生成物(例えば酢酸及びグリセロール)について解析した。HPLCカラムはBioRadから購入した(Aminex HPX−87H,BioRad Inc.,Hercules,CA)。屈折率を検出しEXP定量を行い、続いてZhang et al.(2009,Enzyme and Microbial Technology 44:196〜202)に記載のものと同様の手順を行った。他の代謝副産物、コハク酸がEXPにより共溶出され、EXP定量を増量させている可能性があることが判明した。220nmの紫外検出器及び酵素を用いるアッセイキット(K−SUCC,Megazyme,Co.Wicklow,Ireland)の両方を使用して測定した結果、酵母及びザイモモナス発酵に関し、試験条件で生成されたコハク酸濃度は1〜2g/L未満であることが結論づけられた。
7.2.1.EXP生成及び同定
7.2.1.1.ザイモモナス・モビリス組み換え体を用いるSSF時のEXP生成
上記のSSF発酵条件下で、グルコース及びキシロースをエタノールへと共発酵させることのできるザイモモナス・モビリス組み換え株を用いることで、副産物の生成が観察された。本実験には、キシラン含量が高いトウモロコシの穂軸を希アンモニアで前処理したものを基質として使用し、この基質をトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)から誘導される、市販のセルラーゼ/ヘミセルラーゼ酵素調製物(20mg/gセルロースのAccellerase(商標)1500)及びMultifect(登録商標)キシラナーゼ(5mg/gキシラン)で処理した。試験条件下で、副産物の生成はフェドバッチ式SSFで最も多量であり、SSFで2番目に多量であることが判明した(表1)。希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸を用いるSHF、糖(80g/Lグルコース+70g/Lキシロース)を用いるバッチ式及びフェドバッチ式発酵プロセスでは、この副産物の生成は少なかった。
メチル−キシロピラノシド、エチル−キシロピラノシド及びn−プロピルキシロピラノシドの出現についての時間経過を図2に示す。100時間後に生成された生成物の相対量は次のとおりであり:メチル−>エチル−>n−プロピル−キシロシド(図2)、MeOH、EtOH、及びn−PrOHの存在下での、脱水縮合によるアルキル−β−D−キシロピラノシドの生成に関する、Drouet et al.(in 1994,Biotech.&Bioeng.43:1075〜1080)の報告と一致する。エチルキシロピラノシド(EXP)の溶出時間が、SSF条件下で観察されるものと一致すること、溶出時間がアルコールの存在及び性質並びにこれらのアルコールの相対的な活性に対し依存することなどのすべてが、EXPがSSF条件下で生成される副産物であったことを示唆していた。
エチルb−D−キシロピラノシド標準の調製:50mgのD−キシロースを3mLのエタノールに溶解させ、得られた溶液を、アンバーリスト15H+樹脂(100mg)の存在下で70℃で3時間加熱することで、エチルキシロシド試料を調製した。樹脂をろ過し、エタノール溶媒を減圧下留去して無色油を生成した。1H NMR解析により、エチルキシロシド混合物は、a−D−キシロピラノシドが主成分であり、その他にエチルβ−キシロピラノシド及びエチルα/β−キシロフラノシドを含むものであることが明らかになった。
希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸基質を使用するSSF及びフェドバッチ式SSF条件下で、エタノロジェンのザイモモナス・モビリスを用いる、C5/C6糖の共発酵により、高濃度のEXPが得られた。SSFを野生型酵母及びザイモモナス・モビリス(C6糖のみを発酵することのできる微生物)を用いて実施した場合にEXPが生成されるのか否かを判定するため、新規の実験を設計した。結果(図4)は、酵母(5.5g/L)又は野生型ザイモモナス・モビリス(9.1g/L)に発酵させた場合に、SSF反応でEXPが高濃度で生成されたことを示す。したがって、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエ及び野生型ザイモモナス・モビリスによるSSF時にも検出されたことから、EXP産生はザイモモナス・モビリス組み換え体に特異的なものではなかった。
希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸以外の基質を用いた場合にもEXPを生成させることができるかを判定するために、更なる実験を設計した。表2に示される結果から、EXP生成は、SSF条件下での、トリコデルマ・リーゼイセルラーゼ/ヘミセルラーゼ調製物による、キシラン含量の高い任意の基質の発酵に関連付けられることが明らかである。例えば、組み換えザイモモナスSSF条件下で、キシラン含量の高い工業用広葉樹混合クラフトパルプを用いることで、16.1g/LものEXPが生成された。それに対し、キシラン含量の低い基質、例えば前処理したバガス及び針葉樹パルプでは、同様の条件下で生成されたEXP量が少なかった(それぞれ0.91及び4.75g/L)。更に、本明細書に記載のSSFプロセス下でのみ大量のEXPが生成され得ることが再度証明された。SHFプロセス条件下だと、よりキシラン含量の高い基質を使用した場合でさえも、EXP生成は著しく低下した(3.52g/L)。
7.2.4.1.Bxl1によるEXP生成
Drouet et al.(in 1994,Biotech.&Bioeng.43:1075〜1080)に従って、キシロシル基転位反応(transxylosylation)及び脱水縮合反応の両方を介し、トリコデルマ・リーゼイBxl1によりEXP生成を触媒した。図5は、上記の酵母SSF条件下でのEXP生成が、トリコデルマ・リーゼイBxl1の存在下で増加したことを示す。5mg/g Bxl1の添加により、EXP生成量が5.5g/Lから18.8g/Lに増加した。
