CN110747244A

CN110747244A - 一种耐碱耐热的木聚糖酶及其应用

Info

Publication number: CN110747244A
Application number: CN201911194651.8A
Authority: CN
Inventors: 刘巍峰; 孟祥锋; 刘琳; 王海; 徐美青; 张伟欣
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2020-02-04
Anticipated expiration: 2039-11-28
Also published as: CN110747244B

Abstract

本发明从蘑菇堆肥中筛选到的一株高温链霉菌B6，利用分子生物学和基因工程的方法从中克隆表达了具高木聚糖水解活性的糖苷水解酶11和10家族的木聚糖酶(XynST11和XynST10),并研究了该酶的理化性质和产物组成。实验结果表明两种酶在pH、温度、大部分金属离子和化学试剂等方面都表现出较强的抗性。此外，评价了XynST10和XynST11在粘胶纤维碱提废液(HCAWS)生产XOs中的应用，XynST11具有很高的开发潜力，为利用粘胶碱提废液生产木寡糖奠定了基础。

Description

一种耐碱耐热的木聚糖酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种碱性耐热的木聚糖酶及其应用。

背景技术

随着地球不可再生资源的日益消耗，寻找能被有效利用的可再生资源已迫在眉睫。木质纤维素是地球上含量最丰富的可再生多糖类资源，解决好如何有效利用木质纤维素的问题对经济社会的可持续发展具有重要意义。

木聚糖是一种多聚五碳糖，在自然界中广泛存在，是植物细胞壁半纤维素的重要组成部分，是排在纤维素之后的第二丰富的碳水化合物,约占地球上可再利用有机碳的三分之一。其主链主要由β-1,4-糖苷键连接的β-D-吡喃型木糖残基聚合而成。

木聚糖酶广泛分布在细菌，藻类，植物等生物中。目前报道的木聚糖酶大都属于糖苷水解酶10家族(GH10)和11家族(GH11)。木聚糖经过木聚糖酶催化水解生产的初始产物为木寡糖。木寡糖(XOs)又称低聚木糖，是指具有2-7个木糖分子以β-1,4-糖苷键结合而成的功能性低聚糖。木寡糖有改善肠道微生物菌群平衡的作用，在食品，医药，饲料等方面均有应用。低聚木糖生产主要是以富含木聚糖的木质纤维素为原料，如玉米芯、棉籽壳、蔗渣和秸秆等，经过酶法或化学法降解。相比于化学法，酶解法耗能低、无污染、特异性强、易于控制水解速度及程度，是当前作为低聚木糖生产的优选方法。

玉米棒、甘蔗渣等农业废弃物被用作XOs生产的原料；然而近年来，由于玉米棒数量有限，XOs的生产成本有所上升。目前粘胶纤维生产中使用的木质纤维素材料很多，其中大部分半纤维素成分都是通过碱法浸出得到高纯纤维素。生成的碱性压榨碱液回收后，半纤维素保留在剩余的碱性废水中。粘胶纤维碱提废液(HCAWS)的排放不仅是一种生物质资源的浪费，而且会对环境造成污染。在HCAWS中开发一种可行的以木聚糖为原料生产XOs的生物工艺，不仅可以实现其资源的利用，而且可以解决环境问题。但是，由于HCAWS是一种高盐碱性底物，因此水解HCAWS制备XOs缺乏有效的木聚糖酶。

发明内容

本发明从蘑菇堆肥中筛选到的一株高温链霉菌B6，利用分子生物学和基因工程的方法从中克隆表达了具高木聚糖水解活性糖苷水解酶11和10家族的木聚糖酶(XynST11和XynST10)，并研究了该酶的理化性质和产物组成。

一方面，本发明提供了一种耐碱耐热的木聚糖酶，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.1所示。

另一方面，本发明还提供了耐碱耐热的木聚糖酶的编码基因，优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.2所示。

另一方面，本发明还提供了包含耐碱耐热的木聚糖酶的编码基因的重组载体，所述重组载体优选为重组表达载体，如pET系列的载体，例如pET-22b。

另一方面，本发明还提供了包含上述重组载体的重组菌株，优选的，所述重组菌株为大肠杆菌，如，大肠杆菌BL21，更优选的，如大肠杆菌BL21(DE3)star。

另一方面，本发明还提供了上述木聚糖酶或包含木聚糖酶的重组载体、重组菌株在以含有木聚糖的原料为底物制备低聚木糖中的应用。优选的，所述制备低聚木糖的温度为50℃-100℃，如，60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃或95℃；pH为5-12，如，pH为6、7、8、9、10或11。

