CN109072222B - 具有突变型bxl1基因的木霉属真菌和使用该真菌制造低聚木糖和葡萄糖的制造方法 - Google Patents

Abstract

公开了即使在纤维素系生物质的水解中使用来源于木霉属真菌的纤维素酶，生物质中的木聚糖也不被分解成木糖的新的木霉属真菌，和使用该真菌由含纤维素的生物质制造葡萄糖和低聚木糖的制造方法。木霉属真菌具有β‑木糖苷酶1(BXL1)基因的N末端结构域和C末端结构域，Fn3‑like结构域被破坏。如果使用该木霉属真菌，则β‑木糖苷酶活性缺失，β‑葡糖苷酶活性增加。因此，即使水解含纤维素的生物质，生物质中的木聚糖也不分解成木糖，能够有效地制造葡萄糖和低聚木糖。

Description

具有突变型BXL1基因的木霉属真菌和使用该真菌制造低聚木 糖和葡萄糖的制造方法

技术领域

本发明涉及具有β-木糖苷酶(BXL1)活性缺失的突变型BXL1基因的木 霉属真菌和使用该真菌由纤维素系生物质制造低聚木糖和葡萄糖的方法。

背景技术

低聚木糖是多个木糖单元通过β-糖苷键结合而成的寡糖的总称。低聚 木糖由于显示优异的整肠作用等，而也作为功能性食品用的材料而被利用 (非专利文献1)。

低聚木糖可以通过水解纤维素系生物质所含的木聚糖而获得，作为水 解的方法，已知水热处理的方法(非专利文献2)、酸水解的方法(非专利文 献3)、酶处理的方法(专利文献1)。

另一方面，用酶水解生物质时，丝状菌由于作为分解纤维素、木聚糖 的酶的纤维素酶生产能力高，因而非常适合。然而，已知如果使丝状菌所 生产的纤维素酶与生物质反应，则低聚木糖被分解成单糖木糖。作为将低 聚木糖分解成木糖的酶，已知β-木糖苷酶，报告了里氏木霉的β-木糖苷酶 1与二糖(木二糖)至七糖(木七糖)反应，生成木糖(非专利文献4)。

β-木糖苷酶1属于糖苷水解酶家族3(GH3)(非专利文献5)。属于GH3 的酶群中存在多个高度保守的区域(结构域)，其中，里氏木霉的β-木糖苷 酶1包含GH3的N末端结构域和C末端结构域。另外，认为在里氏木霉 的β-木糖苷酶中，264位、311位、464位的氨基酸残基对活性是必需的(非 专利文献6，7)。此外，β-木糖苷酶1除了这些结构域还具有Fn3-like结构域，Fn3-like结构域的功能尚不明。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特许第4675139号

非专利文献

非专利文献1：Ayyappan AA等，Compre.Rev.Food.Sci.Food Saf.10， 2-16(2011)

非专利文献2：Patricia M等，Ind.Crops.Prod.62，460-465(2014)

非专利文献3：Ozlem A等，Carbohydr.Res.344，660-666(2009)

非专利文献4：M.C.Hermann等，Biochem.J.321，375-381(1997)

非专利文献5：Carbohydrate-Active EnZYmes Database (http://www.cazy.org/GH3.html)

非专利文献6：LE Rasmussen等，Biotech.Bioeng.94，5，869-876(2006)

非专利文献7：E Margolles-Clark等，Appl.Environ.Microbiol.62， 10，3840-3846(1996)

发明内容

发明所要解决的课题

存在如果使用来源于木霉属真菌的纤维素酶，则木聚糖被分解为木糖 的课题。

用于解决课题的方法

本发明者们深入研究的结果发现，如果使用在β-木糖苷酶1的氨基酸 序列中具有GH3的N末端结构域和C末端结构域、Fn3-like结构域被破 坏的木霉属真菌，则β-木糖苷酶活性缺失，β-葡糖苷酶活性增加，从而完 成了本发明。

即，本发明提供以下(1)～(9)。

(1)木霉属真菌，具有编码突变型β-木糖苷酶1的突变型BXL1基因，所述突变型β-木糖苷酶1具有β-木糖苷酶1或具β-木糖苷酶活性的多肽中的糖苷水解酶家族3即GH3的N末端结构域和C末端结构域，缺失Fn3-like结构域，并且β-木糖苷酶活性缺失，所述β-木糖苷酶1包含序列 号2所记载的氨基酸序列，所述具β-木糖苷酶活性的多肽包含与序列号2 所记载的氨基酸序列有80％以上的序列同一性的氨基酸序列。

