JP5831911B2 - グルコシダーゼの製造方法、酵素組成物およびバイオマスの加水分解方法 - Google Patents

Description

本発明は、糖鎖付加された好熱性菌由来変異型グルコシダーゼの製造方法、該酵素を含む酵素組成物および該酵素組成物を使用するバイオマスの加水分解方法に関する。

セルロースの糖化には様々な手法があるが、反応条件がマイルドでかつ糖収率の高い酵素糖化法が開発の主流となっている。

セルロース分解酵素であるセルラーゼを大別すると、セルロースの結晶領域に作用するセロビオハイドラーゼ、セルロース分子鎖内部から作用して分子量を低減させるエンドグルカナーゼに分けられる。これらセルラーゼは、生成物の一つであるセロビオースによって阻害を受けることが知られている。またβ-グルコシダーゼは、水溶性オリゴ糖あるいはセロビオースに作用し、そのβ-グリコシド結合を加水分解する反応を触媒する酵素である。特にβ-グルコシダーゼは、発酵原料として有用なグルコースを十分に得るためには必須の酵素である。また、セロビオハイドラーゼあるいはエンドグルカナーゼは、セルロース分解で生成したセロビオースの蓄積により反応阻害が引き起こされることが知られている。すなわち、β-グルコシダーゼは、セルロース分解により生成するセロビオースの蓄積を大幅に低減することができるため、セルロース分解効率を大幅に向上させるといった効果を有する。

セルロースは、草本系植物、木本系植物中に多く含まれ、これら植物を総称してセルロース系バイオマスと呼ぶ。セルロース系バイオマスは、セルロースに加え、キシラン、アラビナンといったヘミセルロース、およびリグニンを含んでいる。特に、セルロース系バイオマス中に含まれるリグニンは、芳香族系の高分子化合物であるため、糸状菌由来セルラーゼを使用した酵素糖化において、阻害的に作用することが知られている。リグニンによる糸状菌由来セルラーゼの阻害機構に関して、すべて解明されている状況ではないが、リグニンにセルラーゼが吸着し、分解効率が低下することが、要因の一つであると言われている（非特許文献１）。

耐熱性酵素は、安定性が高く、高温条件においても長期間活性を保持することから、産業用酵素としての適用が検討されている。こうした耐熱性酵素は、好熱性菌、あるいは超好熱性菌の保有する酵素の中より多くその存在が確認されている。

耐熱性のβ-グルコシダーゼに関しても、数種の好熱性菌あるいは超好熱性菌より同定されており、具体的にはパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、サーモトーガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、スルフォロバス・シバタエ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｈｉｂａｔａｅ）、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）などの微生物より耐熱性のβ-グルコシダーゼが同定されている。

糸状菌由来のセルラーゼあるいはβ-グルコシダーゼは、糖鎖修飾されていることが知られている（非特許文献２）。こうした糖鎖の持つ一般的な機能としては、タンパク質の可溶性向上、物理的安定性の向上、プロテアーゼ耐性向上などの効果が知られている（非特許文献３）。セルラーゼなどの糖化酵素の糖鎖を有する機能としては、キシラナーゼにN型糖鎖を付加することによりその発現量が増大することが開示されている（特許文献１）。

WO/2005/093072

Hetti P.ら,Journal of Biotechnology,107,65-72(2004) Christian P.ら,Trichoderma and Gliocladium:Basic Biology,Taxonomy and Genetics.,vol.1,121-138(1998) H.Ohbaら,Biosci.Biotech.Biochem.,59,1581-1583(1995)

本発明の目的は、糖鎖付加された好熱性菌由来変異型グルコシダーゼを提供し、さらには、本グルコシダーゼとセルラーゼとを混合することで、セルロース、特にリグニンを含有したリグノセルロースの加水分解工程において分解効率の高い酵素組成物を提供することである。

課題を解決する手段

本発明者らは、上記の目的を達成すべく、鋭意研究を重ねた結果、糖鎖付加された好熱性菌由来変異型グルコシダーゼがセルロースの分解に適用できることを見出した。

すなわち、本発明は以下の技術的手段から構成される。

（１）選択的に糖鎖が付加されてなり、かつグルコシダーゼ活性を有する好熱性菌由来変異型グルコシダーゼの製造方法であって、
（i）元来糖鎖付加配列を持たない好熱性菌由来グルコシダーゼをコードするＤＮＡに、Ａｓｎ-Ｘ-ＳｅｒまたはＡｓｎ-Ｘ-Ｔｈｒ（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸）をコードするＤＮＡ配列を導入し、好熱性菌由来変異型グルコシダーゼをコードするＤＮＡを調製し、さらに該変異型グルコシダーゼをコードするＤＮＡに分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を付加する、
（ii）該分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ配列が付加された該変異型グルコシダーゼをコードするＤＮＡを真核微生物に導入し、該変異型グルコシダーゼＤＮＡによってコードされる変異型グルコシダーゼを分泌タンパク質として発現させる、ならびに
（iii）分泌タンパク質として発現された変異型グルコシダーゼを単離・精製する、ことを含む上記方法。

（２）糖鎖が、高マンノース型糖鎖である、（１）の変異型グルコシダーゼの製造方法。

（３）好熱性菌由来グルコシダーゼが、スルホロバス属（Ｓｕｌｏｆｏｌｏｂｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、カルディビルグラ属（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇｒａ）、サーモスファエラ属（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ）、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィラス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）属、カルディビルグラ属（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇｒａ）、フェルビドバクテリウム属（Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、の群から選ばれる１種に由来するグルコシダーゼである、（１）または（２）の変異型グルコシダーゼの製造方法。

（４）好熱性菌由来グルコシダーゼが、
（i）配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０に記載のいずれかのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、あるいは
（ii）配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０に記載のいずれかのアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質である、（１）〜（３）のいずれかのグルコシダーゼの製造方法。

（５）真核微生物が、ピキア・パストリスである、（１）〜（４）のいずれかの変異型グルコシダーゼの製造方法。

（６）分泌シグナル配列がαファクター分泌シグナル配列である、（１）〜（５）のいずれかの変異型グルコシダーゼの製造方法。

（７）好熱性菌由来変異型グルコシダーゼが、配列番号６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４または配列番号５６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、（１）〜（６）のいずれかの変異型グルコシダーゼの製造方法。

（８）セルラーゼおよび（１）〜（７）のいずれかの製造方法によって得られた好熱性菌由来変異型グルコシダーゼを含むバイオマス糖化用の酵素組成物。

（９）セルラーゼが糸状菌由来セルラーゼ混合物である、（８）のバイオマス糖化用の酵素組成物。

（１０）糸状菌由来セルラーゼ混合物が、トリコデルマ属由来セルラーゼ混合物である、（８）または（９）のバイオマス糖化用の酵素組成物。

（１１）（８）〜（１０）のいずれかの酵素組成物を使用するバイオマスの加水分解方法。

（１２）前記酵素組成物による加水分解物を限外濾過膜に通じて濾過し、使用後の該酵素組成物を分離回収することを特徴とする、（１１）のバイオマスの加水分解方法。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-044242号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

本発明により得られる糖鎖付加された好熱性菌由来変異型グルコシダーゼは、セルロース系バイオマスの加水分解において、セルラーゼ混合物に糖鎖付加がなされていない好熱性菌由来グルコシダーゼを使用した場合に比べて、高いセルロース分解効率を得ることができる。その効果は、特にリグノセルロースの加水分解において顕著である。また、本発明の糖鎖付加された好熱性菌由来変異型グルコシダーゼは、セルロース系バイオマス、特にリグノセルロースおよび限外濾過膜に対する吸着性が低く、また加水分解物から糖液を分離するときに使用する限外濾過膜に対する吸着性が低く、加水分解物からの酵素回収性に優れる。

実施例１における、配列番号４のパイロコッカス・フリオサス由来β-グルコシダーゼ（ＰｆｕＢＧＬ）、と配列番号１のトリコデルマ・リーセイ由来β-グルコシダーゼ（ＴｒｉＲｅＢＧＬ）、および配列番号２のアスペルギルス・ニガー由来β-グルコシダーゼ（ＡｓｐＮｇＢＧＬ）とのアライメントを示す図である。配列番号１、配列番号２の糖鎖付加配列を下線にて示し、また配列番号４の糖鎖付加配列導入箇所（Ｈ６０，Ｌ６１，Ｙ６２）についても、同様に下線にて示した。 実施例２における、配列番号６のアミノ酸配列（ｇＰｆｕＢＧＬ）と配列番号８（ＴｈＡｇｇＢＧＹ）、配列番号１０（ＣｍＧＨＦＰ）、配列番号１２（ＳａＢＧＡＬ）、配列番号１４（ＳｓｏＢＧＡＬ）、配列番号１６（ＰｔＢＧＡＬ）、配列番号１８（ＴｖＢＧＡＬ）および配列番号２０（ＦｎＧＨＦＰ）のアミノ酸配列とのアライメント図である。配列番号６における導入された糖鎖付加配列Ａｓｎ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ（Ｎ-Ｒ-Ｔ）を配列中の下線にて示した。さらに、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０における、配列番号６の糖鎖付加部位Ａｓｎ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ（Ｎ-Ｒ-Ｔ）に対応する箇所も、同様に配列中の下線にて示した。 図２−１の続きである。 比較例１において調製したＰｆｕＢＧＬ（左）と、実施例２において調製した糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬのＥｎｄｏＨ処理なし（右）あり（中央）におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動のバンドパターンを示す図である。糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬは、ＥｎｄｏＨ処理による分子量の低下が確認できる。 実施例４における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解におけるＰｆｕＢＧＬのグルコース生成量の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例４における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解における糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬのグルコース生成量の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例５における、リグノセルロース基質にトリコデルマ属由来セルラーゼ＋糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬおよびトリコデルマ属由来セルラーゼ＋ＰｆｕＢＧＬの酵素組成物を作用させた場合のグルコース生成量の変化を比較した結果を示す図である。５ ｗｔ％リグノセルロースを基質とし、反応は５０℃において２８時間まで行い、適宜サンプリングして生成したグルコース濃度の測定を行った。酵素添加量は、セルラーゼ０．５ ｍｇ／ｍＬ、グルコシダーゼ０．００５ ｍｇ／ｍＬ（セルラーゼの１／１００量）である。 Ｎ型糖鎖の基本構造を示す図である。好熱性菌由来グルコシダーゼのＡｓｎ側鎖に対し、２個のＮ−アセチルグルコサミン、さらに３個のマンノースが結合した構造を基本構造とする。 実施例１２における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解におけるＡｇｇＢＧＹの残存活性（保温０時間に対する相対値）の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例１２における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解における糖鎖付加変異型ＡｇｇＢＧＹの残存活性（保温０時間に対する相対値）の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例１２における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解におけるＣｍＧＨＦＰの残存活性（保温０時間に対する相対値）の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例１２における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解における糖鎖付加変異型ＣｍＧＨＦＰの残存活性（保温０時間に対する相対値）の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例１２における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解におけるＳａＢＧＡＬの残存活性（保温０時間に対する相対値）の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例１２における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解における糖鎖付加変異型ＳａＢＧＡＬの残存活性（保温０時間に対する相対値）の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例１２における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解におけるＳｓｏＢＧＡＬの残存活性（保温０時間に対する相対値）の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例１２における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解における糖鎖付加変異型ＳｓｏＢＧＡＬの残存活性（保温０時間に対する相対値）の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例１２における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解におけるＰｔＢＧＡＬの残存活性（保温０時間に対する相対値）の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例１２における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解における糖鎖付加変異型ＰｔＢＧＡＬの残存活性（保温０時間に対する相対値）の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例１２における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解におけるＴｖＢＧＡＬの残存活性（保温０時間に対する相対値）の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例１２における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解における糖鎖付加変異型ＴｖＢＧＡＬの残存活性（保温０時間に対する相対値）の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例１２における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解におけるＦｎＧＨＦＰの残存活性（保温０時間に対する相対値）の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。 実施例１２における、５０〜９０℃の保温時間によりセロビオース分解における糖鎖付加変異型ＦｎＧＨＦＰの残存活性（保温０時間に対する相対値）の変化を測定し、酵素の熱安定性を評価した結果を示す図である。