优选的，所述含有木聚糖的原料为粘胶纤维碱提废液。

另一方面，本发明还提供了一种以粘胶纤维碱提废液为原料制备低聚木糖的方法，所述方法包括利用上述木聚糖酶或包含木聚糖酶的重组载体、重组菌株对粘胶纤维碱提废液进行处理的步骤。

进一步的，所述木聚糖酶与粘胶纤维碱提废液的用量比例为100-500U：1mL，优选，200U：1mL；即，每ml粘胶纤维碱提废液中加入的木聚糖酶的量为100-500U，优选，200U。

所述处理温度为30-℃70，℃优选，50；℃所述处理时间为12h-48h，优选，24h。

粘胶纤维是利用含有天然纤维素的木浆、棉浆等浆粕经过化学与机械方法加工而成的化学纤维。粘胶纤维的生产包括了浸渍工艺，浸渍工艺是用碱液将半纤维素从浆粕中溶解出来，获得更高纯度的纤维素，浸渍碱液中半纤维素浓度过高，会对粘胶纤维成品质量产生极其不利的影响，故必须通过浸渍碱液外移、补充新碱的方式保证浸渍系统碱液半纤维素含量恒定，外移的浸渍碱液称为废碱。对粘胶纤维生产废碱的处理多采用膜滤回收，碱液回收率高达90％，经过膜滤回收碱液后还是会产生含碱、含半纤维素的废液，本申请中将其定义为粘胶纤维碱提废液(HCAWS)，这些碱提废液中不仅碱浓度比较高，而且还含有较多的半纤维素，碱含量在10-100g/L，半纤维含量在30-200g/L。

在一个实施方式中，本发明所述的粘胶纤维碱提废液是通过以下步骤获得的：(1)利用碱液对浆粕浸泡以溶解其中的半纤维素，得到溶解有半纤维素的碱液；(2)将溶解有半纤维素的碱液从浆粕中分离；(3)采用膜透析的方式对溶解有半纤维素的碱液进行处理，得到回收的碱液以及含有半纤维素的废液；所述含有半纤维素的废液即为粘胶纤维碱提废液。

进一步的，所述步骤(1)中碱液的终质量浓度为10％-20％，优选，15％-18％；所述浸泡温度为15-40℃，优选，20-30℃；所述浸泡时间为30min-120min，优选，45min-75min；更优选的，所述碱液为NaOH溶液。

进一步的，所述步骤(2)在压力存在的情况下，将溶解有半纤维素的碱液从浆粕中分离；优选的，所述压力为3-20Mpa，更优选，4-10Mpa。

进一步的，所述步骤(3)的膜透析采用截留分子量为100-3000Da的膜进行透析，优选，200-2000Da；优选的，采用纳滤膜和/或陶瓷膜进行透析，更优选的，所述纳滤膜的截留分子量为100-500Da，优选200-400Da,所述陶瓷膜的截留分子量为1000-3000Da，优选1200-2000Da；更优选的，所述透析时间为2-10h，优选，3-8h，更优选4-6h；进一步的，所述透析可以在20-60℃的条件下进行，如25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃。

进一步的，所述浆粕来源于木浆或棉浆，优选的，所述木浆包括硬木或软木制成的木浆，更优选的，所述硬木来源于桉树、山毛榉、白杨、刺槐或桦木，所述软木来源于松木、云杉、红柏、铁杉和落叶松。

粘胶纤维生产的HCAWS为XOs生产提供了丰富的半纤维素来源。然而，由于高盐碱性，在HCAWS中水解木聚糖需要耐碱高效的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶(XynST11和XynST10)在pH、温度、大部分金属离子和化学试剂等方面都表现出较强的抗性，可高效水解HCAWS。通过对HCAWS生产XOs进行评价，结果显示，XynST10产生了大量的木糖，而XynST11只产生了非常少量的木糖。XOs产品(DP2-4)在XynST10和XynST11之间的分布也有显著差异，XynST10产生大量的木二糖，较少的木三糖和木四糖，XynST11产生的木二糖和木三糖数量相等，是木四糖的一半。XynST11的XOs转化率也高于XynST10，XynST11具有生产XOs所需的特性。许多木聚糖酶已被测试用于从不同的农业废料生产XOs。本发明获得的XOs产率远高于以往的一些报道。HCAWS是一种很有前景的新原料来源，可用于利用高效木聚糖酶生产XOs。XynST11具有很高的开发潜力，为利用粘胶纤维碱提废液生产木寡糖奠定了基础。