(2)根据(1)所述的木霉属真菌，所述序列同一性为95％以上。

(3)根据(1)或(2)所述的木霉属真菌，所述突变型BXL1基因是编码具有 β-木糖苷酶1中的GH3的N末端结构域和C末端结构域、缺失Fn3-like 结构域的突变型多肽的基因，所述β-木糖苷酶1包含序列号2所记载的氨 基酸序列。

(4)根据(1)～(3)的任一项所述的木霉属真菌，所述Fn3-like结构域的缺 失，是在编码位于所述C末端结构域的下游且位于所述Fn3-like结构域的 上游的区域的基因区域内，通过由碱基的缺失或插入造成的移码突变、或 由碱基的替换造成的终止密码子突变而产生的。

(5)根据(1)～(4)的任一项所述的木霉属真菌，所述木霉属真菌是非重组 体。

(6)根据(1)～(5)的任一项所述的木霉属真菌，所述木霉属真菌是里氏木 霉。

(7)根据(5)所述的木霉属真菌，所述木霉属真菌是解除了碳分解代谢物 阻遏的菌株。

(8)纤维素酶组合物的制造方法，包括：培养(1)～(7)的任一项所述的木 霉属真菌的工序。

(9)葡萄糖和低聚木糖的制造方法，包括：回收通过(8)所述的方法制造 的纤维素酶组合物的工序，和

用所得的纤维素酶组合物水解包含木聚糖和纤维素的生物质的工序。

发明的效果

根据本发明，通过使用具有编码在β-木糖苷酶1的氨基酸序列中具有 GH3的N末端结构域和C末端结构域、且Fn3-like结构域缺失的突变型 BXL1的基因的木霉属真菌，能够使β-木糖苷酶活性缺失，使β-葡糖苷酶 活性增加。进而，通过使用该来源于木霉属真菌的纤维素酶组合物，能够 高效地制造葡萄糖和低聚木糖。

附图说明

图1是显示下述实施例中制作的、用于突变BXL1基因插入的质粒的 结构的图。

具体实施方式

本发明基于如下新见解而完成：通过使用具有编码木霉属真菌的 BXL1的作为功能未知结构域的Fn3-like结构域缺失的突变型BXL1的基 因的木霉属真菌，能够使β-木糖苷酶活性缺失。

本发明中使用的木霉属真菌属于Trichoderma属，只要是具有生成蛋 白质的能力就不特别限制。属于Trichoderma属的木霉属真菌具体可列举 绿木霉(Trichodermavirens)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、深绿木 霉(Trichoderma atroviride)、盖姆斯木霉(Trichoderma gamsii)、里氏木霉 (Trichoderma reesei)。其中优选为里氏木霉(Trichoderma reesei)。另外， 也可以利用来源于木霉属、经突变剂或紫外线照射等实施了突变处理、蛋 白质的生产性提高的突变株。优选列举作为来源于里氏木霉的公知突变株的QM6a株(NBRC31326)、QM9414株(NBRC31329)、PC-3-7株 (ATCC66589)、QM9123株(NBRC31327)、RutC-30株(ATCC56765)、 CL-847株(Enzyme.Microbiol.Technol.10，341-346(1988))、MCG77株 (Biotechnol.Bioeng.Symp.8，89(1978))、MCG80株(Biotechnol.Bioeng.12， 451-459(1982))和它们的派生株等。

进而，本发明中使用的木霉属真菌优选解除了碳分解代谢物阻遏。解 除了碳分解代谢物阻遏的株由于纤维素酶等蛋白质的生产量提高，因而能 够生成更多的蛋白质。进而优选为解除了介由碳分解代谢物阻遏物-I的碳 分解代谢物阻遏的菌株。例如通过在碳分解代谢物阻遏物-I基因(cre1)中插 入突变来解除介由碳分解代谢物阻遏物-I的碳分解代谢物阻遏。已知由 cre1基因编码的CRE1蛋白质通过由葡萄糖造成的分解代谢物阻遏，而抑制纤维素酶基因的表达(FEBS Lett.，376，103-107，1995)。于是如果在cre1 基因中插入突变，则纤维素酶基因的表达抑制被解除，纤维素酶的生产量 提高。因此，在cre1基因中插入了突变的菌株更适合蛋白质、纤维素酶组 合物的制造。作为具体的碳cre1基因的突变的例子，可列举在PC-3-7株 (ATCC66589)的cre1基因中，将232位的A替换成C，其结果氨基酸序列 的78位的苏氨酸被替换为脯氨酸。已知通过插入该突变，纤维素酶的生产 量提高(Biosci.Biotechnol.Biochem.，77(3)，534-543，2013)。另外，已知在 RutC-30株(ATCC56765)中cre1基因被部分切断，碳分解代谢物阻遏被解 除(BMC Genomics.，9，327，2008)。其中，在cre1基因插入了突变的菌株， 包含通过基因突变剂、紫外线照射等而引入了由cre1基因区域内的碱基的 缺失或插入造成的移码、或由碱基的替换造成的终止密码子突变、或碱基 的切断的菌株，进一步也包含通过重组等将cre1基因的全部或一部分除去或替换成其他基因的菌株。具体优选使用继承了PC-3-7株(ATCC66589)、 RutC-30株(ATCC56765)、以及PC-3-7株(ATCC66589)、RutC-30株 (ATCC56765)的特征的菌株，进一步优选继承了PC-3-7株(ATCC66589) 或PC-3-7株(ATCC66589)的特征的菌株。其中，继承了PC-3-7(ATCC66589)、RutC-30株(ATCC56765)的特征的菌株中，也包含 在继承了PC-3-7株(ATCC66589)、RutC-30株(ATCC56765)的特征的菌株 中也包含新加入了突变的菌株、通过重组提高了功能的菌株。