以下に、本発明を詳細に説明する。

本発明における「グルコシダーゼ」とは、β-グリコシド結合をした二糖を加水分解する活性（すなわち、β-グルコシダーゼ活性）を有する酵素である。ＥＣ番号：ＥＣ ３．２．１．２１として、β-グルコシダーゼに帰属される酵素群が記載されているが、本発明ではＥＣ番号においてβ-グルコシダーゼに帰属されないものの、上記β-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質もグルコシダーゼに含まれるとする。例えば、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、グルコシド結合加水分解酵素ファミリープロテインなどが挙げられる。

本発明における好熱性菌とは、５０℃以上で生育可能な微生物群の総称であり、また特に超好熱性菌とは８０℃以上で生育可能な微生物群のことを指す。該好熱性菌としてはスルホロバス属（Ｓｕｌｏｆｏｌｏｂｕｓ）、サーモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、カルディビルグラ属（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇｒａ）、サーモスファエラ属（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｈａｅｒａ）、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィラス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）属、カルディビルグラ属（Ｃａｌｄｉｖｉｒｇｒａ）、フェルビドバクテリウム属（Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、などを例示することができる。

好熱性菌由来グルコシダーゼは公知であり、例えばGenBankなどにNP_577802として登録されており、本発明においてはこれらを利用することができる。好ましくは、好熱性菌由来グルコシダーゼは、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０で示されるアミノ酸配列を含む。さらに好ましくは、好熱性菌由来グルコシダーゼは、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０で示されるアミノ酸配列からなる。本発明において、好熱性菌由来グルコシダーゼには、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０で示されるアミノ酸配列において１もしくは複数個または１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質も含まれる。ここで「１もしくは数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、10個以内、さらに好ましくは５個以内、特に好ましくは４個以内、あるいは１個又は２個である。また、本発明において、好熱性菌由来グルコシダーゼには、配列番号４、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０で示されるアミノ酸配列とBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、85％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは当該アミノ酸列からなり、かつβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質も含まれる。ここで、「同一性」とは、２つのアミノ酸配列にギャップを導入して、またはギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアライメントにおいて、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（パーセンテージ）を意味する。同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの公知のアルゴリズム）を使用して求めることができる。「β-グルコシダーゼ活性」とは上に定義したとおりであり、当該活性の測定は、例えば５０ ｍＭ 酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解したセロビオースの基質溶液に酵素液を添加し、３０〜８５℃で３０分間反応後、必要によりｐＨを変化させるなどして反応を停止させた後、グルコース定量キットを用いて、反応液中のグルコース濃度を定量することによって行うことができる。

本発明において「好熱性菌由来グルコシダーゼ」には、天然にそのアミノ酸配列中に糖鎖付加配列を有するものは含まれず、天然に糖鎖付加配列を有していないものに限定される。

本発明でいう「糖鎖」とは、単糖がグリコシド結合で連結した構造を有し、その糖鎖の末端は、好熱性菌由来グルコシダーゼのペプチド配列中のアミノ酸側鎖と共有結合している。「糖鎖」の有無は、一般に知られている過ヨウ素酸−シッフ塩基（ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ ｂａｓｅ：ＰＡＳ）反応により、ＳＤＳ電気泳動など分離したグルコシダーゼを染色することで確認できる。

糖鎖は、主にアスパラギンの側鎖と結合するＮ型糖鎖と、セリン、スレオニンの側鎖と結合するＯ型糖鎖とに分類されるが、Ｎ型糖鎖であることが好ましい。Ｎ型糖鎖としては、アスパラギン側鎖に対して、２個のＮ−アセチルグルコサミン、３個のマンノースを基本骨格とした構造を例示することができる（図７）。こうした基本構造に対して、酵素作用によってさらに糖分子が結合することにより、多様な糖鎖構造を構成する。糖鎖構造は、宿主とする微生物の種類、その宿主の培養条件などによって変化する。糖鎖付加された好熱性菌由来グルコシダーゼとは、種々の糖鎖構造が付加した組成物のことを指す。

好熱性菌由来グルコシダーゼに結合した糖鎖がＮ型かＯ型かの確認は、例えば、グルコシダーゼに対し、Ｎ型糖鎖の末端部分を特異的に加水分解するＮ−グリカナーゼとＯ型糖鎖の末端部分を特異的に加水分解するＯ−グリカナーゼとをそれぞれ作用させ、その後ＳＤＳ電気泳動を行い、その分子量の変化を比較することで確認することができる。ここで用いるＮ−グリカナーゼとしては、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来Ｎ−グルコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｌｉｃａｔｕｓ由来エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミダーゼなどを使用することができる。また、Ｏ−グリカナーゼとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来エンド−α−Ｎ−アセチルガラクトサミダーゼなどを使用することができる。

本発明の変異型グルコシダーゼにおける糖鎖は、高マンノース型であることが好ましい。ここでいう高マンノース型は、Ｎ型糖鎖のうち、糖鎖を構成するＮ−アセチルグルコサミンまたはグルコサミン２個に対して、マンノースが４個以上連結した糖鎖のことを指す。マンノース以外の糖として、グルコースなどの他の単糖が含まれていてもよい。グルコースが含まれる場合は、通常、高マンノース型のマンノースの非還元末端部分に結合している。

高マンノース型以外のＮ型糖鎖として、複合型糖鎖が例示できる。複合型では、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン以外の糖として、フルクトース、シアル酸などの多種の糖を構成成分として含む特徴を有する。高マンノース型と比較して、糖鎖に含まれるＮ−アセチルグルコサミンの比率が増加し、Ｎ−アセチルグルコサミン２個に対するマンノースの比率は３個以下になる。

Ｎ型糖鎖が高マンノース型であるか、混合型であるかの確認は、例えば、電気泳動したグルコシダーゼをＰＶＤＦ膜に転写し、糖鎖特異的なレクチンと反応させ、その発色により行うことができる。ここで用いる糖鎖特異的なレクチンとしては、例えば、ビオチン、ＨＲＰ標識を行ったタチナタ豆レクチン（ＣｏｎＡ）、ヒマレクチン（ＲＣＡ１２０）、ハリエニシダレクチン（ＵＥＡ−１）、ピーナッツレクチン（ＰＮＡ）などを使用することができる。ＣｏｎＡで染色できれば、Ｎ型糖鎖のうち高マンノース型であると確認することができ、ＲＣＡ１２０で染色されれば、Ｎ型糖鎖混合型と確認することができる。また、別の判定手法として、十分精製されたグルコシダーゼより糖鎖構成糖を分離し、分離された糖をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ、あるいはＨＰＬＣで分析して構成する単糖成分を定量することで糖鎖構造を確認することができる。

「糖鎖付加配列」とは、真核生物により発現・翻訳される際に糖鎖付加修飾を受ける部位のアミノ酸配列を指す。

糖鎖付加配列は、例えば、Ｎ結合型糖鎖のコンセンサス配列であるＡｓｎ-Ｘ-ＳｅｒもしくはＡｓｎ-Ｘ-Ｔｈｒ（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸）や、Ｏ結合型糖鎖のコンセンサス配列であるＣｙｓ-Ｘ-Ｓｅｒ-Ｘ-Ｐｒｏ-Ｃｙｓ（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸）が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、Ｎ結合型糖鎖のコンセンサス配列である。ここで、プロリンを除く任意のアミノ酸Ｘとしては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。

本発明における糖鎖付加された好熱性菌由来変異型グルコシダーゼ（以下、「変異型グルコシダーゼ」と称する）とは、上記好熱性菌由来グルコシダーゼのアミノ酸配列に、上記糖鎖付加配列を構成するアミノ酸配列が導入された変異型グルコシダーゼであって、該アミノ酸配列に、選択的に糖鎖が付加されたものである。導入される糖鎖付加配列は一つであっても二つ以上であってもよく、その種類は全て同じであっても、複数種の糖鎖付加配列が含まれていても良い。

糖鎖付加配列の導入箇所は、当該導入によって本来の酵素活性が消失しない位置を選択することが好ましい。こうした糖鎖付加配列の導入箇所の決定方法としては、以下の手順１）、手順２）で実施することができる。

手順１）元来糖鎖付加配列を有する糸状菌由来グルコシダーゼと、元来糖鎖付加配列を有さない好熱性菌由来グルコシダーゼのアミノ酸配列アライメント解析を行い、糸状菌由来グルコシダーゼの糖鎖付加配列の好熱性菌由来グルコシダーゼにおける相対的な位置関係を明確にし、糖鎖付加配列の導入箇所を特定する。アライメントツールとしては、ＣｌｕｓｔａｌＷなどの多数の良く知られたソフトウェアを用いることができる。元来糖鎖付加配列を有する糸状菌由来グルコシダーゼとは、好ましくはトリコデルマ属由来グルコシダーゼ、もしくはアスペルギルス属由来グルコシダーゼである。これらの糸状菌由来グルコシダーゼのアミノ酸配列は公知であり、好ましくは配列番号１記載のアミノ酸配列を含むトリコデルマ・リーセイ由来β-グルコシダーゼ、もしくは配列番号２記載のアミノ酸配列を含むアスペルギルス・ニガー由来β-グルコシダーゼを利用する。

手順２）次に上記アライメント解析で、特定された好熱性菌由来グルコシダーゼの糖鎖付加配列の導入箇所が、酵素表面に存在するか確認する。酵素表面にあるか否かは、目的の好熱性菌由来グルコシダーゼの結晶構造を使用して知ることができる。こうした結晶構造は、既知のものであれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースより取得することが可能である。また、実際にＸ線結晶構造解析などを行い、結晶構造を取得してもよい。

本発明では、上記手順１）、手順２）に従って糖鎖付加配列の導入箇所を選定することが好ましいが、別の手法として、下記の手順３）、手順４）に従って選定することもできる。

手順３）ＡＳＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｒｅａ；溶媒露出表面積）解析ソフトウェアを用いてアミノ酸残基のＡＳＡ（Å^２）を求め、その値から好熱性菌由来グルコシダーゼの表面付近に露出したアミノ酸残基を選定する。各アミノ酸残基のＡＳＡは、例えばＡＲＥＡＩＭＯＬ（ｃｃｐ４ ｐａｃｋａｇｅ）（UK Science and Engineering Research Council の CCP4 (Collaborative Computing Project Number 4）、ＳＵＲＦａｃｅ（Barry Honig's group, the Department of Biochemistry and Molecular Biophysics and Center of Computational Biology and Bioinformatics of Columbia）、ＡＳＡＰ（Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland and the ARC Centre in Bioinformatics）などのウェブサイトから入手可能なＡＳＡ解析ソフトウェアを使用することで算出できる。算出されたＡＳＡが１Å^２以上のアミノ酸残基であれば表面に露出している残基と考えられ、糖鎖付加配列の導入箇所としてはＡＳＡが２Å^２以上のアミノ酸残基を選択することが好ましい。特に、Ｎ結合型糖鎖のコンセンサス配列である３アミノ酸残基（Ａｓｎ-Ｘ-ＳｅｒもしくはＡｓｎ-Ｘ-Ｔｈｒ：Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸）を導入するためには、ＡＳＡが２Å^２以上のアミノ酸残基が３残基以上連続する部位を選択することがより好ましい。

