CN108026554A - 用于纯化生物质水解产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于纯化生物质水解产物的新型和有利的方法以及按照本发明的方法产生的纯化水解产物和该纯化水解产物作为发酵介质的用途。

Description

用于纯化生物质水解产物的方法
本发明涉及用于纯化生物质水解产物的新型和有利的方法以及按照本发明的方法产生的纯化的水解产物和该纯化水解产物作为发酵介质的用途。
来源于农作物残渣如甘蔗渣、稻草、大麦秆的木质纤维素生物质及其它含糖或多糖和含蛋白质的材料不仅是精制糖如单糖或二糖的有价值的来源，而且也是其它成分如氨基酸、蛋白质和矿物质的有价值的来源。
现有技术中存在着用于从甜菜和甘蔗分离特别地如糖的成分的各种方法。从这些所谓的“第一代”基质的处理获得的溶液通常是相对纯的糖溶液且它们可以如在标准的工艺中一样使用而对工艺效率没有重大影响。与此相反，由基于农作物残渣如甘蔗渣、稻草或大麦秆的“第二代”基质的水解得到的溶液是蛋白质、矿物质和糖的复杂混合物。它们也包含有机酸、有色颗粒、木素的降解产物和其它杂质。这使得这些第二代水解产物不适合于进一步的加工如，例如，从乳酸制备聚乳酸。涉及这一类型的水解产物的现有工艺也具有在管道、管路中和在膜上以及在应用的其它工艺单元中严重结垢的问题，从而降低工艺效率、使得有必要更频繁地清洁和更换处理单元而导致显著更高的成本。
因此，需要能够制备含有最大量的有价值化合物如单糖和二糖但仅含有最小量的杂质的高度纯化的生物质水解产物的方法。这种方法提高了进一步加工的可能性和增加了水解产物的可能应用。
本发明的根本目的是提供用于纯化生物质水解产物以制备水解产物的方法，其不显示现有技术中已知的方法的缺陷。
在第一方面中，本发明因此提供用于纯化生物质水解产物的方法，包括以下步骤：
a)提供生物质水解产物；
b)调节生物质水解产物的温度至选自50-95℃的范围的温度；
c)添加至少一种酸至生物质水解产物；
d)生物质水解产物-酸混合物的固-液分离以获得固体相和液体相；
e)在按照步骤d)的分离后水解产物-酸混合物的液体相的去离子化。
本发明的发明人惊异地发现，温度调节与酸添加(其甚至提高溶液的离子含量)的组合会导致后期去离子化的改善且由此导致改善的纯化水解产物。去离子化在两个方面改善：在去离子化过程中移除的盐的量增加及去离子化单元和该方法的周围部件的结垢减少。本发明的进一步的优势是该方法也可以在生物质水解产物包含有机酸的情况中应用。
如本发明中使用的术语“生物质”是指本领域技术人员已知适合于本发明的方法的任何类型的生物质。特别优选的是植物源的生物质。在进一步优选的实施方式中，生物质的初始干物质含量选自10-100wt.-％，更优选选自35-95wt.-％和特别优选选自40-80wt.-％。术语“干物质”(d.m.)是指在水和其它挥发性化合物已经从新鲜组织除去后使用IR-衡器(IR-balance)测定的质量-生物质比率。因而特别优选的是选择生物质从而其干物质含有至少25wt.-％的糖如单糖、二糖及寡糖和/或多糖，更优选至少40wt.-％，特别优选至少60wt.-％，进一步优选至少80wt.-％的糖如单糖、二糖及寡糖和/或多糖。此外，合适的生物质的任何混合物将包括在术语“生物质”内。
特别优选的生物质是“木质纤维素生物质”。
术语“木质纤维素生物质”是指来自林业和农业、食品加工业和造纸业的残渣、废物和/或副产物以及城市废物。特别地，如本发明中使用的术语“木质纤维素生物质”包括谷草和/或斯佩耳特小麦(如小麦、黑麦、大麦、燕麦)，玉米秸杆，秣草和/或穗轴，牧草如截叶铁扫帚，柳枝稷(Panicum virgatum)，象草(芒属(Miscanthus)；China reed)，苏丹草(Sorghum sudananse，Sorghum drummondi)，芦荻(Arundo donax)，树皮，木材，木材残渣，刨花和/或碎木屑，果皮，稻杆，香蕉叶，空果串和龙舌兰残渣。
适合于该方法的另外的生物质是来自牲畜棚的粪肥、草本材料、研磨咖啡渣和来自榨油机的废物如菜籽饼粕和来自磨机的污水、造纸原料和来自造纸厂的废水、废纸、蔬菜和水果剩余物。
在本发明的方法的优选实施方式中，生物质选自含纤维素、半纤维素和/或木素的生物质。
在本发明的方法的特别优选的实施方式中，生物质选自甜菜粕、甘蔗渣、甘蔗秸秆、小麦秸杆、木材及其混合物。
在本发明的方法的另一特别优选的实施方式中，生物质是来自农业残渣如小麦秸杆、大麦秸杆、大豆秸杆、甘蔗渣、甘蔗叶和茎杆、甘蔗秸秆、玉米秸杆、大麦秸杆、秣草及其混合物的木质纤维素生物质。
如本发明中使用的术语“生物质水解产物”理解为描述通过水解反应解聚合的解聚聚合物。“水解反应”理解为通过添加水切割化学键。在技术上，进行水解的一种方式是添加水解酶到生物质中。
在优选的实施方式中，生物质水解产物包含至少50wt.-％，优选至少65wt.-％，更优选至少75wt.-％，还优选至少85wt.-％和最优选99wt.-％的单糖和二糖形式的糖，其全部相对于生物质的干物质(d.m.)。在进一步优选的实施方式中，生物质水解产物包含氨基酸、寡肽、矿物质、寡糖和/或蛋白质以及有机酸。矿物质的含量优选为至少0.5wt.-％，优选至少1wt.-％，更优选至少2wt.-％和最优选3wt.-％的盐，其全部相对于生物质的干物质(d.m.)。生物质水解产物可以包含有机酸如甲酸、乙酸、半乳糖醛酸和乳酸。它也可以包含以下降解产物：酚类化合物如4-羟基-3-甲氧基苯基和4-羟基-3,5-二甲氧基苯基、阿魏酸、4-羟基苯甲酸、乙酰丙酸、糠醛类、5-羟基甲基糠醛、丹宁酸类和萜烯类。
本发明的方法中使用的生物质水解产物优选按照以下方法制备：
优选提供颗粒形式的生物质，例如，在步骤(a)之前通过切割、碾磨、研磨、剪切、剪切-分散、切碎、分散和/或共混生物质来提供。在进一步的实施方式中，生物质可经历预处理过程。
适合于生物质的预处理的方法包括本领域技术人员已知的任何种类的机械、生物、化学和/或物理预处理方法。在优选的实施方式中，预处理方法选自机械粉碎、酸和/或碱的处理、湿氧化、pH-受控的水热解和/或蒸汽爆破的方法。
“蒸汽爆破”优选包括在60-350℃，优选80-300℃，特别优选100-250℃和最优选110-220℃的温度下含木质纤维素的材料在酸(如H2SO4、HCl、H3PO4)或碱/碱性(即，NH4OH、NaOH、KOH、石灰)催化剂存在或不存在的情况下的加压水热处理，该酸或碱催化剂(如果存在的话)以0.01-15％(wt./wt.)，优选0.05-12.5％(wt./wt.)，更优选0.1-10％(wt./wt.)和最优选0.25-7.5％的浓度添加。在优选的实施方式中，压力优选选自1-100巴，优选2-50巴，还优选3-25巴和最优选5-15巴。蒸汽爆破期间的反应时间必须选自10s-2h，优选1分钟-1.5小时和最优选5分钟-1小时以提供生物质组分的有效转化而准备用于酶促水解。在特别优选的实施方式中，含木质纤维素材料的“机械粉碎”预处理在蒸汽爆破预处理之前或期间进行，其中机械粉碎选自机械加工、研磨、切碎、压碎、切割、照射(irradiation)、碾磨及其组合。
“酸预处理”优选构成连续的稀酸和/或弱酸处理，如用硫酸或者另一种有机酸如乙酸、甲酸、乳酸、磷酸、硝酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、盐酸或其混合物的处理。其它的酸也可以使用。“弱酸处理”理解为在0.1-5的pH，优选2-3的pH下进行。在优选的实施方式中，酸以0.01-15wt.-％(wt./wt.)，优选0.05-12.5wt.-％(wt./wt.)，更优选0.1-10wt.-％(wt./wt.)和最优选0.25-7.5wt.-％的浓度添加。酸优选是硫酸。酸可以在120-280℃，优选135-225℃和最优选150-200℃范围的温度下接触生物质1-60分钟，优选2-30分钟和最优选5-15分钟的时间段。添加强酸如硫酸可以在特别优选的实施方式中应用以除去半纤维素。
