ES2544710T3 - Procedimiento para producir glucosidasa, composición enzimática y procedimiento de hidrólisis de biomasa - Google Patents

Procedimiento para producir glucosidasa, composición enzimática y procedimiento de hidrólisis de biomasa Download PDF

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Abstract

Procedimiento para producir una β-glucosidasa mutante derivada de un termófilo que tiene fijada selectivamente a ella una cadena de azúcares y también tiene una actividad glucosidasa, que comprende: (i) preparar ADN que codifica una β-glucosidasa mutante derivada de un termófilo introduciendo una secuencia de ADN que codifica Asn-X-Ser o Asn-X-Thr (en las que, X es cualquier aminoácido excepto prolina) en ADN que codifica una β-glucosidasa derivada de un termófilo que está originalmente desprovista de una secuencia de glucosilación y, además, añadiendo una secuencia de ADN que codifica una secuencia señal de secreción al ADN que codifica una β-glucosidasa mutante, (ii) introducir el ADN que codifica una β-glucosidasa mutante al que se le ha añadido la secuencia de ADN que codifica la secuencia señal de secreción en un microorganismo eucariota, de modo que una β-glucosidasa mutante codificada por el ADN de la β-glucosidasa mutante se exprese como una proteína secretora, y (iii) aislar y purificar la β-glucosidasa mutante expresada de este modo como una proteína secretora.

Description

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embargo, la secuencia de glucosilación no está limitada a éstas. Preferentemente, la secuencia de glucosilación es la secuencia consenso de una cadena de azúcares unida a N. En este caso, los ejemplos de aminoácido excepto prolina incluyen Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys, Ser, Thr, Asp, Glu, His, Lys, Arg, Asn y Gln.
La glucosidasa mutante glucosilada derivada de un termófilo, según la presente invención, (a continuación, en el presente documento, denominada como “glucosidasa mutante”) se refiere a una glucosidasa mutante que resulta de la introducción de la secuencia de aminoácidos que compone la secuencia de glucosilación mencionada anteriormente en la secuencia de aminoácidos mencionada anteriormente de una glucosidasa derivada de un termófilo, en la que la secuencia de aminoácidos se glucosila selectivamente. Pueden introducirse una o dos o más secuencias de glucosilación, y estas secuencias pueden ser todas iguales o contener múltiples tipos de secuencias de glucosilación.
Como sitio de introducción de la secuencia de glucosilación, se selecciona preferentemente una posición tal que no inactiva la actividad enzimática original mediante la introducción. El procedimiento para determinar dicho sitio de introducción de la secuencia de glucosilación puede llevarse a cabo mediante las siguientes etapa 1) y etapa 2).
Etapa 1) Realizar el análisis de alineamiento de la secuencia de aminoácidos entre una glucosidasa derivada de hongos filamentosos que posee de forma natural una secuencia de glucosilación y una glucosidasa derivada de un termófilo que está desprovista de forma natural de una secuencia de glucosilación para aclarar una relación posicional relativa de la secuencia de glucosilación de la glucosidasa derivada de hongos filamentosos en la glucosidasa derivada de un termófilo para especificar el sitio de introducción de la secuencia de glucosilación. Como herramienta de alineamiento, pueden usarse muchos softwares bien conocidos tales como ClustalW. La glucosidasa derivada de hongos filamentosos que posee de forma natural una secuencia de glucosilación es, preferentemente, una glucosidasa derivada del género Trichoderma o una glucosidasa derivada del género Aspergillosis. Las secuencias de aminoácidos de estas glucosidasas derivadas de hongos filamentosos son conocidas públicamente y, preferentemente, se utiliza una β-glucosidasa derivada de Trichoderma reesei que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una β-glucosidasa derivada de Aspergillus niger que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
Etapa 2) A continuación, confirmar si el sitio de introducción de la secuencia de glucosilación en la glucosidasa derivada de un termófilo que ha sido especificada por el análisis de alineamiento mencionado anteriormente está presente sobre la superficie de la enzima. Si ésta está o no presente sobre la superficie de la enzima puede averiguarse utilizando la estructura cristalina de la glucosidasa derivada de un termófilo objetivo. Dicha estructura cristalina puede recuperarse de una base de datos tal como Protein Data Bank si es conocida. Además, una estructura cristalina puede obtenerse realizando en realidad cristalografía por rayos X, etc.
