JPWO2017170918A1 - 変異型bxl1遺伝子を有するトリコデルマ属真菌及びそれを使用したキシロオリゴ糖とグルコースの製造方法 - Google Patents
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Abstract
セルロース系バイオマスの加水分解にトリコデルマ・リーセイ属真菌由来のセルラーゼを使用しても、バイオマス中のキシランがキシロースにまで分解されない、新規なトリコデルマ・リーセイ属真菌、及びそれを用いた、セルロース含有バイオマスからのグルコースとキシロオリゴ糖の製造方法が開示されている。トリコデルマ属真菌は、β−キシロシダーゼ1(BXL1)遺伝子のN末端ドメインとC末端ドメインを有し、Fn3−likeドメインが破壊されている。このトリコデルマ属真菌を使用すると、β−キシロシダーゼ活性が欠失し、β−グルコシダーゼ活性が増加する。このため、セルロース含有バイオマスを加水分解してもバイオマス中のキシランがキシロースにまで分解されず、グルコースとキシロオリゴ糖を効率よく製造可能である。
Description
(1)配列番号2に記載のアミノ酸配列から成るβ−キシロシダーゼ1又は配列番号2に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであってβ−キシロシダーゼ活性を持つポリペプチドにおける糖質加水分解酵素ファミリー3(GH3)のN末端ドメインとC末端ドメインを有し、Fn3−likeドメインを欠失し、かつβ−キシロシダーゼ活性が欠失した変異型β−キシロシダーゼ1をコードする変異型BXL1遺伝子を有するトリコデルマ属真菌。
(2)前記配列同一性が95%以上である(1)記載のトリコデルマ属真菌。
(3)前記変異型BXL1遺伝子は、配列番号2に記載のアミノ酸配列から成るβ−キシロシダーゼ1におけるGH3のN末端ドメインとC末端ドメインを有し、Fn3−likeドメインを欠失した変異型ポリペプチドをコードするものである(1)又は(2)記載のトリコデルマ属真菌。
(4)前記Fn3−likeドメインの欠失が、前記C末端ドメインよりも下流で前記Fn3−likeドメインよりも上流の領域をコードする遺伝子領域内の塩基の欠失若しくは挿入によるフレームシフト、又は塩基の置換によるストップコドン変異によるものである、(1)〜(3)のいずれか1項に記載のトリコデルマ属真菌。
(5)前記トリコデルマ属真菌が非組換え体である、(1)〜(4)のいずれか1項に記載のトリコデルマ属真菌。
(6)前記トリコデルマ属真菌がトリコデルマ・リーセイである、(1)〜(5)のいずれか1項に記載のトリコデルマ属真菌。
(7)前記トリコデルマ属真菌が、カーボン・カタボライト・リプレッションが解除されている株である、(5)に記載のトリコデルマ属真菌。
(8)(1)〜(7)のいずれか1項に記載のトリコデルマ属真菌を培養する工程を含む、セルラーゼ組成物の製造方法。
(9)(8)記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物を回収する工程と、得られたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する工程を含む、グルコースとキシロオリゴ糖の製造方法。
非組換え体を使用して製造する場合には、組換え体を使用して製造する際に必要な拡散防止処置を行わずに済むメリットがある。
市販のタンパク質濃度測定試薬(Quick Start Bradfordプロテインアッセイ、Bio−Rad製)を使用した。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬250μLに希釈した糸状菌由来セルラーゼ溶液を5μL添加し、室温で5分間静置後の595nmにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。標準品としてBSAを使用し、検量線に照らし合わせてタンパク質濃度を算出した。
β−キシロシダーゼ活性測定方法は具体的には1mMp−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド(シグマアルドリッチジャパン社製)を含有する50mM酢酸バッファー90μL中で酵素希釈液10μLを用いて30℃で反応を行い、30分後に2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して反応を停止し、405nmの吸光度の増加を測定した。1分間あたり1μmolのp−ニトロフェノールを遊離する活性を1Uと定義した。ブランクは 1mMp-ニトロフェニル-β-キシロピラノシドを含有する50mM酢酸バッファー90μLに2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合し、その後酵素希釈液10μLを添加し30℃で30分間反応させた。その後、405nmの吸光度の増加を測定した。
β−グルコシダーゼ活性測定方法は具体的には1mMp−ニトロフェニル−β−グルコピラノシド(シグマアルドリッチジャパン社製)を含有する50mM酢酸バッファー90μL中で酵素希釈液10μLを用いて30℃で反応を行い、10分後に2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して反応を停止し、405nmの吸光度の増加を測定した。1分間あたり1μmolのp−ニトロフェノールを遊離する活性を1Uと定義した。ブランクは 1mMp-ニトロフェニル-β-グルコピラノシドを含有する50mM酢酸バッファー90μLに2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合し、その後酵素希釈液10μLを添加し30℃で30分間反応させた。その後、405nmの吸光度の増加を測定した。
セロビオハイドロラーゼ活性測定方法は具体的には1mMp−ニトロフェニル−β−ラクトピラノシド(シグマアルドリッチジャパン社製)を含有する50mM酢酸バッファー90μL中で酵素希釈液10μLを用いて30℃で反応を行い、60分後に2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合して反応を停止し、405nmの吸光度の増加を測定した。1分間あたり1μmolのp−ニトロフェノールを遊離する活性を1Uと定義した。ブランクは 1mMp-ニトロフェニル-β-ラクトピラノシドを含有する50mM酢酸バッファー90μLに2M炭酸ナトリウム10μLを加えてよく混合し、その後酵素希釈液10μLを添加し30℃で30分間反応させた。その後、405nmの吸光度の増加を測定した。
キシロオリゴ糖、グルコース、キシロースは、日立高速液体クロマトグラフ LaChrom Eite(HITACHI)を用いて、以下の条件で定量分析した。キシロオリゴ糖であるキシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、キシロヘキサオース、およびグルコース、キシロースの標品で作製した検量線をもとに、定量分析した。なお、本実施例で記すキシロオリゴ糖とは、キシロース単位がβグリコシド結合により2〜6個結合したキシロオリゴ糖を指す。
カラム:KS802、KS803(Shodex)
移動相:水
検出方法:RI
流速:0.5mL/min
温度:75℃
相同組み換えで目的遺伝子を破壊する方法としては、マーカー遺伝子を含むDNAの上流及び下流に、導入目的箇所に相同的な部分を付加するようにデザインしたプライマーを用いてPCRを行い、得られたPCR断片を糸状菌に形質転換する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
変異BXL1遺伝子として配列番号3の塩基配列を使用した。この変異BXL1遺伝子はトリコデルマ・リーセイのBXL1遺伝子(配列番号1)の1940番目と1941番目の塩基配列が欠失し、その後のアミノ酸配列がフレームシフトしている塩基配列である。この変異BXL1遺伝子がコードするアミノ酸配列と配列番号2のFn3−likeドメインのアミノ酸配列との相同性は0%であった。この変異BXL1遺伝子は、人工合成により作成した。
前培養
トリコデルマ・リーセイ PC−3−7株の胞子を1.0×107/mLになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液2.5mLを1Lバッフル付フラスコに入れた表1に記した組成で構成される前培養液250mLへ接種させた。接種させた前培養液を28℃、160rpmの培養条件にて3日間培養を行った。
*微量元素溶液は、0.3g/L H3BO3、1.3g/L (NH4)6Mo7O24・4H2O、5g/L FeCl3・6H2O、2g/L CuSO4・5H2O、0.4g/L MnCl2・4H2O、10g/L ZnCl2を含む。
**マンデルスは、7g/L (NH4)2SO4、10g/L KH2PO4、3g/L CaCl2、3g/L MgSO4・7H2Oを含む。
トリコデルマ・リーセイ PC−3−7株の前培養液250mLをそれぞれ5L容ミニジャーに入れた表2に示した本培養液2.5L(バイオマス250gをさらに含む)へ接種させ、28℃、700rpm、1vvm、pH5の培養条件にて5日間培養を行った。中和は10%アンモニアと1N硫酸を使用した。バイオマスは、Arbocel(登録商標)(J.Rettenmaier&Sohne)を使用した。
*微量元素溶液は、0.3g/L H3BO3、1.3g/L (NH4)6Mo7O24・4H2O、5g/L FeCl3・6H2O、2g/L CuSO4・5H2O、0.4g/L MnCl2・4H2O、10g/L ZnCl2を含む。
**マンデルスは、7g/L (NH4)2SO4、10g/L KH2PO4、3g/L CaCl2、3g/L MgSO4・7H2Oを含む。
***Arbocelは他成分を混合し、メスアップした後に添加する。
培養開始より2日おきに500μLずつ培養液を採取した。そして、15,000×g、4℃の条件下で10分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を0.22μmのフィルターでろ過し、そのろ液を培養上清液とした。酵素活性測定、糖化反応には培養5日目の培養上清液を使用した(表3)。
トリコデルマ・リーセイPC−3−7/△BXL1株を使用すること以外は比較例2と同様に行い、培養5日目の培養上清液を酵素活性測定、糖化反応に使用した(表3)。その結果、β−キシロシダーゼ活性が親株のPC−3−7株よりも顕著に減少していた。
トリコデルマ・リーセイPC−3−7/変異BXL1株を使用すること以外は比較例2と同様に行い、培養5日目の培養上清液を酵素活性測定、糖化反応に使用した(表3)。その結果、β−キシロシダーゼ活性がトリコデルマ・リーセイPC−3−7/△BXL1株と同等にまで減少していることが判明した。さらにトリコデルマ・リーセイPC−3−7/△BXL1株よりもβ−グルコシダーゼ活性が増加していることが判明した。
比較例2で得られたろ液を使用して糖化反応を行った。糖化反応に使用したバガスはアルカリ処理(前処理)を行ったバガスを使用した。糖化反応は以下のようにして行った。2mLチューブの中にアルカリ処理をしたバガスを乾燥重量50mg分入れ、バガスの固形分濃度が反応開始時に5重量%となるように純水を加えつつ、希塩酸を用いてpH5.0に調整した。pHを調製した前処理物に8mg/g−バイオマスになるようにセルラーゼ組成物を添加して、ヒートブロックローテーターを用いてpH5.0、50℃の反応条件で反応を開始した。反応中は適宜pH5になるように調整を行った。8時間後に99度の湯浴に5分間浸けて反応を停止した。反応液は8,000×gの条件下で5分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を0.22μmのフィルターでろ過し、そのろ液を参考例5に従いキシロオリゴ糖とグルコースの分析に供した(表4)。
比較例3で得られたろ液を使用して糖化反応を行った。糖化反応は比較例4と同様に行った(表4)。その結果、親株のPC−3−7株よりもキシロオリゴ糖の収量が顕著に増加していた。
実施例2で得られたろ液を使用し、比較例4と同様に糖化反応を行った(表4)。その結果、トリコデルマ・リーセイPC−3−7/△BXL1株のろ過液と同等のキシロオリゴ糖収量を得ることが判明し、さらにグルコースの収量が増加していることが判明した。
Claims (9)
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列から成るβ−キシロシダーゼ1又は配列番号2に記載のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであってβ−キシロシダーゼ活性を持つポリペプチドにおける糖質加水分解酵素ファミリー3(GH3)のN末端ドメインとC末端ドメインを有し、Fn3−likeドメインを欠失し、かつβ−キシロシダーゼ活性が欠失した変異型β−キシロシダーゼ1をコードする変異型BXL1遺伝子を有するトリコデルマ属真菌。
- 前記配列同一性が95%以上である請求項1記載のトリコデルマ属真菌。
- 前記変異型BXL1遺伝子は、配列番号2に記載のアミノ酸配列から成るβ−キシロシダーゼ1におけるGH3のN末端ドメインとC末端ドメインを有し、Fn3−likeドメインを欠失した変異型ポリペプチドをコードするものである請求項1又は2記載のトリコデルマ属真菌。
- 前記Fn3−likeドメインの欠失が、前記C末端ドメインよりも下流で前記Fn3−likeドメインよりも上流の領域をコードする遺伝子領域内の塩基の欠失若しくは挿入によるフレームシフト、又は塩基の置換によるストップコドン変異によるものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のトリコデルマ属真菌。
- 前記トリコデルマ属真菌が非組換え体である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のトリコデルマ属真菌。
- 前記トリコデルマ属真菌がトリコデルマ・リーセイである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のトリコデルマ属真菌。
- 前記トリコデルマ属真菌が、カーボン・カタボライト・リプレッションが解除されている株である、請求項5に記載のトリコデルマ属真菌。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のトリコデルマ属真菌を培養する工程を含む、セルラーゼ組成物の製造方法。
- 請求項8記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物を回収する工程と、得られたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する工程を含む、グルコースとキシロオリゴ糖の製造方法。
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