JPWO2011108312A1 - グルコシダーゼの製造方法、酵素組成物およびバイオマスの加水分解方法 - Google Patents
グルコシダーゼの製造方法、酵素組成物およびバイオマスの加水分解方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2011108312A1 JPWO2011108312A1 JP2012503035A JP2012503035A JPWO2011108312A1 JP WO2011108312 A1 JPWO2011108312 A1 JP WO2011108312A1 JP 2012503035 A JP2012503035 A JP 2012503035A JP 2012503035 A JP2012503035 A JP 2012503035A JP WO2011108312 A1 JPWO2011108312 A1 JP WO2011108312A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- glucosidase
- derived
- mutant
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
(i)元来糖鎖付加配列を持たない好熱性菌由来グルコシダーゼをコードするDNAに、Asn-X-SerまたはAsn-X-Thr(Xはプロリンを除く任意のアミノ酸)をコードするDNA配列を導入し、好熱性菌由来変異型グルコシダーゼをコードするDNAを調製し、さらに該変異型グルコシダーゼをコードするDNAに分泌シグナル配列をコードするDNA配列を付加する、
(ii)該分泌シグナル配列をコードするDNA配列が付加された該変異型グルコシダーゼをコードするDNAを真核微生物に導入し、該変異型グルコシダーゼDNAによってコードされる変異型グルコシダーゼを分泌タンパク質として発現させる、ならびに
(iii)分泌タンパク質として発現された変異型グルコシダーゼを単離・精製する、ことを含む上記方法。
(i)配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18または配列番号20に記載のいずれかのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、あるいは
(ii)配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18または配列番号20に記載のいずれかのアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質である、(1)〜(3)のいずれかのグルコシダーゼの製造方法。
超好熱性古細菌パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)由来β-グルコシダーゼ(以下、「PfuBGL」と称する)は、100℃以上で活性をもつほどの耐熱性を有し、種々のセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生産するためセルロース系バイオマスの有効利用に期待されている。
まず、PfuBGLの糖鎖付加配列の導入箇所を検索するための、一次配列の決定と三次元構造の決定を試みた。
実施例1で得られた配列番号6に対して、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18および配列番号20のアライメントを行うため、当該業者に良く知られたソフトウェアである、ClustalWおよびBOXSHADEを用いてアライメントを整形した(図2−1、図2−2)。配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18または配列番号20について、配列番号6の糖鎖付加配列Asn-Arg-Thr(N-R-T)に対応する箇所を、各配列への糖鎖付加配列の導入箇所として決定した。
配列番号6記載の糖鎖付加変異型PfuBGLの調製を行った。
糖鎖付加変異型PfuBGLと、PfuBGLのβ-グルコシダーゼ活性を比較した。基質に10mM セロビオース/50mM 酢酸緩衝液を用い、それぞれ実施例2、比較例1で調製した酵素を終濃度0.23mg/mLで添加し、50℃で酵素反応を行った。生成物の定量には、グルコーステストワコーII(Wako)を用いた。
β-グルコシダーゼ活性1ユニット(U)=反応終了時に生成したグルコース濃度(g/L)×1000/180/30
さらに、β-グルコシダーゼ活性を、β-グルコシダーゼ量(mg)当たりの比活性を下記の式で算出した。
β-グルコシダーゼ比活性(U/mg protein)=β-グルコシダーゼ活性(U)/活性測定に添加したβ-グルコシダーゼ量(mg)
反応後の各グルコース生成量は、PfuBGLが1.58g/L、糖鎖付加変異型PfuBGLが1.34g/Lであった。また、PfuBGLの比活性に対する糖鎖付加変異型PfuBGLの比活性は85%と、実施例1にて決定した箇所への糖鎖付加配列変異の導入は、酵素活性を喪失させないことが明らかであり、PfuBGLの代替として糖鎖付加変異型PfuBGLが利用できることが確認された。