“化学预处理”还涉及用H2O2、臭氧、路易斯酸、FeCl3、含水醇中的(Al)2SO4、甘油、二噁烷、苯酚、乙二醇、NaOH、Na2CO3和/或氨处理生物质。与上文关于酸预处理提及的条件类似地选择优选的浓度、温度和持续时间。
“湿氧化预处理”包括氧化剂(如基于亚硫酸盐的氧化剂)的使用。
术语“机械粉碎”是指促进纤维素、半纤维素和/或木素从生物质分离和/或释放的任何机械处理。
机械粉碎优选选自机械加工、研磨、切碎、压碎、切割、照射、碾磨如干磨、湿磨和振动球磨及其组合。
“生物预处理”是指促进纤维素、半纤维素和/或木素从生物质分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以包括应用溶解木素的微生物，如放线菌(例如链霉菌菌株)或白腐真菌(white rod fungi)。
如之前所述的预处理方法在本领域技术人员已知的适合装置中进行。适合进行化学预处理的装置可以是任何种类的容器，如罐式反应器或搅拌罐式反应器。适合进行蒸汽爆破的装置可以是任何种类的容器，如罐式反应器或搅拌罐式反应器，但也可以在螺杆反应器，优选连续螺杆反应器中进行，或者在推流式反应器，优选连续推流式反应器中进行。
预处理生物质的干物质含量优选选自20-60wt.-％，特别优选35-50wt.-％，其中最优选的是生物质通过不包括添加任何酸和/或碱的方法预处理。
但是，生物质水解工艺的特定优势还在于，应用相对大的和/或未预处理的生物质颗粒仍然获得有利的结果。生物质颗粒的大小优选为使得至少90wt.-％的颗粒具有200mm，更优选100mm，甚至更优选50mm和最优选25的最大长度。进一步优选的是生物质颗粒的大小优选为使得至少95wt.-％的颗粒具有200mm，更优选100mm，甚至更优选50mm和最优选25mm的最大长度。
预处理的生物质然后优选与包含选自水解酶类的至少一种酶的酶组合物接触。
术语“接触”(或“接触的”)包括本领域技术人员已知为适合于本发明方法的生物质与酶组合物的任何种类的接触。在优选的实施方式中，生物质与酶组合物的“接触”通过向生物质添加酶组合物进行。此外，特别优选的是酶组合物的添加之后接着进行酶组合物和生物质的混合或者与酶组合物和生物质的混合同时进行。
术语“酶组合物”是指包含选自水解酶类的至少一种酶的任何组合物。选自水解酶类的至少一种酶优选达到1-99.99wt.-％(相对于酶组合物的重量)，进一步优选5-99wt.-％，特别优选10-95wt.-％和最优选20-90wt.-％，且可以进一步包含选自裂解酶类的至少一种酶。在其中酶-组合物包含选自裂解酶类的至少一种酶的实施方式中，选自水解酶类的至少一种酶优选达到0.01-50wt.-％(相对于酶组合物的重量)，优选0.05-20wt.-％，更优选0.08-5wt.-％和最优选0.1-1wt.-％。
在优选的实施方式中，酶组合物包含纤维素酶、半纤维素酶和/或果胶酶。
在特别优选的实施方式中，酶组合物包含至少一种纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.-)和至少一种内切-,4-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)。
在特别优选的实施方式中，酶组合物包含至少一种纤维二糖水解酶(EC3.2.1.-)、至少一种内切-,4-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、至少一种β-葡糖苷酶(EC3.2.1.4)、至少一种糖苷水解酶61(GH61和CBM33)、至少一种内切-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)和至少一种β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)。
在特别优选的实施方式中，以上限定的酶组合物进一步包含选自β-葡聚糖酶(EC3.2.1.-)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)、乙酰半乳聚糖酯酶(3.1.1.6)、α-阿拉伯吡喃糖苷酶(arabinopyranosidase)(3.2.1.-)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)、α-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)、β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)、果胶乙酰酯酶(pectin acetyl esterase)(EC 3.1.1.-)、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)(EC 3.2.1.-；GH28)、鼠李半乳糖醛酸聚糖(rhamnogalacturonan)乙酰酯酶(EC 3.1.1.86)、鼠李半乳糖醛酸聚糖endolyase(EC4.2.2.23)、鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶(EC 4.2.2.-)和β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15,67,82；GH28)和果胶/果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2,6,9,10)的一种或多种酶。
术语“纤维素酶”、“半纤维素酶”和“果胶酶”是指参与聚合物纤维素、半纤维素和/或果胶降解为单糖的水解降解(解聚)的任何酶共混物。如本文中使用的，术语“纤维素酶”、“半纤维素酶”和“果胶酶”是指包括如通过生物体如丝状真菌产生的多种酶的天然存在和非天然存在的共混物两者。“纤维素酶”、“半纤维素酶”和“果胶酶”优选源自真菌如真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚门的成员，包括但不限于以下属：曲霉属(Aspergillus)、枝顶孢属(Acremonium)、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、头孢霉属(Cephalosporium)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛壳菌属(Chaetomium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、内座壳属(Endothia)、Endothia mucor、镰刀菌属(Fusarium)、胶枝霉属(Gilocladium)、腐质霉属(Humicola)、稻瘟病菌属(Magnaporthe)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、平革菌属(Phanerochaete)、柄孢壳菌属(Podospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、梨孢霉属(Pyricularia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophylum)、壳多孢属(Stagonospora)、篮状菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)、嗜热霉属(Thermomyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、毛癣菌属(Trichophyton)和栓菌属(Trametes)。在优选的实施中，丝状真菌是木霉属物种。