里氏木霉的BXL1的氨基酸序列示于序列号2，编码该氨基酸序列的 碱基序列示于序列号1。本发明中，作为缺失Fn3-like结构域之前的母基 因，可以优选使用编码序列号2所示的氨基酸序列的基因，也可以利用编 码包含与序列号2所记载的氨基酸序列有80％以上、优选为85％以上、更 优选为90％以上、更优选为93％以上、更优选为95％以上、更优选为97 ％以上、更优选为99％以上的序列同一性的氨基酸序列且具β-木糖苷酶活 性的多肽的基因作为母基因(以下为了方便将包含与序列号2所记载的氨 基酸序列有80％以上的序列同一性的氨基酸序列且具β-木糖苷酶活性的 多肽的氨基酸序列称为“序列号2类似氨基酸序列”)。其中，二者的氨基 酸序列的序列同一性是以一致的氨基酸数最多的方式将序列对齐，将一致 的氨基酸数除以总氨基酸数(在总氨基酸数不同的情况下为较长一方的氨基酸数)而得的结果用百分率表示的值，可以通过如BLAST那样公知的软 件容易地计算出。同样地，二者的碱基序列的序列同一性是以一致的碱基 数最多的方式将序列对齐，将一致的碱基数除以总碱基数(在总碱基数不同 的情况下为较长一方的碱基数)而得的结果用百分率表示的值，可以通过如 BLAST那样公知的软件容易地计算出。

本发明的木霉属真菌中β-木糖苷酶活性缺失。β-木糖苷酶是将木糖通 过β-1，4-键合而成的木二糖分解而产生木糖的酶。β-木糖苷酶的酶活性(U： 单位)可以以例如对硝基苯基-β-吡喃木糖苷(pNP-Xyl)作为底物测定活性。 本发明中，β-木糖苷酶活性缺失是指与缺失BXL1基因的FN3-like结构域 之前的母株相比β-木糖苷酶活性降低到十分之一以下，更优选为二十分之 一以下、更优选为五十分之一以下、更优选为八十分之一以下、最优选为 一百分之一以下。本发明中，活性作为相对于酶液中所含的蛋白质每1mg 的U来计算。

本发明中，β-木糖苷酶活性的缺失通过BXL1的Fn3-like结构域的缺 失来进行。包含序列号2所示的氨基酸序列的BXL1中的Fn3-like结构域 是指序列号2的第695个残基至第759个残基的区域。在序列号2类似氨 基酸序列的情况下，是指与序列号2中的第695个残基至第759个残基的 区域对应的区域。其中，“对应的区域”是指在将序列号2的氨基酸序列与序列号2类似氨基酸序列以一致的氨基酸数最多的方式将序列对齐时， 与序列号2的第695个残基至第759个残基的区域对齐的区域。在序列号 1所示的碱基序列的情况下的“对应的区域”也同样，是指将序列号1的 碱基序列与另一碱基序列以一致的碱基数最多的方式将序列对齐时，与序 列号1的碱基序列中的区域对齐的区域。此外，在以下说明中，基于显示 里氏木霉的BXL1的氨基酸序列的序列号2的氨基酸序列和编码该氨基酸 序列的基因的碱基序列(序列号1)进行说明，但这些说明也适用于序列号2 类似氨基酸序列和编码该氨基酸序列的基因的碱基序列，此时序列号2或 序列号1中的特定区域是指序列号2类似氨基酸序列或编码该氨基酸序列 的碱基序列中的对应的区域。