それぞれ50℃、60℃、70℃、80℃、90℃での保温状態における24時間までのグルコース生成量の変化を測定した。
糖鎖付加した変異型グルコシダーゼを含む酵素組成物を用いた加水分解に使用するリグノセルロース1〜3を次のように調製した。
セルロースとして、稲藁を使用した。前記セルロースを小型反応器(耐圧硝子工業製、TVS−N2 30ml)に投入し、液体窒素で冷却した。この反応器にアンモニアガスを流入し、試料を完全に液体アンモニアに浸漬させた。リアクターの蓋を閉め、室温で15分ほど放置した。次いで、150℃のオイルバス中にて1時間処理した。処理後、反応器をオイルバスから取り出し、ドラフト中で直ちにアンモニアガスをリーク後、さらに真空ポンプで反応器内を10Paまで真空引きし乾燥させた。これをリグノセルロース1として以下の実施例に使用した。
セルロースとして、稲藁を使用した。セルロースを硫酸1%水溶液に浸し、150℃で30分オートクレーブ処理(日東高圧製)した。処理後、固液分離を行い、硫酸水溶液(以下、希硫酸処理液)と硫酸処理セルロースに分離した。次に硫酸処理セルロースと固形分濃度が10重量%となるように希硫酸処理液と攪拌混合した後、水酸化ナトリウムによって、pHを5付近に調製した。これをリグノセルロース2として以下の実施例に使用した。
セルロースとして、稲藁を使用した。前記セルロースを水に浸し、撹拌しながら180℃で20分間オートクレーブ処理(日東高圧株式会社製)した。その際の圧力は10MPaであった。処理後は溶液成分(以下、水熱処理液)と処理バイオマス成分に遠心分離(3000G)を用いて固液分離した。この処理バイオマス成分をリグノセルロース3として以下の実施例に使用した。
リグノセルロース基質に該酵素組成物を作用させた場合のグルコース生成量の変化を比較した。50mM 酢酸緩衝液(pH5.0)に5wt%のリグノセルロース1(参考例1で調製)を懸濁したものを基質とした。反応は50℃において28時間まで行い、適宜サンプリングして生成したグルコース濃度の測定を行った(図6)。糸状菌由来セルラーゼ混合物としては、市販のトリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ(セルクラスト、シグマ)を用いた。グルコシダーゼとしては、実施例2で調製した糖鎖付加変異型PfuBGLと比較例1で調製したPfuBGLをそれぞれ用いた。酵素添加量は、セルラーゼ0.5mg/mL、グルコシダーゼ0.005mg/mL(セルラーゼの1/100量)である。
トリコデルマ属由来セルラーゼを以下の方法で調製した。
コーンスティップリカー5%(w/vol)、グルコース2%(w/vol)、酒石酸アンモニウム0.37%(w/vol)、硫酸アンモニウム0.14%(w/vol)、リン酸二水素カリウム0.2%(w/vol)、塩化カルシウム二水和物0.03%(w/vol)、硫酸マグネシウム七水和物0.03%(w/vol)、塩化亜鉛0.02%(w/vol)、塩化鉄(III)六水和物0.01%(w/vol)、硫酸銅(II)五水和物0.004%(w/vol)、塩化マンガン四水和物 0.0008%(w/vol)、ホウ酸0.0006%(w/vol)、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物0.0026%(w/vol)となるよう蒸留水に添加し、100mLを500mLバッフル付き三角フラスコに張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ121℃で15分間オートクレーブ滅菌したPE−MとTween80をそれぞれ0.1%添加した。この前培養培地にトリコデルマ・リーセイATCC66589(Tricoderma reesei ATCC66589)を1×105個/mLになるように植菌し、28℃、72時間、180rpmで振とう培養し、前培養とした(振とう装置:TAITEC社製 BIO−SHAKER BR−40LF)。
コーンスティップリカー5%(w/vol)、グルコース2%(w/vol)、セルロース(アビセル)10%(w/vol)、酒石酸アンモニウム0.37%(w/vol)、硫酸アンモニウム0.14%(w/vol)、リン酸二水素カリウム0.2%(w/vol)、塩化カルシウム二水和物0.03%(w/vol)、硫酸マグネシウム七水和物0.03%(w/vol)、塩化亜鉛0.02%(w/vol)、塩化鉄(III)六水和物0.01%(w/vol)、硫酸銅(II)五水和物0.004%(w/vol)、塩化マンガン四水和物0.0008%(w/vol)、ホウ酸0.0006%(w/vol)、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物0.0026%(w/vol)となるよう蒸留水に添加し、2.5Lを5L容撹拌ジャー(ABLE社製 DPC−2A)容器に張り込み、121℃で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ121℃で15分間オートクレーブ滅菌したPE−MとTween80をそれぞれ0.1%添加し、あらかじめ前記の方法にて液体培地で前培養したトリコデルマ・リーセイATCC66589(Tricoderma reesei ATCC66589)を250mL接種した。その後、28℃、87時間、300rpm、通気量1vvmにて培養を行い、遠心分離後、上清を膜濾過(ミリポア社製 ステリカップ−GV 材質:PVDF)した。