En la presente invención, el sitio de introducción de la secuencia de glucosilación se selecciona, preferentemente, de acuerdo con la etapa 1) y la etapa 2) mencionadas anteriormente; sin embargo, como otra técnica, puede seleccionarse de acuerdo con la etapa 3) y la etapa 4) siguiente.
Etapa 3) Obtener el área superficial accesible (ASA) (Å2) del residuo de aminoácido mediante software analítico y, en base al valor obtenido de este modo, seleccionar el residuo de aminoácido que está expuesto cerca de la superficie de la glucosidasa derivada de un termófilo. El ASA de cada residuo de aminoácido puede calcularse utilizando software analítico de ASA tal como AREAIMOL (paquete ccp4) (Collaborative Computing Project Number 4 (CCP4) of UK Science and Engineering Research Council) (“Proyecto colaborativo de computación número 4 (CCP4) del consejo de investigación de ciencia e ingeniería del RU”), SURFace (grupo Barry Honig, the Department of Biochemistry and Molecular Biophysics and Center of Computational Biology and Bioinformatics of Columbia
(“Departamento de bioquímica y biofísica molecular y centro de biología computacional y bioinformática de Columbia”), y ASAP(Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland y the ARC Centre in Bioinformatics) (“Instituto de biociencia molecular, Universidad de Queensland y centro ARC de bioinformática”), todos los cuales pueden obtenerse de páginas web. Si se calcula que un residuo de aminoácido tiene un ASA de 1 Å2 o mayor, entonces se supone que está expuesta a la superficie, y como sitio de introducción de la secuencia de glucosilación, se selecciona preferentemente un residuo de aminoácido con un ASA de 2 Å2 o más. Particularmente, para introducir los tres residuos de aminoácidos (Asn-X-Ser o Asn-X-Thr: X es un aminoácido excepto prolina), que forman la secuencia consenso para una cadena de azúcares unida a N, es preferente seleccionar una parte que contiene tres o más aminoácidos consecutivos con un ASA de 2 Å2 o más.
Etapa 4) Seleccionar, de entre los sitios de introducción de la secuencia de glucosilación en una glucosidasa derivada de un termófilo seleccionada mediante la etapa 3) anteriormente, una posición que está demasiado lejos del sitio activo de la enzima de la glucosidasa derivada de un termófilo para causar una reducción de la actividad enzimática mediante introducción de la secuencia de glucosilación. La distancia desde el sitio activo de la enzima puede averiguarse utilizando la estructura cristalina de la glucosidasa derivada de un termófilo objetivo de una manera similar a la anterior. Específicamente, después de excluir los residuos de aminoácidos dentro de una distancia de 3,5 Å desde el sitio activo de la enzima, se selecciona preferentemente el residuo de aminoácido que está más alejado que esta distancia.
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Por ejemplo, la aplicación de la etapa 3) y la etapa 4) mencionadas anteriormente a PfuBGL representada mediante la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 será de la siguiente manera. En primer lugar, utilizando AREAIMOL (paquete ccp4), se calcula el ASA suponiendo que la molécula de disolvente tiene 1,4 Å, y el residuo de aminoácido con un ASA de 2 Å2 o más es excluido (Tabla 1 (i)). Posteriormente, se extrae una parte que contiene tres o más 5 aminoácidos consecutivos con un ASA de 2 Å2 o más (Tabla 1 (ii)). Además, en base a la información de la estructura cristalina de PfuBGL, se especifican los residuos de aminoácidos dentro de una distancia de 3,5 Å del sitio activo de la enzima (23 residuos de S13, R78, N207, I263, I303, G304, V305, N306, Y307, S343, D344, L367, I370, I371, T372, D378, R384, Y387, H391, D404, V405, R406, N407, Y408, L409, H410, W411 y F427) y a continuación se excluyen. Como resultado, puede seleccionarse el sitio de introducción de la secuencia de
10 glucosilación (Tabla 1 (iii)).