附图说明

图1.在大肠杆菌BL21(DE3)Star中表达的重组木聚糖酶XynST10(A)和XynST11(B)的SDS-PAGE分析，其中M:蛋白Marker；1：表达XynST10的BL21细胞粗提取液；2：镍柱纯化后的XynST10；3：表达XynST11的BL21细胞粗提取液；4：镍柱纯化后的XynST11。

图2.重组木聚糖酶XynST10的最适pH(A)，pH稳定性(B)，最适温度(C)，热稳定性(D)。

图3.重组木聚糖酶XynST11的最适pH(A)，pH稳定性(B)，最适温度(C)，热稳定性(D)。

图4.重组木聚糖酶XynST10(A)和XynST11(B)的酶动力学曲线。

图5.重组木聚糖酶XynST10(A)和XynST11(B)水解山毛榉来源木聚糖的产物分析。其中，M：标准品包括木糖(X1)，木二糖(X2)，木三糖(X3)，木四糖(X4)和木五糖(X5)。分别反应0-48h。

图6.重组木聚糖酶XynST10，XynST11以及商业化的木聚糖酶1和2降解粘胶纤维碱提废液(HCAWS)的生产木寡糖的产物分布分析(A)及转化率(B)。

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1、从蘑菇堆肥中分离木聚糖降解菌株

从蘑菇堆肥中取样并用无菌水稀释，将适当稀释的样品涂于木聚糖琼脂平板上(2.0g NaNO₃,1.0g K₂HPO₄,2.0g山毛榉木木聚糖，0.5g MgSO₄,0.5g KCl,0.2g蛋白胨，15.0g琼脂,pH 7.2)，培养5-7天。用0.1％刚果红溶液染色15min,1M NaCl稀释15min，观察木聚糖的降解情况。选择具有降解圈的菌落纯化分离菌株，分离得到一株高温链霉菌(Streptomyces sp.)B6。

实施例2、从分离菌株中进行木聚糖酶的鉴定及序列分析

对分离菌种高温链霉菌B6的基因组进行碳水化合物活性酶的分析，从中鉴定出GH10和GH11家族酶，分别命名为XynST10和XynST11，利用SignalP4.1 web server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测XynST10和XynST11的信号肽及其裂解位点。用ProtParam估算了木聚糖酶成熟蛋白的分子量和pI。利用Blastp对木聚糖酶进行保守域分析。序列分析显示：XynST10和XynST11的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，XynST10和XynST11的核苷酸序列分别如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示。

实施例3、重组木聚糖酶的基因克隆

从菌种基因组上扩增出木聚糖酶基因序列，将去除信号肽的木聚糖酶基因序列克隆到pET-22b载体上，将构建成功的重组质粒转化至大肠杆菌DH5α，挑取转化子PCR和测序验证。

实施例4、重组蛋白的表达和纯化

以大肠杆菌BL21(DE3)star为表达宿主，利用pET-22b为表达载体，以0.1mM IPTG在18℃下诱导表达目的蛋白。利用His标签，从粗酶液中纯化目的蛋白。进一步利用阴阳离子交换柱和凝胶排阻层析对目的蛋白进行纯化。如图1所示，利用大肠杆菌对XynST10和XynST11进行重组表达、纯化，能够得到纯度较高的目的蛋白。

实施例5、重组木聚糖酶的活力测定和表征

利用DNS显色的方法测定催化过程中还原糖的释放速度，以表征木聚糖酶的活力。分别测定XynST10和XynST11木聚糖酶在不同pH和不同反应温度的活力，以测定其最佳反应pH和最佳反应温度。测定不同的金属离子和化学试剂对于木聚糖酶活力的影响。在最佳反应条件测定木聚糖酶的动力学常数。

