CN102884184A - 葡糖苷酶的制造方法、酶组合物和生物量的水解方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供有效的生物量的分解方法，其中，制造提高了纤维素分解效率的葡糖苷酶，并利用该葡糖苷酶。本发明提供突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，包含以下步骤：在编码来源于嗜热菌的葡糖苷酶的DNA中，导入编码分泌信号序列的DNA、和编码Asn-X-Ser或Asn-X-Thr的DNA，然后将其导入真核微生物，使其作为分泌蛋白质表达。本发明还提供包含该突变型葡糖苷酶的酶组合物和使用该酶组合物的生物量的水解方法。

Description

葡糖苷酶的制造方法、酶组合物和生物量的水解方法

技术领域

本发明涉及添加了糖链的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶的制造方法、包含该酶的酶组合物和使用该酶组合物的生物量的水解方法。

背景技术

纤维素的糖化有各种方法，但开发反应条件温和且糖收率高的酶糖化法已经成为主流。

如果将作为纤维素分解酶的纤维素酶大致分类，则分为作用于纤维素的结晶区域的纤维二糖水解酶、从纤维素分子链内部开始作用而降低分子量的内切葡聚糖酶。已知这些纤维素酶受到作为生成物之一的纤维二糖阻抑。另外β-葡糖苷酶是作用于水溶性寡糖或纤维二糖，催化其β-糖苷键的水解反应的酶。特别是，β-葡糖苷酶是用于获得作为发酵原料有用的葡萄糖所必需的酶。另外，已知纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶由于纤维素分解所生成的纤维二糖的积累而发生反应阻抑。即，β-葡糖苷酶能够大幅降低由纤维素分解而生成的纤维二糖的积累，因此具有大幅提高纤维素分解效率这样的效果。

纤维素在草本系植物、木本系植物中大量含有，因此将这些植物总称为纤维素系生物量。纤维素系生物量中除了纤维素之外，还包含木聚糖、阿拉伯聚糖等半纤维素、和木质素。特别是已知由于纤维素系生物量中所含的木质素是芳香族系的高分子化合物，因此在使用来源于丝状菌的纤维素酶的酶糖化中发挥阻抑作用。关于由木质素产生的来源于丝状菌的纤维素酶的阻抑机制目前尚未完全阐明，据说纤维素酶吸附于木质素而分解效率降低是要因之一(非专利文献1)。

耐热性酶由于稳定性高、即使在高温条件下也能长期保持活性，因此被研究了作为产业用酶的应用。确认了这样的耐热性酶在嗜热菌、或超嗜热菌所具有的酶中更多地存在。

关于耐热性的β-葡糖苷酶，已经从数种嗜热菌或超嗜热菌中鉴定出，具体地，从强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)、掘越氏热球菌(Pyrococcushorikoshii)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、芝田硫化叶菌(Sulfolobusshibatae)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)等微生物中鉴定出了耐热性的β-葡糖苷酶。

已知来源于丝状菌的纤维素酶或β-葡糖苷酶被进行了糖链修饰(非专利文献2)。作为这样的糖链所具有的一般功能，已知提高蛋白质的可溶性、提高物理稳定性、提高蛋白酶耐性等的效果(非专利文献3)。作为纤维素酶等糖化酶具有糖链的功能，公开了通过对木聚糖酶赋予N型糖链从而其表达量增大(专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:WO/2005/093072

非专利文献

非专利文献1:Hetti P.等,Journal of Biotechnology,107,65-72(2004)

非专利文献2:Christian P.等,Trichoderma and Gliocladium:BasicBiology,Taxonomy and Genetics.,vol.1,121-138(1998)

非专利文献3:H.Ohba等,Biosci.Biotech.Biochem.,59,1581-1583(1995)

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的是提供添加了糖链的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶，进而通过混合本葡糖苷酶和纤维素酶，从而提供在纤维素、特别是含有木质素的木质纤维素的水解工序中分解效率高的酶组合物。

解决课题的手段

本发明者们为了实现上述目的而进行了深入研究，结果发现，添加了糖链的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶能够应用于纤维素的分解。

即，本发明由以下技术的手段构成。

(1)选择性地添加了糖链、且具有葡糖苷酶活性的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶的制造方法，该方法包括以下工序：

(i)对编码本来不具有糖链添加序列的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的DNA，导入编码Asn-X-Ser或Asn-X-Thr(X是除脯氨酸以外的任意氨基酸)的DNA序列，制备编码来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶的DNA，进一步对编码该突变型葡糖苷酶的DNA添加编码分泌信号序列的DNA序列，

(ii)将添加了该编码分泌信号序列的DNA序列的编码该突变型葡糖苷酶的DNA导入真核微生物，使由该突变型葡糖苷酶DNA编码的突变型葡糖苷酶作为分泌蛋白质表达，以及

(iii)分离·纯化作为分泌蛋白质表达的突变型葡糖苷酶。

(2)根据(1)的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，糖链是高甘露糖型糖链。

(3)根据(1)或(2)的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，来源于嗜热菌的葡糖苷酶是来源于选自硫化叶菌属(Sulofolobus)、热原体属(Thermoplasma)、暖枝菌属(Caldivirgra)、热球形菌属(Thermosphaera)、火球菌属(Pyrococcus)、嗜苦菌属(Picrophilus)、暖枝菌属(Caldivirgra)、闪烁杆菌属(Fervidobacterium)中的1种的葡糖苷酶。。

(4)根据(1)～(3)的任一项的葡糖苷酶的制造方法，其中，来源于嗜热菌的葡糖苷酶是下述(i)或(ii)的蛋白质：

(i)包含与序列号4、序列号8、序列号10、序列号12、序列号14、序列号16、序列号18或序列号20所记载的任一氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白质，

(ii)包含与序列号4、序列号8、序列号10、序列号12、序列号14、序列号16、序列号18或序列号20所记载的任一氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、且具有β-葡糖苷酶活性的蛋白质。

(5)根据(1)～(4)的任一项的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，真核微生物是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

(6)根据(1)～(5)的任一项的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，分泌信号序列是α因子分泌信号序列。

(7)根据(1)～(6)的任一项的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶包含序列号6、序列号38、序列号40、序列号42、序列号44、序列号46、序列号48、序列号50、序列号52、序列号54和序列号56的任一项所示氨基酸序列。

(8)生物量糖化用的酶组合物，其包含纤维素酶和通过(1)～(7)的任一项的制造方法获得的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶。

(9)根据(8)的生物量糖化用的酶组合物，其中，纤维素酶是来源于丝状菌的纤维素酶混合物。

(10)根据(8)或(9)的生物量糖化用的酶组合物，其中，来源于丝状菌的纤维素酶混合物是来源于木霉属(Trichoderma)的纤维素酶混合物。

(11)生物量的水解方法，其中，使用(8)～(10)的任一项的酶组合物。

(12)根据(11)的生物量的水解方法，其特征在于，将由上述酶组合物产生的水解物通过超滤膜进行过滤，分离回收使用后的该酶组合物。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2010-044242号的说明书和/或说明书附图所记载的内容。

发明的效果

本发明所得的添加了糖链的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶，在纤维素系生物量的水解中，与纤维素酶混合物中使用未添加糖链的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的情况相比，可以获得高的纤维素分解效率。该效果在木质纤维素的水解中特别显著。另外，本发明的添加了糖链的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶，对纤维素系生物量、特别是木质纤维素以及超滤膜的吸附性低，另外对从水解物分离糖液时所使用的超滤膜的吸附性低，从水解物的酶回收性优异。

附图说明

图1是显示实施例1中的、序列号4的来源于强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶(PfuBGL)、与序列号1的来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)的β-葡糖苷酶(TriReBGL)、和序列号2的来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的β-葡糖苷酶(AspNgBGL)的比对的图。序列号1、序列号2的糖链添加序列用下划线表示，另外对于序列号4的糖链添加序列导入位置(H60，L61，Y62)也同样地用下划线表示。

图2-1是显示实施例2中的、序列号6的氨基酸序列(gPfuBGL)与序列号8(ThAggBGY)、序列号10(CmGHFP)、序列号12(SaBGAL)、序列号14(SsoBGAL)、序列号16(PtBGAL)、序列号18(TvBGAL)和序列号20(FnGHFP)的氨基酸序列的比对图。将序列号6中的导入的糖链添加序列Asn-Arg-Thr(N-R-T)用序列中的下划线表示。进而，序列号8、序列号10、序列号12、序列号14、序列号16、序列号18或序列号20中的、与序列号6的糖链添加部位Asn-Arg-Thr(N-R-T)对应的位置也同样地用序列中的下划线表示。

图2-2是图2-1的接续。

图3是显示比较例1中制备的PfuBGL(左)、与实施例2中制备的糖链添加突变型PfuBGL在无EndoH处理(右)、有EndoH处理(中央)条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳的条带图案的图。糖链添加突变型PfuBGL可以确认通过EndoH处理产生的分子量降低。

图4是显示实施例4中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的PfuBGL的葡萄糖生成量的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图5是显示实施例4中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型PfuBGL的葡萄糖生成量的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图6是显示实施例5中的、对木质纤维素底物作用来源于木霉属的纤维素酶＋糖链添加突变型PfuBGL和来源于木霉属的纤维素酶＋PfuBGL的酶组合物时的葡萄糖生成量的变化的比较结果的图。以5重量％的木质纤维素为底物，反应在50℃进行至28小时，适宜取样测定生成的葡萄糖浓度。酶添加量为纤维素酶0.5mg/mL、葡糖苷酶0.005mg/mL(纤维素酶的1/100量)。