在酶-组合物的优选实施方式中，纤维素酶和/或果胶酶来自真菌来源。在酶-组合物的特别优选的实施方式中，这种真菌来源是里氏木霉(Trichoderma reesei)。
术语“酶共混物”优选是指从一种单一微生物来源或多种微生物来源分泌的酶的共混物。在一些实施方式中，用于这些酶共混物中的酶可以从一种或多种天然存在的或工程化的丝状真菌菌株制备。优选的菌株为以上所列的。最终共混物中酶组分的所需比率可以通过改变最终共混物中酶的相对量来实现，例如通过补充纯化的或部分纯化的酶。在一些实施方式中，最终共混物可以补充一种或多种非丝状真菌内源表达的或由丝状真菌以相对低的水平表达的酶活性，以提高纤维素基质降解为可发酵的糖的降解。补充的酶可以作为补充剂添加到最终共混物且酶可以是单独的全发酵液的组分，或可以被纯化或者最低限度地回收和/或纯化。
术语"纤维素酶"是指能够水解纤维素聚合物为较短的寡聚物和/或葡萄糖的任何酶。酶组合物中优选的纤维素酶包括纤维二糖水解酶(CBH)(EC 3.2.1.-)、内切-1,4-β-葡聚糖酶(EG)(EC 3.2.1.4)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.21)、糖苷水解酶61(GH61和CBM33)、扩张蛋白(expansin)、膨胀素(swollenin)、loosinin和CIP蛋白(EC 3.1.1.-；CE15)。
术语"半纤维素酶"是指能够降解半纤维素或支持半纤维素的降解的任何酶。酶组合物中优选的半纤维素酶包括β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.-)、内切-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)、乙酰半乳聚糖酯酶(3.1.1.6)、乙酰甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)(EC 3.1.1.73)、葡糖醛酸酯酶(glucuronoyl esterase)(EC 3.1.1.-)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(arabinofuranosidase)(EC 3.2.1.55)、α-阿拉伯吡喃糖苷酶(3.2.1.-)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、α-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)、β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、甘露聚糖1,4-甘露二糖糖苷酶(mannobiosidase)(EC3.2.1.100)、阿拉伯半乳聚糖内切-β-1,4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、内切-β-1,3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、半乳聚糖内切-β-1,3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.181)、葡糖醛酸阿拉伯木聚糖(glucuronoarabinoxylan)内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.136)、α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)、松柏苷β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.126)、木葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.150,151,155)、木聚糖α-1,2-葡萄糖苷酸酶(glucuronosidase)(EC 3.2.1.131)、内切-木糖半乳糖醛酸聚糖(xylogalacturonan)水解酶(EC 3.2.1.-；GH28)、α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、半乳聚糖1,3-半乳糖苷酶(GH43)、-1,4,-内切半乳聚糖酶(EC 3.5.1.89；GH53)、α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)、β-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.43)、木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)、Mn过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、芳基-醇氧化酶(EC1.1.3.7)、乙二醛氧化酶(EC 1.1.3.)、碳水化合物氧化酶(EC 1.1.3.4,9,10)、漆酶(EC1.10.3.2)和纤维二糖脱氢酶(EC 1.1.99.18)。
术语"果胶酶"是指能够降解果胶或支持果胶的降解的任何酶。酶组合物中优选的果胶酶包括聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15,67,82；GH28)、果胶/果胶酸裂解酶(EC4.2.2.2,6,9,10)、果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)、果胶乙酰酯酶(EC 3.1.1.-)、鼠李半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.-；GH28)、鼠李半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶(EC 3.1.1.86)、鼠李半乳糖醛酸聚糖endolyase(EC 4.2.2.23)、鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶(EC 4.2.2.-)、鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶(galacturonohydrolase)(EC 3.2.1.-)、木糖半乳糖醛酸聚糖(xylogalacturonan)水解酶(EC 3.2.1.-)、果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)、β-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、β-1,4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、β-1,3-半乳聚糖酶(EC3.2.1.90)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、阿魏酸乙酰酯酶(EC 3.1.1.-)、α-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)、(β-岩藻糖苷酶)(EC 3.2.1.38)、β-apiosidase(EC 3.2.1.-)、α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)、β-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.43)、α-阿拉伯吡喃糖苷酶(EC 3.2.1.-)、β-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.31)、α-葡萄糖醛酸酶(EC3.2.1.139)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)和α-木糖苷酶(EC 3.2.1.x)。