手順４）上記手順３で選択された好熱性菌由来グルコシダーゼの糖鎖付加配列導入箇所のうち、好熱性菌由来グルコシダーゼの酵素活性部位から十分距離を有しており、糖鎖付加配列導入により酵素活性低下のおそれのない箇所を選択する。酵素活性部位からの距離は、上記同様に目的の好熱性菌由来グルコシダーゼの結晶構造を使用して知ることができる。具体的には、酵素活性部位から３．５Å以内の距離にあるアミノ酸残基を除外し、これより距離が離れているアミノ酸残基を選択することが好ましい。

例えば、配列番号４のアミノ酸配列で表されるＰｆｕＢＧＬに対して、上記手順３）、手順４）を適用すると、以下のようになる。まず、ＡＲＥＡＩＭＯＬ（ｃｃｐ４ ｐａｃｋａｇｅ）を使用して、溶媒分子１．４Åを前提にＡＳＡを算出し、ＡＳＡが２Å^２以上のアミノ酸残基を抽出する（表１ (i)）。次いで、ＡＳＡが２Å^２以上のアミノ酸残基が３残基以上連続する部位を抽出する（表１ (ii)）。さらに、ＰｆｕＢＧＬの結晶構造情報より、酵素活性部位からの距離が３．５Å以下であるアミノ酸残基を特定して（Ｓ１３、Ｒ７８、Ｎ２０７、Ｉ２６３、I３０３、Ｇ３０４、Ｖ３０５、Ｎ３０６、Ｙ３０７、Ｓ３４３、Ｄ３４４、Ｌ３６７、Ｉ３７０、Ｉ３７１、Ｔ３７２、Ｄ３７８、Ｒ３８４、Ｙ３８７、Ｈ３９１、Ｄ４０４、Ｖ４０５、Ｒ４０６、Ｎ４０７、Ｙ４０８、Ｌ４０９、Ｈ４１０、Ｗ４１１、Ｆ４２７の２３残基）、これらを除外する。以上の結果、糖鎖付加配列導入箇所として選定することができる（表１ (iii)）。

糖鎖付加配列の導入箇所は、１箇所もしくは、２〜５箇所であることが好ましい。

本発明でいう導入とは、上記糖鎖付加配列がポリペプチドとして翻訳されることを指す。すなわち、好熱性菌由来グルコシダーゼの本来のアミノ酸配列において、前述の糖鎖付加配列が、既存のアミノ酸配列と置換されるものでもよく、また、既存のアミノ酸配列に挿入されたものであってもよい。すなわち、置換の場合は、変異前に対してポリペプチド長は変化しないが、挿入の場合は、挿入した糖鎖付配列の長さだけポリペプチド長が増加する。ただし、糖鎖付加配列の導入は、酵素活性の保持という点から、既存のアミノ酸配列との置換であることが好ましい。

また、導入される糖鎖付加配列は、上記糖鎖付加配列のいずれを採用してもよく、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であればいずれも用いることができるが、変異導入による影響が小さいと予想される糖鎖付加配列およびアミノ酸を選択すべきである。例えば、アミノ酸の置換であれば、保存的アミノ酸置換が望ましい。保存的アミノ酸置換は、電気的性質、構造的性質、極性もしくは疎水性、などが類似したアミノ酸間での置換であり、このような類似アミノ酸による置換は、タンパク質の表現型に変化をもたらさないことが予測される。例えば、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ）、分枝鎖アミノ酸（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ)、極性アミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ)、疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）などが挙げられる。

一態様において、上記手法を用いてパイロコッカス・フリオサス由来β-グルコシダーゼのアミノ酸配列（配列番号４）における糖鎖付加配列の導入箇所は、Ｈ６０-Ｌ６１-Ｙ６２と特定することができる（図１）。

また本発明では、前述の方法で糖鎖付加配列の導入箇所を決定した好熱性菌由来グルコシダーゼのアミノ酸配列を利用して、当該アミノ酸配列と高いアミノ酸配列同一性を有する別の好熱性菌由来グルコシダーゼに対しても、糖鎖付加配列の導入箇所を決定することができる。例えば、配列番号４記載のパイロコッカス・フリオサス由来β-グルコシダーゼに関して前述の手法で糖鎖付加配列の導入箇所を決定した後、該配列番号４記載のβ-グルコシダーゼと高い同一性を有するアミノ酸配列を含む別の酵素とアライメント解析を行い、別の酵素のアミノ酸配列上、配列番号４において決定された導入箇所（例えば、Ｈ６０-Ｌ６１-Ｙ６２）に対応する位置を糖鎖付加配列の導入箇所として決定することができる。配列番号４記載のβ-グルコシダーゼと高い同一性を有するアミノ酸配列を含む別の酵素として、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む酵素が例示できる。

一態様において、当該手法を用いて、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０に示されるアミノ酸配列における糖鎖付加配列の導入箇所はそれぞれ、Ｎ６０-Ｌ６１-Ｎ６２、Ｄ６０-Ｌ６１-Ｙ６２、Ｇ６１-Ｎ６２-Ｙ６３、Ｇ６１-Ｎ６２-Ｙ６３、Ｄ５８-Ｌ５９-Ｙ６０、Ｎ６３-Ｎ６４-Ｙ６５およびＫ６３-Ｑ６４-Ｙ６５と特定することができる（図２−１、図２−２）。

一態様において、本発明における変異型グルコシダーゼは、例えば、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明における変異型グルコシダーゼは、例えば、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる。

本発明において、グルコシダーゼ活性とは、セロビオース分解活性のことをいう。すなわち、セロビオースを基質にした際、これを加水分解し、グルコースを生成させる反応を触媒する活性である。本発明の変異型グルコシダーゼは、野生型グルコシダーゼにおけるセロビオース分解活性に対して、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％以上の活性を保有する。セロビオース分解活性は、例えば、１０ｍＭ セロビオース／５０ｍＭ 酢酸緩衝液に対し、変異型グルコシダーゼまたは野生型グルコシダーゼを添加し、５０℃で酵素反応を行い、生成したグルコース量を測定することで、野生型に対する本発明の変異型グルコシダーゼの活性を評価することができる。ここで生成したグルコースは、酵素法、ＨＰＬＣ法など公知の手法に準じて定量することができる。

本発明における変異型グルコシダーゼはいかなる方法によって得られるものであってもよいが、導入された糖鎖付加配列に選択的に糖鎖が付加されるためには、変異型グルコシダーゼをコードするＤＮＡを含む真核細胞を培養することにより提供されることが望ましい。

変異型グルコシダーゼをコードするＤＮＡは以下の方法により作製することができる。すなわち、好熱性菌由来グルコシダーゼのアミノ酸配列において上記の手法により糖鎖付加配列の導入箇所を決定した後、当該グルコシダーゼをコードするＤＮＡ中、当該導入箇所に対応する塩基配列部位に糖鎖付加配列をコードするＤＮＡを導入することによって行う。ここで「ＤＮＡ」には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、遺伝子など、当該グルコシダーゼまたは当該糖鎖付加配列をコードする任意の核酸が含まれる。

好熱性菌由来グルコシダーゼをコードするＤＮＡとしては、上記好熱性菌由来グルコシダーゼをコードするＤＮＡ、例えば、配列番号３、７、９、１１、１３、１５、１７および１９に示される塩基配列を含む、好ましくは当該塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。また、好熱性菌由来グルコシダーゼをコードするＤＮＡには、配列番号３、７、９、１１、１３、１５、１７および１９に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な塩基配列を含み、好ましくは当該塩基配列からなり、かつβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。ストリンジェント条件は、低ストリンジェント条件、中ストリンジェント条件または高ストリンジェント条件のいずれでもよい。そのような条件は、例えば、２〜５×ＳＳＣ、０．２ ％ ＳＤＳ（ここで、１×ＳＳＣは、１５０ ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を指す）中、４５〜７０ ℃でのハイブリダイゼーションを行ったのち、０．１〜１×ＳＳＣ、０．１〜０．２％ ＳＤＳを用いて、４５〜６５ ℃で洗浄を行うことを含む。ストリンジェント条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら, Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓなどに記載されている。さらに、好熱性菌由来グルコシダーゼをコードするＤＮＡには、配列番号３、７、９、１１、１３、１５、１７および１９に示される塩基配列において、１もしくは複数個または１もしくは数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。ここで「１もしくは数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、10個以内、さらに好ましくは５個以内、特に好ましくは４個以内、あるいは１個又は２個である。またさらに、好熱性菌由来グルコシダーゼをコードするＤＮＡには、配列番号３、７、９、１１、１３、１５、１７および１９に示される塩基配列とBLAST等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、85％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列を含み、好ましくは当該塩基配列からなり、かつβ-グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。

糖鎖付加配列をコードするＤＮＡとしては、上記糖鎖付加配列をコードするＤＮＡが挙げられ、宿主生物や遺伝暗号の縮重などを考慮して適宜決定することができる。

糖鎖付加配列をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲによる特異的変異導入法などの公知の手法によってグルコシダーゼをコードするＤＮＡへ導入することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）。

一態様において、変異型グルコシダーゼをコードするＤＮＡとしては、配列番号５に示される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。好ましくは、変異型グルコシダーゼをコードするＤＮＡとしては、配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。配列番号５において糖鎖付加配列をコードするＤＮＡは178-186位に−aaccgcact−として導入されている。

さらに、宿主に合った分泌シグナル配列をコードするＤＮＡを上記変異型グルコシダーゼにコードするＤＮＡに付加しても良い。分泌シグナル配列は、変異型グルコシダーゼにコードするＤＮＡの５’末端側、３’末端側に適宜付加することができるが、好ましくは５’末端側に付加する。分泌シグナル配列をコードするＤＮＡは、予め発現ベクターに組み込まれていても良い。例えば、宿主が酵母である場合、αファクターシグナル配列、α-アミラーゼシグナル配列、グルコアミラーゼシグナル配列、血清アルブミンシグナル配列、イヌリナーゼ由来シグナル配列、インベルターゼシグナル配列、キラータンパク質シグナル配列、リゾチウムシグナル配列などが用いられる。特にピキア・パストリスでは、αファクター分泌シグナル配列が好ましい。αファクター分泌シグナル配列は公知であり、例えばGenBankなどにNP_015137として登録されており、本発明においてはこれらを利用することができる。

宿主としてトリコデルマ属を使用する場合は、セルラーゼ関連シグナル配列を使用することができる。トリコデルマ属は、セルラーゼとして、セロビオハイドラーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ、キシロシダーゼ、キシログルカナーゼなどを細胞外に分泌する特徴を有しており、これらの酵素はそれぞれ分泌シグナル配列を有している。こうしたシグナル配列は公知であり、これらのシグナル配列を含むペプチド配列を変異型グルコシダーゼに対して機能的に連結して使用することができる。