上記に議論された結果は、EXP生成が、トリコデルマ・リーゼイBxl1強く影響を受け、かつ効果的に触媒されたことを示す。トリコデルマ・リーゼイBxl1は、キシラン高含有のバイオマス基質を用いる、SSF条件下でのEXP生成に顕著にかつ非常に有効である。しかしながら、今までのところ試験した(及び上記で議論した)すべての酵素は未精製品であり、トリコデルマ・リーゼイBxl1と同様にEXPを生成することのできる持ち込み酵素活性を含有している可能性がある。持ち込み酵素活性の効果を調査するために、EXP生成に対する精製酵素の効果も試験した。精製トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼ、CBH1及びCBH2;トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼ、EG2;及びトリコデルマ・リーゼイβ−グルコシダーゼ、Bgl1、からなるセルラーゼ混合物を、Accellerase(商標)1500の基質として使用した一方、精製トリコデルマ・リーゼイXyn3を、Multifect(商標)キシラナーゼの代わりに使用した。図8に示された結果から、セルラーゼ単独ではEXPが生成されないことは明らかである。未精製のトリコデルマ・リーゼイXyn3を添加することで、大量のEXPが、例えば約13.1g/LのEXPが生成された。この大幅な増加は、未精製のトリコデルマ・リーゼイXyn3試料中に存在する持ち込みトリコデルマ・リーゼイBxl1がより多量であることに起因する可能性がある。
GH3ファミリーの加水分解酵素であるBxl1は、SSF条件下(上記)でのEXPの生成を活発にかつ有効に触媒することが示された。他のGHファミリーβ−キシロシダーゼも、同様の条件下でEXPの生成を触媒し得るのか否かについては疑問が残る。Fv43B、Pf43A、Fv43E、及びAf43Aを包含する、GH43ファミリー由来の様々なβ−キシロシダーゼを、希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸の固形分25重量%の基質を用い、組み換えザイモモナスSSF条件下で試験した。Pf43A、Fv43E、及びAf43Aは、229株のタンパク質調製物から作製した対照試料と比較して、EXP生成をわずかに増加させることが判明した。それに対し、Fv43Bは、EXP生成を1.5倍も増加させた(図9)。これらのGH43ファミリーの酵素のすべてがトリコデルマ・リーゼイで発現したものであったこと、並びに本実験においてこれらのすべてが未精製のタンパク質調製物であったことから、EXP生成の増加は、タンパク質調製物中に存在する天然Bxl1に起因し得ることが仮定され得る。
以降の例は、SSF反応に特定のヘミセルラーゼを添加することにより、EXPが減少することを示す。
典型的には、EXP生成はキシロース(直接的にはキシロース、又はキシロビオース若しくは他のキシロオリゴマー)及びエタノールの両方を等モルベースで消費する。ザイモモナスを包含する多くの微生物にはEXPを分解及び発酵することができないことから、ないしはEXPを利用することができないことから、この消費機構はエタノールの収率を実質的に減少させる直接の原因になる。1gのEXPを存在させることは、生成されることになるエタノール(0.51g/キシロースgの速度でキシロースが消費されエタノールへと発酵される)を0.688g損失させることと等価であると計算される。したがって、EXPの生成を防ぐことで、結果としてエタノール収率を増加させることができる。図10に示すように、フザリウム・バーティシリオイデスのβ−キシロシダーゼ、Fv43Dをほんの1mg/キシランg添加することで、組み換えザイモモナスのSSF条件下で生成されるEXPの量が非常に減少する(約4倍)ことが判明した。
C5/C6を発酵する組み換えザイモモナスから得られる結果と同様に、C6を発酵する微生物として酵母を用いるSSF反応にAccellerase(商標)1500+Multifect(登録商標)キシラナーゼとFv43Dを添加することでも、EXP生成が減少した。具体的には、Fv43Dを1mg/キシランg添加することで、EXPが2〜3倍減少した(図11)。
組み換えザイモモナスのSSF条件下で、3つの酵素組成Accellerase(商標)1500+Multifect(登録商標)キシラナーゼ、Accellerase(商標)1500+アスペルギルス・ニガーキシラナーゼ、及びトリコデルマ・リーゼイ組み換え株229から生成される酵素複合体、にFv43Dを加えることで、EXPの減少率を調査した。固形分25重量%の、希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸を、基質として用いた。
Fv43Dに由来するEXPの減少が、持ち込み酵素活性によるものではなかったことを保証するため、精製Fv43Dを包含する精製酵素を用い、EXP生成の減少について試験した。精製CBH1、CBH2、EG2及びBgl1のトリコデルマ・リーゼイセルラーゼ混合物をAccellerase(商標)1500の代わりに使用し、かつ精製トリコデルマ・リーゼイXyn3をMultifect(登録商標)キシラナーゼの基質として使用した。図13に記載の結果は、精製及び未精製Fv43Dを添加した場合に、EXP生成のわずかな減少を示し、かつ結果としてエタノール力価のわずかな増加を示した。EXP生成が比較的わずかに減少したのは、精製酵素(例えば、セルラーゼ及びXyn3)中にトリコデルマ・リーゼイBxl1の持ち込み酵素が存在しなかったことに起因する可能性がある。トリコデルマ・リーゼイXyn3の作用に起因し、対照試料により生成されたEXPの量が非常に少なかったことも観察された。したがってFv43Dを更に添加してもEXP生成は実質的に減少しない。この点を更に調査するために、図14Aに示す結果を有する他の実験を実施して、多量のBxlの存在下でFv43Dを添加することによるEXPの減少効果を調査した。