参考例1で調製したリグノセルロース1〜3を基質とし、参考例2で調製したトリコデルマ・リーセイ培養液を糸状菌由来セルラーゼ混合物として使用し、酵素添加量をセルラーゼ1.0mg/mL、グルコシダーゼ0.005mg/mL(セルラーゼの1/100量)とした以外は、実施例6と同様にしてリグノセルロース1〜3の加水分解を実施した。
糸状菌由来セルラーゼと糖鎖付加変異型PfuBGLから成る酵素組成物を用い、加水分解の反応温度条件を変えてグルコース生成量を比較検討した。反応温度を、30℃、40℃、50℃(実施例7)、60℃の各温度に設定し、実施例7と同様の手順で行い、28時間後のグルコース生成量を測定した。基質は、リグノセルロース1を使用した。
糸状菌由来セルラーゼと糖鎖付加変異型PfuBGLから成る酵素組成物を用い、加水分解反応におけるpH条件を変えてグルコース生成量を比較検討した。希硫酸を添加して加水分解反応時のpHを1.2、3.5、5.0(実施例7)、7.0、8.2の各pHに設定し、実施例7と同様の手順で行い、28時間後のグルコース生成量を測定した。基質は、リグノセルロース1を使用した。
以下のようにして、比較例1で調製したPfuBGLとアミノ酸配列が類似するグルコシダーゼ7種を調製した。
比較例2で得られた野生型グルコシダーゼ(ThAggBGY、CmGHFP、SaBGAL、SsoBGAL、PtBGAL、TvBGAL、FnGHFP)について、実施例2においてPfuBGLで決定した糖鎖付加配列の挿入箇所の情報を基に、糖鎖導入箇所を決定し、それぞれ糖鎖付加変異型グルコシダーゼを調製した。
実施例4と同様にして、実施例10で得られた糖鎖付加変異型グルコシダーゼの酵素活性を測定して、比較例2で得られた各野生型グルコシダーゼの酵素活性と比較した。糖鎖付加変異型の酵素活性は、各野生型の酵素活性を100としたときの相対活性(%)として表5に示した。
実施例5と同様にして、比較例2で得られた各野生型グルコシダーゼと実施例10で得られた各糖鎖付加変異型グルコシダーゼの熱安定性試験を行った。熱安定性は、保温前の酵素活性を100とした場合の各保温時間における残存活性を、相対活性として図8〜図20に示した。全てのグルコシダーゼにおいて、糖鎖付加変異型(図9,図11,図13,図15,図17,図19,図21)は、野生型(図8,図10,図12,図14,図16,図18,図20)に比べて熱安定性が向上することが判明した。
実施例6と同様にして、比較例2で得られた各野生型グルコシダーゼと実施例10で得られた各糖鎖付加変異型グルコシダーゼを用いて、参考例1で調製したリグノセルロース1(アンモニア処理)の加水分解を行った。反応28時間後における各グルコース生成量(g/L)を表6に示した。
実施例6と同様にして、比較例2で得られた各野生型グルコシダーゼと実施例10で得られた各糖鎖付加変異型グルコシダーゼを用いて、参考例1で調製したリグノセルロース2(希硫酸処理)の加水分解を行った。反応28時間後における各グルコース生成量(g/L)を表7に示した。
実施例6と同様にして、比較例1及び比較例2で得られた各野生型グルコシダーゼと実施例1及び実施例10で得られた各糖鎖付加変異型グルコシダーゼを用いて、参考例1で調製したリグノセルロース3(水熱処理)の加水分解を行った。反応28時間後における各グルコース生成量(g/L)を表8に示した。
工業用パルプに、比較例1及び比較例2で得られた各野生型グルコシダーゼと実施例1及び実施例10で得られた各糖鎖付加変異型グルコシダーゼをを作用させた場合のグルコース生成量を比較検討した。50mM 酢酸緩衝液(pH5.0)に5wt%の工業用パルプ(東亜化成社製)を懸濁したものを基質とした以外は実施例6と同様にして、加水分解を行った。反応28時間後における各グルコース生成量(g/L)を表9に示した。
実施例1で得られたPfuBGLの三次元構造情報より、さらなる糖鎖修飾部位の探索を行った。酵素反応が行われるクレフトの周囲に糖鎖付加配列を導入し、糖鎖の付加による触媒部位の保護を試みた。まず、PfuBGLの実施例1記載の糖鎖変異導入部位以外の部分において、酵素表面に露出している部分に限定した。次に、糖鎖付加配列であるAsn−Xaa−Thr(N−X−T)の変異を導入しても、立体障害および/または構造的な歪みを生じない位置を探索した。またグルコシダーゼの活性部位を避けた部位において、3点変異導入箇所を選定した。