上記のようにして調製した、真核細胞による糖鎖付加を受けうる１以上の糖鎖付加配列を含む、変異型グルコシダーゼをコードするＤＮＡを、制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて、適当な発現ベクター中のプロモーター下流に連結することにより、該ＤＮＡを含む発現ベクターを製造することができる。

発現ベクターとしては、細菌プラスミド、酵母プラスミド、ファージＤＮＡ（ラムダファージなど）、レトロウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０の誘導体など、植物細胞用のベクターとしてのアグロバクテリウムなどが挙げられるが、宿主細胞において複製および生存可能かつ糖鎖付加が可能である限り他のいかなるベクターを用いることができる。例えば、宿主が酵母である場合、ｐＰｉｎｋ-ＨＣ、ｐＰｉｎｋ-ＬＣ、ｐＰｉｎｋα-ＨＣ、ｐＰＣＩＺ、ｐＰＣＩＺα、ｐＰＣＩ６、ｐＰＣＩ６α、ｐＦＬＤ１、ｐＦＬＤ１α、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ９などが挙げられる。

プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。構成的なプロモーター、誘導的なプロモーターのいずれであってもよい。例えば、宿主が酵母である場合、ＡＯＸ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＡＤＥ２プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＧＡＬ−Ｌ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＹＰＴ１プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＦＬＤプロモーターなどが挙げられる。

本発明に用いる宿主細胞としては、糖鎖付加機構を有するものであればいかなる宿主細胞でもよいが、例えば酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などが好ましい。酵母細胞としては、例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などが挙げられる。真菌細胞としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などが挙げられる。昆虫細胞としてはＳｆ９など、植物細胞としては双子葉植物など、動物細胞としては、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３などが挙げられる。より好ましくは酵母細胞であり、さらに好ましくはピキア・パストリスである。

形質転換または、トランスフェクションは、リン酸カルシウム法、電気穿孔法などの公知の方法で行うことができる。変異型グルコシダーゼは、上記のように形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞においてプロモーターの制御下にて発現させ、産生した変異型グルコシダーゼを回収して得ることができる。発現に際しては、宿主細胞を適切な細胞密度まで増殖または成長させた後、温度シフトまたはイソプロピル-１-チオ-β-Ｄ-ガラクトシド（ＩＰＴＧ）添加などの化学的誘発手段によってプロモーターを誘発させ、細胞をさらに一定期間培養する。

変異型グルコシダーゼが細胞外に排出される場合には、培地から直接に、また細胞外に存在する場合には、超音波破砕や機械的破砕などの物理的手段もしくは細胞溶解剤などの化学的手段によって、細胞を破壊した後に変異型グルコシダーゼを精製する。変異型グルコシダーゼは、組換え細胞の培地から、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、電気泳動などの技術を組み合わせて、部分的にまたは完全に精製することができる。

本発明の変異型グルコシダーゼは、セルロース系バイオマスの加水分解において、セルラーゼ混合物に糖鎖付加がなされていない好熱性菌由来グルコシダーゼを使用した場合に比べて、高い熱安定性を有し、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍またはそれ以上の高いセルロース分解効率を得ることができる。本発明の変異型グルコシダーゼは、セルロース系バイオマスとして、リグニン成分を含むセルロース系バイオマス、リグニン成分をほとんど含まないアビセル、ソルカフロック、工業用パルプなどに適用できるが、特にリグニン成分を含むセルロース系バイオマスにおいて顕著なセルロース分解効率を得ることができる。

上記のようにして取得された変異型グルコシダーゼは、セルラーゼと混合することで、バイオマス糖化用の酵素組成物として使用することができる。ここでいうセルラーゼとは、セルロースを分解する活性を有する酵素であれば特に限定されず、一種類以上の混合物であってもよい。このような酵素としては、例えばセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼなどが挙げられる。

本発明で使用するセルラーゼは、好ましくは糸状菌由来セルラーゼ混合物である。糸状菌由来セルラーゼ混合物は、少なくともエンドグルカナーゼおよびセロビオハイドラーゼの双方を含んでなる混合物である。さらに効率的なセルロースの糖化を行うためには、エンドグルカナーゼに関して２種以上、および／または、セロビオハイドラーゼに関して２種以上含んでなる糸状菌由来セルラーゼ混合物であることが好ましい。前記糸状菌セルラーゼ混合物を生産する微生物として、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、などの微生物を挙げることができる。これら微生物は、培養液中にセルラーゼを産生するために、その培養液を未精製の糸状菌セルラーゼ混合物としてそのまま使用してもよいし、また培養液を精製し、製剤化したものを糸状菌セルラーゼ混合物として使用してもよい。糸状菌セルラーゼ混合物として、同時に微生物が産生したβ-グルコシダーゼが含まれる場合もあるが、セルロース分解において、量的に十分量存在しないこと、後述のパイロコッカス属由来β-グルコシダーゼと明確に区別することが可能であることから、本発明では、セルラーゼ生産微生物に由来するβ-グルコシダーゼは、セルラーゼに含まれるものとする。前記培養液より、糸状菌セルラーゼ混合物を精製し、製剤化したものとして使用する場合、プロテアーゼ阻害剤、分散剤、溶解促進剤、安定化剤など、酵素以外の物質を添加したものを、セルラーゼ製剤として使用してもよい。

本発明で使用する糸状菌セルラーゼ混合物は、トリコデルマ属が産生するセルラーゼ混合物であることが好ましい。トリコデルマ属は、少なくとも２種以上のエンドグルカナーゼ、および、少なくとも２種以上のセロビオハイドラーゼを含んでなるセルラーゼ混合物を培養液中に産生し、こうした培養液より調製されたセルラーゼ混合物は本発明に好ましく使用することができる。こうしたトリコデルマ属のうち、より好ましくは、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼ混合物である。トリコデルマ・リーセイ由来のセルラーゼ混合物としては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ-３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ Ｒｕｔ-３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３-７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ３-７）、トリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６６５８９、トリコデルマ・リーセイＣＬ-８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＣＬ-８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ ＱＭ９１２３）に由来するセルラーゼ混合物が挙げられる。また、前記トリコデルマ属に由来し、変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、セルラーゼ生産性が向上した変異株であってもよい。

本発明で使用するトリコデルマ属由来セルラーゼ混合物は、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼなどの複数の酵素成分を含む酵素組成物である。トリコデルマ属由来セルラーゼ混合物は、セルロース分解において複数の酵素成分の協奏効果または補完効果により効率的なセルロースの加水分解を実施することができる。

セロビオハイドラーゼは、セルロースの末端部分から加水分解していくことを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．９１としてセロビオハイドラーゼに帰属される酵素群が記載されている。

エンドグルカナーゼは、セルロース分子鎖の中央部分から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４、ＥＣ３．２．１．６、ＥＣ３．２．１．３９、ＥＣ３．２．１．７３としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。

エキソグルカナーゼは、セルロース分子鎖の末端から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．７４、ＥＣ３．２．１．５８としてエキソグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。

βグルコシダーゼは、セロオリゴ糖あるいはセロビオースに作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．２１としてβグルコシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。

キシラナーゼは、ヘミセルロースあるいは特にキシランに作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．８としてキシラナーゼに帰属される酵素群が記載されている。

キシロシダーゼは、キシロオリゴ糖に作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．３７としてキシロシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。

本発明では、セルロース含有バイオマスを酵素反応の基質とする。セルロース含有バイオマスとは、広く植物バイオマスに由来するセルロースである。さらに具体的には、バガス、コーンストーバー、コーンコブ、スイッチグラス、稲藁、麦藁、樹木、木材、廃建材、新聞紙、古紙、パルプなどである。これらセルロース含有バイオマスは、高分子芳香族化合物リグニンやヘミセルロースなどの不純物が含まれているが、前処理として、酸、アルカリ、加圧熱水などを用いて、リグニンやヘミセルロースを部分的に分解したセルロース含有バイオマスを、セルロースとして利用してもよい。ここでは、前記前処理を施したセルロース含有バイオマスを「リグノセルロース」とし、酵素反応基質として用いることができる。

本発明で用いるセルロース含有バイオマスとしては、公知の手法により、アンモニア処理、希硫酸処理、水熱処理等の前処理を行ったものを用いることができる。

アンモニア処理は、特開２００８−１６１１２５号公報および特開２００８−５３５６６４号公報に記載の方法を適用することができる。具体的には、バイオマスに対して０．１〜１５重量％の濃度のアンモニアを添加し、４〜２００℃、好ましくは９０〜１５０℃で処理する。添加するアンモニアは液体状態または気体状態のどちらであってもよい。液体状態の場合は、液体アンモニア、アンモニア水溶液のいずれでもよい。処理回数は特に限定されず、１回以上行えばよい。処理を２回以上行う場合は、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。アンモニア処理によって得られた処理物は、加水分解反応を行う前に、アンモニアの中和またはアンモニアの除去を行う必要がある。中和は、固形分を含んだままの状態で行っても、固形分を分離した液体画分に対して行ってもよい。中和に使用する酸試薬は特に限定されない。アンモニア処理物を減圧状態に保つことでアンモニアを気体状態に揮発させて除去することもでき、この場合除去したアンモニアは、回収再利用してもよい。

水熱処理は、例えば、セルロース含有バイオマスが、０．１〜５０重量％となるよう水を添加後、１００〜４００℃の温度で、１秒〜６０分処理する。処理回数は特に限定されず、１回以上行えばよい。処理を２回以上行う場合は、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。

希硫酸処理は、例えば、硫酸の濃度は０．１〜１５重量％であることが好ましく、０．５〜５重量％であることがより好ましい。反応温度は１００〜３００℃の範囲で設定することができ、１２０〜２５０℃で設定することが好ましい。反応時間は１秒〜６０分の範囲で設定することができる。処理回数は特に限定されず、処理を１回以上行えばよい。処理を２回以上行う場合、１回目と２回目以降の処理を異なる条件で実施してもよい。希硫酸処理によって得られた加水分解物は、酸を含んでいるので、加水分解反応で用いる前に中和を行う必要がある。

本発明におけるセルロース含有バイオマスの酵素処理条件は、糸状菌由来セルラーゼと本発明の変異型グルコシダーゼを含むバイオマス糖化用酵素組成物を使用する場合、処理温度４０℃〜６０℃、処理ｐＨ３〜７、セルロース含有バイオマス固形分濃度０．１〜３０％が好ましい。該範囲に設定することにより、糸状菌由来セルラーゼおよび好熱性菌由来グルコシダーゼのセルロース分解効率を最大限発揮することができる。好熱性菌由来グルコシダーゼは、本来、反応最適温度は１００℃付近の酵素もあるが、本発明で使用する好熱性菌由来グルコシダーゼは、４０℃〜６０℃においても十分高い比活性を示し、糸状菌由来セルラーゼ共存下で、セルロース含有バイオマスの分解を効率的に行うことが可能である。この酵素処理は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。