如图2-3所示，以山毛榉木木聚糖为底物，测定了XynST10(图2)和XynST11(图3)的最佳pH及其稳定性，最佳温度及其稳定性。使用50mM琥珀酸-磷酸二氢钠-甘氨酸(SPG)缓冲液(pH 4.0-9.0)和甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0-10.0)，在pH 4.0-10.0范围内评价pH对XynST10和XynST11活性的影响。在30-100℃的不同温度下，测定了XynST10和XynST11的最佳pH值。为评价酶的pH稳定性，将酶在不同pH值(5.0-11.0)下预孵育不同时间(24h)，并在相应的最佳条件下测定酶的残留活性。在热稳定性方面，酶在50℃、60℃、70℃条件下预孵育24h，测定酶在相应的最佳条件下的残留活性。

在pH值5.0-8.0范围内，XynST10的活性保持在90％以上，最佳pH值为8.0。在pH值为9.0和10.0时，XynST10的活性分别保留了65％和40％，说明XynST10是耐碱性的(图2A)。XynST11在pH值为6.0时表现出最佳pH值，在pH值为5.0-8.0时其活性保持88％以上(图3A)。XynST11在pH 9.0(70％)和pH 10.0(55％)时也表现出较高的活性。在pH 4.0时，XynST11保留了80％的活性，高于XynST10(图3A)。确定XynST10的最佳温度为60℃图(2C)。在较高和较低的温度下，XynST10活性显著降低(图2C)。XynST11在70℃时表现出最佳温度，在60-90℃时活性保持在90％以上(图3C)。即使在100，℃XynST11仍然保留了87.5％的活性，这反映了它的耐热性(图3C)。

测定XynST10(图2B)和XynST11的pH稳定性(图3B)，分别在50℃，不同pH条件下孵育0-24小时，然后测定其活性。XynST10在pH 5.0-9.0时稳定，24小时后活性仍保持90％以上。在pH 10.0时，XynST10的活性在孵育24小时后逐渐下降到40％，而在pH 11.0孵育15分钟后，XynST10被灭活。XynST11在pH 6.0-11.0时表现出较高的稳定性。值得注意的是，在pH11.0孵育24小时后，XynST11的活性仍然保持在70％以上。

在热稳定性方面，XynST10的活性(图2D)在50℃时不受明显影响，而在60℃时，在24的降解过程中其活性逐渐下降至25％。XynST10在70℃时15分钟内迅速失活，而XynST11在50和℃60℃时24小时内稳定，在70℃时4小时内失活(图3D)。

此外，还探究了金属离子和试剂对酶活的影响。在2.0mM Ni²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Co²⁺、Fe² ⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、NaCl、EDTA、1％SDS的存在下，测定金属离子等化学试剂对XynST10、XynST11活性的影响，如表1所示。

表1.金属离子和化学试剂对重组木聚糖酶XynST10和XynST11酶活的影响

2mM Ni²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺对XynST10活性有轻微的刺激作用，而2mM Ag⁺、NaCl和1％SDS对XynST10活性有抑制作用(表1)。2.0mM Co²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、EDTA对XynST10活性无影响。对于XynST11，2.0mM Ni²⁺、NaCl、EDTA对其活性有明显的抑制作用，2.0mM Ca²⁺、Mg²⁺、Fe² ⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ag⁺对其活性有轻微的刺激作用。值得注意的是，1％SDS的存在并不影响XynST11的活性。

如图4所示：采用1mg/mL-50mg/mL不同底物浓度，测定XynST10和XynST11对山毛榉木木聚糖的动力学参数(Km和Vmax)。数据采用SigmaPlot软件拟合Michaelis-Menten机理方程。所有酶活测定均为三次取平均值。

以山毛榉木木聚糖为底物，在相应的最佳反应条件下，测定了XynST10和XynST11的动力学参数。XynST10的Km和Vmax分别为10.4mg/mL和185.2U/mg,XynST11的Km和Vmax分别为16.1mg/mL和2894.03U/mg(图4)。

实施例6、利用XynST10和XynST11对底物的酶解分析

分析重组木聚糖酶对不同木聚糖和粘胶纤维碱提废液(HCAWS)的水解产物，采用TLC和高效液相色谱(HPLC)对水解产物进行分析，采用各种产物各自的标准量进行定量。为了研究木聚糖酶的作用模式，通过薄层色谱(TLC)对不同反应时间的水解产物进行分析。