酶按照基于International Union of Biochemistry and Molecular Biology’sEnzyme Nomenclature and Classification(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)或基于Carbohydrate-Active EnZYmes(http://www.cazy.org/)数据库的命名法分类。
术语酶的"活性"是指在酶用作蛋白质催化剂的适宜条件下酶的催化活性，其将特定的聚合物或人工底物转化为特定的寡聚物或单体产物。在这种情况中，术语“适宜的条件”是本领域技术人员公知的和可应用的。
“接触”可以通过本领域技术人员已知适合于本发明的目的的任何手段完成。因此优选的是酶混合物添加到生物质而同时在容器内搅拌生物质。酶也可以固定在载体材料上。
在优选的实施方式中，生物质的水解进行足以水解至少20wt.-％，优选至少30wt.-％，更优选至少50wt.-％和最优选至少60wt.-％的生物质的时间。在进一步优选的实施方式中，生物质的水解进行足以水解10-100wt.-％，优选20-90wt.-％，甚至更优选30-85.0wt.-％和最优选40-75wt.-％的生物质的纤维素的时间。术语“水解”理解为生物质的不溶性聚合物组分通过化学、物理和/或酶过程(如水解)而水解转化为可溶性的单体、二聚体和/或寡聚体化合物。
在特别优选的实施方式中，生物质的水解进行1分钟至136小时，更优选30分钟至112小时，特别优选1小时至100小时，甚至更优选4小时至96小时，也特别优选12小时至85小时。
在进一步优选的实施方式中，生物质的水解进行直到剩余不溶性固体物质的含量小于40wt.-％，优选小于30wt.-％，甚至更优选小于20wt.-％和最优选小于15wt.-％。在进一步优选的实施方式中，生物质的水解进行直到剩余不溶性固体物质的含量为5-40wt.-％，优选8-30wt.-％和最优选10-25wt.-％。
在另一优选实施方式中，生物质的水解进行直到生物质被液化到至少50％，优选至少60％和最优选至少80％，其中60-90％的液化是特别优选的。
水解过程中的反应温度优选选自25-80℃，更优选选自30-75℃和特别优选选自35-65℃。在另一优选实施方式中，生物质的水解进行1-120小时，优选2-110小时，更优选3-100小时，其中温度选自35-75℃或45-65℃。
在另一优选实施方式中，水解过程中的pH优选选自4-6.5，特别优选选自4.5-5.5。
适宜的剂量水平和操作条件对于本领域技术人员是明显的，特别是参照本文中提供的详细公开内容。最佳剂量水平根据使用的基质和预处理技术显著地变化。酶组合物优选以生物质的干物质的0.01-24wt.-％，更优选生物质的干物质的0.025-12wt.-％，特别优选生物质的干物质的0.05-6wt.-％和最优选生物质的干物质的0.1-3wt.-％的量添加到生物质。总酶(蛋白质)浓度用牛血清白蛋白作为参比标准通过Bradford法测定(Bradford,M.,1976)。
生物质的水解在本领域技术人员已知适合于本发明的方法的任何种类的容器中进行，优选在反应器中进行。合适的反应器在本领域技术人员的知识范围内。优选的容器/反应器包括，但不限于包含搅拌工具和/或用于在反应器内泵送或再循环生物质内容物的工具的容器/反应器。优选的反应器的进一步优选的工具包括，但不限于用于温度和/或pH控制及温度和/或pH的调节的工具。
按照本发明方法的步骤b)，生物质水解产物的温度调节到选自50-95℃的范围，优选60-90℃的范围，进一步优选65-85℃的范围的温度。该调节通过本领域技术人员已知适合于本发明的方法的任何方式进行。
在特别优选的实施方式中，本发明方法的步骤b)进行1分钟至120分钟，更优选2分钟至90分钟和特别优选3分钟至75分钟，而还优选30分钟至90分钟和45分钟至75分钟。
按照本发明方法的步骤c)，向生物质水解产物添加至少一种酸以获得生物质水解产物-酸混合物。至少一种酸可以是有机或无机酸。在优选的实施方式中，至少一种酸优选选自硫酸、磷酸、盐酸、硝酸、乙酸、甲酸、乳酸、半乳糖醛酸、柠檬酸、琥珀酸及其混合物。在优选的实施方式中，至少一种酸选自pKa值低于5.0的酸，优选选自pKa值低于3.5的酸，因此-4.0至5.0的pKa值是特别优选的和-3.0至5.0的pKa值是最优选的。
在进一步优选的实施方式中，至少一种酸添加到生物质水解产物直到生物质水解产物达到1.5-4.5，优选2.0-4.0和最优选2.5-3.5的pH。
在进一步优选的实施方式中，温度选自65-85℃的范围，且pH选自2.0-3.5的范围。在进一步优选的实施方式中，温度提高至70℃且pH设定为2.5。
在另一优选的实施方式中，本发明方法的步骤b)和c)至少部分地同时进行。因此特别优选的是至少一种酸在生物质水解产物的温度从50℃的温度，还优选从60℃的温度向上调节到选自65-90℃的范围的温度的过程中添加。优选的是至少一种酸在生物质水解产物的温度从50℃的温度，还优选从60℃的温度向上调节到选自65-85℃的范围的温度的过程中添加。
在另一优选的实施方式中，至少一种酸的温度选自5-50℃，优选10-40℃和最优选15-30℃的范围，且至少一种酸在选自50-95℃，优选65-85℃的范围的生物质水解产物温度下添加到生物质水解产物。因此特别优选的是至少一种酸和生物质水解产物之间的温度差异选自35-95％，优选40-90％的范围。
本发明的范围中还包括本发明方法的步骤c)在步骤b)之前进行。
在添加至少一种酸至生物质水解产物并调节生物质水解产物的温度后，所得的组合物本申请范围内称为“生物质水解产物-酸混合物”。
根据本发明方法的步骤(d)，固体相和液体相从生物质水解产物-酸混合物分离。水解产物-酸混合物的固体相和液体相的分离(下面“液体相”或“水解产物的液体相”与“水解产物-酸混合物的液体相”同义使用)可以通过本领域技术人员已知适合于本发明目的的任何方式进行，且优选通过过滤、离心、倾析或压榨(例如，通过螺旋压榨机)进行。优选的是压滤机，最优选膜片式压滤机。在优选的实施方式中，压滤机的滤布具有2-10L/dm2/min的布透气率。过滤助剂如硅藻土或散硅藻土(kieselguhr)或珍珠岩也可以在过滤过程中添加，优选以0.1wt.-％至10wt.-％，更优选0.5wt.-％至5wt.-％，和最优选1wt.-％至3wt.-％的浓度添加。
在固体相和液体相的分离后，进行根据步骤(e)的液体相的去离子化。去离子化优选通过电渗析、电容去离子化、膜电容去离子化、纳滤、反向渗透、色谱分离如离子交换色谱、疏水作用色谱和/或尺寸排阻色谱进行或者通过这些方法中的两种或更多种的任何组合进行。“膜电容去离子化”通过将阳离子交换膜和阴离子交换膜插入到电容去离子化单元中进行。
在特别优选的实施方式中，去离子化通过标准电渗析或通过使用至少一个双极膜的电渗析进行，特别优选接着进行电容去离子化、膜电容去离子化或离子交换色谱。
当利用标准电渗析或使用至少一个双极膜的电渗析进行去离子化时，从溶液除去的离子优选在称为“浓缩物”的液体中回收。在这一方面，特别优选的是在开始去离子化之前添加液体到电渗析装置的隔室中。在进一步优选的实施方式中，这一液体在停止给定量的去离子化后不更换，而是浓缩物在重复的去离子化中重新使用至少2个循环，更优选至少4个循环，特别优选6个循环和最优选10个循环。
在本发明中，“使用至少一个双极膜的电渗析”理解为包括使用适合于通过移除液体相中存在的离子如Na+、K+、Mg2+、Ca2+、SO4 2-、PO3 3-、Cl-和分解的H2O而除去盐的三种不同类型的膜的任何技术。使用至少一个双极膜的电渗析优选包括使用阳离子交换膜、阴离子交换膜和催化中间层，所谓的“双极膜”，以能够将液体相中的水分解成质子和氢氧根离子。通过将经由阳离子和阴离子交换膜选择性除去盐与催化中间层上的同时水解离组合，形成了酸和碱部分。