[Tabla 1]
Ejemplo de selección del sitio de introducción de la secuencia de glucosilación en PfuBGL
(i) Residuos de aminoácidos con un ASA de 2 Å2 o más
M1-M9, F17-F19, G22-G25, E27-V34, H37-E40, I42-L51, E53, N54, Y58-Q64, D67, I68, E70, I68, E70, K71, G73, D75, E82-R85, P88-P90, F92-D110, P112-115, K117, E118, E120-A127, E129, H130, R132, K133, S136, D137, K139-F145, Y150-W152, P155-D160, I162, A163, R165-L167, P169-P173, W176-T181, V183, E184, K187, Y194, H195, D197-L199, D201, M202, E208, N210-Q215, Y217-S222, F224, P225, G227-K236, K238-N240, I242, I246, Y249, D250, K253-S259, A265-E279, E281-D287, E289, T292, I293, H295-W302, Y308, R310-Y313, A315-Y326, F328-R340, D344, F345, W374, Y350-E352, E355, N356, K359, Y360, N362-P368, I370, E373, M376, A379-Y383, P385-Y387, S390, K363, A394, Y396, N397, M399-R406, W411, E418-Q421, F423-F427, Y431, D433, P443, L446, R449, E450, T453-E460, A462-K473
(ii) Entre (i), una parte que contiene tres o más residuos de aminoácidos consecutivos
M1-M9, F17-F19, G22-G25, E27-V34, H37-E40, I42-L51, Y58-Q64, E82-R85, P88-P90, F92-D110, P112-115, E120-A127, K139-F145, Y150-W152, P155-D160, R165-L167, P169-P173, W176-T181, D197-L199, N210-Q215, Y217-S222, G227-K236, K238-N240, K253-S259, A265-E279, E281-D287, H295-W302, R310-Y313, A315-Y326, F328-R340, Y350-E352, N362-P368, A379-Y383, P385-Y387, M399-R406, E418-Q421, F423-F427, T453-E460, A462-K473
(iii) Entre (ii), un residuo de aminoácido alejado del sitio activo de la enzima 3,5 Å o más
M1-M9, F17-F19, G22-G25, E27-V34, H37-E40, I42-L51, Y58-Q64, E82-R85, P88-P90, F92-D110, P112-115, E120-A127, K139-F145, Y150-W152, P155-D160, R165-L167, P169-P173, W176-T181, D197-L199, N210-Q215, Y217-S222, G227-K236, K238-N240, K253-S259, A265-E279, E281-D287, H295-W302, R310-Y313, A315-Y326, F328-R340, Y350-E352, N362-E366, A379-Y383, M399-A403, E418-Q421, F423-R426, T453-E460, A462-K473
El sitio de introducción de la secuencia de glucosilación está presente en un sitio o, preferentemente, en de dos a 15 cinco sitios.
En la presente invención, el término “introducción” indica que la secuencia de glucosilación mencionada
anteriormente se traduce en un polipéptido. Es decir, en la secuencia de aminoácidos original de una glucosidasa
derivada de un termófilo, la secuencia de glucosilación mencionada anteriormente puede sustituir a la secuencia de 20 aminoácidos existente, o puede insertarse en la secuencia de aminoácidos existente. Es decir, en el caso de
sustitución, la longitud del polipéptido permanece inalterada con respecto a antes de la mutación, mientras que en el
caso de inserción, la longitud del polipéptido se vuelve más larga por la longitud de la secuencia de glucosilación
insertada. Sin embargo, desde el punto de vista de retención de la actividad enzimática, la introducción de la
secuencia de glucosilación preferentemente tiene lugar mediante sustitución de la secuencia de aminoácidos 25 existente.