Bxl1の存在下でのEXP生成は、相当なものであり、使用したSSF条件により正確な量は変化するものの、20g/L以上のEXPが一貫して検出された。EXP生成の減少をFv43Dの添加量との関連で評価するため、用量反応試験を実施した。図14Aは、トリコデルマ・リーゼイ組み換え株229及びトリコデルマ・リーゼイBxl1から生成される酵素複合体へのFv43Dの添加量を増加させることで、EXPの減少に関して得られた結果を示す。以前に示した結果と同様、1mg/gのFv43DはEXP生成を3倍近く減少させるのに効果的であると同時に、エタノール力価を上昇させることが判明した。しかしながら、Fv43Dの添加量を3、6、及び9mg/g増加させても、エタノール力価の有意な上昇が観察されるにも関わらずEXP生成は大きく減少しない。Fv43Dを大量(9mg/g)に添加した場合でさえも、EXP濃度は6.6g/L以下に減少せず、EXPの量は試験に使用した特定の条件についてその濃度で平衡に達している可能性があることが明らかであった。3種類の特定の実験条件下で、Fv43Dを更に(例えば1mg/キシランg)添加したところで、EXP生成の減少には何ら影響なかった。
反転型GH43ファミリーβ−キシロシダーゼであるFo43A及びGz43Aも、本明細書に記載のSSF条件下でEXP生成を減少させる効果について試験した。図14Bに示す結果に基づくと、トリコデルマ・リーゼイ組み換え株229から生成されるタンパク質複合体、トリコデルマ・リーゼイBxl1、希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸基質、及び組み換えザイモモナス、及び3mg/キシランgを含む酵素ブレンドに添加した場合に、これらの2つの酵素はそれぞれEXP生成を4倍近く減少させた。Fv43D(上記)を添加した場合に観察されたものと同様、EXP生成の減少及び対応するエタノール力価の上昇(約10g/L)が観察された。
SSF条件下で、フザリウム・バーティシリオイデスβ−キシロシダーゼFv43Dの存在下で生成されるEXPと比較して、フザリウム・バーティシリオイデスβ−キシロシダーゼFv3Aの存在下でEXPがおよそ4倍も多く生成された(図10及び11)ことは、EXP生成機構を理解するための手がかりをもたらす。
1)糖鎖転移化反応:X−O−X+EtOH→X−O−Et+X
2)脱水縮合:X+EtOH⇔X−O−Et+H2O
Drouet et al.(1994,Biotech.& Bioeng.43:1075〜1080)によると、糖鎖転移機構はこれら2つの経路のなかでより急速なものである。βアノマーのみ(図29を参照のこと)が糖鎖転移反応で生成されるという事実は、反応が、アノマーの立体配置を保持するよう制御する酵素により触媒されることを意味する。この場合、糖はβ−グリコシル結合により結合する。それに対し、脱水縮合によりEXPのβアノマーが生成される場合、アノマーの立体配置の反転又は保持のいずれによりEXPが生成されるのかによって、開始基質がそれぞれα−又はβ−キシロースのいずれであるか決まることを示唆する。
SSF条件下で、Multifect(登録商標)キシラナーゼ及びFv3Aは、キシロビオースだけでなく、より多量のキシロースオリゴマーとも遭遇する。キシロースオリゴマーが加水分解されることで、EXP産量が増加し得る。切断によりEXPが生成される場合、オリゴマー生成物のうちの一つが糖鎖転移されて、エチルグリコシル付加物が生成される。糖鎖転移反応により更に切断することで、次いで追加のエチル付加物が生成され、キシロビオースのみを糖鎖転移した場合に観察されるものと比較して、EXP生成対キシロース生成の比が大きくなる場合がある。例えば、
3)X4+EtOH→X2−Et+X2
4)X2−Et+EtOH→2EXP
5)X2+EtOH→EXP+X
キシロビオースのみを糖鎖転移させた場合、EXP生成のみが5)の反応由来のものであることが記載される。
Drouet et al.(in 1994,Biotech.& Bioeng.43:1075〜1080)により、脱水縮合によるアルキル−キシロピラノシド(AXP)(例えばEXP)の生成範囲は、アルコール、キシロース及びアルキル−キシロピラノシド生成物間に得られる平衡関係によって割り出すことができることが示唆された。
10.1bxl1欠失カセットの作製bxl1欠失カセットを作製するため、PfuUltra II Fusion HS DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用い、プライマー対MH375/MH376及びMH377/MH378をそれぞれ(表4に示す)使用して、PCRによりトリコデルマ・リーゼイのゲノムDNAから、bxl1遺伝子の5’及び3’フランキング配列(Margolles−Clark et al.,1996,App.Environ.Microbiol.62(10):3840〜6)を増幅させた。bgl1遺伝子付近が含有されることを回避するため、3’フランキング配列にはBxl1コード配列の一部を含有させた。プライマーMH376の5’末端をリン酸化した。5U/μL(Roche Applied Bioscience)の濃度のT4 DNAリガーゼ1μl、10X ligation buffer(Roche)1μL及びPCRフラグメントおよそ20ngを、合計容量10μLで室温で10分にわたってインキュベートした。ライゲーション反応の混合物を、PCR反応のテンプレートとして、プライマー対MH379/MH380及びPfuUltra II Fusion HS DNAポリメラーゼ(Stratagene)と共に使用した。
本明細書中に前述したように、トリコデルマ・リーゼイBgl1及びトリコデルマ・リーゼイXyn3を過剰発現させたトリコデルマ・リーゼイ株229を、bxl1−欠失カセットのDNAで形質転換した。100ppmのハイグロマイシンB(Invitrogen)を含有している培地で、形質転換体を選択した。bxl1欠失カセットを含有している形質転換体をPCRにより選択した。本明細書では、bxl1−欠損トリコデルマ・リーゼイ株を「bxl1−」株として参照する。
以降の例により、どのようにしてトリコデルマ・リーゼイを遺伝子操作してFv43Dを発現させたかを示す。本明細書では、Fv43Dを発現するよう遺伝子操作されたトリコデルマ・リーゼイ株を、「Fv43D+」株として参照する。