在优选的实施方式中，使用至少一个阳离子交换膜、至少一个阴离子交换膜和至少一个催化中间层或者双极膜。在进一步优选的实施方式中，至少两组这些膜串联地排列，优选至少4组，还优选至少6组和最优选至少10组。在特别优选的实施方式中，以上定义的所有三种膜或所有膜组排列在单一装置内。
去离子化优选在5℃-80℃，更优选10℃-75℃，最优选15℃-70℃的范围内的温度下进行。跨电渗析单元的压力降优选低于1巴，更优选低于0.5巴。在进一步的特别优选的实施方式中，进行去离子化直到溶液的电导率降低到至少10mS/cm，更优选至少6mS/cm，特别优选至少4mS/cm和最优选至少2mS/cm。
在进一步优选的实施方式中，通过使用至少一个双极膜的电渗析的去离子化接着进行电容去离子化。电容去离子化优选如所谓的“膜电容去离子化”应用，即，通过插入阳离子交换膜和阴离子交换膜到电容去离子化单元中。如果使用至少一个双极膜的电渗析之后进行膜电容去离子化，电渗析优选进行直到在切换到膜电容去离子化之前溶液的电导率降低到至少10mS/cm，更优选至少6mS/cm，特别优选至少4mS/cm和最优选至少2mS/cm。接着电渗析的膜电容去离子化然后用于进一步降低溶液的电导率到优选至少8mS/cm，更优选至少6mS/cm，特别优选至少4mS/cm和最优选至少2mS/cm。
在进一步优选的实施方式中，通过使用至少一个双极膜的电渗析的去离子化接着进行离子交换色谱。如果使用至少一个双极膜的电渗析之后进行离子交换色谱，电渗析优选进行直到在切换到膜电容去离子化之前溶液的电导率降低到至少10mS/cm，更优选至少6mS/cm，特别优选至少4mS/cm和最优选至少2mS/cm。接着电渗析的离子交换色谱然后用于进一步降低溶液的电导率到优选至少8mS/cm，更优选至少6mS/cm，特别优选至少4mS/cm和最优选至少2mS/cm。
在本发明中，“离子交换”定义为包含至少一种离子的溶液与固体聚合物或矿物质(mineralic)离子交换材料之间离子的交换，其中溶解在溶液中的离子通过与离子交换材料接触而被相同电荷的离子交换和替代。
通过使用至少一个双极膜的电渗析的去离子化减少在去离子化过程中产生的废物以及在其它应用中的工艺成本。使用至少一个双极膜的电渗析的采用导致产生碱部分，其可以用作例如酶的产生、生物质的水解或生物质的预处理的pH剂。在优选的实施方式中，产生的碱部分具有9-14，更优选12-13的pH。使用至少一个双极膜的电渗析的采用也导致产生酸部分，其可以用于例如生物质的水解或生物质的预处理或本发明方法的步骤c)。在优选的实施方式中，产生的酸部分具有1-5，更优选2-4的pH。特别优选的是将该酸部分用于蒸汽爆破。最优选的是根据本发明方法的步骤c)将酸部分添加到生物质水解产物中。通过电渗析的去离子化优选在5℃-80℃，更优选10℃-75℃，最优选15℃-70℃的范围内的温度下用液体相进行。跨电渗析单元的压力降优选低于1巴，更优选低于0.5巴。在进一步的特别优选的实施方式中，去离子化通过标准电渗析或通过使用至少一个双极膜的电渗析进行直到溶液的电导率降低到10mS/cm，更优选6mS/cm，特别优选4mS/cm和最优选2mS/cm。在进一步优选的实施方式中，然后去离子化进一步通过电容去离子化、膜电容去离子化或离子交换色谱继续。
在优选的实施方式中，离子交换色谱步骤中使用的离子交换树脂是一种阳离子交换树脂和一种阴离子交换树脂。在进一步优选的实施方式中，阴离子交换树脂和阳离子交换树脂在后续离子交换步骤中使用。特别优选的阴离子交换树脂是具有叔胺官能团的阴离子交换树脂。阴离子交换树脂基质优选是苯乙烯二乙烯基苯共聚物或交联的丙烯酸凝胶结构。进一步优选的是OH-形式的阴离子交换树脂。特别优选的阳离子交换树脂是具有磺酸酯或羧酸官能团的阳离子交换树脂。阳离子交换树脂基质优选是苯乙烯二乙烯基苯共聚物或交联的丙烯酸结构。进一步优选的是H+形式的阳离子交换树脂。在优选的实施方式中，离子交换树脂具有至少0.5eq/L树脂，更优选至少1eq/L树脂，最优选至少2eq/L树脂的容量。1eq定义为待通过树脂交换的1mol离子除以该离子的价位。
当将阳离子交换树脂与液体接触时，液体应当在5℃-135℃，优选10℃-70℃的温度下。当将阴离子交换树脂与液体接触时，液体应当在5℃-75℃，优选10℃-60℃的温度下。
在优选的实施方式中，离子交换树脂与液体之间的各次接触的接触时间应当在0.1和300min，更优选0.2和100min，最优选0.3和10min之间。
阳离子交换树脂使用酸再生，优选硫酸、硝酸、磷酸或盐酸。使用的酸应当是浓缩的，优选在0.05和20M之间，最优选0.5和10M之间的浓度下。阳离子交换树脂的再生优选在至少15℃下进行。阴离子交换树脂使用碱再生，优选氢氧化钠、碳酸钠或碳酸铵。使用的碱应当是浓缩的，优选在0.05和20M，最优选0.5和10M之间的浓度下。阴离子交换树脂的再生优选在至少15℃下进行。离子交换树脂与碱或酸的接触时间应当优选为至少5min，更优选至少15min。阳离子和阴离子交换树脂优选使用至少500个去离子化-再生循环，更优选至少1500个循环。
在优选的实施方式中，离子交换色谱在色谱柱内的固定床中或松散床(loosebed)中进行。但是，根据本发明的离子交换在模拟移动床设备中进行。模拟移动床设备仅在具有非常相似的性质的物质必须彼此分离时使用，例如，在例如葡萄糖和木糖的分离的情况中的两种糖单体。但是，在本发明的方法中，盐从液体除去，即离子(带电物质)与组分的其余部分(非带电物质)分离。当待彼此分离的这两类组分在其基本物理性质中显著不同时，模拟移动床设备不适合于本发明的方法。此外，由于模拟移动床设备是相当复杂和昂贵的设备，使用色谱柱内的固定床或松散床的优选实施方式提供进一步的优势。
在进一步优选的实施方式中，阴离子交换树脂和阳离子交换树脂在两个不同的柱中且不混合。在进一步优选的实施方式中，待去离子化的液体首先与阳离子交换树脂接触和然后与阴离子交换树脂接触。进一步优选的实施方式在于将液体与阳离子交换树脂接触，然后与阴离子交换树脂和然后再与新的阳离子交换树脂或已经在第一步骤中使用的阳离子交换树脂接触。进一步优选的实施方式在于重复阳离子交换树脂和阴离子交换树脂的循环。重复的循环中使用的离子交换树脂可以是新的离子交换树脂或已经在前一循环中使用的离子交换树脂。离子交换树脂和液体之间的重复接触循环的数目优选为1-10，最优选2-5。
当将液体与柱中的离子交换树脂接触时，流速应当优选为1-200床体积/小时，更优选2-80床体积/小时。
在进一步优选的实施方式中，离子交换色谱在搅拌罐中进行。
在进一步的特别优选的实施方式中，至少一种吸附剂在步骤(b)、(c)或(d)任一之前或期间添加。至少一种吸附剂优选选自膨润土、木炭、活性炭、硅藻土或散硅藻土、珍珠岩、漂白土、粘土矿物、聚合物树脂及其混合物。
进行本发明方法的步骤a)-e)导致本申请的范围内称为“纯化的水解产物”的组合物。
本发明的另一方面涉及按照如本文中定义的本发明方法制备的纯化的水解产物。纯化的水解产物的盐含量优选为最多80％，优选最多60％，更优选最多40％，更优选最多20％，和最优选最多10％，其全部相对于基质水解后的盐含量。
本发明进一步涉及按照本发明方法制备的纯化的水解产物作为发酵介质的用途。
由纯化的水解产物的细菌发酵产生的有价值的有机化合物包括，但不限于有机酸(如乙酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、富马酸、丙酸和葡萄糖醛酸)、氨基酸(如谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸)、己内酰胺类(如α-氨基-己内酰胺)、抗生素(如博来霉素、维吉霉素、林可霉素、莫能菌素、杀稻瘟菌素、四环素)、维生素(如维生素B2、B12和C)、酶、核苷酸/核苷(如NADH、ATP、cAMP、FAD、辅酶A)、生物气体、生物聚合物(如聚羟基丁酸、聚酰胺/丝蛋白)、蛋白质、多糖(如黄原胶、葡聚糖)、氨基葡聚糖(如透明质酸)以及有机溶剂和生物燃料(如丙酮、乙醇、丁醇、丙二醇)。