Además, como la secuencia de glucosilación a introducir, puede adoptarse cualquiera de las secuencias de
glucosilación mencionadas anteriormente y, como X, puede utilizarse cualquier aminoácido excepto prolina; sin
embargo, debe seleccionarse una secuencia de glucosilación y un aminoácido que se espera que tengan poco 30 impacto cuando se introducen como una mutación. Por ejemplo, en el caso de una sustitución de aminoácidos, es
deseable una sustitución de aminoácidos conservativa. La sustitución de aminoácidos conservativa se refiere a una
sustitución que tiene lugar entre los aminoácidos que tienen propiedades eléctricas, propiedades estructurales,
polaridad o hidrofobicidad similares, etc., y se espera que la sustitución entre estos aminoácidos similares no altere
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Trichoderma reesei QM9123, Trichoderma reesei RutC-30, Trichoderma reesei PC3-7, Trichoderma reesei ATCC66589, Trichoderma reesei CL-847, Trichoderma reesei MCG77, Trichoderma reesei MCG80 y Trichoderma viride QM9123. Además, también puede utilizarse una cepa mutante derivada del género Trichoderma mencionado anteriormente que ha conseguido productividad de celulosa mejorada a través de tratamiento mutagénico utilizando un mutágeno, irradiación con rayos ultravioleta, o similares.
La mezcla de celulasas derivadas del género Trichoderma utilizada en la presente invención es una composición enzimática que contiene una pluralidad de componentes enzimáticos tales como celobiohidrolasa, endoglucanasa, exoglucanasa, β-glucosidasa, xilanasa y xilosidasa. La mezcla de celulasas derivadas del género Trichoderma puede llevar a cabo hidrólisis eficaz de celulosa debido al efecto concertado o el efecto complementario de una pluralidad de componentes enzimáticos en la hidrólisis de celulosa.
Celobiohidrolasa es un término genérico para celulasa que se caracteriza por comenzar la hidrólisis a partir de la sección terminal de celulosa, y un grupo de enzimas que pertenecen a celobiohidrolasa se enumera en EC No: EC3.2.1.91.
Endoglucanasa es un término genérico para celulasa que se caracteriza por comenzar la hidrólisis a partir de la parte media de la cadena molecular de celulosa, y un grupo de enzimas que pertenecen a endoglucanasa se enumera en EC NO: EC3.2.1.4, EC3.2.1.6, EC3.2.1.39 y EC3.2.1.73.
Exoglucanasa es un término genérico para celulasa que se caracteriza por comenzar la hidrólisis a partir del extremo de la cadena molecular de celulosa, y un grupo de enzimas que pertenecen a exoglucanasa se enumera en EC NO: EC3.2.1.74 y EC3.2.1.58.
β-glucosidasa es un término genérico para celulasa que se caracteriza por actuar sobre celooligosacáridos o celobiosa, y un grupo de enzimas que pertenecen a β-glucosidasa se enumera en EC No: EC3.2.1.21.
Xilanasa es un término genérico para celulasa que se caracteriza por actuar sobre hemicelulosa o, particularmente, xilano, y un grupo de enzimas que pertenecen a xilanasa se enumera en EC No: EC3.2.1.8.
Xilosidasa es un término genérico para celulasa que se caracteriza por actuar sobre xilooligosacáridos, y un grupo de enzimas que pertenecen a xilosidasa se enumera en EC No: EC3.2.1.37.
En la presente invención, se utiliza biomasa que contiene celulosa como sustrato de la reacción enzimática. La biomasa que contiene celulosa es celulosa que se deriva ampliamente de biomasa vegetal. Más específicamente, la biomasa que contiene celulosa es bagazo, forraje de maíz, mazorca de maíz, pasto de aguja, paja de arroz, paja de trigo, árboles, materiales leñosos, residuos de material de construcción, periódicos, papel usado, pasta y similares. Aunque la biomasa que contiene celulosa anterior contiene una impureza tal como el compuesto aromático macromolecular lignina y hemicelulosa, biomasa que contiene celulosa en la que lignina y hemicelulosa están parcialmente degradadas utilizando un ácido, un álcali, agua caliente presurizada, y similares como pretratamiento también puede utilizarse como celulosa. En este caso, biomasa que contiene celulosa pretratada tal como se ha descrito anteriormente se proporciona como “lignocelulosa”, que puede utilizarse como un sustrato de la reacción enzimática.