首先，以山毛榉来源的木聚糖为底物，利用XynST10和XynST11对其进行酶解。以2.5mg/m L的山毛榉木木聚糖作为底物，在酶的最佳温度和pH条件下，利用0.5U/mL的XynST10或XynST11对其进行水解，0-48h不间断取样保存，将水解产物进行TLC分析。XynST10水解发生半小时后，山毛榉木木聚糖首先被水解成分子量较大的低聚木糖，再将聚合度2-5的寡糖进一步水解。经过48小时的反应，主要产物为木糖、木三糖和木五糖，产物中没有检测到木糖和木四糖(图5A)。同样地，XynST11在半小时内先将底物水解成较大分子量的低聚木糖。然而，在最后48小时反应产物中检测到含有聚合度2-8的木寡糖，木三糖比其他木寡糖积累得更多(图5B)。

另外，以粘胶纤维碱提废液为底物，研究XynST10和XynST11对其酶解的情况。本实施例中的粘胶纤维碱提废液是以硬木制成的纸浆为原料，在室温下于碱(NaOH,终浓度18％，w/w)中浸泡1小时，以溶解其中的半纤维素。之后，在4-8MPa的压力下，用液压机将溶解半纤维素的碱液从纸浆中分离出来。经过在40℃-50℃温度下纳滤膜处理(分子量300Da)和陶瓷膜处理(分子量1500Da)4.5h后，溶液中的大部分碱和水被回收，留下的即为粘胶纤维碱提废液，其含有约30g/L的碱，约80g/L的半纤维素。

以上述粘胶纤维碱提废液(HCAWS)为底物，采用利用XynST10和XynST11以及商业化的木聚糖酶1和2对其进行酶解，将XynST10(用量：200U/mL)，XynST11(用量：200U/mL)，商品酶1(用量：200U/mL)和商品酶2(用量：200U/mL)分别加入到HCAWS中，50℃孵育24h。上清液采用高效液相色谱法进行分析，生成的木糖和木寡糖(DP2-4)用高效液相色谱法进行定量。

图6示出了XynST10和XynST11以及商业化的木聚糖酶1和2降解粘胶纤维碱提废液的结果，如图所示：HCAWS的总酸水解结果表明，其木糖含量为59.54g/L，葡萄糖含量为5.02g/L，阿拉伯糖含量为2.14g/L。HPLC酶解分析结果表明，XynST10产木四糖1.62g/L，木三糖5.50g/L，木二糖16.10g/L；但同时也检测到大量的木糖(9.27g/L)；XynST11产生了5.09g/L的木四糖、11.28g/L的木三糖和11.92g/L的木二糖，值得注意的是XynST11只产生少量木糖(1.19g/L)；而商品酶1和2均产生大量的木糖(图6A)。XynST10和XynST11的低聚木糖(DP2-4)总转化率分别为39.0％和47.5％，基本是商品酶的2-3.5倍(图6B)。

本专利中，XynST10和XynST11水解HCAWS产生的木寡糖得率比商业化的木聚糖酶以及已有的报道都要高；结果证明HCAWS可以作为一种新原料，利用高效木聚糖酶XynST10和XynST11等进行木寡糖生产。

上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 山东大学

<120> 一种碱性耐热的木聚糖酶及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 477

<212> PRT

<213> 高温链霉菌(Streptomyces sp.)

<400> 1

Met Gly Ser Arg Ala Leu Pro Arg Ser Val Val Arg Arg Lys Thr Arg

1 5 10 15

Gly Pro Leu Leu Ala Leu Phe Ala Gly Val Leu Gly Val Val Ala Ser

20 25 30

Leu Val Thr Pro Pro Thr Ala His Ala Ala Glu Ser Thr Leu Gly Ala

35 40 45

Ala Ala Ala Gln Ser Gly Arg Tyr Phe Gly Val Ala Ile Ala Ala Gly

50 55 60

Lys Leu Gly Asp Pro Thr Tyr Thr Thr Ile Ala Asn Arg Glu Phe Asn

65 70 75 80

Ser Val Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Ile Asp Ala Thr Glu Pro Gln