本发明中，Fn3-like结构域的缺失是指该结构域完全消失、一部分消 失、完全变成不同的氨基酸、一部分变成不同的氨基酸、或它们的组合。 更具体是指与突变前的母(序列号2或序列号2类似氨基酸序列)Fn3-like 结构域的氨基酸序列的序列同一性为80％以下，优选为50％以下，更优选 为20％以下，更优选为10％以下，更优选为5％以下，更优选为3％以下， 更优选为1％以下，最优选为0％。

作为Fn3-like结构域的缺失的方法，可通过利用突变剂或紫外线照射 等的突变处理、或基因重组来进行。具体通过在编码位于C末端结构域(后 述)的下游且位于所述Fn3-like结构域的上游的区域的基因区域(序列号1 所示的里氏木霉的BXL1基因碱基序列中1929位至2082位)内由碱基的缺 失或插入造成的移码、或由碱基的替换造成的终止密码子突变来进行。或 者通过在Fn3-like结构域的碱基序列内由碱基序列内的碱基的缺失、插入 造成的移码、或由碱基的替换造成的终止密码子突变来进行。另外，利用 基因重组的Fn3-like结构域的缺失以Fn3-like结构域的氨基酸的一部分或 全部消失或变化的方式进行。

本发明的突变型BXL1基因中编码Fn3-like结构域的基因序列缺失， 但具有编码糖苷水解酶家族3(GH3)GH3的N末端结构域和C末端结构域 的基因序列。GH3的N末端结构域是指BXL1(序列号2)的第84个残基至 至第375个残基，GH3的C末端结构域是指BXL1(序列号2)的第414个 残基至第642个残基。认为GH3的N末端结构域和C末端度结构域参与 β-木糖苷酶的活性，被认为参与前述的β-木糖苷酶的活性的264位、311 位、464位的氨基酸残基也包含在GH3家族的N末端区域或C末端区域 中。具有结构域是指该结构域的氨基酸序列与序列号2相比完全无变化。 β-葡糖苷酶的氨基酸序列中是否保有Fn3-like结构域、GH3家族的N末端 序列和C末端序列，可以通过利用NCBI(The National Center for BiotechnologyInformation)在线提供的氨基酸序列的分析软件“Conserved Domains”(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？)来确认。

本发明中，具有突变型BXL1基因的木霉属真菌可以使用基因重组的 方法、利用基因突变处理等的非重组的方法来获得。具体地，可以利用NTG 处理等进行突变处理，培养生长起来的集落，测定对硝基苯基-β-吡喃木糖 苷的分解活性，获得活性降低的菌株，从而得到具有突变BXL1基因的木 霉属真菌。

在使用非重组体制造的情况下，具有可以不进行使用重组体制造时必 须的防扩散处置的优势。

本发明中，培养本发明的木霉属真菌，就能够得到纤维素酶组合物。 用所得的纤维素酶组合物水解包含木聚糖和纤维素的生物质，能够制造葡 萄糖和低聚木糖。

本发明中的纤维素酶组合物是水解β-1，4-葡聚糖的糖苷键的各种水解 酶的混合物。作为纤维素酶组合物所含的水解酶，可列举例如，纤维二糖 水解酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、阿拉伯呋 喃糖酶、木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、α-葡糖苷酸酶、脱乙酰壳多糖酶、壳 多糖酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶等。

本发明所得的纤维素酶组合物在上述水解酶中，β-木糖苷酶活性缺失， β-葡糖苷酶活性增加。

β-葡糖苷酶是分解葡萄糖通过β-1，4-键合而成的纤维二糖而产生葡萄 糖的酶。β-葡糖苷酶的酶活性(U：单位)可以以例如对硝基苯基-β-吡喃葡糖 苷(pNP-Glu)作为底物测定活性。本发明中β-葡糖苷酶活性增加，是指与 缺失BXL1基因的Fn3-like结构域之前的母株相比β-葡糖苷酶活性增加了 0.2％以上，更优选为0.5％以上、更优选为1％以上、更优选为2％以上。

本发明中对于木霉属真菌的培养方法不特别限定，只要是产生纤维素 酶组合物的方法即可，可以采用木霉属细菌的公知的培养方法。使用的培 养基所含的碳源和诱导剂优选使用生物质。作为氮源可使用例如，多聚胨、 肉汁、CSL、大豆粕等。此外，该培养基中可以添加生产作为目的的纤维 素酶所需的成分。培养可以采用振荡培养、搅拌培养、搅拌振荡培养、静 置培养、连续培养等各种培养方式，但优选为振荡培养或搅拌培养。培养 温度通常为20℃～35℃、优选为25℃～31℃，培养时间通常为3～10天、 优选为4～9天。