プライマーSK1322/SK1297(表5)を用い、フザリウム・バーティシリオイドゲノムDNAサンプル中のFv43D遺伝子をPCR増幅することでフザリウム・バーティシリオイドβ−キシロシダーゼFv43Dの発現カセットを作製した。遺伝子操作したトリコデルマ・リーゼイ株RL−P37から抽出した、トリコデルマ・リーゼイゲノムDNAサンプル中の、エンドグルカナーゼ遺伝子egl1のプロモータ領域を、プライマーSK1236/SK1321を用い増幅させた(例えば,Sheir−Neiss G.and B.S.Montenecourt,Appl.Biotechnology,20(1984)pp.46〜53を参照されたい)。増幅させた2つのフラグメントを、続いて、プライマーSK1236/SK1297を用い、PCR反応で一緒に融合させた。得られたPCRフラグメントをpCR−Blunt II−TOPOベクター(Invitrogen)にクローン化し、プラスミドTOPO Blunt/Pegl1−Fv43D(図18)を生成し、次にプラスミドを用い、E.coli One Shot(登録商標)TOP10 chemically competent cells(Invitrogen)を形質転換した。複数のE.coliクローンからプラスミドDNAを抽出し、制限酵素で消化して確認した。
標準的な形質転換方法(例えば、電気穿孔法など)を用い、bxl1−欠失トリコデルマ・リーゼイ宿主株を、Fv43D発現カセット(eg1プロモータ,Fv43D翻訳領域,及びFv43Dの天然ターミネータを含む)、及び存在している、天然als遺伝子を含有している選択マーカーカセットにより、形質転換した(例えば、PCT特許出願公開第08/153712号を参照されたい)。クロリムロンエチルを含有している最少培地の寒天プレートで形質転換体を選択した。これらの形質転換体はbxl1−Fv43D+トリコデルマ・リーゼイである。
野生型bxl1遺伝子を有するトリコデルマ・リーゼイ宿主株(PCT特許出願公開第2005/001036(A2)号)を、標準的な形質転換法、例えば、電気穿孔法を用い、Fv43D発現カセット(eg1プロモータ,Fv43D翻訳領域,及びFv43Dの天然ターミネータを含む)、及び存在する、天然als遺伝子を含有する選択マーカーカセットにより、形質転換した(例えば、PCT特許出願公開第08/153712号を参照されたい)。クロリムロンエチルを含有している最少培地の寒天プレートで形質転換体を選択した。これらの形質転換体はFv43D+トリコデルマ・リーゼイである。
形質転換体bxl1−Fv43D+トリコデルマ・リーゼイ、及びFv43D+トリコデルマ・リーゼイを使用して、セルラーゼ含有培養ブロスを生成する。次いで、本明細書に記載のとおりに、これらの培養ブロスを、連続式、バッチ式、又はフェドバッチ式SSF反応に使用し、脱水縮合生成物のトランスキシロシル化(trans-xylosication)により、AXP生成を減少させ、かつ糖収率の低下を減少させる。
Claims (129)
- 発酵微生物を少なくとも1つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも1つ、セルラーゼを少なくとも1つ、ヘミセルラーゼを少なくとも1つ、及び反転型β−キシロシダーゼを少なくとも1つ含む完全発酵培地を、発酵生成物の生成に好適な期間及び条件下で培養することを包含する、同時糖化発酵(SSF)の方法。
- 前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地が生成する短鎖アルキル−β−キシロピラノシド(「AXP」)の量よりも、前記完全発酵培地が生成するAXPの量が少なくなるように、有効な量の前記反転型β−キシロシダーゼを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地が生成するAXPよりも、前記完全発酵培地が生成するAXPが少なくとも40パーセント減少するように、有効な量の前記反転型β−キシロシダーゼを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地が生成するAXPよりも、前記完全発酵培地が生成するAXPが少なくとも50パーセント減少するように、有効な量の前記反転型β−キシロシダーゼを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地が生成するAXPよりも、前記完全発酵培地が生成するAXPが少なくとも60パーセント減少するように、有効な量の前記反転型β−キシロシダーゼを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地が生成するAXPよりも、前記完全発酵培地が生成するAXPが少なくとも70パーセント減少するように、有効な量の前記反転型β−キシロシダーゼを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記AXPが、メチル−β−キシロピラノシド(MXP)、エチル−β−キシロピラノシド(EXP)、プロピル−β−キシロピラノシド(PXP)、又はブチル−β−キシロピラノシド(BXP)である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地の培養から得られる前記発酵生成物の収率と比較して、前記発酵生成物の収率を増加させるのに有効な量の前記反転型β−キシロシダーゼを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記発酵生成物の収率が少なくとも1%増加する、請求項8に記載の方法。
- 前記発酵生成物の収率が少なくとも2%増加する、請求項9に記載の方法。
- 前記発酵生成物の収率が少なくとも3%増加する、請求項10に記載の方法。
- 前記発酵生成物の収率が少なくとも5%増加する、請求項11に記載の方法。
- 前記発酵生成物の収率が少なくとも7.5%増加する、請求項12に記載の方法。
- 前記発酵生成物の収率が少なくとも10%増加する、請求項13に記載の方法。
- 前記発酵生成物がアルコールである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール、プロパン−1,3−ジオール、又はブタノールである、請求項15に記載の方法。