图7是显示N型糖链的基本结构的图。以相对于来源于嗜热菌的葡糖苷酶的Asn侧链，结合有2个N-乙酰葡糖胺、以及3个甘露糖的结构为基本结构。

图8是显示实施例12中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的AggBGY的残存活性(相对于保温0小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图9是显示实施例12中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型AggBGY的残存活性(相对于保温0小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图10是显示实施例12中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的CmGHFP的残存活性(相对于保温0小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图11是显示实施例12中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型CmGHFP的残存活性(相对于保温0小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图12是显示实施例12中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的SaBGAL的残存活性(相对于保温0小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图13是显示实施例12中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型SaBGAL的残存活性(相对于保温0小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图14是显示实施例12中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的SsoBGAL的残存活性(相对于保温0小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图15是显示实施例12中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型SsoBGAL的残存活性(相对于保温0小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图16是显示实施例12中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的PtBGAL的残存活性(相对于保温0小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图17是显示实施例12中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型PtBGAL的残存活性(相对于保温0小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图18是显示实施例12中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的TvBGAL的残存活性(相对于保温0小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图19是显示实施例12中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型TvBGAL的残存活性(相对于保温0小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图20是显示实施例12中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的FnGHFP的残存活性(相对于保温0小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

图21是显示实施例12中的、通过50～90℃的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型FnGHFP的残存活性(相对于保温0小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。

具体实施方式

以下详细说明本发明。

本发明中的“葡糖苷酶”，是具有水解形成β-糖苷键的二糖的活性(即，β-葡糖苷酶活性)的酶。作为EC编号：EC 3.2.1.21记载了属于β-葡糖苷酶的酶群，但在本发明中，虽然在EC编号中不属于β-葡糖苷酶但具有上述β-葡糖苷酶活性的蛋白质也包含在葡糖苷酶中。可列举例如，半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、糖苷键水解酶家族蛋白等。

本发明中的嗜热菌是指能够在50℃以上生长的微生物群的总称，另外特别地超嗜热菌是指能够在80℃以上生长的微生物群。作为该嗜热菌，可例示硫化叶菌属(Sulofolobus)、热原体属(Thermoplasma)、暖枝菌属(Caldivirgra)、热球形菌属(Thermosphaera)、火球菌属(Pyrococcus)、嗜苦菌属(Picrophilus)、暖枝菌属(Caldivirgra)、闪烁杆菌属(Fervidobacterium)等。

来源于嗜热菌的葡糖苷酶是公知的，例如在GenBank等作为NP 577802登录，本发明中可以利用这些来源于嗜热菌的葡糖苷酶。优选来源于嗜热菌的葡糖苷酶包含序列号4、8、10、12、14、16、18和20所示的氨基酸序列。进一步优选来源于嗜热菌的葡糖苷酶由序列号4、8、10、12、14、16、18和20所示的氨基酸序列组成。在本发明中，来源于嗜热菌的葡糖苷酶还包含在序列号4、8、10、12、14、16、18和20所示的氨基酸序列中具有1个或多个或者1个或几个氨基酸的缺失、替换、添加或插入，且具有β-葡糖苷酶活性的蛋白质。这里对“1个或几个”的范围不特别限定，例如为10个以内，进一步优选5个以内，特别优选4个以内，或为1个或2个。另外，在本发明中，来源于嗜热菌的葡糖苷酶还包含以下蛋白质：包含使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at theNational Center for Biological Information(美国国家生物信息中心的基本本地比对检索工具))等(例如，默认即初始设定的参数)计算时与序列号4、8、10、12、14、16、18和20所示的氨基酸序列具有85％以上、更优选90％以上、最优选95％以上的同一性的氨基酸序列，优选由该氨基酸列组成，且具有β-葡糖苷酶活性的蛋白质。这里，“同一性”是指在2个氨基酸序列中导入间隙或不导入间隙使其排列的情况下的最适比对中，相对于重叠的全部氨基酸残基的相同氨基酸和类似氨基酸残基的比例(百分率)。同一性可以使用本领域技术人员周知的方法、序列分析软件等(例如BLAST、FASTA等公知的算法)求出。“β-葡糖苷酶活性”如上述定义的那样，该活性的测定如下进行：例如，在溶解于50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH值5.0)中的纤维二糖的底物溶液中添加酶液，在30～85℃反应30分钟，然后根据需要进行pH值改变等来停止反应，然后使用葡萄糖定量试剂盒来定量反应液中的葡萄糖浓度。

在本发明中，“来源于嗜热菌的葡糖苷酶”不包含天然其氨基酸序列中具有糖链添加序列的蛋白质，仅限于天然不具有糖链添加序列的蛋白质。

本发明所说的“糖链”，具有单糖以糖苷键连接而成的结构，该糖链的末端与来源于嗜热菌的葡糖苷酶的肽序列中的氨基酸侧链共价结合。“糖链”有无可以通过一般已知的过碘酸-席夫碱(periodic acid-Schiff base：PAS)反应将SDS电泳等分离的葡糖苷酶染色，从而确认。

糖链主要分为与天冬酰胺的侧链结合的N型糖链、和与丝氨酸、苏氨酸的侧链结合的O型糖链，优选为N型糖链。作为N型糖链，对天冬酰胺侧链，可以例示以2个N-乙酰葡糖胺、3个甘露糖为基本骨架的结构(图7)。相对于这样的基本结构，通过酶作用而进一步结合糖分子，从而构成多样的糖链结构。糖链结构根据作为宿主的微生物的种类、该宿主的培养条件等不同而变化。添加了糖链的来源于嗜热菌的葡糖苷酶是指添加了各种糖链结构的组合物。

与来源于嗜热菌的葡糖苷酶结合的糖链是N型还是O型可以如下确认：例如，对葡糖苷酶分别作用特异性地水解N型糖链的末端部分的N-聚糖酶和特异性地水解O型糖链的末端部分的O-聚糖酶，然后进行SDS电泳，通过比较其分子量的变化来确认。作为这里使用的N-聚糖酶，可以使用来源于脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)的N-葡糖苷酶F(PNGaseF)、来源于褶皱链霉菌(Streptomyces plicatus)的内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶等。另外，作为O-聚糖酶，可以使用来源于链球菌属(Streptococcus)的内-α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶等。

本发明的突变型葡糖苷酶中的糖链优选为高甘露糖型。这里所说的高甘露糖型是指在N型糖链中相对于构成糖链的N-乙酰葡糖胺或葡糖胺2个，连接有4个以上甘露糖的糖链。作为除甘露糖以外的糖，还可包含葡萄糖等其他单糖。在包含葡萄糖的情况下，通常与高甘露糖型的甘露糖的非还原末端部分结合。

作为除高甘露糖型以外的N型糖链，可以例示复合型糖链。在复合型中，具有作为除甘露糖、N-乙酰葡糖胺以外的糖而含有果糖、唾液酸等多种糖作为构成成分的特征。与高甘露糖型相比，糖链所含的N-乙酰葡糖胺的比率增加，相对于N-乙酰葡糖胺2个，甘露糖的比率为3个以下。

N型糖链是高甘露糖型还是混合型可以如下确认：例如，将电泳的葡糖苷酶转印于PVDF膜，使其与糖链特异性的凝集素反应，通过其发色来确认。作为这里使用的糖链特异性的凝集素，例如，可以使用生物素、进行了HRP标记的刀豆凝集素(ConA)、蓖麻凝集素(RCA120)、荆豆凝集素(UEA-1)、花生凝集素(PNA)等。如果能用ConA染色，则可确认为N型糖链中的高甘露糖型，如果能用RCA120染色，则可确认为N型糖链混合型。另外，作为其他判定方法，从充分纯化后的葡糖苷酶中分离糖链构成糖，将分离的糖用MALDI-TOF/MS、或HPLC分析来定量构成的单糖成分，从而确认糖链结构。

“糖链添加序列”是指在通过真核生物被表达·翻译时受到糖链添加修饰的部位的氨基酸序列。

糖链添加序列可列举例如，作为N结合型糖链的共有序列的Asn-X-Ser或Asn-X-Thr(X为除脯氨酸以外的任意氨基酸)、作为O结合型糖链的共有序列的Cys-X-Ser-X-Pro-Cys(X为除脯氨酸以外的任意氨基酸)，但不限于这些。优选为N结合型糖链的共有序列。这里，作为除脯氨酸以外的任意氨基酸X，可列举Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Met、Cys、Ser、Thr、Asp、Glu、His、Lys、Arg、Asn、Gln。

本发明中的添加了糖链的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶(以下称为“突变型葡糖苷酶”)，是在上述来源于嗜热菌的葡糖苷酶的氨基酸序列中导入了构成上述糖链添加序列的氨基酸序列的突变型葡糖苷酶，且该氨基酸序列中选择性地添加了糖链。导入的糖链添加序列可以是一个也可以是二个以上，其种类可以完全相同，也可以包含多种糖链添加序列。

糖链添加序列的导入位置优选选择不会由于该导入而使本来的酶活性消失的位置。作为这样的糖链添加序列的导入位置的确定方法，可以通过以下的步骤1)、步骤2)来实施。

步骤1)将本来具有糖链添加序列的来源于丝状菌的葡糖苷酶、与本来不具有糖链添加序列的来源于嗜热菌的葡糖苷酶进行氨基酸序列比对分析，明确来源于丝状菌的葡糖苷酶的糖链添加序列在来源于嗜热菌的葡糖苷酶中的相对位置关系，特定糖链添加序列的导入位置。作为比对工具，可以使用ClustalW等多数广为人知的软件。本来具有糖链添加序列的来源于丝状菌的葡糖苷酶优选为来源于木霉属的葡糖苷酶、或来源于曲霉属(Aspergillus)的葡糖苷酶。这些来源于丝状菌的葡糖苷酶的氨基酸序列是公知的，优选利用包含序列号1记载的氨基酸序列的来源于里氏木霉的β-葡糖苷酶、或包含序列号2记载的氨基酸序列的来源于黑曲霉的β-葡糖苷酶。

步骤2)接着，确认通过上述比对分析特定的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的糖链添加序列的导入位置是否存在于酶表面。是否存在于酶表面，可以使用目标的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的晶体结构来获知。如果这样的晶体结构是已知的，则可以从Protein Data Bank等数据库获取。另外，也可以实际进行X射线晶体结构分析等来获取晶体结构。