本发明中在培养时为了增加纤维素酶组合物量而可以添加诱导剂。对 使用的诱导剂不特别限定，但优选使用生物质。本发明中生物质是来源于 可再生的生物的有机性资源。另外，生物质中优选使用包含纤维素和木聚 糖的生物质，具体可列举纸浆、甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸(玉 米的茎叶)、玉米棒(玉米的芯)、稻秸、麦秸等草本系生物质，以及树木、 废建材等木质系生物质等作为例子。这些诱导剂可以以容易添加到培养液 中的方式进行处理。具体的处理方法可以使用酸处理、硫酸处理、稀硫酸 处理、碱处理、水热处理、亚临界处理、微粉碎处理、蒸煮处理等公知的 方法。

对作为诱导剂的生物质所含的木聚糖含量不特别限定，相对于生物质 固体成分重量优选为5重量％以上，更优选为10重量％以上，更优选为 20％重量以上。对生物质所含的纤维素含量、木聚糖含量的测定方法不特 别限定，具体可以通过以下的方法测定。首先，将要测定的生物质试样风 干后用维利氏磨粉机(Wiley Mill)粉碎，分取适量，根据在105℃干燥后的 重量减少计算水分率(wt％)。然后，用天平称取适量(约0.3g)的试样，加入72％硫酸3mL，一边在30℃时常搅拌一边放置1小时。将该反应液与纯 化水84mL混合后，在120℃用高压灭菌器加热分解1小时。加热分解后， 过滤分离分解液和残渣，加入滤液和残渣的洗液定容至100mL，通过高速 液相色谱法进行单糖(葡萄糖、木糖等)的定量。由所得的单糖浓度(葡萄糖、 木糖)和试样分解量(由水分率计算无水基质重量)计算出试样中的含量(纤 维素、木聚糖)。

对本发明中作为诱导剂使用的生物质的量不特别限制，优选为5重量 ％～20重量％，更优选为8重量％～15重量％，更优选为8重量％～12 重量％。

对本发明中制造的纤维素酶组合物的使用方法不特别限定，但优选在 糖的制造中使用。更优选在低聚木糖的制造中使用，更优选在低聚木糖和 葡萄糖的制造中使用。

本发明中的“低聚木糖”是指至少2个以上木糖通过β-糖苷键连接而 成的低聚木糖。对低聚木糖的聚合度不特别限定，优选为水溶性高的2糖 (木二糖)至6糖(木六糖)。最优选包含肠内细菌容易作为碳源同化的木二 糖、木三糖、木四糖。

本发明中纤维素酶组合物通过培养木霉属真菌而获得，在生物质的糖 化反应中使用。对纤维素酶组合物的制备方法不特别限定，但优选将培养 液所含的木霉属真菌的菌体除去，或使其不生长。这是为了防止将纤维素 酶组合物和生物质进行糖化反应时生成的葡萄糖、低聚木糖被菌体消耗。 作为菌体的除去方法可列举离心分离、膜分离等为例。作为使菌体不生长 的处理方法，可列举热处理、药剂处理、酸/碱处理、UV处理等。

接着对于本发明中的水解反应进行说明。水解反应中使用的生物质只 要是包含纤维素和木聚糖的生物质就不特别限定，除了可以使用种子植物、 蕨类植物、苔藓植物、藻类、水草等植物之外，也可以使用纸浆、废旧建 材等。种子植物分类成裸子植物和被子植物，任一种均能够优选使用。作 为裸子植物的具体例，可以举出苏铁、银杏、松、枞树、桧树、杉树等。 被子植物进一步分类成单子叶植物和双子叶植物，作为单子叶植物的具体 例，可以举出甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸秆、玉米芯、稻秸、 麦秸，作为双子叶植物的具体例，优选使用甜菜浆、桉树、橡木、白桦等。

这些包含纤维素和木聚糖的生物质可以进行前处理以使其容易进行水 解反应。作为前处理方法不特别限定，具体可以使用酸处理、硫酸处理、 稀硫酸处理、碱处理、水热处理、亚临界处理、微粉碎处理、蒸煮处理等 公知的方法。另外，对于反应pH不特别限定，但优选pH为3～7左右， 更优选为4～6，更优选为5左右。对于反应温度不特别限定，优选为40℃～ 70℃。另外，对于反应中使用的纤维素酶组合物的量也不特别限定。另外， 对于反应时间也不特别限定。