- 前記反転型β−キシロシダーゼがGH43ファミリー酵素である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反転型β−キシロシダーゼが、Fv43D、Pf43A、Fv43E、Fv43B、Af43A、Fo43A、Gz43A又はXynB3ポリペプチドである、請求項17に記載の方法。
- 前記Fv43Dポリペプチドが、配列番号2、又は配列番号2の残基21〜350に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項18に記載の方法。
- 前記Pf43Aポリペプチドが、配列番号8、又は配列番号8の残基21〜455に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項18に記載の方法。
- 前記Fv43Eポリペプチドが、配列番号10、又は配列番号10の残基19〜530に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項18に記載の方法。
- 前記Fv43Bポリペプチドが、配列番号12、又は配列番号12の残基17〜574に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項18に記載の方法。
- 前記Af43Aポリペプチドが、配列番号14、又は配列番号14の残基15〜558に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項18に記載の方法。
- 前記Fo43Aポリペプチドが、配列番号24、又は配列番号24の残基21〜348に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項18に記載の方法。
- 前記Gz43Aポリペプチドが、配列番号22、又は配列番号22の残基19〜340に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項18に記載の方法。
- 前記XynB3ポリペプチドが、配列番号25に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項18に記載の方法。
- 前記反転型β−キシロシダーゼが、前記キシラン含有バイオマス中のキシラン1グラム当たり0.3mg〜10mgの濃度で、前記完全発酵培地中に存在する、請求項17〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反転型β−キシロシダーゼが、前記キシラン含有バイオマス中のキシラン1グラム当たり0.4mg〜10mgの濃度で存在する、請求項27に記載の方法。
- 前記反転型β−キシロシダーゼが、前記キシラン含有バイオマス中のキシラン1グラム当たり0.3mg〜3mgの濃度で存在する、請求項27に記載の方法。
- 連続式、バッチ式、又はフェドバッチ式SSFプロセスとして実施される、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記完全発酵培地を調製する工程を更に含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記完全発酵培地を調製する工程が、(a)前記発酵微生物、(b)前記キシラン含有バイオマス、(c)前記セルラーゼ、(d)前記ヘミセルラーゼ、(e)前記反転型β−キシロシダーゼ、及び(f)(a)〜(e)の1つ以上又はすべてを含まない培地、を混合すること含む、請求項31に記載の方法。
- 前記セルラーゼが、全セルラーゼ調製物の形態で存在する、請求項32に記載の方法。
- 前記全セルラーゼ調製物が、ヘミセルラーゼを含む、請求項33に記載の方法。
- 前記全セルラーゼ調製物が、糸状菌の培養から得られる培養ブロスである、請求項33又は34に記載の方法。
- 前記糸状菌がトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)である、請求項35に記載の方法。
- 前記トリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)が、前記天然β−キシロシダーゼ遺伝子が欠失する又は不活性化するように遺伝子操作された、請求項36に記載の方法。
- 前記発酵微生物が真菌である、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真菌がサッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)酵母である、請求項38に記載の方法。
- 前記発酵微生物がバクテリアである、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記バクテリアがザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)である、請求項40に記載の方法。
- 前記キシラン含有バイオマスが、トウモロコシ茎葉、バガス、モロコシ、大きな根茎のある多年生草本(giant reed)、エレファントグラス(elephant grass)、茅、杉、麦わら、スイッチグラス、広葉樹パルプ、又は針葉樹パルプである、請求項1〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キシラン含有バイオマスがスラリーである、請求項42に記載の方法。
- 前記キシラン含有バイオマスが前処理された、請求項42又は43に記載の方法。
- 前記発酵生成物を回収する工程を更に含む、請求項1〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記完全発酵培地が、モル基準において、分子量基準において、又はモル基準及び分子量基準の両方において、保持型β−キシロシダーゼの量よりも多い反転型β−キシロシダーゼの量を含む、請求項1〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記完全発酵培地中の前記反転型β−キシロシダーゼ対前記保持型β−キシロシダーゼの比が、モル基準において、分子量基準において、又はモル基準及び分子量基準の両方において、少なくとも2:1である、請求項46に記載の方法。