在本发明中，优选按照上述步骤1)、步骤2)来选定糖链添加序列的导入位置，作为其他方法，也可以按照下述步骤3)、步骤4)来选定。

步骤3)使用ASA(Accessible Surface Area：溶剂露出表面积)分析软件求出氨基酸残基的

由该值选定露出来源于嗜热菌的葡糖苷酶的表面附近的氨基酸残基。各氨基酸残基的ASA，可以使用例如能够从AREAIMOL(ccp4 package)(UK Science and Engineering ResearchCouncil  的CCP4(Collaborative Computing Project Number 4)、SURFace(Barry Honig’s group,the Department of Biochemistry andMolecular Biophysics and Center of Computational Biology andBioinformatics of Columbia)、ASAP(Institute for Molecular Bioscience,University of Queensland and the ARC Centre in Bioinformatics)等的网站获得的ASA分析软件来算出。对于算出的ASA为

以上的氨基酸残基，则认为是露出表面的残基，作为糖链添加序列的导入位置，优选选择ASA为

以上的氨基酸残基。特别是为了导入作为N结合型糖链的共有序列的3个氨基酸残基(Asn-X-Ser或Asn-X-Thr：X为除脯氨酸以外的任意氨基酸)，更优选选择的ASA为以上的氨基酸残基3个残基以上连续的部位。

步骤4)在上述步骤3所选择的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的糖链添加序列导入位置中，选择离来源于嗜热菌的葡糖苷酶的酶活性部位有充分距离、不会由于糖链添加序列导入而导致酶活性降低的位置。离酶活性部位的距离与上述同样地使用目标的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的晶体结构来获知。具体地，优选将离酶活性部位距离为

以内的氨基酸残基排除，选择距离更远的氨基酸残基。

例如，如果相对于序列号4的氨基酸序列所示的PfuBGL应用上述步骤3)、步骤4)则如下。首先，使用AREAIMOL(ccp4 package)以溶剂分子

为前提计算出ASA，提取出ASA为

以上的氨基酸残基(表1(i))。接着，提取出ASA为

以上的氨基酸残基3个残基以上连续的部位(表1(ii))。进而，根据PfuBGL的晶体结构信息特定出离酶活性部位的距离为

以下的氨基酸残基(S13、R78、N207、I263、I303、G304、V305、N306、Y307、S343、D344、L367、I370、I371、T372、D378、R384、Y387、H391、D404、V405、R406、N407、Y408、L409、H410、W411、F427的23个残基)，并将它们排除在外。以上的结果可以作为糖链添加序列导入位置选定(表1(iii))。

表1

PfuBGL中的糖链添加序列的导入位置的选定例

糖链添加序列的导入位置优选为1个位置或2～5个位置。

本发明中所说的导入是指上述糖链添加序列作为多肽被翻译。即，在来源于嗜热菌的葡糖苷酶的本来的氨基酸序列中，上述的糖链添加序列既可以与已有的氨基酸序列替换，也可以插入到已有的氨基酸序列中。即，在替换的情况下，相对于突变前多肽长度不变化，在插入的情况下，多肽长度增加相当于插入的糖链添加序列的长度。但是，从保持酶活性这样的观点考虑，糖链添加序列的导入优选为与已有的氨基酸序列的替换。

另外，导入的糖链添加序列可以采用上述糖链添加序列的任一者，X只要为除脯氨酸以外的任意氨基酸就可以使用任一者，应选择预想由突变导入产生的影响小的糖链添加序列和氨基酸。例如，如果是氨基酸的替换，则优选保守的氨基酸替换。保守的氨基酸替换是电性质、结构性质、极性或疏水性等类似的氨基酸之间的替换，预测这样的类似氨基酸的替换在蛋白质的表型上不带来变化。可列举例如，碱性氨基酸(Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、芳香族氨基酸(Trp、Phe、Tyr、His)、支链氨基酸(Val、Ile、Thr)、极性氨基酸(Ser、Thr、Tyr、Cys、Met、Gln、Asn、Gly)、疏水性氨基酸(Ala、Val、Leu、Ile)等。

在一种方式中，使用上述方法，可以将来源于强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶的氨基酸序列(序列号4)中的糖链添加序列的导入位置特定为H60-L61-Y62(图1)。

另外在本发明中，利用通过上述的方法确定了糖链添加序列的导入位置的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的氨基酸序列，对与该氨基酸序列具有高的氨基酸序列同一性的其他来源于嗜热菌的葡糖苷酶，也可以确定糖链添加序列的导入位置。例如，在关于序列号4记载的来源于强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶通过上述的方法确定了糖链添加序列的导入位置之后，与包含与该序列号4记载的β-葡糖苷酶具有高的同一性的氨基酸序列的其他酶进行比对分析，可以将其他酶的氨基酸序列上与在序列号4中确定的导入位置(例如，H60-L61-Y62)对应的位置确定为糖链添加序列的导入位置。作为包含与序列号4记载的β-葡糖苷酶具有高的同一性的氨基酸序列的其他酶，可例示包含序列号8、序列号10、序列号12、序列号14、序列号16、序列号18和序列号20所示的氨基酸序列的酶。

在一种方式中，使用该方法，可以将序列号8、序列号10、序列号12、序列号14、序列号16、序列号18和序列号20所示的氨基酸序列中的糖链添加序列的导入位置分别特定为N60-L61-N62、D60-L61-Y62、G61-N62-Y63、G61-N62-Y63、D58-L59-Y60、N63-N64-Y65和K63-Q64-Y65(图2-1、图2-2)。

在一种方式中，本发明中的突变型葡糖苷酶包含例如序列号6所示的氨基酸序列。优选本发明中的突变型葡糖苷酶由例如序列号6所示的氨基酸序列组成。

在本发明中，葡糖苷酶活性是指纤维二糖分解活性。即，以纤维二糖为底物时，催化将其水解而生成葡萄糖的反应的活性。本发明的突变型葡糖苷酶，相对于野生型葡糖苷酶中的纤维二糖分解活性，保有优选40％以上、更优选50％以上、进一步优选60％以上、特别优选70％以上的活性。纤维二糖分解活性，例如，可以通过对10mM纤维二糖/50mM乙酸缓冲液添加突变型葡糖苷酶或野生型葡糖苷酶，在50℃进行酶反应，测定生成的葡萄糖量，从而评价本发明的突变型葡糖苷酶相对于野生型的活性。这里生成的葡萄糖可以依据酶法、HPLC法等公知的方法来定量。

本发明中的突变型葡糖苷酶可以通过任何方法获得，为了在导入的糖链添加序列中选择性地添加糖链，优选通过培养包含编码突变型葡糖苷酶的DNA的真核细胞来提供。

编码突变型葡糖苷酶的DNA可以通过以下方法制作。即，在来源于嗜热菌的葡糖苷酶的氨基酸序列中通过上述方法确定糖链添加序列的导入位置，然后在编码该葡糖苷酶的DNA中与该导入位置对应的碱基序列部位导入编码糖链添加序列的DNA，从而进行。这里，“DNA”包含cDNA、基因组DNA、基因等编码该葡糖苷酶或该糖链添加序列的任意核酸。

作为编码来源于嗜热菌的葡糖苷酶的DNA，可列举编码上述来源于嗜热菌的葡糖苷酶的DNA，例如，包含序列号3、7、9、11、13、15、17和19所示的碱基序列的DNA，优选为由该碱基序列组成的DNA。另外，编码来源于嗜热菌的葡糖苷酶的DNA还包含以下DNA：该DNA能与由序列号3、7、9、11、13、15、17和19所示的碱基序列的互补碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交的碱基序列，优选由该碱基序列组成，且编码具有β-葡糖苷酶活性的蛋白质。严格条件可以是低严格条件、中严格条件和高严格条件的任一者。这样的条件包含例如，在2～5×SSC、0.2％SDS(这里，1×SSC是指150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠、pH值7.0)中、在45～70℃进行杂交，然后使用0.1～1×SSC、0.1～0.2％SDS在45～65℃进行洗涤。严格条件例如在Sambrook等,Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd edition(分子克隆实验指南第2版)，1989，ColdSpring Harbor Laboratory Press等中记载。进而，编码来源于嗜热菌的葡糖苷酶的DNA还包含在序列号3、7、9、11、13、15、17和19所示的碱基序列中具有1个或多个、或者1个或几个碱基的缺失、替换、添加或插入，且编码具有β-葡糖苷酶活性的蛋白质的DNA。这里对“1个或几个”的范围不特别限定，例如为10个以内、进一步优选为5个以内、特别优选为4个以内、或为1个或2个。另外，编码来源于嗜热菌的葡糖苷酶的DNA还包含以下DNA：该DNA包含使用BLAST等(例如，默认即初始设定的参数)计算时，与序列号3、7、9、11、13、15、17和19所示的碱基序列具有85％以上、更优选90％以上、最优选95％以上的同一性的碱基序列，优选由该碱基序列组成，且编码具有β-葡糖苷酶活性的蛋白质。

作为编码糖链添加序列的DNA，可列举编码上述糖链添加序列的DNA，可以考虑宿主生物、遗传密码的简并等适宜确定。

编码糖链添加序列的DNA可以通过例如定点诱变法、利用PCR的特异性突变导入法等的公知的方法导入到编码葡糖苷酶的DNA中(Sambrook等，上述)。

在一种方式中，作为编码突变型葡糖苷酶的DNA，可列举包含序列号5所示的碱基序列的DNA。优选作为编码突变型葡糖苷酶的DNA，列举由序列号5所示的碱基序列组成的DNA。在序列号5中，编码糖链添加序列的DNA在178-186位作为-aaccgcact-被导入。