本発明の変異型グルコシダーゼを含むバイオマス糖化用酵素組成物はβグルコシダーゼ活性が高いため、これを使用してセルロース系バイオマスを加水分解して得られた糖液はセロビオース含量が少なく、グルコースが多いという特徴を有している。したがって、本発明のバイオマス糖化用酵素組成物を使用して得られた糖液は、微生物や培養細胞の生育またはこれらを用いる発酵生産の炭素源として好ましく利用することができる。ここで使用される微生物あるいは培養細胞は、例えば、発酵工業において使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物や細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。また、セルロース含有バイオマスに由来する糖液には、キシロース等のペントースを含むため、ペントースの代謝経路を強化した微生物を好ましく使用できる。また、こうした糖液を発酵原料として、化学品を製造することができる。化学品の具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。例えば、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオール、グリセロールなどのアルコール、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸などの有機酸、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、カダベリンなどのアミン化合物を挙げることができる。さらに、酵素、抗生物質、組換えタンパク質などの生産に適用することも可能である。

本発明のバイオマス糖化用酵素組成物を使用してセルロース系バイオマスを加水分解して得られた糖液は、必要に応じて未分解の固形物を除去したものを糖液として使用してもよいし、固形物を含むまま糖液として使用してもよい。

本発明のバイオマス糖化用酵素組成物を使用するバイオマスの加水分解方法では、セルロース含有バイオマスの酵素処理で得られた糖液から、使用した酵素組成物を分離して回収することができる。分離回収する方法は、特に限定されないが、本発明の変異型グルコシダーゼは、糖鎖を有さない従来のグルコシダーゼと比べて、セルロース含有バイオマス、特にリグノセルロースに対する吸着性、また限外濾過膜に対する吸着性が大幅に低下しているといった特徴と有する。したがって、使用した酵素組成物の分離回収には、加水分解物を必要により固液分離し、得られた糖液を限外濾過膜に通じて濾過し、非透過液として酵素組成物を分離回収する方法を好ましく用いることができる。

本発明のバイオマスの加水分解方法における、固液分離の手法としては、濾過法、遠心分離法のいずれも用いることができる。こうした固液分離を行う装置として、ベルトフィルター、スクリューデカンタ、連続遠心機、フィルタープレス、ドラムフィルターなどを例示できるが、これらに限定されるものではない。

本発明のバイオマスの加水分解方法において、酵素組成物の分離回収に使用する限外濾過膜としては、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリフッ化ビニルデン（ＰＶＤＦ）、再生セルロース、セルロース、セルロースエステル、スルホン化ポリスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリ４フッ化エチレン、などを膜素材とするものを使用することができる。これらのなかでも、セルロース以外の合成高分子を限外濾過膜の膜素材とするものが長期使用の観点で好ましい。一般に、合成高分子を膜素材とする限外濾過膜は、酵素（タンパク質）の膜への吸着性が高いという課題を有しているが、本発明において分離回収される酵素組成物は、糖鎖付加の効果によって吸着性が低減しているため、好ましく使用することができる。本発明に使用する限外濾過膜の分画分子量は、５００Ｄａ〜１０００００Ｄａの限外濾過膜を使用することができる。このうち、特に、本発明の変異型グルコシダーゼおよび糸状菌由来セルラーゼ成分の双方の分離回収性が高い、分画分子量１００００Ｄａ〜３００００Ｄａの範囲の限外濾過を最も好ましく使用することができる。

限外濾過膜による濾過方式として、デッドエンドろ過、クロスフローろ過があるが、膜ファウリング抑制の観点から、クロスフローろ過であることが好ましい。また使用する限外ろ過膜の膜形態としては、平膜型、スパイラル型、チューブラー型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。具体的には、ＤＥＳＡＬ社のＧ−５タイプ、Ｇ−１０タイプ、Ｇ−２０タイプ、Ｇ−５０タイプ、ＰＷタイプ、ＨＷＳ ＵＦタイプ、ＫＯＣＨ社のＨＦＭ−１８０、ＨＦＭ−１８３、ＨＦＭ−２５１、ＨＦＭ−３００、ＨＦＭ−１１６、ＨＦＭ−１８３、ＨＦＭ−３００、ＨＦＫ−１３１、ＨＦＫ−３２８、ＭＰＴ−Ｕ２０、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｐ、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｓ、Ｓｙｎｄｅｒ社のＳＰＥ１、ＳＰＥ３、ＳＰＥ５、ＳＰＥ１０、ＳＰＥ３０、ＳＰＶ５、ＳＰＶ５０、ＳＯＷ３０、旭化成社製のマイクローザ（登録商標）ＵＦシリーズ分画分子量３０００から１０００００に相当するもの、日東電工株式会社製のＮＴＲ７４１０、ＮＴＲ７４５０などが挙げられる。

以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。

［比較例１］パイロコッカス・フリオサス由来β-グルコシダーゼの調製（１）
超好熱性古細菌パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来β-グルコシダーゼ（以下、「ＰｆｕＢＧＬ」と称する）は、１００℃以上で活性をもつほどの耐熱性を有し、種々のセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生産するためセルロース系バイオマスの有効利用に期待されている。

ＰｆｕＢＧＬ遺伝子は、配列番号３記載の遺伝子を全合成し、ｐＥＴ−１１ｄのＮｃｏIおよびＢａｍＨＩにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）を使用して連結し、ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ）に形質転換した。スクリーニングは、アンピシリンを抗生物質として含むＬＢ寒天培地を用いて行った。形質転換されたＪＭ１０９株より、作製したベクターｐＥＴ-ＰｆｕＢＧＬをミニプレップキット(キアゲン)により単離し、塩基配列解析を行った。ｐＥＴ-ＰｆｕＢＧＬは、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に形質転換し、ＢＬ２１-ＰｆｕＢＧＬ株を作製した。ＢＬ２１-ＰｆｕＢＧＬ株を、アンピシリン含有ＬＢ培地１０ｍＬに植菌し、３７℃で一晩振とう培養（前培養）を行った。本培養として、アンピシリン含有ＬＢ培地１Ｌに、前培養で得られた菌体を植菌し、波長６００ ｎｍでの吸光度ＯＤ６００が０．８となるまで振とう培養を行った。その後、最終濃度が０．４ｍＭになるようにイソプロピル-１-チオ-β-Ｄ-ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加え、さらに２５℃で一晩培養した。培養後、菌体を遠心分離により回収し、 ５０ｍＭ トリス-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に再懸濁した。この溶液を氷冷しながら、超音波破砕を行い、その上清を無細胞抽出液として遠心分離により回収した。得られた無細胞抽出液を、８５℃で１５分保温し、該グルコシダーゼ以外の大腸菌に由来するタンパク質を凝集沈殿した。遠心分離により沈殿物を除去し、上清を分画分子量１００００の再生セルロース製透析膜（スペクトラム・ラボラトリーズ製）を使用して、５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に透析した。得られたタンパク質溶液を、野生型のＰｆｕＢＧＬとして使用した。

［実施例１］ＰｆｕＢＧＬにおけるＮ型糖鎖付加配列の導入箇所の決定
まず、ＰｆｕＢＧＬの糖鎖付加配列の導入箇所を検索するための、一次配列の決定と三次元構造の決定を試みた。

ＰｆｕＢＧＬのホモログに対するアライメントを行うため、ホモログ検索サーバＦＵＧＵＥを利用した。その結果、ＰｆｕＢＧＬはＧｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ１に対し、配列の類似性を示すＺＳＣＯＲＥが７１．６５と最高値を示した（ＺＳＣＯＲＥ＞＝６．０で９９％ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ）得られたＧｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ１のアライメントを整形するため、ＪＯＹサーバを利用した。その結果、アスペルギルス・ニガー由来β-グルコシダーゼ（ＡｓｐＮｇＢＧＬ）およびトリコデルマ・リーセイ由来β-グルコシダーゼ（ＴｒｉＲｅＢＧＬ）が有する３箇所のＮ型糖鎖付加配列の位置に対応するＰｆｕＢＧＬの配列は、Ｎ型糖鎖付加配列ではないことが判明した（Ｈ６０，Ｌ６１，Ｙ６２とＮ１４８，Ｌ１４９，Ｙ１５０とＮ３７４，Ｇ３７５，Ｍ３７６の３箇所）。

ＰｆｕＢＧＬのＸ線結晶構造は、不完全なものが報告されているが（Ｔｈｉｊｉｓ Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．１７（２０００））分解能が３．３ Åと低く、完全な構造モデル構築には至っていない。またＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）への登録もされていない。そこで、ＰｆｕＢＧＬの三次元構造を決定するため、新たな結晶条件で詳細なＸ線結晶構造解析を試みた。新たな結晶化条件を探索し、リン酸を沈殿剤として結晶化に成功した。大型放射光実験施設ＳＰｒｉｎｇ-８でＸ線回折実験を行い、分解能２．５ÅでＰｆｕＢＧＬの構造を決定し、ＰｆｕＢＧＬの完全なモデル構築に成功した。構造決定は分子置換法を用い、モデル分子には配列番号８記載のサーモスファエラ・アグリガンズ（Ｔｈｅｍｏｓｐｈａｅｒａ ａｇｇｒｅｇａｎｓ）由来β-グルコシダーゼ（ＴｈＡｇｇＢＧＹ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＱＶＢ）を用いた。

このようにして得られたＰｆｕＢＧＬの三次元構造から、Ｎ型糖鎖付加配列の位置に対応する上記３箇所のうち、酵素表面に露出し、かつ活性部位に近接しておらず酵素活性への影響が小さいと考えられる部位はＨ６０，Ｌ６１，Ｙ６２の部位のみであった。従って、この部分をＮ型糖鎖付加配列の導入箇所とし、Ｈ６０Ｎ，Ｌ６１Ｒ，Ｙ６２Ｔの変異を置換により導入することによって糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬとして配列番号６記載のアミノ酸配列を得た。

［実施例２］ＰｆｕＢＧＬとアミノ酸配列の類似したグルコシダーゼにおけるＮ型糖鎖付加配列の導入箇所の決定
実施例１で得られた配列番号６に対して、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０のアライメントを行うため、当該業者に良く知られたソフトウェアである、ＣｌｕｓｔａｌＷおよびＢＯＸＳＨＡＤＥを用いてアライメントを整形した（図２−１、図２−２）。配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０について、配列番号６の糖鎖付加配列Ａｓｎ-Ａｒｇ-Ｔｈｒ（Ｎ-Ｒ-Ｔ）に対応する箇所を、各配列への糖鎖付加配列の導入箇所として決定した。

［実施例３］糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬの調製（１）
配列番号６記載の糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬの調製を行った。

まず、実施例１で決定した糖鎖付加配列を配列番号４記載のＰｆｕＢＧＬへ導入するための変異導入用プライマー５’-ＣＣＡＣＡＴＡＴＴＧＧＣＡＣＣＴＣＴＡＴＡＡＧＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧ-３’（配列番号２１）および５’-ＣＡＴＧＡＴＣＴＴＧＣＴＴＡＧＴＧＣＧＧＴＴＣＣＡＡＴＡＴＧＣＴＧＧ-３’（配列番号２２）を使用して、部位特異的変異導入法によりＮ型糖鎖付加配列変異の導入を行った。得られた遺伝子のシークエンスを確認後、αファクター分泌シグナル配列を予め含む酵母発現用ベクターｐＰＩＣ９のＥｃｏＲＩとＮｏｔ Ｉサイトの間に挿入した。変異導入後の遺伝子は大腸菌に形質転換した後、目的の変異を含む遺伝子を持つコロニーを、シーケンサーを用いて確認した。