配列番号6記載の糖鎖付加変異型PfuBGLにおける、実施例17で決定した変異導入箇所に、糖鎖付加配列を導入するために、配列番号57及び配列番号58で示す変異A導入用プライマーを使用して、部位特異的変異導入法によりN型糖鎖付加配列変異の導入を行った。その結果、配列番号51の糖鎖付加変異型PfuBGL2A遺伝子を得た。また、変異Cについては、配列番号59及び配列番号60で示す変異C導入用プライマーを、変異Eについては、配列番号61及び配列番号62で示す変異E導入用プライマーをそれぞれ用いて、同様に部位特異的変異導入法によりN型糖鎖付加配列変異の導入を行い、配列番号53で示す糖鎖付加変異型PfuBGL2C遺伝子、および配列番号55で示す糖鎖付加変異型PfuBGL2E遺伝子をそれぞれ得た。このように調製した糖鎖付加変異型遺伝子を用いて、実施例3と同様の手順を行うことにより、配列番号52で表される糖鎖付加変異型PfuBGL2A、配列番号54で表される糖鎖付加変異型PfuBGL2C、配列番号56で表される糖鎖付加変異型PfuBGL2Eをそれぞれ得た。
実施例4と同様にして、実施例18で得た糖鎖付加変異型グルコシダーゼPfuBGL2A(配列番号52)、糖鎖付加変異型PfuBGL2C(配列番号54)、糖鎖付加変異型PfuBGL2E(配列番号56)の酵素活性を、野生型PfuBGLと比較して測定した。糖鎖付加変異型の酵素活性は、野生型PfuBGLの酵素活性を100としたときの相対活性(%)として表10に示した。
実施例6と同様にして、実施例18で得られた糖鎖付加変異型グルコシダーゼ(PfuBGL2A、PfuBGL2C、PfuBGL2E)を用いて、参考例1で調製したリグノセルロース2(希硫酸処理)の加水分解を行った。反応28時間後におけるグルコース生成量(g/L)を表11に示した。
結晶セルロース(アビセル)及び参考例1で調製したリグノセルロース1〜3に対する糖鎖付加変異型グルコシダーゼの吸着性を評価した。グルコシダーゼは、実施例1で調製した糖鎖付加変異型PfuBGL、および比較例1で調製した野生型PfuBGLを使用しこれらの酵素液は、比活性が等しくなるように調整し、酢酸緩衝液(pH5)を加えて最終濃度100mMとなるように用意した。この酵素液を、それぞれ結晶セルロース、リグノセルロース1〜3に対して最終濃度(固形物濃度)7.5重量%となるように添加し、この混合物を50℃で1時間保温および攪拌した。その後、反応させた混合物を15000rpmで10分遠心分離を行い、その上澄みのセロビオース分解活性を測定した。セロビオース分解活性は、結晶セルロース、リグノセルロース1〜3を含まない酵素液の酵素活性を100として、相対活性(%)で評価した。
糖鎖付加変異型グルコシダーゼの限外濾過膜に対する吸着性の評価を行った。限外濾過膜は、VIVASPIN20(ザルトリウス社、ポリエーテルサルホン製、分画分子量10000Da)を使用した。グルコシダーゼは、実施例1で調製した糖鎖付加変異型PfuBGL、および比較例1で調製したPfuBGLを使用し、これらの酵素液は、比活性が等しくなるように調整し、酢酸緩衝液(pH5)を加えて最終濃度50mMとなるように用意した。この酵素液5mLを限外濾過膜VIVASPIN20に移し、4000Gで10分間遠心分離を行った。遠心分離後、限外濾過膜の非透過側に残った溶液(約100μL以下)に50mM酢酸緩衝液3mLを添加し、限外濾過膜の膜面および容器内壁の残存物をピペッティングにより回収した。回収物した残存物を5mLにメスアップし、10μLをセロビオース分解活性用にサンプリングした。この一連の操作を、7回繰り返し、各回数におけるセロビオース分解活性を、初期活性を100(%)として相対活性(%)で算出した。この結果を、表13に示す。
実施例7で行ったリグノセルロース1−3の加水分解物から、次のように酵素組成物の回収を行った。まず、加水分解物10mLを遠心分離し、5mLの上澄み液を得た。次に上澄み液を、平均細孔径0.2μm精密濾過膜(ミリポア社製、PVDF膜)に通じて濾過し、濾液を回収した。この濾液全量を、限外濾過膜VIVASPIN20(ポリエーテルサルホン製、分画分子量10000Da)に移し、遠心分離を行った。限外濾過膜の非透過側に残った残存物を回収し、セロビオース分解活性を測定した。活性は、投入した酵素活性を初期酵素活性100%として、残存物として回収した酵素組成物の酵素活性を相対値(%)で算出した。
実施例1記載の糖鎖付加PfuBGLの糖鎖構造を解析した。糖鎖付加PfuBGLを−80℃で凍結乾燥したサンプル1.33mgに精製水1.33mLを添加し、1mg/mL試料溶液を調整した。この試料溶液中の中性糖およびアミノ糖の定量を、それぞれ以下の手順で実施した。
1mg/mL試料溶液100μLを試験管に移し、減圧乾固を行い、その後、2Mトリフルオロ酢酸を200μLを添加した。この試験管を窒素置換し、試験管を減圧封管した。その後、100℃で6時間加水分解を行い、その後再度減圧乾固した。得られた残さに精製水200μLを添加し、残さを溶解させた後、0.22μmのフィルターで濾過した。濾液を精製水で10倍希釈したサンプルを以下の条件で分析した。