进而，可以在上述编码突变型葡糖苷酶的DNA中添加编码适合宿主的分泌信号序列的DNA。分泌信号序列可以适宜添加在编码突变型葡糖苷酶的DNA的5’末端侧、3’末端侧，优选添加在5’末端侧。编码分泌信号序列的DNA可以预先整合到表达载体中。例如，在宿主为酵母的情况下，可使用α因子信号序列、α-淀粉酶信号序列、葡糖淀粉酶信号序列、血清白蛋白信号序列、来源于菊糖酶的信号序列、转化酶信号序列、杀伤蛋白质信号序列、溶菌酶信号序列等。特别是在巴斯德毕赤酵母中，优选α因子分泌信号序列。α因子分泌信号序列是公知的，例如在GenBank等作为NP 015137登录，本发明中可以利用它们。

在作为宿主使用木霉属的情况下，可以纤维素酶相关信号序列。木霉属具有向细胞外分泌作为纤维素酶的纤维二糖水解酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、木糖苷酶、木葡聚糖酶等的特征，这些酶分别具有分泌信号序列。这样的信号序列是公知的，可以将包含这些信号序列的肽序列与突变型葡糖苷酶功能性地连接而使用。

将如上所述制备的、编码包含能够接受通过真核细胞的糖链添加的1个以上的糖链添加序列的突变型葡糖苷酶的DNA，使用限制性酶和DNA连接酶连接在适当的表达载体中的启动子下游，从而可以制造包含该DNA的表达载体。

作为表达载体，可列举细菌质粒、酵母质粒、噬菌体DNA(λ噬菌体等)、反转录病毒、杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒等病毒DNA、SV40的衍生物等、作为植物细胞用的载体的农杆菌等，只要能够在宿主细胞中复制和生存且能够糖链添加即可，可以使用其他任何载体。例如，在宿主为酵母的情况下，可列举pPink-HC、pPink-LC、pPinkα-HC、pPCIZ、pPCIZα、pPCI6、pPCI6α、pFLD1、pFLD1α、pGAPZ、pGAPZα、pPIC9K、pPIC9等。

作为启动子，只要是与在基因表达中使用的宿主对应的适当启动子即可使用任何启动子。可以是组成型启动子、诱导型启动子的任一者。例如，在宿主是酵母的情况下，可列举AOX1启动子、TEF1启动子、ADE2启动子、CYC1启动子、GAL-L1启动子、AOX2启动子、YPT1启动子、GAP启动子、FLD启动子等。

作为本发明中使用的宿主细胞，只要具有糖链添加机制即可，可以是任何宿主细胞，优选例如酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞等。作为酵母细胞，可列举例如，毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)等。作为真菌细胞，可列举曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)等。作为昆虫细胞可列举Sf9等，作为植物细胞可列举双子叶植物等，作为动物细胞可列举CHO、HeLa、HEK293等。更优选为酵母细胞，进一步优选为巴斯德毕赤酵母。

转化或转染可以通过磷酸钙法、电穿孔法等公知的方法来进行。突变型葡糖苷酶可以在如上所述被转化或转染的宿主细胞中在启动子的控制下表达，回收产生的突变型葡糖苷酶而获得。表达时，使宿主细胞增殖或成长至适当的细胞密度，然后通过温度位移或添加异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)等化学诱导手段诱导启动子，将细胞进一步培养一定时间。

在突变型葡糖苷酶被排除到细胞外的情况下，从培养基直接纯化突变型葡糖苷酶，另外在存在于细胞外的情况下，通过超声波破碎、机械破碎等物理手段或细胞溶解剂等化学手段破坏细胞，然后纯化突变型葡糖苷酶。突变型葡糖苷酶可以组合硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、反相高速液相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、电泳等技术，从而从重组细胞的培养基中部分或完全纯化出。

本发明的突变型葡糖苷酶，在纤维素系生物量的水解中，在纤维素酶混合物中使用未添加糖链的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的情况相比，具有高的热稳定性，可以获得1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍或其以上的高的纤维素分解效率。本发明的突变型葡糖苷酶可以在作为纤维素系生物量的包含木质素成分的纤维素系生物量、基本不含木质素成分的艾维素(Avicel)、ソルカフロツク(Solka Flock)、工业用纸浆等中应用，但特别在包含木质素成分的纤维素系生物量中可以获得显著的纤维素分解效率。

如上所述获取的突变型葡糖苷酶可以通过与纤维素酶混合而作为生物量糖化用的酶组合物使用。这里所说的纤维素酶只要是具有分解纤维素的活性的酶即可，不特别限定，也可以是一种以上的混合物。作为这样的酶，可列举例如，纤维素酶、半纤维素酶、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等。

本发明中使用的纤维素酶优选为来源于丝状菌的纤维素酶混合物。来源于丝状菌的纤维素酶混合物是至少包含内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的两者的混合物。进而为了有效地进行纤维素的糖化，优选含有内切葡聚糖酶2种以上、和/或含有纤维二糖水解酶2种以上的来源于丝状菌的纤维素酶混合物。作为生产上述丝状菌纤维素酶混合物的微生物，可列举木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、腐质霉属(Humicola)、枝顶孢霉属(Acremonium)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、篮状菌属(Talaromyces)等的微生物。这些微生物在培养液中产生纤维素酶，因而既可以将培养液作为未纯化的丝状菌纤维素酶混合物直接使用，也可以将纯化培养液而制剂化的产物作为丝状菌纤维素酶混合物使用。作为丝状菌纤维素酶混合物，有时同时包含由微生物所产生的β-葡糖苷酶，但由于纤维素分解中，在量上不存在充分量，能够与后述的来源于火球菌属的β-葡糖苷酶明确地区别，因此在本发明中，来源于纤维素酶生产微生物的β-葡糖苷酶作为包含在纤维素酶中的酶。在作为从上述培养液中纯化丝状菌纤维素酶混合物而制剂化而得的产物使用的情况下，可以使用添加了蛋白酶抑制剂、分散剂、溶解促进剂、稳定剂等除了酶以外的物质的制剂作为纤维素酶制剂。

本发明中使用的丝状菌纤维素酶混合物优选是由木霉属产生的纤维素酶混合物。木霉属在培养液中产生包含至少2种以上的内切葡聚糖酶、和至少2种以上的纤维二糖水解酶的纤维素酶混合物，从这样的培养液制备的纤维素酶混合物可以在本发明中优选使用。这样的木霉属中，更优选来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶混合物。作为来源于里氏木霉的纤维素酶混合物，可列举来源于里氏木霉QM9414(Trichoderma reeseiQM9414)、里氏木霉QM9123(Trichoderma reesei QM9123)、里氏木霉RutC-30(Trichoderma reesei Rut-30)、里氏木霉PC3-7(Trichodermareesei PC3-7)、里氏木霉ATCC66589、里氏木霉CL-847(Trichodermareesei CL-847)、里氏木霉MCG77(Trichoderma reesei MCG77)、里氏木霉MCG80(Trichoderma reesei MCG80)、绿色木霉QM9123(Trichoderma viride QM9123)的纤维素酶混合物。另外，也可以是来源于上述木霉属、通过突变剂或紫外线照射等进行突变处理而纤维素酶生产性提高了的突变株。

本发明中使用的来源于木霉属的纤维素酶混合物是包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β葡糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶等多种酶成分的酶组合物。来源于木霉属的纤维素酶混合物在纤维素分解中可以通过多种酶成分的协同效果或互补效果来有效地进行纤维素的水解。

纤维二糖水解酶是以从纤维素的末端部分开始水解为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.91记载了属于纤维二糖水解酶的酶群。

内切葡聚糖酶是以从纤维素分子链的中央部分开始水解为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.4、EC3.2.1.6、EC3.2.1.39、EC3.2.1.73记载了属于内切葡聚糖酶的酶群。

外切葡聚糖酶是以从纤维素分子链的末端开始水解为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.74、EC3.2.1.58记载了属于外切葡聚糖酶的酶群。

β葡糖苷酶是以作用于纤维寡糖或纤维二糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.21记载了属于β葡糖苷酶的酶群。

木聚糖酶是以作用于半纤维素或特别是木聚糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.8记载了属于木聚糖酶的酶群。

木糖苷酶是以作用于木寡糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.37记载了属于木糖苷酶的酶群。

在本发明中，以含纤维素的生物量作为酶反应的底物。含纤维素的生物量是广泛地来源于植物生物量的纤维素。更具体地是甘蔗渣、玉米秸、玉米穗轴、柳枝稷、稻秸、麦秸、树木、木材、废建材、报纸、旧纸、纸浆等。这些含纤维素的生物量含有高分子芳香族化合物木质素、半纤维素等杂质，作为前处理，可以使用酸、碱、加压热水等，从而将木质素、半纤维素部分分解而得的含纤维素的生物量作为纤维素利用。这里，以进行了上述前处理的含纤维素的生物量为“木质纤维素”，作为酶反应底物使用。

作为本发明中使用的含纤维素的生物量，可以使用通过公知的方法进行了氨处理、稀硫酸处理、水热处理等前处理而得的生物量。

氨处理可以应用日本特开2008-161125号公报和日本特开2008-535664号公报所述的方法。具体地，添加相对于生物量为0.1～15重量％的浓度的氨，在4～200℃、优选为90～150℃进行处理。添加的氨可以是液体状态或气体状态的任一者。在液体状态的情况下，可以是液体氨、氨水溶液的任一者。对处理次数不特别限定，进行1次以上即可。在将处理进行2次以上的情况下，第1次与第2次以后的处理可以在不同的条件下实施。通过氨处理获得的处理物需要在进行水解反应之前进行氨的中和或氨的除去。中和可以直接在包含固体成分的状态下进行，也可以对分离固体成分后的液体级分进行。对中和中使用的酸试剂不特别限定。也可以通过将氨处理物在减压状态保持使氨以气体状态挥发而除去，这种情况下除去的氨可以回收再利用。

水热处理例如在添加水使含纤维素的生物量为0.1～50重量％之后，在100～400℃的温度下处理1秒～60分钟。对处理次数不特别限定，进行1次以上即可。在进行2次以上处理的情况下，第1次与第2次以后的处理可以在不同条件下实施。

稀硫酸处理例如，硫酸的浓度优选为0.1～15重量％，更优选为0.5～5重量％。反应温度可以在100～300℃的范围内设定，优选在120～250℃设定。反应时间可以在1秒～60分钟的范围内设定。对处理次数不特别限定，进行1次以上处理即可。在进行2次以上处理的情况下，第1次与第2次以后的处理可以在不同条件下实施。因为通过稀硫酸处理获得的水解物含有酸，所以需要在水解反应中使用之前进行中和。

关于本发明中的含纤维素的生物量的酶处理条件，在使用包含来源于丝状菌的纤维素酶和本发明的突变型葡糖苷酶的生物量糖化用酶组合物的情况下，优选处理温度为40℃～60℃、处理pH值为3～7、含纤维素的生物量固体成分浓度为0.1～30％。通过设定在该范围，可以最大限发挥来源于丝状菌的纤维素酶和来源于嗜热菌的葡糖苷酶的纤维素分解效率。来源于嗜热菌的葡糖苷酶中本来也有反应最适温度在100℃附近的酶，但本发明中使用的来源于嗜热菌的葡糖苷酶在40℃～60℃也显示充分高的比活性，在来源于丝状菌的纤维素酶共存下，可以有效地进行含纤维素的生物量的分解。该酶处理可以以分批式进行，也可以以连续式进行。

包含本发明的突变型葡糖苷酶的生物量糖化用酶组合物由于β葡糖苷酶活性高，因此使用该组合物水解纤维素系生物量而得的糖液具有纤维二糖含量少、葡萄糖多这样的特征。因此，使用本发明的生物量糖化用酶组合物获得的糖液可以优选作为微生物、培养细胞的生长或使用它们的发酵生产的碳源利用。这里使用的微生物或培养细胞可列举例如，在发酵工业中使用的面包酵母等酵母、大肠杆菌、棒状杆菌型细菌等细菌、丝状菌、放线菌、动物细胞、昆虫细胞等。使用的微生物、细胞可以是从自然环境中分离出的，也可以是通过突变和/或基因重组改变了一部分性质而得的。另外，来源于含纤维素的生物量的糖液含有木糖等戊糖，因此优选使用强化了戊糖的代谢途径的微生物。另外，以这样的糖液为发酵原料，可以制造化学品。作为化学品的具体例，可列举醇、有机酸、氨基酸、核酸等在发酵工业中大量生产的物质。可列举例如，乙醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、甘油等醇、乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸等有机酸、肌苷、鸟苷等核苷、肌苷酸、鸟苷酸等核苷酸、尸胺等胺化合物。进而，还可以应用于酶、抗生素、重组蛋白质等的生产。

使用本发明的生物量糖化用酶组合物水解纤维素系生物量而得的糖液，可以根据需要除去未分解的固体物后作用糖液使用，也可以以包含固体物的状态直接作为糖液使用。

在使用本发明的生物量糖化用酶组合物的生物量的水解方法中，从含纤维素的生物量经酶处理而得的糖液中分离回收所使用的酶组合物。对分离回收的方法不特别限定，本发明的突变型葡糖苷酶与不具有糖链的现有的葡糖苷酶相比，具有对含纤维素的生物量、特别是木质纤维素的吸附性、以及对超滤膜的吸附性大幅降低这样的特征。因此，所使用的酶组合物的分离回收可以优选使用以下方法：将水解物根据需要进行固液分离，将所得的糖液通过超滤膜进行过滤，作为非透过液分离回收酶组合物。

作为本发明的生物量的水解方法中的固液分离的方法，可以使用过滤法、离心分离法的任一者。作为进行这样的固液分离的装置，可以例示带型过滤器、螺旋沉降器、连续离心机、压滤机、鼓型过滤器等，但不限于这些。

在本发明的生物量的水解方法中，作为在酶组合物的分离回收中使用的超滤膜，可以使用以聚醚砜(PES)、聚砜(PS)、聚丙烯腈(PAN)、聚1,1-二氟乙烯(PVDF)、再生纤维素、纤维素、纤维素酯、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚烯烃、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯等为膜素材的超滤膜。其中，以除纤维素以外的合成高分子为超滤膜的膜素材的超滤膜从长期使用的观点考虑是优选的。一般以合成高分子为膜素材的超滤膜存在酶(蛋白质)对膜的吸附性高这样的课题，但在本发明中分离回收的酶组合物由于糖链添加的效果而吸附性降低，因此可以优选使用。本发明中使用的超滤膜的截流分子量可以使用500Da～100000Da的超滤膜。其中，特别是可以最优选使用本发明的突变型葡糖苷酶和来源于丝状菌的纤维素酶成分两者的分离回收性高、截流分子量为10000Da～30000Da的范围的超滤膜。

作为利用超滤膜的过滤方式，有死端过滤、错流过滤，从抑制膜污染的观点考虑，优选错流过滤。另外作为所使用的超滤膜的膜方式，可以使用平膜型、螺旋型、管型、中空丝型等适宜方式的超滤膜。具体可列举DESAL社的G-5型、G-10型、G-20型、G-50型、PW型、HWS UF型、KOCH社的HFM-180、HFM-183、HFM-251、HFM-300、HFM-116、HFM-183、HFM-300、HFK-131、HFK-328、MPT-U20、MPS-U20P、MPS-U20S、Synder社的SPE1、SPE3、SPE5、SPE10、SPE30、SPV5、SPV50、SOW30、旭化成社制的マクロ一ザ(登录商標)UF系列相当于截流分子量3000～100000的产品、日东电工株式会社制的NTR7410、NTR7450等。

实施例

以下列举实施例具体地说明本发明。但本发明不限于这些实施例。

［比较例1］来源于强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶的制备(1)

来源于超嗜热性古细菌强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)的β-葡糖苷酶(以下称为“PfuBGL”)具有在100℃以上有活性的程度的耐热性，水解各种纤维寡糖而生产葡萄糖，因此在纤维素系生物量的有效利用中被期待。

关于PfuBGL基因，完全合成序列号3记载的基因，使用Ligation High(东洋纺)与pET-11d的NcoI和BamHI连接，转化JM109(Takara)。使用含有氨苄青霉素作为抗生素的LB琼脂培养基进行筛选。通过ミニプレツプ试剂盒(キアゲン)从转化得到的JM109株中分离制作的载体pET-PfuBGL，进行碱基序列分析。用pET-PfuBGL转化表达用大肠杆菌BL21(DE3)pLysS株，制作BL21-PfuBGL株。将BL21-PfuBGL株接种于含氨苄青霉素的LB培养基10mL中，在37℃振荡培养一夜(前培养)。作为主培养，在含氨苄青霉素的LB培养基1L中接种前培养所得的菌体，振荡培养至波长600nm的吸光度OD600为0.8。然后，加入异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)使其最终浓度为0.4mM，再在25℃培养一夜。培养后，通过离心分离回收菌体，再悬浮于50mM Tris-HCl缓冲液(pH值8.0)中。将该溶液一边冰冷却一边进行超声波破碎，将其上清作为无细胞提取液通过离心分离回收。将所得的无细胞提取液在85℃保温15分钟，使除该葡糖苷酶以外的来源于大肠杆菌的蛋白质凝集沉淀。通过离心分离除去沉淀物，将上清使用截流分子量10000的再生纤维素制透析膜(スペクトラム·ラボラトリ一ズ制)对50mM乙酸缓冲液(pH值5.0)进行透析。使用所得的蛋白质溶液作为野生型的PfuBGL。

［实施例1］PfuBGL中的N型糖链添加序列的导入位置的确定

首先，尝试用于检索PfuBGL的糖链添加序列的导入位置的、一级序列的确定和三维结构的确定。

为了对PfuBGL的同源物进行比对，利用同源检索服务器UGUE。其结果得到了PfuBGL相对于糖基水解酶家族1(Glycosyl hydrolasefamily1)，表示序列的类似性的ZSCORE显示71.65的最高值(ZSCORE≥6.0，99％置信度)。为了进行所得的糖基水解酶家族1的比对，利用JOY服务器。其结果判明，与来源于黑曲霉的β-葡糖苷酶(AspNgBGL)和来源于里氏木霉的β-葡糖苷酶(TriReBGL)所具有的3个位置的N型糖链添加序列的位置对应的PfuBGL的序列不是N型糖链添加序列(H60、L61、Y62，N148、L149、Y150，和N374、G375、M376的3个位置)。

关于PfuBGL的X射线晶体结构报告尚不完全(ThiJis K.等，Biochem.vol.39，No.17(2000))，分解能低至

不能实现完全的结构模型构建。另外也没有登录于Protein Data Bank(PDB)。因此，为了确定PfuBGL的三维结构，在新的结晶条件下尝试了详细的X射线晶体结构分析。探索新的结晶化条件，以磷酸为沉淀剂成功地进行了结晶化。用大型放射线实验设备SPring-8进行X射线衍射实验，以分解能

确定PfuBGL的结构，成功地实现了PfuBGL的完全的模型构建。结构确定使用分子替换法，模型分子使用序列号8记载的来源于サ一モスフアエラ·アグリガンズ(Themosphaera aggregans)的β-葡糖苷酶(ThAggBGY、PDBID：1QVB)。

根据这样得到的PfuBGL的三维结构，认为与N型糖链添加序列的位置对应的上述3个位置中露出酶表面、且不与活性部位接近、对酶活性的影响小的部位仅为H60、L61、Y62的部位。因此，将该部分作为N型糖链添加序列的导入位置，通过替换导入H60N、L61R、Y62T的突变，从而作为糖链添加突变型PfuBGL得到序列号6记载的氨基酸序列。

［实施例2］与PfuBGL氨基酸序列类似的葡糖苷酶中的N型糖链添加序列的导入位置的确定

为了相对于实施例1所得的序列号6进行序列号8、序列号10、序列号12、序列号14、序列号16、序列号18和序列号20的比对，使用本领域技术人员公知的软件ClustalW和BOXSHADE进行比对(图2-1、图2-2)。对于序列号8、序列号10、序列号12、序列号14、序列号16、序列号18或序列号20，将与序列号6的糖链添加序列Asn-Arg-Thr(N-R-T)对应的位置确定为对各序列的糖链添加序列的导入位置。

［实施例3］糖链添加突变型PfuBGL的制备(1)

制备序列号6记载的糖链添加突变型PfuBGL。

首先，使用用于将实施例1所确定的糖链添加序列导入序列号4记载的PfuBGL的突变导入用引物5’-CCACATATTGGCACCTCTATAAGCAAGATCATG-3’(序列号21)和5’-CATGATCTTGCTTAGTGCGGTTCCAATATGCTGG-3’(序列号22)，通过定点突变导入法进行N型糖链添加序列突变的导入。在确认所得的基因的序列之后，插入预先包含α因子分泌信号序列的酵母表达用载体pPIC9的EcoRI和NotI位点之间。突变导入后的基因在转化大肠杆菌之后，使用测序仪确认具有包含目标的突变的基因的菌落。

在使用一般方法制成的酵母感受态细胞中混合突变体质粒，使用GENE PULSERII(Bio-Rad)进行转化。条件在1.7kV、25μF、200Ω进行。转化后的酵母在RDB平板上划线。3天后从平板上出现的菌落中选出10个，进行表达确认。选择能够通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行目标蛋白质的表达确认的克隆。

作为种子培养，从平板上的菌落，将酵母接种在2mL的BMGY培养基中培养2天。接着，作为主培养，在1L的BMGY培养基中加入酵母种子培养液2mL，培养2天，使酵母充分增殖。一次将培养液1L离心使酵母沉淀，将BMGY培养基更换成含2％甲醇的BMMY培养基。然后使菌体再悬浮于培养基中，然后培养48小时。通过离心回收含表达蛋白质的培养基，过滤器过滤后，通过70％(w/v)硫酸铵进行硫酸铵沉淀。离心回收沉淀，然后溶解于缓冲液，然后透析得到目标蛋白质。

对所得的酶进行EndoH处理，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(图3)。根据EndoH处理前后的条带位移，确认制作了添加了N型糖链的糖链添加突变型PfuBGL。

［实施例4］糖链添加突变型PfuBGL的酶活性(2)

比较糖链添加突变型PfuBGL与PfuBGL的β-葡糖苷酶活性。底物使用10mM纤维二糖/50mM乙酸缓冲液，分别将实施例2、比较例1中制备的酶以终浓度0.23mg/mL添加，在50℃进行酶反应。生成物的定量使用グルコ一ステストワコ一II(Wako)。

β-葡糖苷酶活性1单位(U)依据下述式算出。

β-葡糖苷酶活性1单位(U)＝反应结束时生成的葡萄糖浓度(g/L)×1000/180/30

进而，将β-葡糖苷酶活性相对于β-葡糖苷酶量(mg)的比活性通过下述式计算出。

β-葡糖苷酶比活性(U/mg蛋白质)＝β-葡糖苷酶活性(U)/活性测定中添加的β-葡糖苷酶量(mg)

反应后的各葡萄糖生成量，PfuBGL为1.58g/L，糖链添加突变型PfuBGL为1.34g/L。另外，糖链添加突变型PfuBGL的比活性相对于PfuBGL的比活性为85％，明确了向实施例1所确定的位置导入糖链添加序列突变不会使酶活性丧失，确认了可以利用糖链添加突变型PfuBGL代替PfuBGL。

［实施例5］糖链添加突变型PfuBGL的热稳定性

分别测定在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的保温状态下到24小时的葡萄糖生成量的变化。

分别将实施例2、比较例1所制备的酶(蛋白质浓度1.0mg/mL)分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃保温。对各保温时间，添加底物10mM纤维二糖/50mM乙酸缓冲液，在保温温度下进行30分钟的酶反应。回收反应后的溶液，使用グルコ一ステストワコ一II(Wako)进行生成物的定量(图4、图5)。

至24小时的保温中，与PfuBGL相比，糖链添加突变型PfuBGL在高的温度下的酶失活降低。由此确认，糖链添加突变型PfuBGL获得了高于PfuBGL的耐热性，酶的稳定性提高。

［参考例1］木质纤维素的制备

如下制备在使用了包含添加了糖链的突变型葡糖苷酶的酶组合物的水解中使用的木质纤维素1～3。

1.木质纤维素1的制备(氨处理)

作为纤维素使用稻秸。将上述纤维素加入小型反应器(耐压硝子工业制、TVS-N230ml)中，用液氮冷却。在反应器中流入氨气，使样品完全浸渍于液体氨中。封闭反应器的盖，在室温放置约15分钟。接着，在150℃的油浴中处理1小时。处理后，将反应器从油浴中取出，在通风中直接挥散氨气，然后进一步用真空泵将反应器内抽真空至10Pa使其干燥。将此作为木质纤维素1在以下的实施例中使用。

2.木质纤维素2的制备(稀硫酸处理)

作为纤维素使用稻秸。将纤维素浸渍于硫酸1％水溶液，在150℃高压釜处理(日东高压制)30分钟。处理后进行固液分离，分离成硫酸水溶液(以下称为稀硫酸处理液)和硫酸处理纤维素。接着将硫酸处理纤维素与稀硫酸处理液搅拌混合使固体成分浓度为10重量％，然后用氢氧化钠调整至pH值5左右。将此作为木质纤维素2在以下的实施例中使用。

3.木质纤维素3的制备(水热处理)

作为纤维素使用稻秸。将上述纤维素浸渍于水中，一边搅拌一边在180℃高压釜处理20分钟(日东高压株式会社制)。此时的压力为10MPa。处理后使用离心分离(3000G)进行固液分离成溶液成分(以下称为水热处理液)和处理生物量成分。将该处理生物量成分作为木质纤维素3在以下的实施例中使用。

［实施例6］使用来源于丝状菌的纤维素酶混合物和包含糖链添加突变型PfuBGL的酶组合物的木质纤维素的水解(1)

比较使该酶组合物对木质纤维素底物作用时的葡萄糖生成量的变化。以在50mM乙酸缓冲液(pH值5.0)中悬浮5重量％的木质纤维素1(参考例1中制备)而得的混合物作为底物。反应在50℃进行至28小时，适宜取样而测定生成的葡萄糖浓度(图6)。作为来源于丝状菌的纤维素酶混合物，使用市售的来源于里氏木霉的纤维素酶(セルクラスト、シグマ)。作为葡糖苷酶，分别使用实施例2所制备的糖链添加突变型PfuBGL和比较例1所制备的PfuBGL。酶添加量为纤维素酶0.5mg/mL、葡糖苷酶0.005mg/mL(纤维素酶的1/100量)。

如果将使用PfuBGL和糖链添加突变型PfuBGL的情况进行比较，则关于反应28小时后的葡萄糖生成量，糖链添加突变型PfuBGL大幅上升至PfuBGL的1.6倍。明确了糖链添加突变型PfuBGL仅以纤维素酶的1/100量添加，对葡萄糖生成量的增加有巨大效果。

［参考例2］来源于木霉属的纤维素酶的制备

通过以下方法制备来源于木霉属的纤维素酶。

1.前培养

在蒸馏水中添加玉米浸渍液5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14％(w/vol)、磷酸二氢钾0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)，将100mL倒入500mL带挡板的三角烧瓶中，在121℃高压釜灭菌15分钟。放冷后，分别添加与其分别在121℃高压釜灭菌15分钟后的PE-M和Tween800.1％。在该前培养培养基中接种里氏木霉ATCC66589(Tricoderma reesei ATCC66589)1×10⁵个/mL，以28℃、72小时、180转/分钟振荡培养，作为前培养(振荡装置：TAITEC社制BIO-SHAKER BR-40LF)。

2.主培养

在蒸馏水中添加玉米浸渍液5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、纤维素(艾维素)10％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14％(w/vol)、磷酸二氢钾0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)，将2.5L加入5L容量的搅拌广口瓶(ABLE社制DPC-2A)容器中，在121℃高压釜灭菌15分钟。放冷后，分别加入与上述分别地在121℃高压釜灭菌15分钟后的PE-M和Tween800.1％，接种预先通过上述方法用液体培养基进行了前培养的里氏木霉ATCC66589(Tricoderma reesei ATCC66589)250mL。然后，以28℃、87小时、300转/分钟、通气量1vvm进行培养，离心分离后，将上清进行膜过滤(ミリポア社制ステリカツプ-GV材质：PVDF)。

［实施例7］使用来源于丝状菌的纤维素酶混合物和包含糖链添加突变型PfuBGL的酶组合物的木质纤维素的水解(2)

以参考例1所制备的木质纤维素1～3为底物，使用参考例2所制备的里氏木霉培养液作为来源于丝状菌的纤维素酶混合物，使酶添加量为纤维素酶1.0mg/mL、葡糖苷酶0.005mg/mL(纤维素酶的1/100量)，除此以外，与实施例6同样地进行木质纤维素1～3的水解。

表2中比较反应28小时后生成的葡萄糖浓度(g/L)。

表2

将使用PfuBGL和糖链添加突变型PfuBGL的情况进行比较，则关于反应28小时后的葡萄糖生成量，糖链添加突变型PfuBGL大幅上升至PfuBGL的1.8倍。明确了糖链添加突变型PfuBGL仅以纤维素酶的1/200量添加，就具有葡萄糖生成量大幅增加的效果。判明了不仅使用实施例6那样的市售的纤维素酶，而且使用里氏木霉培养液也具有糖链添加突变型中的效果。

［实施例8］使用来源于丝状菌的纤维素酶混合物和包含糖链添加突变型PfuBGL的酶组合物的木质纤维素的水解(3)

使用来源于丝状菌的纤维素酶和包含糖链添加突变型PfuBGL的酶组合物，改变水解的反应温度条件，对葡萄糖生成量进行比较研究。将反应温度设定在30℃、40℃、50℃(实施例7)、60℃的各温度，通过与实施例7同样的步骤进行，测定28小时后的葡萄糖生成量。底物使用木质纤维素1。