一般的な手法を用いて作成した酵母コンピテントセルに変異体プラスミドを混合して、ＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲII（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて形質転換を行った。条件は１．７ｋＶ、２５μＦ、２００Ωで行った。形質転換後の酵母はＲＤＢプレートにストリークした。３日後にプレート上に現れたコロニーから１０個を選び、発現確認を行った。ポリアクリルアミドゲル電気泳動による目的タンパク質の発現確認ができたクローンを選択した。

シード培養として、プレート上のコロニーより２ｍＬのＢＭＧＹ培地に酵母を植菌し２日間培養した。次に、本培養として、１ ＬのＢＭＧＹ培地に酵母シード培養液２ｍＬを加え、２日間培養し十分に酵母を増殖させた。一度培養液１Ｌを遠心により酵母を沈殿させ、ＢＭＧＹ培地を２％メタノール含有ＢＭＭＹ培地に交換した。その後菌体を培地に再懸濁した後、４８時間の培養を行った。発現タンパク質を含む培地を遠心により回収し、フィルター濾過後、７０％（ｗ／ｖ）硫安による硫安沈殿を行った。沈殿を遠心で回収した後、バッファーに溶解し、その後透析して目的タンパク質を得た。

得た酵素のＥｎｄｏＨ処理を行い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った（図３）。ＥｎｄｏＨ処理前後でのバンドシフトによって、Ｎ型糖鎖が付加された糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬを作製したことを確認した。

［実施例４］糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬの酵素活性（２）
糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬと、ＰｆｕＢＧＬのβ-グルコシダーゼ活性を比較した。基質に１０ｍＭ セロビオース／５０ｍＭ 酢酸緩衝液を用い、それぞれ実施例２、比較例１で調製した酵素を終濃度０．２３ｍｇ／ｍLで添加し、５０℃で酵素反応を行った。生成物の定量には、グルコーステストワコーＩＩ（Ｗａｋｏ）を用いた。

β-グルコシダーゼ活性1ユニット（Ｕ）は、下記の式に準じて算出した。

β-グルコシダーゼ活性1ユニット（Ｕ）＝反応終了時に生成したグルコース濃度（ｇ／Ｌ）×１０００／１８０／３０

さらに、β-グルコシダーゼ活性を、β-グルコシダーゼ量（ｍｇ）当たりの比活性を下記の式で算出した。

β-グルコシダーゼ比活性（Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）＝β-グルコシダーゼ活性（Ｕ）／活性測定に添加したβ-グルコシダーゼ量（ｍｇ）

反応後の各グルコース生成量は、ＰｆｕＢＧＬが１．５８ｇ／L、糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬが１．３４ｇ／Lであった。また、ＰｆｕＢＧＬの比活性に対する糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬの比活性は８５％と、実施例１にて決定した箇所への糖鎖付加配列変異の導入は、酵素活性を喪失させないことが明らかであり、ＰｆｕＢＧＬの代替として糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬが利用できることが確認された。

［実施例５］糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬの熱安定性
それぞれ５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃での保温状態における２４時間までのグルコース生成量の変化を測定した。

それぞれ実施例２、比較例１で調製した酵素（タンパク質濃度１．０ｍｇ／ｍL）を、それぞれ５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃で保温した。各保温時間につき、基質１０ｍＭ セロビオース／５０ｍＭ 酢酸緩衝液を添加し、保温温度にて３０分間の酵素反応を行った。反応後の溶液を回収し、グルコーステストワコーＩＩ（Ｗａｋｏ）を用いて生成物の定量を行った（図４、図５）。

２４時間までの保温では、ＰｆｕＢＧＬよりも糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬの方が、高い温度における酵素失活が低減していた。このことから、糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬは、ＰｆｕＢＧＬよりも高い耐熱性を獲得し、酵素の安定性が向上したことが確認された。

［参考例１］リグノセルロースの調製
糖鎖付加した変異型グルコシダーゼを含む酵素組成物を用いた加水分解に使用するリグノセルロース１〜３を次のように調製した。

１．リグノセルロース１の調製（アンモニア処理）
セルロースとして、稲藁を使用した。前記セルロースを小型反応器（耐圧硝子工業製、ＴＶＳ−Ｎ２ ３０ｍｌ）に投入し、液体窒素で冷却した。この反応器にアンモニアガスを流入し、試料を完全に液体アンモニアに浸漬させた。リアクターの蓋を閉め、室温で１５分ほど放置した。次いで、１５０℃のオイルバス中にて１時間処理した。処理後、反応器をオイルバスから取り出し、ドラフト中で直ちにアンモニアガスをリーク後、さらに真空ポンプで反応器内を１０Ｐａまで真空引きし乾燥させた。これをリグノセルロース１として以下の実施例に使用した。

２．リグノセルロース２の調製（希硫酸処理）
セルロースとして、稲藁を使用した。セルロースを硫酸１％水溶液に浸し、１５０℃で３０分オートクレーブ処理（日東高圧製）した。処理後、固液分離を行い、硫酸水溶液（以下、希硫酸処理液）と硫酸処理セルロースに分離した。次に硫酸処理セルロースと固形分濃度が１０重量％となるように希硫酸処理液と攪拌混合した後、水酸化ナトリウムによって、ｐＨを５付近に調製した。これをリグノセルロース２として以下の実施例に使用した。

３．リグノセルロース３の調製（水熱処理）
セルロースとして、稲藁を使用した。前記セルロースを水に浸し、撹拌しながら１８０℃で２０分間オートクレーブ処理（日東高圧株式会社製）した。その際の圧力は１０ＭＰａであった。処理後は溶液成分（以下、水熱処理液）と処理バイオマス成分に遠心分離（３０００Ｇ）を用いて固液分離した。この処理バイオマス成分をリグノセルロース３として以下の実施例に使用した。

［実施例６］糸状菌由来セルラーゼ混合物と糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬから成る酵素組成物を用いたリグノセルロースの加水分解（１）
リグノセルロース基質に該酵素組成物を作用させた場合のグルコース生成量の変化を比較した。５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に５ｗｔ％のリグノセルロース１（参考例１で調製）を懸濁したものを基質とした。反応は５０℃において２８時間まで行い、適宜サンプリングして生成したグルコース濃度の測定を行った（図６）。糸状菌由来セルラーゼ混合物としては、市販のトリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ（セルクラスト、シグマ）を用いた。グルコシダーゼとしては、実施例２で調製した糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬと比較例１で調製したＰｆｕＢＧＬをそれぞれ用いた。酵素添加量は、セルラーゼ０．５ｍｇ／ｍＬ、グルコシダーゼ０．００５ｍｇ／ｍＬ（セルラーゼの１／１００量）である。

ＰｆｕＢＧＬと糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬを用いた場合を比較すると、反応２８時間後におけるグルコース生成量は、糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬはＰｆｕＢＧＬの１．６倍と大幅に上昇した。糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬは、セルラーゼの１／１００量添加するだけで、グルコース生成量の増加に対して多大な効果があることが明らかとなった。

［参考例２］トリコデルマ属由来セルラーゼの調製
トリコデルマ属由来セルラーゼを以下の方法で調製した。

１．前培養
コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物 ０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるよう蒸留水に添加し、１００ｍＬを５００ｍＬバッフル付き三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．１％添加した。この前培養培地にトリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６６５８９（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＡＴＣＣ６６５８９）を１×１０^５個／ｍＬになるように植菌し、２８℃、７２時間、１８０ｒｐｍで振とう培養し、前培養とした（振とう装置：ＴＡＩＴＥＣ社製 ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ−４０ＬＦ）。

２．本培養
コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、セルロース（アビセル）１０％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるよう蒸留水に添加し、２．５Ｌを５Ｌ容撹拌ジャー（ＡＢＬＥ社製 ＤＰＣ−２Ａ）容器に張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．１％添加し、あらかじめ前記の方法にて液体培地で前培養したトリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６６５８９（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＡＴＣＣ６６５８９）を２５０ｍＬ接種した。その後、２８℃、８７時間、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍにて培養を行い、遠心分離後、上清を膜濾過（ミリポア社製 ステリカップ−ＧＶ 材質：ＰＶＤＦ）した。

［実施例７］糸状菌由来セルラーゼ混合物と糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬから成る酵素組成物を用いたリグノセルロースの加水分解（２）
参考例１で調製したリグノセルロース１〜３を基質とし、参考例２で調製したトリコデルマ・リーセイ培養液を糸状菌由来セルラーゼ混合物として使用し、酵素添加量をセルラーゼ１．０ｍｇ／ｍＬ、グルコシダーゼ０．００５ｍｇ／ｍＬ（セルラーゼの１／１００量）とした以外は、実施例６と同様にしてリグノセルロース１〜３の加水分解を実施した。

表２に反応２８時間後に生成したグルコース濃度（ｇ／Ｌ）を比較した。

ＰｆｕＢＧＬと糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬを用いた場合を比較すると、反応２８時間後におけるグルコース生成量は、糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬはＰｆｕＢＧＬの１．８倍と大幅に上昇した。糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬは、セルラーゼの１／２００量添加するだけで、グルコース生成量が大幅に増加する効果があることが明らかとなった。実施例６のような市販のセルラーゼだけでなく、トリコデルマ・リーセイ培養液を用いても糖鎖付加変異型における効果があることが判明した。

［実施例８］糸状菌由来セルラーゼ混合物と糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬから成る酵素組成物を用いたリグノセルロースの加水分解（３）
糸状菌由来セルラーゼと糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬから成る酵素組成物を用い、加水分解の反応温度条件を変えてグルコース生成量を比較検討した。反応温度を、３０℃、４０℃、５０℃（実施例７）、６０℃の各温度に設定し、実施例７と同様の手順で行い、２８時間後のグルコース生成量を測定した。基質は、リグノセルロース１を使用した。

表３に示すように、糸状菌由来セルラーゼ、特にトリコデルマ属由来セルラーゼを使用する場合においては、４０℃〜５０℃の範囲で反応温度を設定することが好ましいことが判明した。これは、トリコデルマ属由来セルラーゼの反応最適温度が４０℃〜５０℃であることを反映している結果である。すなわち、本発明の好熱性菌由来グルコシダーゼは、５０℃以上でも高い活性を示すものの、糸状菌由来セルラーゼを含むバイオマス糖化用酵素組成物として使用する場合においては、反応温度を糸状菌由来セルラーゼの最適反応温度範囲で行うことが好ましいことが判明した。

［実施例９］糸状菌由来セルラーゼ混合物と糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬから成る酵素組成物を用いたリグノセルロースの加水分解（４）
糸状菌由来セルラーゼと糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬから成る酵素組成物を用い、加水分解反応におけるｐＨ条件を変えてグルコース生成量を比較検討した。希硫酸を添加して加水分解反応時のｐＨを１．２、３．５、５．０（実施例７）、７．０、８．２の各ｐＨに設定し、実施例７と同様の手順で行い、２８時間後のグルコース生成量を測定した。基質は、リグノセルロース１を使用した。