由纯化的水解产物的酵母发酵产生的有价值的有机化合物包括，但不限于有机溶剂(例如，乙醇、丙醇)、核苷酸(例如，RNA)、生物表面活性剂(例如，槐糖脂)、酶和生物聚合物(例如，蜘蛛丝蛋白类(spidroins))。
由纯化的水解产物的真菌发酵产生的有价值的有机化合物包括有机酸(如柠檬酸、富马酸、衣康酸)、抗生素(如青霉素、头孢菌素)、酶和多糖(如几丁质)。
在这一方法的进一步优选的实施方式中，有机化合物选自醇类、有机酸、生物聚合物、抗生素、氨基酸、己内酰胺类、多糖、有机溶剂、生物燃料、氨基葡聚糖类、核苷酸/核苷、维生素、生物表面活性剂、酶及其混合物。
下面描述了本发明方法的特别优选的实施方式，其不理解为以任何方式限制本发明。
特别优选的实施方式1
特别优选的是用于纯化生物质水解产物的方法，其包括以下步骤：
a)提供生物质水解产物；
b)调节生物质水解产物的温度至选自50-95℃，优选30-90℃，特别优选45-75℃的范围的温度和最优选至70℃的温度；
c)添加至少一种酸至生物质水解产物；
d)生物质水解产物-酸混合物的固-液分离以获得固体相和液体相；
e)在按照步骤d)的分离后水解产物-酸混合物的液体相的去离子化；
其中生物质是木质纤维素基质，优选谷物秸杆或甘蔗渣，特别优选预处理的谷物秸杆或甘蔗渣。
特别优选的实施方式2
如对于特别优选的实施方式1限定的方法，其中步骤b)进行1-90分钟，优选2-75分钟。
特别优选的实施方式3
如对于特别优选的实施方式1或2限定的方法，其中酸是有机酸，优选硫酸，且水解产物的pH调节至2.0-3.0。
特别优选的实施方式4
如对于特别优选的实施方式1-3任一项限定的方法，其中步骤c)在步骤b)之后进行。
特别优选的实施方式5
如对于特别优选的实施方式1-4任一项限定的方法，其中固-液分离通过压滤机进行，优选通过膜片式压滤机进行。
特别优选的实施方式6
如对于特别优选的实施方式1-5任一项限定的方法，其中去离子化通过电渗析进行。
特别优选的实施方式7
如对于特别优选的实施方式1-6任一项限定的方法，其中去离子化通过电渗析接着离子交换色谱步骤或接着膜电容去离子化进行。
特别优选的实施方式8
如对于特别优选的实施方式1-7任一项限定的方法，其中去离子化通过使用至少一个双极膜的电渗析进行。
特别优选的实施方式9
如对于特别优选的实施方式1-6或8任一项限定的方法，其中去离子化通过使用至少一个双极膜的电渗析接着离子交换色谱步骤或膜电容去离子化进行。
特别优选的实施方式10
如对于特别优选的实施方式5-9任一项限定的方法，其中通过电渗析的去离子化优选在5℃-80℃，更优选10℃-75℃，最优选15℃-70℃的范围内的温度下进行。
特别优选的实施方式11
如对于特别优选的实施方式5-10任一项限定的方法，其中去离子化通过电渗析进行，且跨电渗析单元的压力降优选低于1巴，更优选低于0.5巴。
特别优选的实施方式12
如对于特别优选的实施方式1-4任一项限定的方法，其中去离子化通过离子交换色谱，优选用阳离子交换接着阴离子交换进行。
特别优选的实施方式13
特别优选的是用于纯化生物质水解产物的方法，其包括以下步骤：
a)从预处理的谷物秸杆或甘蔗渣提供生物质水解产物；
b)调节生物质水解产物的温度至选自30-90℃的范围的温度2-75分钟；
c)添加至少一种有机酸至生物质水解产物以调节pH至2.0-3.0；
d)通过膜片式压滤机的生物质水解产物-酸混合物的固-液分离以获得固体相和液体相；
e)在按照步骤d)的分离后水解产物-酸混合物的液体相的去离子化，其中去离子化通过电渗析接着离子交换色谱步骤或膜电容去离子化进行。
特别优选的实施方式14
特别优选的是用于纯化生物质水解产物的方法，其包括以下步骤：
a)从预处理的谷物秸杆或甘蔗渣提供生物质水解产物；
b)调节生物质水解产物的温度至选自30-90℃的范围的温度2-75分钟；
c)添加至少一种有机酸至生物质水解产物以调节pH至2.0-3.0；
d)通过膜片式压滤机的生物质水解产物-酸混合物的固-液分离以获得固体相和液体相；
e)在按照步骤d)的分离后水解产物-酸混合物的液体相的去离子化，
其中去离子化通过具有阳离子交换接着阴离子交换的离子交换色谱进行。
特别优选的实施方式15
特别优选的是用于纯化生物质水解产物的方法，其包括以下步骤：
a)从预处理的谷物秸杆或甘蔗渣提供生物质水解产物；
b)调节生物质水解产物的温度至选自30-90℃的范围的温度2-75分钟；
c)添加至少一种有机酸至生物质水解产物以调节pH至2.0-3.0；
d)通过膜片式压滤机的生物质水解产物-酸混合物的固-液分离以获得固体相和液体相；
e)在按照步骤d)的分离后水解产物-酸混合物的液体相的去离子化，
其中去离子化通过具有阳离子交换接着阴离子交换的离子交换色谱进行。
特别优选的实施方式16
特别优选的是用于纯化生物质水解产物的方法，其包括以下步骤：
a)从预处理的谷物秸杆或甘蔗渣提供生物质水解产物；
b)调节生物质水解产物的温度至选自30-90℃的范围的温度2-75分钟；
c)添加至少一种有机酸至生物质水解产物以调节pH至2.0-3.0；
d)通过膜片式压滤机的生物质水解产物-酸混合物的固-液分离以获得固体相和液体相；
e)在按照步骤d)的分离后水解产物-酸混合物的液体相的去离子化，
其中去离子化通过具有阳离子交换接着阴离子交换的离子交换色谱进行，且
其中添加剂在按照步骤b)调节温度之前添加。
特别优选的实施方式17
特别优选的是用于纯化生物质水解产物的方法，其包括以下步骤：
a)从预处理的谷物秸杆或甘蔗渣提供生物质水解产物；
b)调节生物质水解产物的温度至选自30-90℃的范围的温度2-75分钟；
c)添加至少一种有机酸至生物质水解产物以调节pH至2.0-3.0；
d)通过膜片式压滤机的生物质水解产物-酸混合物的固-液分离以获得固体相和液体相；
e)在按照步骤d)的分离后水解产物-酸混合物的液体相的去离子化，
其中去离子化通过具有阳离子交换接着阴离子交换的离子交换色谱进行，且
其中添加剂在按照步骤c)调节pH之后添加。
实施例和附图
本发明现在通过以下实施例和附图描述。实施例和附图仅用于说明性目的而不理解为限制本发明。
图1显示在根据实施例1进行本发明的方法时，未处理的水解产物的离子交换色谱后(左柱)和处理的水解产物(本发明的方法：加热到70℃，接着pH转变到2.5)的离子交换色谱后(右柱)盐去除的相对增加。
图2显示在根据实施例1进行本发明的方法时，未处理的水解产物的离子交换色谱后(左柱)和处理的水解产物(本发明的方法：加热到70℃，接着pH转变到2.5)的离子交换色谱后(右柱)阴离子交换树脂重量的相对增加。
图3显示在根据实施例2进行本发明的方法时，未处理的水解产物的离子交换色谱后(左柱)和处理的水解产物(本发明的方法：添加膨润土，加热到70℃，接着pH转变到2.5)的离子交换色谱后(右柱)盐去除的相对增加。
图4显示在根据实施例2进行本发明的方法时，未处理的水解产物的离子交换色谱后(左柱)和处理的水解产物(本发明的方法：添加膨润土，加热到70℃，接着pH转变到2.5)的离子交换色谱后(右柱)阴离子交换树脂重量的相对增加。
图5显示在根据实施例3进行本发明的方法时，未处理的水解产物的离子交换色谱后(左柱)和处理的水解产物(本发明的方法：加热到70℃，接着pH转变到2.5和添加散硅藻土)的离子交换色谱后(右柱)盐去除的相对增加。
图6显示在根据实施例3进行本发明的方法时，未处理的水解产物的离子交换色谱后(左柱)和处理的水解产物(本发明的方法：加热到70℃，接着pH转变到2.5和添加散硅藻土)的离子交换色谱后(右柱)阴离子交换树脂重量的相对增加。
图7显示如实施例4中所述使用根据本发明处理的水解产物时在16h的管囊酵母(Pachysolen tannophilus)发酵后消耗的木糖的相对量。