表3

如表3所示，判定了在使用来源于丝状菌的纤维素酶、特别是来源于木霉属的纤维素酶的情况下，优选在40℃～50℃的范围内设定反应温度。这是反映来源于木霉属的纤维素酶的反应最适温度为40℃～50℃的结果。即，判明了本发明的来源于嗜热菌的葡糖苷酶虽然在50℃以上也显示高活性，但在作为包含来源于丝状菌的纤维素酶的生物量糖化用酶组合物使用的情况下，优选反应温度在来源于丝状菌的纤维素酶的最适反应温度范围进行。

［实施例9］使用来源于丝状菌的纤维素酶混合物和包含糖链添加突变型PfuBGL的酶组合物的木质纤维素的水解(4)

使用来源于丝状菌的纤维素酶和包含糖链添加突变型PfuBGL的酶组合物，改变水解反应中的pH值条件对葡萄糖生成量进行比较研究。添加稀硫酸将水解反应时的pH值设定为1.2、3.5、5.0(实施例7)、7.0、8.2的各pH值，通过与实施例7同样的步骤进行，测定28小时后的葡萄糖生成量。底物使用木质纤维素1。

表4

如表4所示，判明在使用来源于丝状菌的纤维素酶、特别是来源于木霉属的纤维素酶的情况下，优选在pH值3.5～pH值7的范围进行。

［比较例2］PfuBGL类似葡糖苷酶的制备(2)

如下制备与比较例1所制备的PfuBGL氨基酸序列类似的葡糖苷酶7种。

分别通过全合成制作序列号23、25、27、29、31、33、35的DNA序列，整合到pET-11d的克隆位点NcoI与BamHI之间，构建各自的表达载体。以下，与比较例1同样地地，获得用序列号24、26、28、30、32、34、36的氨基酸序列表示的野生型的葡糖苷酶(ThAggBGY、CmGHFP、SaBGAL、SsoBGAL、PtBGAL、TvBGAL、FnGHFP)。

［实施例10］PfuBGL类似葡糖苷酶的糖链添加突变型葡糖苷酶的制备

对于比较例2所得的野生型葡糖苷酶(ThAggBGY、CmGHFP、SaBGAL、SsoBGAL、PtBGAL、TvBGAL、FnGHFP)，以在实施例2中以PfuBGL确定的糖链添加序列的插入位置的信息为基础，确定糖链导入位置，制备各个糖链添加突变型葡糖苷酶。

通过全合成分别制作序列号37、39、41、43、45、47、49的编码糖链添加突变型葡糖苷酶的DNA序列，整合到pCU9载体的EcoRI与NotI之间，构建各自的表达载体。以下，与实施例3同样地，得到了用序列号38、40、42、44、46、48、50的氨基酸序列表示的糖链添加突变型葡糖苷酶。

［实施例11］糖链添加突变型葡糖苷酶的酶活性

与实施例4同样地，测定实施例10所得的糖链添加突变型葡糖苷酶的酶活性，与比较例2所得的各野生型葡糖苷酶的酶活性进行比较。糖链添加突变型的酶活性作为以各野生型的酶活性为100时的相对活性(％)示于表5。

表5

可知表5的糖链添加突变型葡糖苷酶与糖链添加前的野生型葡糖苷酶相比维持着酶活性。

［实施例12］糖链添加突变型葡糖苷酶的热稳定性

与实施例5同样地，进行比较例2所得的各野生型葡糖苷酶和实施例10所得的各糖链添加突变型葡糖苷酶的热稳定性试验。关于热稳定性，将以保温前的酶活性为100时的各保温时间中的残存活性作为相对活性示于图8～图20。在所有葡糖苷酶中，判明了糖链添加突变型(图9，图11，图13，图15，图17，图19，图21)与野生型(图8，图10，图12，图14，图16，图18，图20)相比热稳定性提高。

［实施例13］使用来源于丝状菌的纤维素酶混合物和包含糖链添加突变型葡糖苷酶的酶组合物的木质纤维素的水解(5)

与实施例6同样地，使用比较例2所得的各野生型葡糖苷酶和实施例10所得的各糖链添加突变型葡糖苷酶进行参考例1所制备的木质纤维素1(氨处理)的水解。将反应28小时后的各葡萄糖生成量(g/L)示于表6。

表6

如表6所示，可知在氨处理后的木质纤维素1的水解中，糖链添加突变型葡糖苷酶与野生型相比，每单位时间的糖生成量大幅增加，纤维素分解效率优异。

［实施例14］使用来源于丝状菌的纤维素酶混合物和包含糖链添加突变型葡糖苷酶的酶组合物的木质纤维素的水解(6)

与实施例6同样地，使用比较例2所得的各野生型葡糖苷酶和实施例10所得的各糖链添加突变型葡糖苷酶，进行参考例1所制备的木质纤维素2(稀硫酸处理)的水解。将反应28小时后的各葡萄糖生成量(g/L)示于表7。

表7

如表7所示，可知在稀硫酸处理后的木质纤维素2的水解中，糖链添加突变型葡糖苷酶与野生型相比，每单位时间的糖生成量大幅增加，纤维素分解效率优异。

［实施例15］使用来源于丝状菌的纤维素酶混合物和包含糖链添加突变型葡糖苷酶的酶组合物的木质纤维素的水解(7)

与实施例6同样地，使用比较例1和比较例2所得的各野生型葡糖苷酶、以及实施例1和实施例10所得的各糖链添加突变型葡糖苷酶，进行参考例1所制备的木质纤维素3(水热处理)的水解。将反应28小时后的各葡萄糖生成量(g/L)示于表8。

表8

如表8所示，可知在经水热处理的木质纤维素3的水解中，糖链添加突变型葡糖苷酶与野生型相比，每单位时间的糖生成量大幅增加，纤维素分解效率优异。

［实施例16］使用来源于丝状菌的纤维素酶混合物和包含糖链添加突变型葡糖苷酶的酶组合物的工业用纸浆的水解

对于对工业用纸浆作用比较例1和比较例2所得的各野生型葡糖苷酶、以及实施例1和实施例10所得的各糖链添加突变型葡糖苷酶时的葡萄糖生成量进行比较研究。除了将在50mM乙酸缓冲液(pH值5.0)中悬浮5重量％的工业用纸浆(东亚化成社制)而得的产物作为底物以外，与实施例6同样地进行水解。将反应28小时后的各葡萄糖生成量(g/L)示于表9。

表9

如表9所示，可以确认糖链添加突变型葡糖苷酶即使在工业用纸浆的水解中，与野生型相比，每单位时间的糖生成量也大幅增加，纤维素分解效率优异。

［实施例17］糖链添加突变导入部位的选定

根据实施例1所得的PfuBGL的三维结构信息，进行进一步的糖链修饰部位的探索。在酶反应进行的裂隙的周围导入糖链添加序列，通过糖链的添加来尝试催化部位的保护。首先，在PfuBGL的实施例1记载的糖链突变导入部位以外的部分中，限定露出酶表面的部分。接着，探索即使导入作为糖链添加序列的Asn-Xaa-Thr(N-X-T)的突变也不产生立体障碍和/或结构变形的位置。另外在避开葡糖苷酶的活性部位的部位选定3点突变导入位置。

其结果是，除了实施例1所选定的糖链修饰部位之外，新选定了H37-D38-K39(突变A)、S230-F231-E232(突变C)、A364-Y365-E366(突变E)的3个突变导入位置。

［实施例18］糖链添加突变型PfuBGL的制备(2)

为了在序列号6记载的糖链添加突变型PfuBGL中的、通过实施例17所确定的突变导入位置导入糖链添加序列，使用序列号57和序列号58所示的突变A导入用引物，通过定点突变导入法来进行N型糖链添加序列突变的导入。其结果获得了序列号51的糖链添加突变型PfuBGL2A基因。另外，对于突变C，使用序列号59和序列号60所示的突变C导入用引物，对于突变E，使用序列号61和序列号62所示的突变E导入用引物，同样地通过定点突变导入法进行N型糖链添加序列突变的导入，分别获得序列号53所示的糖链添加突变型PfuBGL2C基因、和序列号55所示的糖链添加突变型PfuBGL2E基因。使用这样制备的糖链添加突变型基因，进行与实施例3同样的步骤，从而分别获得序列号52所示的糖链添加突变型PfuBGL2A、序列号54所示的糖链添加突变型PfuBGL2C、序列号56所示的糖链添加突变型PfuBGL2E。

［实施例19］糖链添加突变型PfuBGL的酶活性(2)

与实施例4同样地，将实施例18所得的糖链添加突变型葡糖苷酶PfuBGL2A(序列号52)、糖链添加突变型PfuBGL2C(序列号54)、糖链添加突变型PfuBGL2E(序列号56)的酶活性，与野生型PfuBGL比较进行测定。糖链添加突变型的酶活性作为以野生型PfuBGL的酶活性为100时的相对活性(％)示于表10。

表10

如表10所示，可知添加了2个以上糖链的突变型葡糖苷酶与糖链添加前的野生型葡糖苷酶相比维持着酶活性。

［实施例20］使用来源于丝状菌的纤维素酶混合物和包含各种糖链添加突变型葡糖苷酶的酶组合物的木质纤维素的水解(8)

与实施例6同样地，使用实施例18所得的糖链添加突变型葡糖苷酶(PfuBGL2A、PfuBGL2C、PfuBGL2E)，进行参考例1所制备的木质纤维素2(稀硫酸处理)的水解。将反应28小时后的葡萄糖生成量(g/L)示于表11。

表11

如表11所示，判明了即使在添加了2个以上糖链的突变型葡糖苷酶(序列号52、序列号54、序列号56)中，与无糖链修饰的野生型葡糖苷酶(比较例1；葡萄糖生成量：3g/L)相比，对木质纤维素的分解效率也大幅提高。