- 前記天然β−キシロシダーゼ遺伝子を欠失する、又は検出可能なβ−キシロシダーゼ活性を有さないように遺伝子操作された、トリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞。
- 遺伝子組換えによりGH43ファミリー酵素を発現するよう遺伝子操作された、請求項48に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞。
- 遺伝子組換えによりFv43D、Pf43A、Fv43E、Fv43B、Af43A、Fo43A、Gz43A、又はXynB3ポリペプチドを発現するよう遺伝子操作された、請求項48に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞。
- 前記Fv43Dポリペプチドが、配列番号2、又は配列番号2の残基21〜350に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項49又は50に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞。
- 前記Pf43Aポリペプチドが、配列番号8、又は配列番号8の残基21〜445に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項51に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞。
- 前記Fv43Eポリペプチドが、配列番号10、又は配列番号10の残基19〜530に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項51に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞。
- 前記Fv43Bポリペプチドが、配列番号12、又は配列番号12の残基17〜574に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項51に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞。
- 前記Af43Aポリペプチドが、配列番号14、又は配列番号14の残基15〜558に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項51に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞。
- 前記Fo43Aポリペプチドが、配列番号24、又は配列番号24の残基21〜348に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項51に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞。
- 前記Gz43Aポリペプチドが、配列番号22、又は配列番号22の残基19〜340に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項51に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞。
- 前記XynB3ポリペプチドが、配列番号25に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項51に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞。
- 前記セルラーゼ調製物の生成を得られる条件下で、請求項49〜58のいずれか一項に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞を培養することを含む、セルラーゼ調製物の生成方法。
- 前記セルラーゼ調製物を回収することを更に含む、請求項59に記載の方法。
- 請求項59又は60に記載の方法を実施することで得られるセルラーゼ調製物。
- 請求項49〜58のいずれか一項に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞を培養することで生成される培養ブロス。
- 前記バイオマスと、請求項61に記載のセルラーゼ調製物を接触させることを含む、バイオマス糖化方法。
- 前記バイオマスと、請求項62に記載の培養ブロスを接触させることを含む、バイオマス糖化方法。
- 発酵微生物を少なくとも1つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも1つ、セルラーゼを少なくとも1つ、ヘミセルラーゼを少なくとも1つ、及び反転型β−キシロシダーゼを少なくとも1つ含む、組成物。
- 前記反転型β−キシロシダーゼがGH43ファミリー酵素である、請求項65に記載の組成物。
- 前記反転型β−キシロシダーゼが、Fv43D、Pf43A、Fv43E、Fv43B、Af43A、Fo43A、Gz43A又はXynB3ポリペプチドである、請求項65に記載の組成物。
- 前記Fv43Dポリペプチドが、存在する場合、配列番号2、又は配列番号2の残基21〜350に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項66又は67に記載の組成物。
- 前記Pf43Aポリペプチドが、存在する場合、配列番号8、又は配列番号8の残基21〜445に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項66又は67に記載の組成物。
- 前記Fv43Eポリペプチドが、存在する場合、配列番号10、又は配列番号10の残基19〜530に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項66又は67に記載の組成物。
- 前記Fv43Bポリペプチドが、存在する場合、配列番号12、又は配列番号12の残基17〜574に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項66又は67に記載の組成物。