表４に示すように、糸状菌由来セルラーゼ、特にトリコデルマ属由来セルラーゼを使用する場合においては、ｐＨ３．５〜ｐＨ７の範囲で行うことが好ましいことが判明した。

［比較例２］ＰｆｕＢＧＬ類似グルコシダーゼの調製（２）
以下のようにして、比較例１で調製したＰｆｕＢＧＬとアミノ酸配列が類似するグルコシダーゼ７種を調製した。

配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５のＤＮＡ配列をそれぞれ全合成によって作製し、ｐＥＴ−１１ｄのクローニングサイトＮｃｏＩとＢａｍＨＩの間に組み込み、それぞれの発現ベクターを構築した。以下、比較例１と同様にして、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４，３６のアミノ酸配列であらわされる野生型のグルコシダーゼ（ＴｈＡｇｇＢＧＹ、ＣｍＧＨＦＰ、ＳａＢＧＡＬ、ＳｓｏＢＧＡＬ、ＰｔＢＧＡＬ、ＴｖＢＧＡＬ、ＦｎＧＨＦＰ）を得た。

［実施例１０］ＰｆｕＢＧＬ類似グルコシダーゼの糖鎖付加変異型グルコシダーゼの調製
比較例２で得られた野生型グルコシダーゼ（ＴｈＡｇｇＢＧＹ、ＣｍＧＨＦＰ、ＳａＢＧＡＬ、ＳｓｏＢＧＡＬ、ＰｔＢＧＡＬ、ＴｖＢＧＡＬ、ＦｎＧＨＦＰ）について、実施例２においてＰｆｕＢＧＬで決定した糖鎖付加配列の挿入箇所の情報を基に、糖鎖導入箇所を決定し、それぞれ糖鎖付加変異型グルコシダーゼを調製した。

配列番号３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９の糖鎖付加変異型グルコシダーゼをコードするＤＮＡ配列を全合成によってそれぞれ作製し、ｐＣＵ９ベクターのＥｃｏＲＩとＮｏｔＩの間に組み込み、それぞれの発現ベクターを構築した。以下、実施例３と同様にして、配列番号３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０のアミノ酸配列であらわされる糖鎖付加変異型グルコシダーゼを得た。

［実施例１１］糖鎖付加変異型グルコシダーゼの酵素活性
実施例４と同様にして、実施例１０で得られた糖鎖付加変異型グルコシダーゼの酵素活性を測定して、比較例２で得られた各野生型グルコシダーゼの酵素活性と比較した。糖鎖付加変異型の酵素活性は、各野生型の酵素活性を１００としたときの相対活性（％）として表５に示した。

表５の糖鎖付加変異型グルコシダーゼは、糖鎖付加前の野生型グルコシダーゼと比較して、酵素活性を維持していることがわかった。

［実施例１２］糖鎖付加変異型グルコシダーゼの熱安定性
実施例５と同様にして、比較例２で得られた各野生型グルコシダーゼと実施例１０で得られた各糖鎖付加変異型グルコシダーゼの熱安定性試験を行った。熱安定性は、保温前の酵素活性を１００とした場合の各保温時間における残存活性を、相対活性として図８〜図２０に示した。全てのグルコシダーゼにおいて、糖鎖付加変異型（図９，図１１，図１３，図１５，図１７，図１９，図２１）は、野生型（図８，図１０，図１２，図１４，図１６，図１８，図２０）に比べて熱安定性が向上することが判明した。

［実施例１３］糸状菌由来セルラーゼ混合物と糖鎖付加変異型グルコシダーゼから成る酵素組成物を用いたリグノセルロースの加水分解（５）
実施例６と同様にして、比較例２で得られた各野生型グルコシダーゼと実施例１０で得られた各糖鎖付加変異型グルコシダーゼを用いて、参考例１で調製したリグノセルロース１（アンモニア処理）の加水分解を行った。反応２８時間後における各グルコース生成量（ｇ／Ｌ）を表６に示した。

表６に示すように、アンモニア処理されたリグノセルロース１の加水分解において、糖鎖付加変異型グルコシダーゼは、野生型に比べて、単位時間当たりの糖生成量が大幅に増加し、セルロース分解効率が優れていることがわかった。

［実施例１４］糸状菌由来セルラーゼ混合物と糖鎖付加変異型グルコシダーゼから成る酵素組成物を用いたリグノセルロースの加水分解（６）
実施例６と同様にして、比較例２で得られた各野生型グルコシダーゼと実施例１０で得られた各糖鎖付加変異型グルコシダーゼを用いて、参考例１で調製したリグノセルロース２（希硫酸処理）の加水分解を行った。反応２８時間後における各グルコース生成量（ｇ／Ｌ）を表７に示した。

表７に示すように、希硫酸処理されたリグノセルロース２の加水分解において、糖鎖付加変異型グルコシダーゼは、野生型に比べて、単位時間当たりの糖生成量が大幅に増加し、セルロース分解効率が優れていることがわかった。

［実施例１５］糸状菌由来セルラーゼ混合物と糖鎖付加変異型グルコシダーゼから成る酵素組成物を用いたリグノセルロースの加水分解（７）
実施例６と同様にして、比較例１及び比較例２で得られた各野生型グルコシダーゼと実施例１及び実施例１０で得られた各糖鎖付加変異型グルコシダーゼを用いて、参考例１で調製したリグノセルロース３（水熱処理）の加水分解を行った。反応２８時間後における各グルコース生成量（ｇ／Ｌ）を表８に示した。

表８に示すように、水熱処理されたリグノセルロース３の加水分解において、糖鎖付加変異型グルコシダーゼは、野生型に比べて、単位時間当たりの糖生成量が大幅に増加し、セルロース分解効率が優れていることがわかった。

［実施例１６］糸状菌由来セルラーゼ混合物と糖鎖付加変異型グルコシダーゼから成る酵素組成物を用いた工業用パルプの加水分解
工業用パルプに、比較例１及び比較例２で得られた各野生型グルコシダーゼと実施例１及び実施例１０で得られた各糖鎖付加変異型グルコシダーゼをを作用させた場合のグルコース生成量を比較検討した。５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に５ｗｔ％の工業用パルプ（東亜化成社製）を懸濁したものを基質とした以外は実施例６と同様にして、加水分解を行った。反応２８時間後における各グルコース生成量（ｇ／Ｌ）を表９に示した。

表９に示すように、糖鎖付加変異型グルコシダーゼは、工業用パルプの加水分解においても、野生型に比べて、単位時間当たりの糖生成量が大幅に増加し、セルロース分解効率が優れていることが確認できた。

［実施例１７］糖鎖付加変異導入部位の選定
実施例１で得られたＰｆｕＢＧＬの三次元構造情報より、さらなる糖鎖修飾部位の探索を行った。酵素反応が行われるクレフトの周囲に糖鎖付加配列を導入し、糖鎖の付加による触媒部位の保護を試みた。まず、ＰｆｕＢＧＬの実施例１記載の糖鎖変異導入部位以外の部分において、酵素表面に露出している部分に限定した。次に、糖鎖付加配列であるＡｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ（Ｎ−Ｘ−Ｔ）の変異を導入しても、立体障害および／または構造的な歪みを生じない位置を探索した。またグルコシダーゼの活性部位を避けた部位において、３点変異導入箇所を選定した。

その結果、実施例１で選定した糖鎖修飾部位に加え、Ｈ３７−Ｄ３８−Ｋ３９（変異Ａ）、Ｓ２３０−Ｆ２３１−Ｅ２３２（変異Ｃ）、Ａ３６４−Ｙ３６５−Ｅ３６６（変異Ｅ）の３つの変異導入箇所を新たに選定した。

［実施例１８］糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬの調製（２）
配列番号６記載の糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬにおける、実施例１７で決定した変異導入箇所に、糖鎖付加配列を導入するために、配列番号５７及び配列番号５８で示す変異Ａ導入用プライマーを使用して、部位特異的変異導入法によりＮ型糖鎖付加配列変異の導入を行った。その結果、配列番号５１の糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬ２Ａ遺伝子を得た。また、変異Ｃについては、配列番号５９及び配列番号６０で示す変異Ｃ導入用プライマーを、変異Ｅについては、配列番号６１及び配列番号６２で示す変異Ｅ導入用プライマーをそれぞれ用いて、同様に部位特異的変異導入法によりＮ型糖鎖付加配列変異の導入を行い、配列番号５３で示す糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬ２Ｃ遺伝子、および配列番号５５で示す糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬ２Ｅ遺伝子をそれぞれ得た。このように調製した糖鎖付加変異型遺伝子を用いて、実施例３と同様の手順を行うことにより、配列番号５２で表される糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬ２Ａ、配列番号５４で表される糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬ２Ｃ、配列番号５６で表される糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬ２Ｅをそれぞれ得た。

［実施例１９］糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬの酵素活性（２）
実施例４と同様にして、実施例１８で得た糖鎖付加変異型グルコシダーゼＰｆｕＢＧＬ２Ａ（配列番号５２）、糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬ２Ｃ（配列番号５４）、糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬ２Ｅ（配列番号５６）の酵素活性を、野生型ＰｆｕＢＧＬと比較して測定した。糖鎖付加変異型の酵素活性は、野生型ＰｆｕＢＧＬの酵素活性を１００としたときの相対活性（％）として表１０に示した。

表１０に示すように、２個以上の糖鎖が付加した変異型グルコシダーゼは、糖鎖付加前の野生型グルコシダーゼと比べて、酵素活性を維持していることがわかった。

［実施例２０］糸状菌由来セルラーゼ混合物と各種糖鎖付加変異型グルコシダーゼから成る酵素組成物を用いたリグノセルロースの加水分解（８）
実施例６と同様にして、実施例１８で得られた糖鎖付加変異型グルコシダーゼ（ＰｆｕＢＧＬ２Ａ、ＰｆｕＢＧＬ２Ｃ、ＰｆｕＢＧＬ２Ｅ）を用いて、参考例１で調製したリグノセルロース２（希硫酸処理）の加水分解を行った。反応２８時間後におけるグルコース生成量（ｇ／Ｌ）を表１１に示した。

表１１に示すように、糖鎖が２個以上付加した変異型グルコシダーゼ（配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６）においても、糖鎖修飾のない野生型グルコシダーゼ（比較例１；グルコース生成量：３ｇ／Ｌ）と比べて、リグノセルロースに対する分解効率が大幅に向上していることが判明した。

［実施例２１］糖鎖付加変異型グルコシダーゼのリグノセルロースに対する吸着性の評価
結晶セルロース（アビセル）及び参考例１で調製したリグノセルロース１〜３に対する糖鎖付加変異型グルコシダーゼの吸着性を評価した。グルコシダーゼは、実施例１で調製した糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬ、および比較例１で調製した野生型ＰｆｕＢＧＬを使用しこれらの酵素液は、比活性が等しくなるように調整し、酢酸緩衝液（ｐＨ５）を加えて最終濃度１００ｍＭとなるように用意した。この酵素液を、それぞれ結晶セルロース、リグノセルロース１〜３に対して最終濃度（固形物濃度）７．５重量％となるように添加し、この混合物を５０℃で１時間保温および攪拌した。その後、反応させた混合物を１５０００ｒｐｍで１０分遠心分離を行い、その上澄みのセロビオース分解活性を測定した。セロビオース分解活性は、結晶セルロース、リグノセルロース１〜３を含まない酵素液の酵素活性を１００として、相対活性（％）で評価した。

表１２に示すように、野生型グルコシダーゼに対して、糖化付加変異型グルコシダーゼでは、リグノセルロース１〜３のいずれの存在下においても、上澄み中に含まれるセロビオース分解活性が増加することが判明した。また、結晶セルロースであるアビセルにおいても、上澄み液中に含まれるセロビオース分解活性が僅かに増大した。本結果から、糖化付加変異型グルコシダーゼは、特にリグノセルロース（セルロース前処理物）に対する吸着性が低く、固液分離後の上澄み液からの回収性が高いことが判明した。