［实施例21］糖链添加突变型葡糖苷酶对木质纤维素的吸附性的评价

评价糖链添加突变型葡糖苷酶对结晶纤维素(艾维素)和参考例1所制备的木质纤维素1～3的吸附性。葡糖苷酶使用实施例1所制备的糖链添加突变型PfuBGL、和比较例1所制备的野生型PfuBGL，将这些酶液调整成比活性相等，加入乙酸缓冲液(pH值5)制备成最终浓度100mM。将该酶液分别对结晶纤维素、木质纤维素1～3添加至最终浓度(固体物浓度)7.5重量％，将该混合物在50℃保温和搅拌1小时。然后，将反应而得的混合物以15000转/分钟离心分离10分钟，测定其上清的纤维二糖分解活性。关于纤维二糖分解活性，以不含结晶纤维素、木质纤维素1～3的酶液的酶活性为100，以相对活性(％)进行评价。

表12

如表12所示，判明了相对于野生型葡糖苷酶，在糖化添加突变型葡糖苷酶中，在木质纤维素1～3的任一者存在下，上清中所含的纤维二糖分解活性均增加。另外，在作为结晶纤维素的艾维素中，上清液中所含的纤维二糖分解活性也略微增大。由本结果判明，糖化添加突变型葡糖苷酶特别是对木质纤维素(纤维素前处理物)的吸附性低，从固液分离后的上清液中的回收性高。

［实施例22］糖链添加突变型葡糖苷酶对超滤膜的吸附性的评价

评价糖链添加突变型葡糖苷酶对超滤膜的吸附性。超滤膜使用VIVASPIN20(ザルトリウス社、聚醚砜制、截流分子量10000Da)。葡糖苷酶使用实施例1所制备的糖链添加突变型PfuBGL、和比较例1所制备的PfuBGL，将这些酶液调整成比活性相等，加入乙酸缓冲液(pH值5)制备成最终浓度50mM。将该酶液5mL移至超滤膜VIVASPIN20，以4000G离心分离10分钟。离心分离后，在残留在超滤膜的非透过侧的溶液(约100μL以下)中添加50mM乙酸缓冲液3mL，用移液器回收超滤膜的膜面和容器内壁的残存物。将回收物的残存物稀释至5mL，取样10μL用于纤维二糖分解活性用。将这一系列操作重复7次，以初始活性为100(％)，将各次中的纤维二糖分解活性以相对活性(％)计算出。该结果示于表13。

表13

如表13所示，判明了在无糖链修饰的野生型PfuBGL中，随着重复次数增加，活性减少(在第4次以后活性消失)。另一方面，判明了在糖链添加突变型PfuBGL中，即使重复7次也保持着活性。即，在糖链添加突变型葡糖苷酶中，对超滤膜的吸附低，因此在水解反应后使用超滤膜回收酶时，回收性优异。

［实施例23］水解物所含的酶组合物通过超滤膜的回收

从实施例7中进行的木质纤维素1-3的水解物中，如下回收酶组合物。首先，将水解物10mL进行离心分离，得到5mL的上清液。接着将上清液通过平均细孔径0.2μm精滤膜(ミリポア社制、PVDF膜)进行过滤，回收滤液。将该滤液总量移至超滤膜VIVASPIN20(聚醚砜制、截流分子量10000Da)进行离心分离。回收残存在超滤膜的非透过侧的残存物，测定纤维二糖分解活性。活性以投入的酶活性为初始酶活性100％，通过相对值(％)计算出作为残存物回收的酶组合物的酶活性。

表14

如表14所示，判明了糖链添加突变型葡糖苷酶与突变型葡糖苷酶相比，回收酶的活性大幅增加。认为这是由于，糖链添加突变型葡糖苷酶如实施例21所示对木质纤维素的吸附性低下，如实施例22所示对超滤膜的吸附性低下。

［实施例24］糖链添加突变型葡糖苷酶的糖链成分的分析

分析实施例1记载的糖链添加PfuBGL的糖链结构。将糖链添加PfuBGL在-80℃冻结干燥而得的样品1.33mg中添加纯化水1.33mL，制备1mg/mL样品溶液。分别通过以下步骤进行该样品溶液中的中性糖和氨基糖的定量。

1.中性糖

将1mg/mL样品溶液100μL移至试管中进行减压干固，然后，添加2M三氟乙酸200μL。对该试管进行氮气置换，将试管减压封管。然后，在100℃水解6小时，然后再次减压干固。在所得的残余物中添加纯化水200μL，使残余物溶解，然后用0.22μm的过滤器进行过滤。将滤液用纯化水稀释10倍，将所得的样品在以下条件下进行分析。

分析仪器使用HPLC系统LC20A系统(株式会社岛津制作所)、分光荧光光度计RF-10AXL(株式会社岛津制作所)。

分析条件在TSK-gel Sugar AXG4.6mmI.D.x15cm(东ソ一株式会社)、柱温度70℃、移动相0.6M硼酸钾缓冲液(pH值8.7)、移动相流速0.4mL/分钟下进行。

后柱标记使用1重量％精氨酸、3重量％硼酸作为反应试剂，在反应试剂流速0.5mL/分钟、反应温度150℃下进行。此外，检测波长在激发320nm、检测430nm下进行。中性糖的定量通过与各中性糖标准品的比较来进行。

2.氨基糖

将1mg/mL样品溶液100μL移至试管，进行减压干固，然后，添加4M三盐酸200μL。将该试管进行氮气置换，将试管减压封管。然后，在100℃水解6小时，然后再次进行减压干固。在所得的残余物中添加纯化水200μL，使残余物溶解，然后用0.22μm的过滤器进行过滤。

分析仪器使用HPLC系统LC20A系统(株式会社岛津制作所)、分光荧光光度计RF-10AXL(株式会社岛津制作所)。

分析条件在TSK-gel SCX 6mmI.D.x15cm(东ソ一株式会社)、柱温度60℃、移动相0.16M硼酸钾缓冲液(pH值7.6)、移动相流速0.3mL/分钟、下进行。

后柱标记使用1重量％精氨酸、3重量％硼酸作为反应试剂，在反应试剂流速0.5mL/分钟、反应温度150℃进行。此外检测波长在激发320nm、检测430nm进行。中性糖的定量通过与各中性糖标准品的比较来进行。

表15

(*1)将葡糖胺的浓度B的值基准设定为“2”，以相对比计算出其他糖浓度B。此外计算时，小数点以下通过四舍五入而将值作为整数。

如表15所示，判明了构成实施例1所得的糖链突变型PfuBGL的糖链的中性糖的主成分为甘露糖。另外由甘露糖相对于N-葡糖胺的构成比，判明了糖链突变型PfuBGL为高甘露糖型糖链。

产业可利用性

本发明中的糖链添加的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶可以在利用纤维素分解的糖液的制造中使用。通过大幅提高纤维素分解效率的效果，可以大幅削减酶成本，因此产业上非常有益。

本说明书中引用的所有发行物、专利和专利申请直接作为参考引入本说明书中。

Claims (12)

1.选择性地添加了糖链、且具有葡糖苷酶活性的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶的制造方法，该方法包括以下工序：

(i)对编码本来不具有糖链添加序列的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的DNA，导入编码Asn-X-Ser或Asn-X-Thr(X是除脯氨酸以外的任意氨基酸)的DNA序列，制备编码来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶的DNA，进一步对编码该突变型葡糖苷酶的DNA添加编码分泌信号序列的DNA序列，

(ii)将添加了该编码分泌信号序列的DNA序列的编码该突变型葡糖苷酶的DNA导入真核微生物，使由该突变型葡糖苷酶DNA编码的突变型葡糖苷酶作为分泌蛋白质表达，以及

(iii)分离·纯化作为分泌蛋白质表达的突变型葡糖苷酶。

2.根据权利要求1所述的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，糖链是高甘露糖型糖链。

3.根据权利要求1或2所述的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，来源于嗜热菌的葡糖苷酶是来源于选自硫化叶菌属(Sulofolobus)、热原体属(Thermoplasma)、暖枝菌属(Caldivirgra)、热球形菌属(Thermosphaera)、火球菌属(Pyrococcus)、嗜苦菌属(Picrophilus)、暖枝菌属(Caldivirgra)、闪烁杆菌属(Fervidobacterium)中的1种的葡糖苷酶。

4.根据权利要求1～3的任一项所述的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，来源于嗜热菌的葡糖苷酶是下述(i)或(ii)的蛋白质：

(i)包含与序列号4、序列号8、序列号10、序列号12、序列号14、序列号16、序列号18或序列号20所记载的任一氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白质，

(ii)包含与序列号4、序列号8、序列号10、序列号12、序列号14、序列号16、序列号18或序列号20所记载的任一氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、且具有β-葡糖苷酶活性的蛋白质。

5.根据权利要求1～4的任一项所述的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，真核微生物是巴斯德毕赤酵母。

6.根据权利要求1～5的任一项所述的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，分泌信号序列是α因子分泌信号序列。

7.根据权利要求1～6的任一项所述的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶包含序列号6、序列号38、序列号40、序列号42、序列号44、序列号46、序列号48、序列号50、序列号52、序列号54和序列号56的任一项所示氨基酸序列。

8.生物量糖化用的酶组合物，其包含纤维素酶和通过权利要求1～7的任一项所述的制造方法获得的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶。

9.根据权利要求8所述的生物量糖化用的酶组合物，其中，纤维素酶是来源于丝状菌的纤维素酶混合物。

10.根据权利要求8或9所述的生物量糖化用的酶组合物，其中，来源于丝状菌的纤维素酶混合物是来源于木霉属的纤维素酶混合物。

11.生物量的水解方法，其中，使用权利要求8～10的任一项所述的酶组合物。

12.根据权利要求11所述的生物量的水解方法，其特征在于，将由上述酶组合物产生的水解物通过超滤膜进行过滤，分离回收使用后的该酶组合物。

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