Como biomasa que contiene celulosa utilizada en la presente invención, puede utilizarse una que ha sido sometida a pretratamiento tal como tratamiento con amoníaco, tratamiento con ácido sulfúrico diluido, y tratamiento hidrotérmico mediante una técnica conocida públicamente.
Para tratamiento con amoníaco, pueden aplicarse los procedimientos descritos en la publicación de patente japonesa (Kokai) No. 2008-161125 A y la publicación de patente japonesa (Kokai) No. 2008-535664 A. Específicamente, a la biomasa, se le añade amoníaco a una concentración del 0,1 al 15% en peso, y el tratamiento se lleva a cabo a de 4 a 200°C, preferentemente a de 90 a 150°C. El amoníaco a añadir puede estar en estado líquido o en estado gaseoso. Cuando el amoníaco está en estado líquido, puede utilizarse amoníaco líquido o una solución acuosa de amoníaco. El número de tratamientos no está particularmente limitado, y puede realizarse, como mínimo, una vez. Cuando el tratamiento se realiza dos veces o más, el primer tratamiento y el segundo tratamiento pueden realizarse en diferentes condiciones. El producto obtenido mediante el tratamiento con amoníaco necesita ser sometido a neutralización de amoníaco o eliminación de amoníaco antes de realizar la reacción de hidrólisis. La neutralización puede realizarse en un líquido que sigue conteniendo un contenido sólido o una fracción líquida a partir de la cual se ha separado el contenido sólido. Un reactivo ácido utilizado para neutralización no está particularmente limitado. El amoníaco también puede eliminarse mediante volatilización en estado gaseoso manteniendo el producto tratado con amoníaco en la condición de presión reducida. En ese caso, el amoníaco que ha sido eliminado puede recuperarse y reciclarse.
El tratamiento hidrotérmico puede realizarse, por ejemplo, añadiendo agua de modo que la biomasa que contiene celulosa sea del 0,1 al 50% en peso, y tratando la solución resultante a una temperatura de 100 a 400°C durante de un segundo a 60 minutos. El número de tratamientos no está particularmente limitado, y puede realizarse, como
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2.
Preparación de lignocelulosa 2 (tratamiento con ácido sulfúrico diluido)
Como celulosa, se utilizó paja de arroz. La celulosa se sumergió en una solución acuosa al 1% de ácido sulfúrico, seguido por tratamiento en autoclave (fabricado por Nitto koatsu K.K.) a 150°C durante 30 minutos. Después del tratamiento, se realizó separación sólido-líquido para separar una solución acuosa de ácido sulfúrico (en lo sucesivo en el presente documento, líquido de tratamiento con ácido sulfúrico diluido) a partir de celulosa tratada con ácido sulfúrico. Posteriormente, celulosa tratada con ácido sulfúrico y el líquido de tratamiento con ácido sulfúrico diluido se mezclaron mediante agitación, de modo que la concentración de contenido sólido era el 10% en peso. Posteriormente, el pH se ajustó a aproximadamente 5 con hidróxido sódico. El producto resultante se utilizó en los siguientes ejemplos como lignocelulosa 2.
3.
Preparación de lignocelulosa 3 (tratamiento hidrotérmico)
Como celulosa, se utilizó paja de arroz. La celulosa anterior se sumergió en agua y se sometió a tratamiento en autoclave (fabricado por Nitto koatsu K.K.) a 180°C durante 20 minutos mientras se agitaba. En este tratamiento, la presión era 10 MPa. Después del tratamiento, el producto resultante se sometió a separación sólido-líquido mediante centrifugado (3000G) para separar el componente de solución (en lo sucesivo en el presente documento, la solución de tratamiento hidrotérmico) del componente de biomasa tratada. El componente de biomasa tratada resultante se utilizó en los siguientes ejemplos como lignocelulosa 3.