- 前記Af43Aポリペプチドが、存在する場合、配列番号14、又は配列番号14の残基15〜558に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項66又は67に記載の組成物。
- 前記Fo43Aポリペプチドが、存在する場合、配列番号24、又は配列番号24の残基21〜348に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項66又は67に記載の組成物。
- 前記Gz43Aポリペプチドが、存在する場合、配列番号22、又は配列番号22の残基19〜340に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項66又は67に記載の組成物。
- 前記XynB3ポリペプチドが、存在する場合、配列番号25に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項66又は67に記載の組成物。
- 前記キシラン含有バイオマスが、トウモロコシ茎葉、バガス、モロコシ、大きな根茎のある多年生草本(giant reed)、エレファントグラス(elephant grass)、茅、杉、麦わら、スイッチグラス、広葉樹パルプ、又は針葉樹パルプである、請求項65〜75のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記発酵微生物が真菌又はバクテリアである、請求項65〜76のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記真菌がサッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)酵母である、請求項77に記載の組成物。
- 前記バクテリアがザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)である、請求項77に記載の組成物。
- 前記セルラーゼが全セルラーゼ調製物の形態で存在する、請求項65〜79のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記全セルラーゼ調製物が、ヘミセルラーゼを含む、請求項80に記載の組成物。
- 前記組成物が、保持型β−キシロシダーゼを実質的に含まず、又は検出可能な保持型β−キシロシダーゼ活性を有さない、請求項65〜81のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項65〜82のいずれか一項に記載の組成物を一定期間培養することを含む、発酵生成物の生成方法。
- 前記発酵生成物がアルコールである、請求項83に記載の方法。
- 前記アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール、プロパン−1,3−ジオール、又はブタノールである、請求項84に記載の方法。
- 発酵微生物を少なくとも1つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも1つ、セルラーゼを少なくとも1つ、ヘミセルラーゼを少なくとも1つ、及び保持型β−キシロシダーゼを少なくとも1つ含む完全発酵培地を、アルキル−β−キシロピラノシド(「AXP」)の生成に好適な期間及び条件下で培養することを包含する、同時糖化発酵(SSF)の方法。
- 前記完全発酵培地が、保持型β−キシロシダーゼを含まない、又はより少量で含む対照発酵培地が生成するAXPよりも多く前記完全発酵培地がAXPを生成するのに有効な量の前記保持型β−キシロシダーゼを含む、請求項86に記載の方法。
- 前記AXPが、メチル−β−キシロピラノシド(MXP)、エチル−β−キシロピラノシド(EXP)、プロピル−β−キシロピラノシド(PXP)、又はブチル−β−キシロピラノシド(BXP)である、請求項86又は87に記載の方法。
- 前記保持型β−キシロシダーゼが、GH3、GH30、GH31、GH39、GH52、GH54、又はGH116ファミリー酵素である、請求項86〜88のいずれか一項に記載の方法。
- 前記保持型β−キシロシダーゼが、XlnD、Fv30A、Fv30B、Fv39A、Fv39B、又はXynBポリペプチドである、請求項86〜89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記XlnDポリペプチドが、配列番号40、又は配列番号40の残基18〜804に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項90に記載の方法。
- 前記Fv30Aポリペプチドが、配列番号42、又は配列番号42の残基20〜537に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項90に記載の方法。
- 前記Fv30Bポリペプチドが、配列番号44、又は配列番号44の残基25〜485に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項90に記載の方法。
- 前記Fv39Aポリペプチドが、配列番号46、又は配列番号46の残基20〜439に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項90に記載の方法。
- 前記Fv39Bポリペプチドが、配列番号48、又は配列番号48の残基19〜456に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項90に記載の方法。
- 前記XynBポリペプチドが、配列番号50に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項90に記載の方法。
- 前記XylAポリペプチドが、配列番号52、又は配列番号52の残基19〜705に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項90に記載の方法。
- 前記Xyl1ポリペプチドが、配列番号54に相当するアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項90に記載の方法。