［実施例２２］糖鎖付加変異型グルコシダーゼの限外濾過膜に対する吸着性の評価
糖鎖付加変異型グルコシダーゼの限外濾過膜に対する吸着性の評価を行った。限外濾過膜は、ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ザルトリウス社、ポリエーテルサルホン製、分画分子量１００００Ｄａ）を使用した。グルコシダーゼは、実施例１で調製した糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬ、および比較例１で調製したＰｆｕＢＧＬを使用し、これらの酵素液は、比活性が等しくなるように調整し、酢酸緩衝液（ｐＨ５）を加えて最終濃度５０ｍＭとなるように用意した。この酵素液５ｍＬを限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０に移し、４０００Ｇで１０分間遠心分離を行った。遠心分離後、限外濾過膜の非透過側に残った溶液（約１００μＬ以下）に５０ｍＭ酢酸緩衝液３ｍＬを添加し、限外濾過膜の膜面および容器内壁の残存物をピペッティングにより回収した。回収物した残存物を５ｍＬにメスアップし、１０μＬをセロビオース分解活性用にサンプリングした。この一連の操作を、７回繰り返し、各回数におけるセロビオース分解活性を、初期活性を１００（％）として相対活性（％）で算出した。この結果を、表１３に示す。

表１３に示すように、糖鎖修飾のない野生型ＰｆｕＢＧＬでは、繰り返し回数が増えるに伴い、活性が減少することが判明した（４回目以降は活性消失）。一方、糖鎖付加変異型ＰｆｕＢＧＬでは、７回繰り返しても活性を保持していた。すなわち、糖鎖付加変異型グルコシダーゼでは、限外濾過膜に対する吸着が低く、そのため、加水分解反応後に限外濾過膜を使用して酵素を回収する際に、回収性に優れていることが判明した。

［実施例２３］加水分解物に含まれる酵素組成物の限外濾過膜による回収
実施例７で行ったリグノセルロース１−３の加水分解物から、次のように酵素組成物の回収を行った。まず、加水分解物１０ｍＬを遠心分離し、５ｍＬの上澄み液を得た。次に上澄み液を、平均細孔径０．２μｍ精密濾過膜（ミリポア社製、ＰＶＤＦ膜）に通じて濾過し、濾液を回収した。この濾液全量を、限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（ポリエーテルサルホン製、分画分子量１００００Ｄａ）に移し、遠心分離を行った。限外濾過膜の非透過側に残った残存物を回収し、セロビオース分解活性を測定した。活性は、投入した酵素活性を初期酵素活性１００％として、残存物として回収した酵素組成物の酵素活性を相対値（％）で算出した。

表１４に示すように、糖鎖付加変異型グルコシダーゼでは、変異型グルコシダーゼに比べて、回収酵素の活性が大幅に増加することが判明した。これは、糖鎖付加変異型グルコシダーゼは、実施例２１に示すようにリグノセルロースに対する吸着性が低下していること、実施例２２に示すように限外濾過膜に対する吸着性が低下していることによるものと考えられた。

［実施例２４］糖鎖付加変異型グルコシダーゼの糖鎖成分の解析
実施例１記載の糖鎖付加ＰｆｕＢＧＬの糖鎖構造を解析した。糖鎖付加ＰｆｕＢＧＬを−８０℃で凍結乾燥したサンプル１．３３ｍｇに精製水１．３３ｍＬを添加し、１ｍｇ／ｍＬ試料溶液を調整した。この試料溶液中の中性糖およびアミノ糖の定量を、それぞれ以下の手順で実施した。

１．中性糖
１ｍｇ／ｍＬ試料溶液１００μＬを試験管に移し、減圧乾固を行い、その後、２Ｍトリフルオロ酢酸を２００μＬを添加した。この試験管を窒素置換し、試験管を減圧封管した。その後、１００℃で６時間加水分解を行い、その後再度減圧乾固した。得られた残さに精製水２００μＬを添加し、残さを溶解させた後、０．２２μｍのフィルターで濾過した。濾液を精製水で１０倍希釈したサンプルを以下の条件で分析した。

分析機器は、ＨＰＬＣシステム ＬＣ２０Ａシステム（株式会社島津製作所）、分光蛍光光度計 ＲＦ-１０ＡＸＬ（株式会社島津製作所）を使用した。

分析条件は、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｓｕｇａｒ ＡＸＧ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ１５ｃｍ（東ソー株式会社）、カラム温度７０℃、移動相０．６Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．７）、移動相流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ、で行った。

ポストカラム標識は、反応試薬として、１重量％アルギニン、３重量％ホウ酸、を使用し、反応試薬流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、反応温度１５０℃で行った。なお、検出波長は、励起３２０ｎｍ、検出４３０ｎｍで行った。中性糖の定量は、各中性糖標準品との比較により実施した。

２．アミノ糖
１ｍｇ／ｍＬ試料溶液１００μＬを試験管に移し、減圧乾固を行い、その後、４Ｍトリ塩酸を２００μＬ添加した。この試験管を窒素置換し、試験管を減圧封管した。その後、１００℃で６時間加水分解を行い、その後再度減圧乾固した。得られた残さに精製水２００μＬを添加し、残さを溶解させた後、０．２２μｍのフィルターで濾過した。

分析機器は、ＨＰＬＣシステム ＬＣ２０Ａシステム（株式会社島津製作所）、分光蛍光光度計 ＲＦ-１０ＡＸＬ（株式会社島津製作所）を使用した。

分析条件は、ＴＳＫ−ｇｅｌ ＳＣＸ ６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ１５ｃｍ（東ソー株式会社）、カラム温度６０℃、移動相０．１６Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、移動相流速０．３ｍＬ／ｍｉｎ、で行った。

ポストカラム標識は、反応試薬として、１重量％アルギニン、３重量％ホウ酸、を使用し、反応試薬流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、反応温度１５０℃で行った。なお検出波長は、励起３２０ｎｍ、検出４３０ｎｍで行った。中性糖の定量は、各中性糖標準品との比較により実施した。

表１５に示すように、実施例１で得られた糖鎖変異型ＰｆｕＢＧＬの糖鎖を構成する中性糖の主成分はマンノースであることが判明した。またＮ−グルコサミンに対するマンノースの構成比から、糖鎖変異型ＰｆｕＢＧＬは、高マンノース型糖鎖であることが判明した。

産業上の利用の可能性

本発明における糖鎖付加好熱性菌由来変異型グルコシダーゼは、セルロース分解による糖液の製造に使用できる。セルロース分解効率を大幅に向上させる効果により、酵素コストを大幅に削減することが可能であるため、産業上非常に有益である。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (10)

1. 選択的に糖鎖が付加されてなり、かつグルコシダーゼ活性を有する好熱性菌由来変異型グルコシダーゼの製造方法であって、該好熱性菌由来グルコシダーゼが、
   配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０に記載のいずれかのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、あるいは
   配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０に記載のいずれかのアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質であり、該方法が
   （i）元来糖鎖付加配列を持たない好熱性菌由来グルコシダーゼをコードするＤＮＡに、Ａｓｎ-Ｘ-ＳｅｒまたはＡｓｎ-Ｘ-Ｔｈｒ（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸）をコードするＤＮＡ配列を導入し、好熱性菌由来変異型グルコシダーゼをコードするＤＮＡを調製し、さらに該変異型グルコシダーゼをコードするＤＮＡに分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ配列を付加する、
   ここで、該Ａｓｎ-Ｘ-ＳｅｒまたはＡｓｎ-Ｘ-Ｔｈｒの導入箇所は、
   好熱性菌由来変異型グルコシダーゼが配列番号４のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む場合には、Ｍ１〜Ｍ９、Ｆ１７〜Ｆ１９、Ｇ２２〜Ｇ２５、Ｅ２７〜Ｖ３４、Ｈ３７〜Ｅ４０、Ｉ４２〜Ｌ５１、Ｙ５８〜Ｑ６４、Ｅ８２〜Ｒ８５、Ｐ８８〜Ｐ９０、Ｆ９２〜Ｄ１１０、Ｐ１１２〜１１５、Ｅ１２０〜Ａ１２７、Ｋ１３９〜Ｆ１４５、Ｙ１５０〜Ｗ１５２、Ｐ１５５〜Ｄ１６０、Ｒ１６５〜Ｌ１６７、Ｐ１６９〜Ｐ１７３、Ｗ１７６〜Ｔ１８１、Ｄ１９７〜Ｌ１９９、Ｎ２１０〜Ｑ２１５、Ｙ２１７〜Ｓ２２２、Ｇ２２７〜Ｋ２３６、Ｋ２３８〜Ｎ２４０、Ｋ２５３〜Ｓ２５９、Ａ２６５〜Ｅ２７９、Ｅ２８１〜Ｄ２８７、Ｈ２９５〜Ｗ３０２、Ｒ３１０〜Ｙ３１３、Ａ３１５〜Ｙ３２６、Ｆ３２８〜Ｒ３４０、Ｙ３５０〜Ｅ３５２、Ｎ３６２〜Ｅ３６６、Ａ３７９〜Ｙ３８３、Ｍ３９９〜Ａ４０３、Ｅ４１８〜Ｑ４２１、Ｆ４２３〜Ｒ４２６、Ｔ４５３〜Ｅ４６０、Ａ４６２〜Ｋ４７３より選択され、
   好熱性菌由来変異型グルコシダーゼが配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０に記載のいずれかのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むか、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０に記載のいずれかのアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質である場合には、そのアミノ酸配列と該配列番号４とのアライメント解析を行い、該そのアミノ酸配列上、前記配列番号４において決定された導入箇所に対応する位置を導入箇所として決定する、
   （ii）該分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ配列が付加された該変異型グルコシダーゼをコードするＤＮＡを真核微生物に導入し、該変異型グルコシダーゼＤＮＡによってコードされる変異型グルコシダーゼを分泌タンパク質として発現させる、ならびに
   （iii）分泌タンパク質として発現された変異型グルコシダーゼを単離・精製する、ことを含む上記方法。
2. 糖鎖が、高マンノース型糖鎖である、請求項１に記載の変異型グルコシダーゼの製造方法。
3. 真核微生物が、ピキア・パストリスである、請求項１または２に記載の変異型グルコシダーゼの製造方法。
4. 分泌シグナル配列がαファクター分泌シグナル配列である、請求項１から３のいずれか１項に記載の変異型グルコシダーゼの製造方法。
5. 好熱性菌由来変異型グルコシダーゼが、配列番号６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４または配列番号５６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の変異型グルコシダーゼの製造方法。
6. セルラーゼおよび請求項１から５のいずれか１項に記載の製造方法によって得られた好熱性菌由来変異型グルコシダーゼを含むバイオマス糖化用の酵素組成物。
7. セルラーゼが糸状菌由来セルラーゼ混合物である、請求項６に記載のバイオマス糖化用の酵素組成物。
8. 糸状菌由来セルラーゼ混合物が、トリコデルマ属由来セルラーゼ混合物である、請求項６または７に記載のバイオマス糖化用の酵素組成物。
9. 請求項６から８のいずれか１項に記載の酵素組成物を使用するバイオマスの加水分解方法。
10. 前記酵素組成物による加水分解物を限外濾過膜に通じて濾過し、使用後の該酵素組成物を分離回収することを特徴とする、請求項９に記載のバイオマスの加水分解方法。

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