由本发明的糖化反应制造的反应后液中，除了低聚木糖和葡萄糖之外， 还可以包含由纤维素酶组合物所含的水解酶生成的甘露糖、阿拉伯糖、半 乳糖等单糖、纤维二糖、纤维四糖、甘露二糖、半乳二糖等寡糖等。

由本发明的糖化反应制造的反应后液中作为杂质也可以包含无机盐、 氨基酸、蛋白质、木质素等，另外为了除去杂质也可以进行纯化操作。作 为纯化操作，可以应用离子交换、膜分离、晶析、脱盐等公知的方法。

通过本发明制造的单糖级分(葡萄糖、木糖等)和低聚木糖等级分优选 通过后工序分离。葡萄糖优选作为发酵原料在化学品的制造中使用，低聚 木糖优选在饲料、食品、化妆品用途中使用。作为化学品的具体例，可举 出乙醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、甘油等醇，乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀 酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸等有机酸，肌苷、鸟苷等核苷，肌苷酸、鸟 苷酸等核苷酸，尸胺等胺化合物。

实施例

以下列举实施例具体地说明本发明。但本发明不限于这些实施例。

参考例1蛋白质浓度测定方法

使用市售的蛋白质浓度测定试剂(Quick Start Bradford Protein Assay、 Bio-Rad制)。在回到室温的蛋白质浓度测定试剂250μL中添加稀释的来源 于丝状菌的纤维素酶溶液5μL，在室温静置5分钟后用酶标仪测定595nm 的吸光度。作为标准品使用BSA，比照标准曲线计算蛋白质浓度。

参考例2β-木糖苷酶活性测定方法

β-木糖苷酶活性测定方法具体地，在含有1mM对硝基苯基-β-吡喃木 糖苷(シグマアルドリッチジヤパン社制)的50mM乙酸缓冲液90μL中使 用酶稀释液10μL，在30℃进行反应，30分钟后加入2M碳酸钠10μL充 分混合使反应停止，测定405nm的吸光度增加。将每1分钟游离出1μmol 的对硝基苯酚的活性定义为1U。空白在含有1mM对硝基苯基-β-吡喃木糖苷的50mM乙酸缓冲液90μL中加入2M碳酸钠10μL充分混合，然后添 加酶稀释液10μL在30℃使其反应30分钟。然后，测定405nm的吸光度 增加。

参考例2β-葡糖苷酶活性测定方法

β-葡糖苷酶活性测定方法具体地，在含有1mM对硝基苯基-β-吡喃葡 糖苷(シグマアルドリツチジヤパン社制)的50mM乙酸缓冲液90μL中使 用酶稀释液10μL，在30℃进行反应，10分钟后加入2M碳酸钠10μL充 分混合使反应停止，测定405nm的吸光度增加。将每1分钟游离出1μmol 的对硝基苯酚的活性定义为1U。空白在含有1mM对硝基苯基-β-吡喃葡糖苷的50mM乙酸缓冲液90μL中加入2M碳酸钠10μL充分混合，然后添 加酶稀释液10μL在30℃使其反应30分钟。然后，测定405nm的吸光度 增加。

参考例3纤维二糖水解酶活性测定方法

纤维二糖水解酶活性测定方法具体地，在含有1mM对硝基苯基-β-吡 喃乳糖苷(シグマアルドリツチジヤパン社制)的50mM乙酸缓冲液90μL 中使用酶稀释液10μL，在30℃进行反应，60分钟后加入2M碳酸钠10μL 充分混合使反应停止，测定405nm的吸光度增加。将每1分钟游离出1μmol 的对硝基苯酚的活性定义为1U。空白在含有1mM对硝基苯基-β-吡喃乳糖 苷的50mM乙酸缓冲液90μL中加入2M碳酸钠10μL充分混合，然后添 加酶稀释液10μL在30℃使其反应30分钟。然后，测定405nm的吸光度 增加。

参考例4糖浓度的测定

低聚木糖、葡萄糖、木糖使用日立高速液相色谱LaChrom Eite (HITACHI)，在以下条件下进行定量分析。以用作为低聚木糖的木二糖、 木三糖、木四糖、木五糖、木六糖、和葡萄糖、木糖的标准品制作的标准 曲线为基础进行定量分析。此外，本实施例所记载的低聚木糖是指2～6 个木糖单元通过β糖苷键键合而成的低聚木糖。

柱：KS802、KS803(Shodex)