85 90 95

Gln Gly Arg Phe Asp Phe Thr Ala Gly Asp Arg Val Tyr Asn Trp Ala

100 105 110

Val Gln Asn Gly Lys Glu Val Arg Gly His Thr Leu Ala Trp His Ser

115 120 125

Gln Gln Pro Ala Trp Met Gln Asn Leu Ser Gly Ser Ala Leu Arg Gln

130 135 140

Ala Met Ile Asn His Ile Asn Gly Val Met Thr His Tyr Lys Gly Lys

145 150 155 160

Ile Ala Gln Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Ala Asp Gly Asn Ser

165 170 175

Gly Ala Arg Arg Asp Ser Asn Leu Gln Arg Thr Gly Asn Asp Trp Ile

180 185 190

Glu Val Ala Phe Arg Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Ser Ala Lys Leu

195 200 205

Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Val Glu Asn Trp Asn Ala Ala Lys Thr Gln

210 215 220

Ala Met Tyr Ala Met Val Arg Asp Phe Lys Gln Arg Gly Val Pro Ile

225 230 235 240

Asp Cys Val Gly Phe Gln Ala His Phe Asn Ser Gly Asn Pro Tyr Asn

245 250 255

Ser Asn Phe Arg Thr Thr Leu Gln Asn Phe Ala Asp Leu Gly Val Asp

260 265 270

Val Ala Val Thr Glu Leu Asp Ile Gln Gly Ala Pro Ala Ser Thr Tyr

275 280 285

Ala Ser Val Val Asn Asp Cys Leu Ala Val Ser Arg Cys Leu Gly Ile

290 295 300

Thr Val Trp Gly Val Arg Asp Ser Asp Ser Trp Arg Ser Glu Gln Thr

305 310 315 320

Pro Leu Leu Phe Asn Asn Asp Gly Ser Lys Lys Ala Ala Tyr Thr Ala

325 330 335

Val Leu Asn Ala Leu Asn Gly Asp Asp Thr Thr Pro Leu Pro Pro Glu

340 345 350

Gly Gly Gln Ile Lys Gly Val Gly Ser Gly Arg Cys Leu Asp Val Pro

355 360 365

Asn Ala Ser Thr Ala Asp Gly Thr Gln Val Gln Leu Trp Asp Cys His

370 375 380

Ser Gly Ser Asn Gln Gln Trp Thr Tyr Thr Asp Ala Gly Glu Leu Arg

385 390 395 400

Val Tyr Gly Asn Lys Cys Leu Asp Ala Ala Gly Thr Gly Asn Gly Ala

405 410 415

Lys Val Gln Ile Tyr Ser Cys Trp Gly Gly Asp Asn Gln Lys Trp Arg

420 425 430

Leu Asn Ser Asp Gly Ser Ile Val Gly Val Gln Ser Gly Leu Cys Leu

435 440 445

Asp Ala Val Gly Ala Gly Thr Gly Asn Gly Thr Leu Ile Gln Leu Tyr

450 455 460

Ser Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gln Arg Trp Thr Arg Thr

465 470 475

<210> 2

<211> 1434

<212> DNA

<213> 高温链霉菌(Streptomyces sp.)