1mg/mL試料溶液100μLを試験管に移し、減圧乾固を行い、その後、4Mトリ塩酸を200μL添加した。この試験管を窒素置換し、試験管を減圧封管した。その後、100℃で6時間加水分解を行い、その後再度減圧乾固した。得られた残さに精製水200μLを添加し、残さを溶解させた後、0.22μmのフィルターで濾過した。
Claims (12)
- 選択的に糖鎖が付加されてなり、かつグルコシダーゼ活性を有する好熱性菌由来変異型グルコシダーゼの製造方法であって、
(i)元来糖鎖付加配列を持たない好熱性菌由来グルコシダーゼをコードするDNAに、Asn-X-SerまたはAsn-X-Thr(Xはプロリンを除く任意のアミノ酸)をコードするDNA配列を導入し、好熱性菌由来変異型グルコシダーゼをコードするDNAを調製し、さらに該変異型グルコシダーゼをコードするDNAに分泌シグナル配列をコードするDNA配列を付加する、
(ii)該分泌シグナル配列をコードするDNA配列が付加された該変異型グルコシダーゼをコードするDNAを真核微生物に導入し、該変異型グルコシダーゼDNAによってコードされる変異型グルコシダーゼを分泌タンパク質として発現させる、ならびに
(iii)分泌タンパク質として発現された変異型グルコシダーゼを単離・精製する、ことを含む上記方法。 - 糖鎖が、高マンノース型糖鎖である、請求項1に記載の変異型グルコシダーゼの製造方法。
- 好熱性菌由来グルコシダーゼが、スルホロバス属(Sulofolobus)、サーモプラズマ属(Thermoplasma)、カルディビルグラ属(Caldivirgra)、サーモスファエラ属(Thermosphaera)、パイロコッカス属(Pyrococcus)、ピクロフィラス(Picrophilus)属、カルディビルグラ属(Caldivirgra)、フェルビドバクテリウム属(Fervidobacterium)、の群から選ばれる1種に由来するグルコシダーゼである、請求項1または2に記載の変異型グルコシダーゼの製造方法。
- 好熱性菌由来グルコシダーゼが、
(i)配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18または配列番号20に記載のいずれかのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、あるいは
(ii)配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18または配列番号20に記載のいずれかのアミノ酸配列と85%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質である、請求項1から3のいずれか1項に記載の変異型グルコシダーゼの製造方法。 - 真核微生物が、ピキア・パストリスである、請求項1から4のいずれか1項に記載の変異型グルコシダーゼの製造方法。
- 分泌シグナル配列がαファクター分泌シグナル配列である、請求項1から5のいずれか1項に記載の変異型グルコシダーゼの製造方法。
- 好熱性菌由来変異型グルコシダーゼが、配列番号6、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54または配列番号56のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項1から6のいずれか1項に記載の変異型グルコシダーゼの製造方法。
- セルラーゼおよび請求項1から7のいずれか1項に記載の製造方法によって得られた好熱性菌由来変異型グルコシダーゼを含むバイオマス糖化用の酵素組成物。
- セルラーゼが糸状菌由来セルラーゼ混合物である、請求項8に記載のバイオマス糖化用の酵素組成物。
- 糸状菌由来セルラーゼ混合物が、トリコデルマ属由来セルラーゼ混合物である、請求項8または9に記載のバイオマス糖化用の酵素組成物。
- 請求項8から10のいずれか1項に記載の酵素組成物を使用するバイオマスの加水分解方法。
- 前記酵素組成物による加水分解物を限外濾過膜に通じて濾過し、使用後の該酵素組成物を分離回収することを特徴とする、請求項11に記載のバイオマスの加水分解方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012503035A JP5831911B2 (ja) | 2010-03-01 | 2011-01-26 | グルコシダーゼの製造方法、酵素組成物およびバイオマスの加水分解方法 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010044242 | 2010-03-01 | ||
JP2010044242 | 2010-03-01 | ||
JP2012503035A JP5831911B2 (ja) | 2010-03-01 | 2011-01-26 | グルコシダーゼの製造方法、酵素組成物およびバイオマスの加水分解方法 |
PCT/JP2011/051406 WO2011108312A1 (ja) | 2010-03-01 | 2011-01-26 | グルコシダーゼの製造方法、酵素組成物およびバイオマスの加水分解方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2011108312A1 true JPWO2011108312A1 (ja) | 2013-06-24 |