图8显示如实施例5中所述使用根据本发明处理的水解产物时以每g糖在100h的土曲霉(Aspergillus terreus)发酵后产生的g衣康酸计的发酵产率。
图9显示如实施例6中所述使用根据本发明处理的水解产物时以每g糖在100h的土曲霉(Aspergillus terreus)发酵后产生的g衣康酸计的发酵产率。
实施例1：
干物质含量45wt.-％的谷物秸杆通过蒸汽爆破(220℃)预处理。在蒸汽爆破后，如此处理的谷物秸杆(“基质”)引入搅拌罐(Labfors,Infors AG,Switzerland)中。包含91.3wt.-％(来自里氏木霉ATCC26921的纤维素酶,C2730Sigma)和8.7wt.-％葡糖苷酶(49291Sigma)的酶组合物以0.5wt.-％的酶-固体比率添加到基质以水解基质而获得浆料。水解在50℃,pH 5.0下伴随50rpm的搅拌进行72小时。在水解后，浆料在以200rpm搅拌的同时加热到70℃ 1h，和然后pH使用1M H2SO4设定到2.5。如此处理的浆料然后在3巴的恒定压力下使用具有5L/dm2/min的布透气率的滤布的压滤机过滤以获得液体相和固体相。200mL的液体相然后使用离子交换树脂去离子化：液体以5mL/min的泵送率和在室温下泵送到包含30g阳离子交换树脂(S8528,Lanxess)的玻璃柱(XK16,GEHealthcare)中。在阳离子交换柱后，所得液体相以5mL/min的泵送率和在室温下泵送到包含30g阴离子交换树脂(S6368A,Lanxess)的玻璃柱(XK16,GE Healthcare)中。相同的去离子化使用未用加热步骤和至pH 2.5的pH转变处理的水解产物(即现有技术的方法)进行。改善的纯化过程通过两种方式证明：(1)去离子化效率和(2)IEX树脂上的结垢。
两个试验中的去离子化效率通过测量从水解产物的液体相移除的盐的量来测定。结果显示于图1中。比较显示用加热步骤和pH转变处理的水解产物的液体相的盐去除相对于未处理的水解产物液体相的盐去除(现有技术的方法)显著增加。
在两个试验中阴离子交换树脂的结垢通过比较去离子化之前和之后阴离子交换树脂重量的增加来测定。结果显示于图2中。两个试验之间该值的比较表明与未处理的水解产物(按照现有技术的方法产生)接触的树脂上多30.3％的结垢。
实施例2：
干物质含量45wt.-％的谷物秸杆通过蒸汽爆破(220℃)预处理。在蒸汽爆破后，如此处理的谷物秸杆(“基质”)引入搅拌罐(Labfors,Infors AG,Switzerland)中。包含91.3wt.-％(来自里氏木霉ATCC26921的纤维素酶,C2730Sigma)和8.7wt.-％葡糖苷酶(49291Sigma)的酶组合物以0.5wt.-％的酶-固体比率添加到基质以水解基质而获得浆料。水解在50℃,pH 5.0下伴随50rpm的搅拌进行72小时。在水解后，向浆料添加2wt.-％膨润土(210FF,Clariant Produkte(Deutschland)GmbH)，且混合物在室温下以200rpm搅拌1h。然后浆料在以200rpm搅拌的同时加热到70℃ 1h，和然后pH使用1MH2SO4设定到2.5。如此处理的浆料然后在3巴的恒定压力下使用具有5L/dm2/min的布透气率的滤布的压滤机过滤以获得液体相和固体相。200mL的液体相然后使用离子交换树脂去离子化：液体以5mL/min的泵送率和在室温下泵送到包含30g阳离子交换树脂(S8528,Lanxess)的玻璃柱(XK16,GE Healthcare)中。在阳离子交换柱后，所得液体相以5mL/min的泵送率和在室温下泵送到包含30g阴离子交换树脂(S6368A,Lanxess)的玻璃柱(XK16,GE Healthcare)中。相同的去离子化使用未用膨润土、加热步骤和至pH 2.5的pH转变处理的水解产物(即现有技术的方法)进行。改善的纯化过程通过两种方式证明：(1)去离子化效率和(2)IEX树脂上的结垢。
两个试验中的去离子化效率通过测量从水解产物的液体相移除的盐的量来测定。结果显示于图3中。比较显示用膨润土、加热步骤和pH转变处理的水解产物的液体相的盐去除相对于未处理的水解产物的液体相(现有技术的方法)的盐去除显著增加。
在两个试验中阴离子交换树脂的结垢通过比较去离子化之前和之后阴离子交换树脂重量的增加来测定。结果显示于图4中。两个试验之间该值的比较表明与未处理的水解产物(按照现有技术的方法产生)接触的树脂上多26.5％的结垢。
实施例3：
干物质含量45wt.-％的谷物秸杆通过蒸汽爆破(220℃)预处理。在蒸汽爆破后，如此处理的谷物秸杆(“基质”)引入搅拌罐(Labfors,Infors AG,Switzerland)中。包含91.3wt.-％(来自里氏木霉ATCC26921的纤维素酶,C2730Sigma)和8.7wt.-％葡糖苷酶(49291Sigma)的酶组合物以0.5wt.-％的酶-固体比率添加到基质以水解基质而获得浆料。水解在50℃,pH 5.0下伴随50rpm的搅拌进行72小时。在水解后，浆料在以200rpm搅拌的同时加热到70℃ 1h，和然后pH使用1M H2SO4设定到2.5。然后向浆料添加2wt.-％散硅藻土(200,Eaton)，且在室温下以200rpm搅拌1h。如此处理的浆料然后在3巴的恒定压力下使用具有5L/dm2/min的布透气率的滤布的压滤机过滤以获得液体相和固体相。液体相然后使用离子交换树脂去离子化：液体倒入玻璃搅拌罐(Multifors,Infors AG)中且在室温下添加15wt.-％阳离子交换树脂(S8528,Lanxess)。混合物以200rpm搅拌1h。然后，阳离子交换树脂通过使用纸滤器(Black ribbon 589/1,Whatman)过滤混合物移除。所得液体相再次倒入玻璃搅拌罐(Multifors,Infors AG)中且在室温下添加15wt.-％阴离子交换树脂(S6368A,Lanxess)。混合物以200rpm搅拌1h。然后，阴离子交换树脂通过使用纸滤器(Black ribbon 589/1,Whatman)过滤混合物移除。相同的去离子化使用未用加热步骤和至pH 2.5的pH转变接着添加散硅藻土处理的水解产物(“现有技术”方法)进行。改善的纯化过程通过两种方式证明：(1)去离子化效率和(2)IEX树脂上的结垢。
两个试验中的去离子化效率通过测量从水解产物的液体相移除的盐的量来测定。结果显示于图5中。比较显示用加热步骤和至pH 2.5的pH转变接着添加散硅藻土处理的水解产物的液体相的盐去除相对于未处理的水解产物的液体相(现有技术的方法)的盐去除显著增加。
在两个试验中阴离子交换树脂的结垢通过比较去离子化之前和之后阴离子交换树脂重量的增加来测定。结果显示于图6中。两个试验之间该值的比较表明与未处理的水解产物(按照现有技术的方法产生)接触的树脂上多26.4％的结垢。
实施例4：
干物质含量45wt.-％的谷物秸杆通过蒸汽爆破(220℃)预处理。在蒸汽爆破后，如此处理的谷物秸杆(“基质”)引入搅拌罐(Labfors,Infors AG,Switzerland)中。包含91.3wt.-％(来自里氏木霉ATCC26921的纤维素酶,C2730Sigma)和8.7wt.-％葡糖苷酶(49291Sigma)的酶组合物以0.5wt.-％的酶-固体比率添加到基质以水解基质而获得浆料。水解在50℃,pH 5.0下伴随50rpm的搅拌进行72小时。在水解后，浆料在以200rpm搅拌的同时加热到70℃ 1h，和然后pH使用1M H2SO4设定到2.5。如此处理的浆料然后在3巴的恒定压力下使用具有5L/dm2/min的布透气率的滤布的压滤机过滤以获得液体相和固体相。液体相然后通过使用具有由10个双极膜(PCCell)、10个阴离子交换膜(PC 200D,PCCell)和9个阳离子交换膜(PC SK,PCCell)组成的膜堆的双极膜(ED64004,PCCell)的电渗析进行去离子化。电渗析在32℃下进行2h的持续时间，且对于稀释物和浓缩物具有50L/h的泵送率。在2h后，电导率降低83％。去离子化后电渗析膜的称重显示这些膜与用于未处理的水解产物(按照现有技术的方法产生)的膜相比具有较低的重量。用于处理的水解产物的膜上的结垢因此与用未处理的水解产物(现有技术)进行电渗析相比降低。
在进行电渗析后，处理的水解产物用作用于管囊酵母的发酵的基质。发酵在具有温度和pH控制装置的玻璃搅拌罐(Multifors,Infors AG,Switzerland)中进行。发酵通过在电渗析后添加10％(wt./wt.)的管囊酵母(DSMZ No.70352,Braunschweig)的种子培养物到750mL的处理的水解产物开始。发酵在30℃和pH 6.0下，伴随以200rpm搅拌100小时以分批方式进行。与未处理的水解产物相比，木糖消耗率在使用按照本发明方法的水解产物时显著提高，因此显著加速发酵过程、提高生产率和降低成本。结果显示于图7中。
实施例5：
干物质含量45wt.-％的谷物秸杆通过蒸汽爆破(220℃)预处理。在蒸汽爆破后，如此处理的谷物秸杆(“基质”)引入搅拌罐(Labfors,Infors AG,Switzerland)中。包含91.3wt.-％(来自里氏木霉ATCC26921的纤维素酶,C2730Sigma)和8.7wt.-％葡糖苷酶(49291Sigma)的酶组合物以0.5wt.-％的酶-固体比率添加到基质以水解基质而获得浆料。水解在50℃,pH 5.0下伴随50rpm的搅拌进行72小时。在水解后，浆料在以200rpm搅拌的同时加热到70℃ 1h，和然后pH使用1M H2SO4设定到2.5。如此处理的浆料然后在3巴的恒定压力下使用具有5L/dm2/min的布透气率的滤布的压滤机过滤以获得液体相和固体相。液体相然后通过使用具有由10个双极膜(PCCell)、10个阴离子交换膜(PC 200D,PCCell)和9个阳离子交换膜(PC SK,PCCell)组成的膜堆的双极膜(ED64004,PCCell)的电渗析进行去离子化。电渗析在32℃下进行2h的持续时间，且对于稀释物和浓缩物具有50L/h的泵送率。在2h后，电导率降低83％。去离子化后电渗析膜的称重显示这些膜与用于未处理的水解产物(按照现有技术的方法产生)的膜相比具有较低的重量。用于处理的水解产物的膜上的结垢因此与用未处理的水解产物(现有技术)进行电渗析相比降低。
在进行电渗析后，处理的水解产物用作用于土曲霉的发酵的基质。发酵在置于温箱(Multitron,Infors AG,Switzerland)中的50mL摇瓶中进行。发酵通过在电渗析后添加10％(wt./wt.)的土曲霉(ATCC 32359)的种子培养物到10mL的处理的水解产物开始。发酵在35℃和pH 3.0下，在80％相对湿度下伴随以250rpm搅拌100小时以分批方式进行。尽管未处理的水解产物中土曲霉的发酵不显示显著的生长和衣康酸的显著产生，根据本发明处理的水解产物允许显著的细胞生长和衣康酸的显著产生。以g衣康酸/g糖计的发酵产率显示于图8中。
实施例6:
干物质含量45wt.-％的谷物秸杆通过蒸汽爆破(220℃)预处理。在蒸汽爆破后，如此处理的谷物秸杆(“基质”)引入搅拌罐(Labfors,Infors AG,Switzerland)中。包含91.3wt.-％(来自里氏木霉ATCC26921的纤维素酶,C2730Sigma)和8.7wt.-％葡糖苷酶(49291Sigma)的酶组合物以0.5wt.-％的酶-固体比率添加到基质以水解基质而获得浆料。水解在50℃,pH 5.0下伴随50rpm的搅拌进行72小时。在水解后，浆料在以200rpm搅拌的同时加热到70℃ 1h，和然后pH使用1M H2SO4设定到2.5。如此处理的浆料然后在3巴的恒定压力下使用具有5L/dm2/min的布透气率的滤布的压滤机过滤以获得液体相和固体相。液体相然后通过使用具有由10个双极膜(PCCell)、10个阴离子交换膜(PC 200D,PCCell)和9个阳离子交换膜(PC SK,PCCell)组成的膜堆的双极膜(ED64004,PCCell)的电渗析进行去离子化。电渗析在32℃下进行2h的持续时间，且对于稀释物和浓缩物具有50L/h的泵送率。在2h后，电导率降低83％。去离子化后电渗析膜的称重显示这些膜与用于未处理的水解产物(按照现有技术的方法产生)的膜相比具有较低的重量。用于处理的水解产物的膜上的结垢因此与用未处理的水解产物(现有技术)进行电渗析相比降低。
在进行电渗析后，200mL的这种处理的水解产物使用Explorer(GEHealthcare)单元与玻璃柱XK16中的30g离子交换树脂(S6368A,Lanxess)接触。流率是1mL/min且接触在21℃下进行。
在进行电渗析和离子交换色谱后，处理的水解产物用作用于土曲霉的发酵的基质。发酵在置于温箱(Multitron,Infors AG,Switzerland)中的50mL摇瓶中进行。发酵通过在电渗析和离子交换色谱后添加10％(wt./wt.)的土曲霉(ATCC 32359)的种子培养物到10mL的处理的水解产物开始。发酵在35℃和pH 3.0下，在80％相对湿度下伴随以250rpm搅拌100小时以分批方式进行。尽管未处理的水解产物中土曲霉的发酵不显示显著的生长和衣康酸的显著产生，根据本发明处理的水解产物允许显著的细胞生长和显著改善的衣康酸产生。以g衣康酸/g糖计的发酵产率显示于图9中。

Claims (16)

1.用于纯化生物质水解产物的方法，包括以下步骤：
a)提供生物质水解产物；
b)调节所述生物质水解产物的温度至选自50-95℃的范围的温度；
c)添加至少一种酸至所述生物质水解产物；
d)所述生物质水解产物-酸混合物的固-液分离以获得固体相和液体相；
e)在按照步骤d)的分离后所述生物质水解产物-酸混合物的液体相的去离子化。
2.根据权利要求1的方法，其中按照步骤b)的所述温度选自65-90℃的范围。
3.根据前述权利要求中任一项的方法，其中添加所述至少一种酸直到所述生物质水解产物的pH达到2.0-4.5。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少一种酸选自pKa值为-4.0至5.0的酸。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中至少一种吸附剂在步骤b)或d)任一之前或期间添加。
6.根据权利要求5的方法，其中所述至少一种吸附剂选自膨润土、木炭、活性炭、硅藻土、散硅藻土、漂白土、粘土矿物、聚合物树脂及其混合物。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤b)和c)至少部分地同时进行。
8.根据权利要求7的方法，其中所述至少一种酸在所述水解产物的温度从50℃的温度向上调节到选自65-90℃的范围的温度的过程中添加。
9.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述至少一种酸的温度选自5-45℃且所述至少一种酸在选自70-95℃的范围内的所述水解产物的温度下添加到所述生物质水解产物。
10.根据权利要求9的方法，其中所述至少一种酸和所述生物质水解产物之间的温度差异选自35-95％的范围。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述去离子化通过电渗析、离子交换色谱、膜电容去离子化、纳滤、反向渗透、色谱分离、疏水色谱和/或尺寸排阻色谱或其任何组合进行。
12.根据权利要求11的方法，其中去离子化通过电渗析接着膜电容去离子化或离子交换色谱进行。
13.根据权利要求11的方法，其中去离子化通过使用至少一个双极膜的电渗析进行。
14.根据权利要求1-6或11-13中任一项的方法，其中步骤c)在步骤b)之前进行。
15.根据权利要求1-14中任一项定义的方法制备的纯化的水解产物。
16.根据权利要求15的纯化的水解产物作为发酵介质的用途。
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