<400> 2

atgggctcac gcgcccttcc cagatccgtt gtccgacgga aaacccgcgg cccgctgctg 60

gcgctgttcg ccggcgtcct cggtgtggtc gcctcactgg tcacgccgcc gaccgcgcac 120

gccgccgaga gcacactcgg cgccgcggcg gcgcagagcg gccgttactt cggcgtcgcc 180

attgccgcgg gcaagctggg cgacccgacg tacacgacga tcgcgaaccg tgagttcaac 240

tcggtgacgg ccgagaacga gatgaagatc gacgccaccg agccgcagca gggccggttc 300

gacttcaccg ccggtgaccg cgtctacaac tgggcggtgc agaacggcaa ggaggtacgc 360

ggtcacaccc tcgcctggca ctcccagcag cccgcctgga tgcagaacct cagcggcagc 420

gcactgcgcc aggcgatgat caaccacatc aacggcgtga tgacccacta caagggcaag 480

atcgcccagt gggacgtcgt gaacgaggcc ttcgccgacg gcaattcggg ggcccgccgc 540

gactccaacc tgcagcgcac cggcaacgac tggatcgagg tcgccttccg caccgcgcgc 600

gccgccgacc cgtccgccaa gctgtgctac aacgactaca acgtcgagaa ctggaacgcg 660

gccaagaccc aggccatgta cgccatggtc cgggacttca agcagcgcgg cgtgccgatc 720

gactgcgtcg gcttccaggc gcacttcaac agcggcaacc cctacaacag caacttccgc 780

accaccctgc agaacttcgc cgacctcggc gtcgacgtgg ccgtcaccga gctcgacatc 840

cagggcgccc cggcgtcgac ctacgccagc gtggtcaacg actgcctggc cgtctcgcgc 900

tgcctcggca tcaccgtctg gggtgtgcgc gacagcgact cctggcgatc ggagcagacg 960

ccgctgctgt tcaacaacga cggcagcaag aaggccgcct acaccgccgt cctcaacgcg 1020

ctcaacggcg acgacaccac cccgctcccc ccggagggcg gacagatcaa gggcgtcggc 1080

tcgggccgct gcctggacgt gcccaacgcc agcaccgccg acggcaccca ggtccagctg 1140

tgggactgcc acagcggcag caaccagcag tggacgtaca ccgacgccgg tgagctcagg 1200

gtctacggca acaagtgcct ggacgccgcc ggcaccggca acggcgccaa ggtccagatc 1260

tacagctgct ggggcggcga caaccagaag tggcgtctca actccgacgg atccatcgtc 1320

ggcgtccagt ccggactctg cctcgacgcc gtcggcgccg gcaccggcaa cggcaccctg 1380

atccagctct actcctgctc gggcggcagc aaccaacgct ggacccgcac ctga 1434

<210> 3

<211> 331

<212> PRT

<213> 高温链霉菌(Streptomyces sp.)

<400> 3

Met Asn Ala Leu Val Gln Ala Arg Gly Arg Gly Ser Gly Arg Leu Ala

1 5 10 15

Phe Leu Ile Arg Ser Val Cys Val Ile Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala

20 25 30

Ala Met Leu Pro Gly Thr Ala Arg Ala Asp Thr Tyr Val Asp Thr Asn

35 40 45

Gln Thr Gly Thr His Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Ser

50 55 60

Gln Gly Thr Val Ser Met Asn Met Gly Ser Gly Gly Ser Tyr Ser Thr

65 70 75 80

Ser Trp Arg Asn Thr Gly Asn Phe Val Ala Gly Lys Gly Trp Ser Thr

85 90 95

Gly Gly Arg Arg Thr Val Thr Tyr Ser Gly Thr Phe Asn Pro Ser Gly

100 105 110

Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Ser Thr Asn Pro Leu Val Glu

115 120 125

Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr

130 135 140

Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr

145 150 155 160

Met Arg Tyr Asp Ala Pro Ser Ile Glu Gly Ile Arg Thr Phe Lys Gln

165 170 175

Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Thr Gly Gly Thr Ile Thr Thr

180 185 190

Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg His Gly Met Asn Leu Gly Thr

195 200 205

Phe Asn Tyr Met Ile Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser

210 215 220

Ser Asn Ile Thr Val Gly Ser Ser Gly Ser Asp Gly Gly Asn Asp Gly

225 230 235 240

Gly Gly Ser Gln Gly Cys Thr Ala Thr Leu Ser Ala Gly Gln Gln Trp

245 250 255

Ser Asp Arg Tyr Asn Leu Asn Val Ser Val Ser Gly Ser Ser Asn Trp

260 265 270

Thr Val Thr Met Asn Val Pro Ser Pro Ala Arg Ile Ile Ala Thr Trp

275 280 285

Asn Val Ser Ala Ser Tyr Pro Ser Ser Gln Val Leu Val Ala Arg Pro

290 295 300

Asn Gly Asn Gly Asn Asn Trp Gly Val Thr Ile Gln Thr Asn Gly Asn

305 310 315 320

Trp Thr Trp Pro Thr Val Ser Cys Ser Thr Ser

325 330

<210> 4

<211> 996

<212> DNA

<213> 高温链霉菌(Streptomyces sp.)

<400> 4

atgaatgcgc tcgtccaggc gaggggccgt ggaagcggcc gcctcgcgtt cctcatcagg 60

agtgtctgcg tcatcgcact ggccgccctc gcggcggcga tgctgcccgg cacggccagg 120

gccgacacct acgtcgacac gaaccagacc ggcacccaca acggctactt ctactcgttc 180

tggaccgaca gccagggcac cgtctccatg aacatgggct ccggcggcag ctacagcacc 240

tcctggagaa acaccgggaa cttcgtcgcc ggcaagggat ggagcaccgg cggacgccgc 300

acggtcacct actcgggcac cttcaacccg tccggcaacg cctacctggc cctctacgga 360

tggtcgacca acccgctcgt cgagtactac atcgtcgaca actggggcac ctaccggccc 420

acgggaacgt acaagggcac ggtcaccagt gacggcggca cctacgacat ctacgagacg 480

atgcggtacg acgccccctc catcgagggc atcaggacct tcaagcagta ctggagcgtc 540

cggcagtcca agcggaccgg cggcaccatc accaccggca accacttcga cgcctgggcc 600

cgccacggca tgaacctcgg caccttcaac tacatgatcc tcgcgaccga gggctaccag 660

agcagcggaa gctccaacat caccgtgggc agctccggtt cggacggcgg caacgacggc 720

ggcggctcgc agggctgcac ggcgacgctg tcggccggtc agcagtggag cgaccgttac 780

aacctcaatg tctcggtcag cggctccagc aactggacgg tgacgatgaa cgtgccgtcc 840

ccggcgagga tcatcgccac ctggaacgtc agcgcgagct atcccagctc ccaggtgctg 900

gtcgccaggc ccaacggcaa cggcaacaac tggggcgtga ccatccagac caacggcaac 960

tggacctggc ccacggtctc ctgcagtacg agctga 996

Claims

1.耐碱耐热的木聚糖酶或包含所述耐碱耐热的木聚糖酶编码基因的重组生物材料在以含有木聚糖的原料为底物制备低聚木糖中的应用；所述耐碱耐热的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述包含所述耐碱耐热的木聚糖酶编码基因的重组生物材料选自包含所述耐碱耐热的木聚糖酶编码基因的重组载体，或包含所述重组载体的重组菌株；优选的，所述编码基因的序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组载体优选为重组表达载体；更优选，pET系列的载体，例如pET-22b；所述重组菌株为大肠杆菌，优选的，大肠杆菌BL21，更优选的，大肠杆菌BL21(DE3)star。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述含有木聚糖的原料为粘胶纤维碱提废液。

5.一种以粘胶纤维碱提废液为原料制备低聚木糖的方法，所述方法包括利用权利要求1-3任一所述应用中的耐碱耐热的木聚糖酶或包含所述耐碱耐热的木聚糖酶编码基因的重组生物材料对粘胶纤维碱提废液进行处理的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述木聚糖酶与粘胶纤维碱提废液的用量比例为100-500U：1mL，优选，200U：1mL；所述处理温度为30-℃70，℃优选，50；℃所述处理时间为12h-48h，优选，24h。

7.根据权利要求5-6任一所述的方法，其特征在于，所述粘胶纤维碱提废液通过以下步骤获得：

(1)利用碱液对浆粕浸泡以溶解其中的半纤维素，得到溶解有半纤维素的碱液；

(2)将溶解有半纤维素的碱液从浆粕中分离；

(3)采用膜透析的方式对溶解有半纤维素的碱液进行处理，得到回收的碱液以及含有半纤维素的废液；

所述含有半纤维素的废液即为粘胶纤维碱提废液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中碱液的终质量浓度为10％-20％，优选，15％-18％；所述浸泡温度为15-40℃，优选，20-30℃；所述浸泡时间为30min-120min，优选，45min-75min；更优选的，所述碱液为NaOH溶液。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)在压力存在的情况下，将溶解有半纤维素的碱液从浆粕中分离；优选的，所述压力为3-20Mpa，更优选，4-10Mpa。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的膜透析采用截留分子量为100-3000Da的膜进行透析，优选，200-2000Da；优选的，采用纳滤膜和/或陶瓷膜进行透析，更优选的，所述纳滤膜的截留分子量为100-500Da，优选200-400Da,所述陶瓷膜的截留分子量为1000-3000Da，优选1200-2000Da。