JP5831911B2 JP5831911B2 (ja) | 2015-12-09 |
Family
ID=44541980
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012503035A Expired - Fee Related JP5831911B2 (ja) | 2010-03-01 | 2011-01-26 | グルコシダーゼの製造方法、酵素組成物およびバイオマスの加水分解方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP2543723B1 (ja) |
JP (1) | JP5831911B2 (ja) |
KR (1) | KR20130014516A (ja) |
CN (1) | CN102884184B (ja) |
AU (1) | AU2011222255B2 (ja) |
BR (1) | BR112012021230A2 (ja) |
CA (1) | CA2791495A1 (ja) |
DK (1) | DK2543723T3 (ja) |
ES (1) | ES2544710T3 (ja) |
MY (1) | MY159439A (ja) |
WO (1) | WO2011108312A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102517307B (zh) * | 2011-12-29 | 2013-01-30 | 山东大学 | β-葡萄糖苷酶Mut1b及其表达基因与应用 |
AR091994A1 (es) * | 2012-03-16 | 2015-03-18 | Keclon S A | Metodo de remocion de esteril glicosidos |
JP6330240B2 (ja) * | 2014-12-12 | 2018-05-30 | 本田技研工業株式会社 | 耐熱性β−グルコシダーゼ |
US10590497B2 (en) * | 2016-03-31 | 2020-03-17 | Toray Industries, Inc. | Trichoderma fungus having mutant-type BXL1 gene and method of producing xylooligosaccharide and glucose by using same |
CN110093332B (zh) * | 2018-01-30 | 2021-12-28 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种纤维素酶突变体及其高产菌株 |
CN108588134A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-09-28 | 齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司 | 柠檬酸的提取制备工艺 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5177088B2 (ja) * | 2008-07-15 | 2013-04-03 | 株式会社豊田中央研究所 | ファネロケーテ由来のセロビオヒドロラーゼの利用 |
-
2011
- 2011-01-26 CN CN201180011642.6A patent/CN102884184B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2011-01-26 WO PCT/JP2011/051406 patent/WO2011108312A1/ja active Application Filing
- 2011-01-26 KR KR1020127023914A patent/KR20130014516A/ko not_active Application Discontinuation
- 2011-01-26 CA CA2791495A patent/CA2791495A1/en not_active Abandoned
- 2011-01-26 DK DK11750425.8T patent/DK2543723T3/en active
- 2011-01-26 JP JP2012503035A patent/JP5831911B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2011-01-26 BR BR112012021230A patent/BR112012021230A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2011-01-26 ES ES11750425.8T patent/ES2544710T3/es active Active