[Ejemplo 6] Hidrólisis de lignocelulosa utilizando la composición enzimática compuesta por una mezcla de celulasas derivadas de hongos filamentosos y la PfuBGL mutante glucosilada (1)
Los cambios de la cantidad de glucosa producida permitiendo a la composición enzimática actuar sobre el sustrato de lignocelulosa se compararon. Un tampón de acetato 50 mM (pH 5,0) en el que se suspendió lignocelulosa al 5% en peso 1 (preparada en el ejemplo de referencia 1) se utilizó como sustrato. Se dejó proseguir a la reacción hasta 28 horas a 50°C, y el producto de reacción se muestreó según era apropiado y se midió para conocer la concentración de glucosa (figura 6). Como mezcla de celulasas derivadas de hongos filamentosos, se utilizó celulasa disponible en el mercado derivada de Trichoderma reesei (Celluclast, Sigma). Como glucosidasa, se utilizaron, cada una, la PfuBGL mutante glucosilada preparada en el ejemplo 2 y PfuBGL preparada en el ejemplo comparativo 1. Se añadió celulasa a 0,5 mg/ml y se añadió glucosidasa a 0,005 mg/ml (1/100 de la cantidad de celulasa).
Comparando la utilización de PfuBGL y la utilización de la PfuBGL mutante glucosilada, la cantidad de glucosa producida por la PfuBGL mutante glucosilada después de 28 horas de reacción se incrementaba enormemente, y era 1,6 veces la cantidad producida por PfuBGL. Se reveló que la adición de la PfuBGL mutante glucosilada solamente en una cantidad de 1/100 la cantidad de celulasa era tremendamente eficaz para incrementar la cantidad de producción de glucosa.
[Ejemplo de referencia 2] Preparación de una celulasa derivada de Trichoderma
Una celulasa derivada de Trichoderma se preparó mediante el siguiente procedimiento.
1.
Precultivo
Las siguientes sustancias se añadieron a agua destilada en las cantidades indicadas a continuación; licor de maceración de maíz al 5% (p/vol), glucosa al 2% (p/vol), tartrato de amonio al 0,37% (p/vol), sulfato de amonio al 0,14% (p/vol), dihidrogenofosfato potásico al 0,2% (p/vol), cloruro cálcico dihidratado al 0,03% (p/vol), sulfato de magnesio heptahidratado al 0,03% (p/vol), cloruro de cinc al 0,02% (p/vol), cloruro de hierro (III) hexahidratado al 0,01% (p/vol), sulfato de cobre (II) pentahidratado al 0,004% (p/vol), cloruro de manganeso tetrahidratado al 0,0008% (p/vol), ácido bórico al 0,0006% (p/vol), y hexamolibdato de hexaamonio tetrahidratado al 0,0026% (p/vol). A continuación, 100 ml de la solución resultante se vertieron en un matraz triangular de 500 ml con un deflector y se esterilizaron autoclavando a 121°C durante 15 minutos. Después de refrigerar de forma natural, PE-M y Tween 80, que se esterilizaron, cada uno, autoclavando a 121°C durante 15 minutos, se añadieron, cada uno, al 0,1%. Al medio de precultivo resultante, se le inoculó Tricoderma reesei ATCC66589 a 1 × 105/ml, y se realizó el precultivo agitando a 28°C durante 72 horas a 180 rpm (agitador: BIO-SHAKER BR-40LF fabricado por Taitec Corporation).
2.
Cultivo principal
Las siguientes sustancias se añadieron a agua destilada en las cantidades indicadas a continuación; licor de maceración de maíz al 5% (p/vol), glucosa al 2% (p/vol), celulosa (Avicel) al 10% (p/vol), tartrato de amonio al 0,37% (p/vol), sulfato de amonio al 0,14% (p/vol), dihidrogenofosfato potásico al 0,2% (p/vol), cloruro cálcico dihidratado al 0,03% (p/vol), sulfato de magnesio heptahidratado al 0,03% (p/vol), cloruro de cinc al 0,02% (p/vol), cloruro de hierro
(III) hexahidratado al 0,01% (p/vol), sulfato de cobre (II) pentahidratado al 0,004% (p/vol), cloruro de manganeso tetrahidratado al 0,0008% (p/vol), ácido bórico al 0,0006% (p/vol) y hexamolibdato de hexaamonio tetrahidratado al
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