移动相：水

检测方法：RI

流速：0.5mL/min

温度：75℃

比较例1里氏木霉PC-3-7株的BXL1基因破坏重组株的制作

作为通过同源重组破坏目的基因的方法，可列举使用以在包含标志物 基因的DNA的上游和下游添加与导入目的位置同源的部分的方式设计的 引物进行PCR，用所得的PCR片段转化丝状菌的方法，但不限于此。

转化使用标准的方法(原生质体-PEG法)进行。宿主使用PC-3-7株， 标志物使用乙酰胺酶(AmdS)基因。

关于所得的转化体中是否导入AmdS基因，由用PDA培养基培养的 转化株提取基因组DNA，以此为模板通过PCR进行确认。PDA培养基的 组成为Difeo马铃薯葡萄糖肉汤(Potato Dextrose Broth，BD社)24g/L。 其结果确认了转化体中BXL1基因和AmdS基因盒被替换。将所述工序所 得的在BXL1座导入了AmdS基因盒的PC-3-7株在以下称为PC-3-7/ΔBXL1株。该菌株是BXL1基因的ORF的3个结构域全部丧失的菌株。

实施例1具有编码突变BXL1的基因的里氏木霉PC-3-7株的制作

作为突变BXL1基因使用序列号3的碱基序列。该突变BXL1基因是 里氏木霉的BXL1基因(序列号1)的1940位和1941位的碱基序列缺失、之 后的氨基酸序列移码了的碱基序列。由该突变BXL1基因编码的氨基酸序 列与序列号2的Fn3-like结构域的氨基酸序列的同源性为0％。该突变 BXL1基因通过人工合成制成。

作为将包含突变BXL1基因的DNA通过同源重组插入染色体中的 BXL1基因的启动子的下游的方法，可列举使用以在包含突变BXL1基因 的DNA的上游和下游添加与导入目的位置同源的部分的方式设计的引物 进行PCR，以所得的PCR片段转化丝状菌的方法，但不限于此。

转化通过标准方法(原生质体-PEG法)进行。宿主使用PC-3-7株，标 志物使用乙酰胺酶(AmdS)基因。图1显示通过分子生物学的操作制作的用 于插入突变BXL1基因的质粒。该质粒包含突变BXL1基因(序列号3)， 在其后包含BXL1基因的终止密码子的下游500bp。还包含乙酰胺酶基因 盒、和与从BXL1基因的下游501bp开始的约2.5kb同源的基因序列。由该质粒通过PCR扩增突变BXL1基因插入盒，用于重组。更具体地，转 化方法如Gene，61，165-176(1987)所记载那样进行。另外，突变BXL1 基因插入盒的利用PCR的扩增使用设计的引物(序列号5、序列号6)进行。

关于所得的转化体是否导入了目的基因，由用PDA培养基培养的转化 株提取基因组DNA，以此为模板通过PCR进行确认。具体使用设计的引 物(序列号7、序列号8)进行确认。其结果确认了转化体中突变BXL1基因 盒从BXL1基因的起始密码子开始被导入。将所得的PC-3-7株在以下称 为PC-3-7/突变BXL1株。

比较例2来源于里氏木霉PC-3-7株的纤维素酶组合物的制作

预培养

将里氏木霉PC-3-7株的孢子用生理盐水稀释成1.0×10⁷/mL，将该稀 释孢子溶液2.5mL接种到装在1L带导流板的烧瓶中的以表1所记载的组 成构成的预培养液250mL中。将接种的预培养液在28℃、160rpm的培养 条件下进行3天培养。

表1

*微量元素溶液包含0.3g/L H₃BO₃、1.3g/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O、 5g/L FeCl₃·6H₂O、2g/L CuSO₄·5H₂O、0.4g/L MnCl₂·4H₂O、10g/L ZnCl₂。

**マンデルス包含7g/L(NH₄)₂SO₄、10g/L KH₂PO₄、3g/L CaCl₂、 3g/L MgSO₄·7H₂O。

主培养

将里氏木霉PC-3-7株的预培养液250mL分别接种到装在5L容量小 型罐中的表2所示的主培养液2.5L(进一步含有生物质250g)中，在28℃、 700rpm、1vvm、pH5的培养条件下进行5天培养。中和使用10％氨和1N 硫酸。生物质使用Arbocel(注册商标)(J.Rettenmaier&Sohne)。

表2

*微量元素溶液包含0.3g/L H₃B0₃、1.3g/L(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O、 5g/L FeCl₃·6H₂O、2g/L CuSO₄·5H₂O、0.4g/L MnCl₂·4H₂O、10g/L ZnCl₂。

**マンデルス包含7g/L(NH₄)₂SO₄、10g/L KH₂PO₄、3g/L CaCl₂、 3g/L MgSO₄·7H₂O。

***Arbocel在混合其他成分、定容后添加。

培养液的采集

从培养开始每隔2天各采集500μL培养液。然后在15,000×g、4℃的 条件下进行10分钟离心分离，得到上清。将该上清用0.22μm的过滤器过 滤，将其滤液作为培养上清液。酶活性测定、糖化反应使用培养第5天的 培养上清液(表3)。

表3

比较例3来源于里氏木霉PC-3-7/ΔBXL1株的纤维素酶组合物的制 作

除了使用里氏木霉PC-3-7/ΔBXL1株以外与比较例2同样地进行，将 培养第5天的培养上清液在酶活性测定、糖化反应中使用(表3)。其结果是 β-木糖苷酶活性与母株的PC-3-7株相比显著减少。

实施例2来源于里氏木霉PC-3-7/突变BXL1株的纤维素酶组合物的 制作

除了使用里氏木霉PC-3-7/突变BXL1株以外与比较例2同样地进行， 将培养第5天的培养上清液在酶活性测定、糖化反应中使用(表3)。其结果 判明，β-木糖苷酶活性减少到与里氏木霉PC-3-7/ΔBXL1株同等。进而判 明与里氏木霉PC-3-7/ΔBXL1株相比β-葡糖苷酶活性增加。

比较例4使用来源于里氏木霉PC-3-7株的纤维素酶组合物通过糖化 反应制造低聚木糖和葡萄糖

使用比较例2所得的滤液进行糖化反应。糖化反应中使用的甘蔗渣， 使用进行了碱处理(前处理)的甘蔗渣。糖化反应如下进行。在2mL管中装 入干燥重量为50mg的进行了碱处理的甘蔗渣，加入纯水使得甘蔗渣的固 体成分浓度在反应开始时为5重量％，并且使用稀盐酸调节成pH5.0。在 调节了pH的前处理物中添加纤维素酶组合物使其为8mg/g-生物质，使用 热传导转子在pH5.0、50℃的反应条件下开始反应。反应中适宜进行调节 使pH为5。8小时后在99度的热水浴中浸泡5分钟使反应停止。反应液 在8000×g的条件下进行5分钟离心分离，得到上清。将该上清用0.22μm 的过滤器过滤，将该滤液按照参考例5进行低聚木糖和葡萄糖的分析(表 4)。

表4

比较例5使用来源于里氏木霉PC-3-7/ΔBXL1株的纤维素酶组合物 通过糖化反应制造低聚木糖和葡萄糖

使用比较例3所得的滤液进行糖化反应。糖化反应与比较例4同样地 进行(表4)。其结果与母株PC-3-7株相比，低聚木糖的产量显著增加。

实施例3使用来源于里氏木霉PC-3-7/突变BXL1的纤维素酶组合物 通过糖化反应制造低聚木糖和葡萄糖

使用实施例2所得的滤液，与比较例4同样地进行糖化反应(表4)。 其结果判明，得到与里氏木霉PC-3-7/ΔBXL1株的过滤液同等的低聚木糖 产量，进而判明葡萄糖的产量增加。

产业可利用性

通过使BXL1基因的Fn3-like结构域缺失，能够使β-木糖苷酶活性缺 失。进而与BXL1基因的3个结构域全部破坏的菌株相比β-葡糖苷酶活性 增加，能够高效地制造低聚木糖和葡萄糖。

Claims (6)

1.里氏木霉，具有编码突变型β-木糖苷酶1的突变型BXL1基因，所述突变型β-木糖苷酶1具有β-木糖苷酶1中的糖苷水解酶家族3即GH3的N末端结构域和C末端结构域，缺失Fn3-like结构域，并且β-木糖苷酶活性降低到十分之一以下，所述β-木糖苷酶1由序列号2所记载的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的里氏木霉，所述Fn3-like结构域的缺失，是在编码位于所述C末端结构域的下游且位于所述Fn3-like结构域的上游的区域的基因区域内，通过由碱基的缺失或插入造成的移码突变、或由碱基的替换造成的终止密码子突变而产生的。

3.根据权利要求1或2所述的里氏木霉，所述里氏木霉是非重组体。

4.根据权利要求3所述的里氏木霉，所述里氏木霉是解除了碳分解代谢物阻遏的菌株。

5.纤维素酶组合物的制造方法，包括：培养权利要求1或2所述的里氏木霉的工序。

6.葡萄糖和低聚木糖的制造方法，包括：回收通过权利要求5所述的方法制造的纤维素酶组合物的工序，和

用所得的纤维素酶组合物水解包含木聚糖和纤维素的生物质的工序。

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