- 連続式、バッチ式、又はフェドバッチ式SSFプロセスとして実施される、請求項86〜98のいずれか一項に記載の方法。
- 前記完全発酵培地を調製する工程を更に含む、請求項86〜99のいずれか一項に記載の方法。
- 前記完全発酵培地を調製する工程が、(a)前記発酵微生物、(b)前記キシラン含有バイオマス、(c)前記セルラーゼ、(d)前記ヘミセルラーゼ(e)前記保持型β−キシロシダーゼ、及び(f)(a)〜(e)の1つ以上又はすべてを含まない培地、を混合すること含む、請求項100に記載の方法。
- 前記セルラーゼが、全セルラーゼ調製物の形態で存在する、請求項101に記載の方法。
- 前記全セルラーゼ調製物が、ヘミセルラーゼを含む、請求項102に記載の方法。
- 前記全セルラーゼ調製物が、糸状菌の培養から得られる培養ブロスである、請求項102又は103に記載の方法。
- 前記糸状菌がトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)である、請求項104に記載の方法。
- 前記トリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)が、天然保持型β−キシロシダーゼ遺伝子を過剰発現させる、又は外来保持型β−キシロシダーゼ遺伝子を発現させるよう遺伝子操作された、請求項105に記載の方法。
- 前記発酵微生物が真菌又はバクテリアである、請求項86〜106のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記キシラン含有バイオマスが、トウモロコシ茎葉、バガス、モロコシ、大きな根茎のある多年生草本(giant reed)、エレファントグラス(elephant grass)、茅、杉、麦わら、スイッチグラス、広葉樹パルプ、又は針葉樹パルプである、請求項86〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キシラン含有バイオマスが前処理された、請求項108に記載の方法。
- 前記AXP化合物を回収する工程を更に含む、請求項86〜108のいずれか一項に記載の方法。
- 前記完全発酵培地が、モル基準において、分子量基準において、又はモル基準及び分子量基準の両方において、反転型β−キシロシダーゼよりも多い量の保持型β−キシロシダーゼを含む、請求項86〜110のいずれか一項に記載の方法。
- 天然β−キシロシダーゼ遺伝子が過剰発現される、又は外来β−キシロシダーゼ遺伝子を発現されるように遺伝子操作された、トリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞。
- 遺伝子組換えによりGH3、GH30、GH31、GH39、GH52、GH54、又はGH116ファミリー酵素を発現するよう遺伝子操作された、請求項112に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞。
- 遺伝子組換えによりXlnD、Fv30A、Fv30B、Fv39A、Fv39B、XynB、XylA、又はXyl1ポリペプチドを発現するよう遺伝子操作された、請求項112に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞。
- 前記セルラーゼ調製物の生成を得られる条件下で、請求項112〜114のいずれか一項に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞を培養することを含む、セルラーゼ調製物生成の方法。
- 前記セルラーゼ調製物を回収することを更に含む、請求項115に記載の方法。
- 請求項115又は116に記載の方法を実施することで得られるセルラーゼ調製物。
- 請求項112〜114のいずれか一項に記載のトリコデルマ・リーゼイ(T. reesei)細胞を培養することで生成される培養ブロス。
- 前記バイオマスと、請求項117に記載のセルラーゼ調製物を接触させることを含む、バイオマス糖化方法。
- 前記バイオマスと、請求項118に記載の培養ブロスを接触させることを含む、バイオマス糖化方法。
- 発酵微生物を少なくとも1つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも1つ、セルラーゼを少なくとも1つ、ヘミセルラーゼを少なくとも1つ、及び保持型β−キシロシダーゼを少なくとも1つを含む、組成物。
- 前記保持型β−キシロシダーゼが、GH3、GH30、GH31、GH39、GH52、GH54、又はGH116ファミリー酵素である、請求項121に記載の組成物。
- 前記反転型β−キシロシダーゼが、XlnD、Fv30A、Fv30B、Fv39A、Fv39B、XynB、XylA、又はXyl1ポリペプチドである、請求項121に記載の組成物。
- 前記キシラン含有バイオマスが、トウモロコシ茎葉、バガス、モロコシ、大きな根茎のある多年生草本(giant reed)、エレファントグラス(elephant grass)、茅、杉、麦わら、スイッチグラス、広葉樹パルプ、又は針葉樹パルプである、請求項121〜123のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記発酵微生物が真菌又はバクテリアである、請求項121〜124のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記セルラーゼが全セルラーゼ調製物の形態で存在する、請求項121〜125のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記全セルラーゼ調製物が、ヘミセルラーゼを含む、請求項126に記載の組成物。
- 前記組成物が、反転型β−キシロシダーゼを実質的に含まず、又は検出可能な反転型β−キシロシダーゼ活性を有さない、請求項121〜127のいずれか一項に記載の組成物。
- 請求項121〜128のいずれか一項に記載の組成物を一定期間培養することを含む、AXP化合物の生成方法。
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