- 2011-01-26 MY MYPI2012003904A patent/MY159439A/en unknown
- 2011-01-26 AU AU2011222255A patent/AU2011222255B2/en not_active Ceased
- 2011-01-26 EP EP11750425.8A patent/EP2543723B1/en not_active Not-in-force
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102884184A (zh) | 2013-01-16 |
EP2543723A1 (en) | 2013-01-09 |
CN102884184B (zh) | 2015-12-09 |
ES2544710T3 (es) | 2015-09-03 |
MY159439A (en) | 2017-01-13 |
CA2791495A1 (en) | 2011-09-09 |
KR20130014516A (ko) | 2013-02-07 |
BR112012021230A2 (pt) | 2015-10-27 |
DK2543723T3 (en) | 2015-09-21 |
WO2011108312A1 (ja) | 2011-09-09 |
EP2543723A4 (en) | 2013-08-28 |
AU2011222255A1 (en) | 2012-10-11 |
EP2543723B1 (en) | 2015-06-17 |
AU2011222255B2 (en) | 2014-11-06 |
JP5831911B2 (ja) | 2015-12-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5831911B2 (ja) | グルコシダーゼの製造方法、酵素組成物およびバイオマスの加水分解方法 | |
US9512414B2 (en) | Thermostable beta-glucosidase | |
EP3438263A1 (en) | Trichoderma fungus having mutant-type bxl1 gene and method for producing xylooligosaccharide and glucose by using same | |
US20140127759A1 (en) | Mutant b-glucosidase, enzyme composition for decomposing biomass, and method of producing sugar solution | |
JP6689487B2 (ja) | エンドキシラナーゼ変異体、バイオマス分解用酵素組成物及び糖液の製造方法 | |
US9034627B2 (en) | Method for producing glucosidase, enzyme composition, and method for hydrolyzing biomass | |
US9523108B2 (en) | Thermostable β-xylosidase | |
JP7046370B2 (ja) | キシラナーゼ変異体、及びバイオマス分解用酵素組成物 | |
EP2982751B1 (en) | Hyperthermostable endoglucanase belonging to gh family 12 | |
EP2982750B1 (en) | Hyperthermostable endoglucanase belonging to gh family 12 | |
EP3133155B1 (en) | Hyperthermostable endoglucanase | |
WO2014077264A1 (ja) | バイオマス分解用組成物およびそれを用いた糖液の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131112 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131108 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150210 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150410 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150929 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20151021 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5831911 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |