JP7007645B2 - 変異型ｂｘｌ１遺伝子を有するトリコデルマ属真菌及びそれを使用したキシロオリゴ糖とグルコースの製造方法 - Google Patents

変異型ｂｘｌ１遺伝子を有するトリコデルマ属真菌及びそれを使用したキシロオリゴ糖とグルコースの製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、β－キシロシダーゼ（ＢＸＬ１）活性が欠失した変異型ＢＸＬ１遺伝子を有するトリコデルマ属真菌及びそれを使用した、セルロース系バイオマスからキシロオリゴ糖とグルコースを製造する方法に関する。
キシロオリゴ糖は、キシロース単位がβ－グリコシド結合により複数個結合したオリゴ糖の総称である。キシロオリゴ糖は、優れた整腸作用を示すことなどから機能性食品用の素材としても用いられている（非特許文献１）。
キシロオリゴ糖は、セルロース系バイオマスに含まれるキシランを加水分解することで得ることができ、加水分解の方法としては、水熱処理する方法（非特許文献２）、酸加水分解する方法（非特許文献３）、酵素処理する方法（特許文献１）が知られている。
一方、バイオマスを酵素で加水分解する際に、糸状菌はセルロースやキシランを分解する酵素であるセルラーゼ生産能力が高いことから非常に適している。しかしながら、糸状菌の生産するセルラーゼをバイオマスに反応させるとキシロオリゴ糖は単糖のキシロースにまで分解されてしまうことが知られている。キシロオリゴ糖をキシロースに分解する酵素としては、β－キシロシダーゼが知られており、トリコデルマ・リーセイのβ－キシロシダーゼ１は二糖（キシロビオース）から七糖（キシロヘプトース）に反応し、キシロースを生成することが報告されている（非特許文献４）。
β－キシロシダーゼ１は、糖質加水分解酵素ファミリー３（ＧＨ３）に属している（非特許文献５）。ＧＨ３に属する酵素群には、高度に保存されている領域（ドメイン）が複数存在しているが、これらのうち、トリコデルマ・リーセイのβ－キシロシダーゼ１には、ＧＨ３のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインが含まれている。また、トリコデルマ・リーセイのβ－キシロシダーゼでは、２６４番目、３１１番目、４６４番目のアミノ酸残基が活性に必須的であると考えられている（非特許文献６，７）。その他、β－キシロシダーゼ１はこれらのドメインの他に、Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインを持つが、Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインの機能は明らかになっていない。
特許第４６７５１３９号
Ａｙｙａｐｐａｎ ＡＡら，Ｃｏｍｐｒｅ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ｓａｆ．１０，２－１６（２０１１） Ｐａｔｒｉｃｉａ Ｍら，Ｉｎｄ．Ｃｒｏｐｓ．Ｐｒｏｄ．６２，４６０－４６５（２０１４） Ｏｚｌｅｍ Ａら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３４４，６６０－６６６（２００９） Ｍ．Ｃ．Ｈｅｒｍａｎｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２１，３７５－３８１（１９９７） Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ ＥｎＺＹｍｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（http://www.cazy.org/GH3.html） ＬＥ Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４，５，８６９－８７６（２００６） Ｅ Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ－Ｃｌａｒｋら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２，１０，３８４０－３８４６（１９９６）
トリコデルマ・リーセイ属真菌由来のセルラーゼを使用するとキシランからキシロースにまで分解されてしまう課題があった。
本発明者らは鋭意検討した結果、β－キシロシダーゼ１のアミノ酸配列においてＧＨ３のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインを有し、Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインが破壊されたトリコデルマ属真菌を使用すると、β－キシロシダーゼ活性が欠失し、β－グルコシダーゼ活性が増加することを見出し、本発明に到った。
すなわち、本発明は以下の（１）～（９）を提供する。
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列から成るβ－キシロシダーゼ１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであってβ－キシロシダーゼ活性を持つポリペプチドにおける糖質加水分解酵素ファミリー３（ＧＨ３）のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインを有し、Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインを欠失し、かつβ－キシロシダーゼ活性が欠失した変異型β－キシロシダーゼ１をコードする変異型ＢＸＬ１遺伝子を有するトリコデルマ属真菌。
（２）前記変異型ＢＸＬ１遺伝子は、配列番号２に記載のアミノ酸配列から成るβ－キシロシダーゼ１におけるＧＨ３のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインを有し、Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインを欠失した変異型ポリペプチドをコードするものである（１）記載のトリコデルマ属真菌。
（３）前記Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインの欠失が、前記Ｃ末端ドメインよりも下流で前記Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインよりも上流の領域をコードする遺伝子領域内の塩基の欠失若しくは挿入によるフレームシフト、又は塩基の置換によるストップコドン変異によるものである、（１）又は（２）記載のトリコデルマ属真菌。
（４）前記トリコデルマ属真菌がトリコデルマ・リーセイである、（１）～（３）のいずれか１項に記載のトリコデルマ属真菌。
（５）（１）～（４）のいずれか１項に記載のトリコデルマ属真菌を培養する工程を含む、セルラーゼ組成物の製造方法。
（６）（５）記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物を回収する工程と、得られたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する工程を含む、グルコースとキシロオリゴ糖の製造方法。
本発明によれば、β－キシロシダーゼ１のアミノ酸配列において、ＧＨ３のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインを有し、かつＦｎ３－ｌｉｋｅドメインが欠失した変異型ＢＸＬ１をコードする遺伝子を有するトリコデルマ属真菌を使用することにより、β－キシロシダーゼ活性を欠失し、β－グルコシダーゼ活性を増加させることができる。さらに、そのトリコデルマ属真菌由来のセルラーゼ組成物を使用することで、グルコースとキシロオリゴ糖を効率良く製造することができる。
下記実施例において作製した、変異ＢＸＬ１遺伝子挿入のためのプラスミドの構造を示す図である。
本発明は、トリコデルマ属真菌のＢＸＬ１の機能未知ドメインであるＦｎ３－ｌｉｋｅドメインが欠失した変異型ＢＸＬ１をコードする遺伝子を有するトリコデルマ属真菌を使用することにより、β－キシロシダーゼ活性を欠失することができるという新知見に基づくものである。
本発明において用いるトリコデルマ属真菌は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属し、タンパク質を生産する能力を有していれば特に制限はない。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属するトリコデルマ属真菌は具体的にはトリコデルマ・ビレンス（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｅｎｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ガムシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｇａｍｓｉｉ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）が挙げられる。この中で好ましくはトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）である。また、トリコデルマ属に由来し、変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、タンパク質の生産性が向上した変異株を利用してもよい。好ましくはトリコデルマ・リーセイに由来する公知の変異株であるＱＭ６ａ株（ＮＢＲＣ３１３２６）、ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ３１３２９）、ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）、ＱＭ９１２３株（ＮＢＲＣ３１３２７）、ＲｕｔＣ－３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）、ＣＬ－８４７株（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０，３４１－３４６（１９８８））、ＭＣＧ７７株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｓｙｍｐ．８, ８９（１９７８））、ＭＣＧ８０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１２，４５１－４５９（１９８２））及びこれらの派生株などが挙げられる。
さらに、本発明で用いるトリコデルマ属真菌は、カーボン・カタボライト・リプレッションが解除されていることが好ましい。カーボン・カタボライト・リプレッションが解除されている株は、セルラーゼなどのタンパク質の生産量が向上しているため、より多くのタンパク質を生産することが可能になる。さらに好ましくは、カーボン・カタボライト・リプレッサ－Ｉを介してなされるカーボン・カタボライト・リプレッションが解除されている株であることが好ましい。例えばカーボン・カタボライト・リプレッサーI遺伝子（ｃｒｅ１）に変異が入って入ることによりカーボン・カタボライト・リプレッサ－Ｉを介してなされるカーボン・カタボライト・リプレッションが解除される。ｃｒｅ１遺伝子がコードするＣＲＥ１タンパク質はグルコースによるカタボライト・リプレッションにより、セルラーゼ遺伝子の発現を抑制することが知られている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ., ３７６, １０３－１０７, １９９５）。よってｃｒｅ１遺伝子に変異が入るとセルラーゼ遺伝子の発現抑制が解除され、セルラーゼの生産量が高まる。そのため、ｃｒｅ１遺伝子に変異が入った株はよりタンパク質やセルラーゼ組成物の製造に適する。具体的なカーボン・ｃｒｅ１遺伝子の変異の例としては、ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）のｃｒｅ１遺伝子において、２３２番目のＡがＣに置換され、その結果アミノ酸配列の７８番目のスレオニンがプロリンに置換されていることが挙げられる。この変異が入ることにより、セルラーゼの生産量が向上することが知られている（Ｂｉｏｓｃｉ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., ７７ （３）, ５３４－５４３，２０１３）。また、ＲｕｔＣ－３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）ではｃｒｅ１遺伝子が部分的に切断され、カーボン・カタボライト・リプレッションが解除されていることが知られている（ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ.,９, ３２７, ２００８）。ここでｃｒｅ１遺伝子に変異が入っている株とは、遺伝子変異剤、紫外線照射、などによりｃｒｅ１遺伝子領域内の塩基の欠失若しくは挿入によるフレームシフト、又は塩基の置換によるストップコドン変異、又は塩基の切断が入っている株を含み、さらに組換えなどによりｃｒｅ１遺伝子の全部又は一部を除去又は他の遺伝子と置換している株も含まれる。具体的には、ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）やＲｕｔＣ－３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）さらに、ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）やＲｕｔＣ－３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）の特徴を引き継いだ株が好ましく用いられ、さらに好ましくは、ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）または、ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）の特徴を受け継いだ株である。ここでＰＣ－３－７（ＡＴＣＣ６６５８９）やＲｕｔＣ－３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）の特徴を引き継いだ株には、ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）やＲｕｔＣ－３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）の特徴を引き継いだ株に新たに変異を加えた株や組換えにより機能を向上させた株も含まれる。
トリコデルマ・リーセイのＢＸＬ１のアミノ酸配列を配列番号２に示し、このアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号１に示す。本発明において、Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインを欠失させる前の親遺伝子として、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子を好ましく用いることができるが、配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであってβ－キシロシダーゼ活性を持つポリペプチドをコードする遺伝子も親遺伝子として利用可能である（以下、配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであってβ－キシロシダーゼ活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列を便宜的に「配列番号２類似アミノ酸配列」と呼ぶ）。ここで、二者のアミノ酸配列の配列同一性は、一致するアミノ酸の数が最も多くなるように配列を整列し、一致しているアミノ酸の数を全体のアミノ酸の数（全体のアミノ酸の数が異なる場合には長い方のアミノ酸の数）で除したものを百分率で表したものであり、BLASTのような周知のソフトにより容易に算出できる。同様に二者の塩基配列の配列同一性は、一致する塩基の数が最も多くなるように配列を整列し、一致している塩基の数を全体の塩基の数（全体の塩基の数が異なる場合には長い方の塩基の数）で除したものを百分率で表したものであり、BLASTのような周知のソフトにより容易に算出できる。
本発明のトリコデルマ属真菌は、β－キシロシダーゼ活性が欠失している。β－キシロシダーゼとはキシロースがβ－１，４－結合したキシロビオースを分解してキシロースを産生する酵素である。β－キシロシダーゼの酵素活性（Ｕ：ユニット）は、例えばｐ－ニトロフェニル－β－キシロピラノシド（ｐＮＰ－Ｘｙｌ）を基質として活性を測定することができる。本発明でβ－キシロシダーゼ活性が欠失した、とはＢＸＬ１遺伝子のＦＮ３－ｌｉｋｅドメインを欠失する前の親株に比べて、β－キシロシダーゼ活性が１０分の１以下に低下したことを指し、さらに好ましくは２０分の１以下、さらに好ましくは５０分の１以下、さらに好ましくは８０分の１以下、最も好ましくは１００分の１以下である。本発明では活性とは酵素液中に含まれるタンパク質１ｍｇ当たりのＵとして算出する。
本発明では、β－キシロシダーゼ活性の欠失はＢＸＬ１のＦｎ３－ｌｉｋｅドメインの欠失により行なわれる。配列番号２に示すアミノ酸配列から成るＢＸＬ１におけるＦｎ３－ｌｉｋｅドメインは、配列番号２の第６９５残基から第７５９残基までの領域を指す。配列番号２類似アミノ酸配列の場合には、配列番号２における第６９５残基から第７５９残基までの領域に対応する領域を指す。ここで、「対応する領域」とは、配列番号２のアミノ酸配列と配列番号２類似アミノ酸配列とを一致するアミノ酸の数が最も多くなるように配列を整列した場合に配列番号２の第６９５残基から第７５９残基までの領域に整列する領域を指す。配列番号１に示す塩基配列の場合の「対応する領域」も同様に、配列番号１の塩基配列と、もう一方の塩基配列とを一致する塩基の数が最も多くなるように配列を整列した場合に、配列番号１の塩基配列中の領域と整列される領域を意味する。なお、以下の説明では、トリコデルマ・リーセイのＢＸＬ１のアミノ酸配列を示す配列番号２のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１）に基づいて説明するが、これらの説明は、配列番号２類似アミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子の塩基配列についても当てはまるものであり、その場合には、配列番号２又は配列番号１中の特定の領域は、配列番号２類似アミノ酸配列又はそれをコードする塩基配列における対応する領域を意味する。
本発明ではＦｎ３－ｌｉｋｅドメインの欠失とは、そのドメインが全て無くなる、一部が無くなる、全てが異なるアミノ酸に変わる、一部が異なるアミノ酸に変わる、またはそれらの組み合わせのことを指す。さらに具体的には変異前の親（配列番号２又は配列番号２類似アミノ酸配列）のＦｎ３－ｌｉｋｅドメインのアミノ酸配列と配列同一性が８０％以下になることを指し、好ましくは５０％以下であり、さらに好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下であり、さらに好ましくは５％以下であり、さらに好ましくは３％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０％である。
Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインの欠失の方法としては、変異剤あるいは紫外線照射などによる変異処理、もしくは遺伝子組換えすることにより行なわれる。具体的にはＣ末端ドメイン（後述）よりも下流で前記Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインよりも上流の領域をコードする遺伝子領域（配列番号１に示すトリコデルマ・リーセイのＢＸＬ１遺伝子塩基配列では１９２９番目から２０８２番目まで）内の塩基の欠失若しくは挿入によるフレームシフト、又は塩基の置換によるストップコドン変異によるものである。あるいは、Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインの塩基配列内での塩基配列内の塩基の欠失、挿入によるフレームシフト、または塩基の置換によるストップコドン変異によるものである。また、遺伝子組換えでのＦｎ３－ｌｉｋｅドメインの欠失は、Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインのアミノ酸の一部あるいは全てが無くなるか変化するように行われる。
本発明の変異型ＢＸＬ１遺伝子は、Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインをコードする遺伝子配列は欠失しているが、糖質加水分解酵素ファミリー３（ＧＨ３）ＧＨ３のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインをコードする遺伝子配列を有している。ＧＨ３のＮ末端ドメインはＢＸＬ１（配列番号２）の８４残基から３７５残基までのことを指し、ＧＨ３のＣ末端ドメインはＢＸＬ１（配列番号２）の４１４残基から６４２残基までのことを指す。ＧＨ３のＮ末端ドメインとＣ末端度ドメインはβ－キシロシダーゼの活性に関与していると考えられており、前述した、β－キシロシダーゼの活性に関与しているとされる、２６４番目、３１１番目、４６４番目のアミノ酸残基も、ＧＨ３ファミリーのＮ末端領域またはＣ末端領域に含まれている。ドメインを有する、とはそのドメインのアミノ酸配列が配列番号２から全く変化しないことを指す。β－グルコシダーゼのアミノ酸配列に、Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインや、ＧＨ３ファミリーのＮ末端配列とＣ末端配列が保存されていることは、ＮＣＢＩ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）がオンラインで提供しているアミノ酸配列の解析ソフト“Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎｓ”（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?）を利用することによって、確認することができる。
本発明では、変異型ＢＸＬ１遺伝子を有するトリコデルマ属真菌は、遺伝子組み換えの手法や、遺伝子変異処理などを用いた非組換えの手法を用いて得ることができる。具体的には、ＮＴＧ処理などで変異処理を行ない、生育してきたコロニーを培養し、ｐ－ニトロフェニル－β－キシロピラノシドの分解活性を測定し、活性が低下した株を取得することで、変異ＢＸＬ１遺伝子を有するトリコデルマ属真菌を得ることができる。
非組換え体を使用して製造する場合には、組換え体を使用して製造する際に必要な拡散防止処置を行わずに済むメリットがある。
本発明では、本発明のトリコデルマ属真菌を培養するとセルラーゼ組成物を得ることできる。得られたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解し、グルコースとキシロオリゴ糖の製造することができる。
本発明におけるセルラーゼ組成物とは、β－１，４－グルカンのグリコシド結合を加水分解する種々の加水分解酵素の混合物である。セルラーゼ組成物に含まれる加水分解酵素とは例えば、セロビオハイドラーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、β－キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、キシランエステラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、α－グルクロニダーゼ、キトサナーゼ、キチナーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼなどが挙げられる。
本発明で得られるセルラーゼ組成物は、上記の加水分解酵素のうち、β－キシロシダーゼ活性が欠失しており、β－グルコシダーゼ活性が増加している。
β－グルコシダーゼは、グルコースがβ－１，４－結合したセロビオースを分解してグルコースを産生する酵素である。β－グルコシダーゼの酵素活性（Ｕ：ユニット）は、例えばｐ－ニトロフェニル－β－グルコピラノシド（ｐＮＰ－Ｇｌｕ）を基質として活性を測定することができる。本発明でβ－グルコシダーゼ活性が増加した、ＢＸＬ１遺伝子のＦｎ３－ｌｉｋｅドメインを欠失する前の親株と比べてβ－グルコシダーゼ活性が０．２％以上に増加したことを指し、さらに好ましくは０．５％以上、さらに好ましくは１％以上、さらに好ましくは２％以上である。
本発明では、トリコデルマ属真菌の培養方法については特に限定はないが、セルラーゼ組成物が生産される方法であれば良く、トリコデルマ属細菌の周知の培養方法を採用することができる。使用する培地に含まれる炭素源および誘導剤としてはバイオマスが好ましく使用される。窒素源としては、例えば、ポリペプトン、肉汁、CSL、大豆かすなどが用いられる。その他、この培地には目的とするセルラーゼを生産する上で必要とされる成分を添加することができる。培養には、振とう培養、撹拌培養、撹拌振とう培養、静置培養、連続培養など、様々な培養方式を採用しうるが、好ましくは、振とう培養または撹拌培養である。培養温度は、通常、２０℃～３５℃、好ましくは２５℃～３１℃であり、培養時間は、通常、３～１０日、好ましくは４～９日である。
本発明において培養時にはセルラーゼ組成物量を増加させるために誘導剤を添加しても良い。使用される誘導剤は特に限定はないが、バイオマスが好ましく使用される。本発明においてバイオマスは、再生可能な生物由来の有機性資源である。また、バイオマスの中でもセルロースとキシランを含むバイオマスが好ましく使用され、具体的には、パルプ、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンハル、稲わら、麦わらなどの草本系バイオマス、樹木、廃建材などの木質系バイオマスなどを例として挙げることができる。これらの誘導剤は培養液に添加しやすいように、処理がされていても良い。具体的な処理方法には、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界処理、微粉砕処理、蒸煮処理など公知の手法を用いることができる。
誘導剤であるバイオマスに含まれるキシラン含有量は、特に限定はされないがバイオマス固形分重量に対して５重量％以上が好ましく、より好ましくは１０重量％以上、さらに好ましくは２０％重量以上である。バイオマスに含まれるセルロース含有量、キシラン含有量の測定方法は特に限定されないが、具体的には以下の方法で測定することができる。まず、測定したいバイオマス試料を風乾後ウィレーミルなどにより粉砕し、適量を分取し、１０５℃で乾燥後の重量減から水分率（ｗｔ％）を算出する。その後、試料の適量（約０．３ｇ）を天秤ではかりとり、７２％硫酸３ｍＬを加え、３０℃でときどき攪拌しながら１時間放置する。この反応液を精製水８４ｍＬと混合した後、１２０℃で１時間オートクレーブで加熱分解する。加熱分解後、分解液と残渣をろ別し、ろ液と残渣の洗液を加えて１００ｍＬにメスアップし、高速液体クロマトグラフ法により単糖（グルコース、キシロース等）の定量を行う。得られた単糖濃度（グルコース、キシロース）と、試料分解量（水分率から無水ベース重量を算出）から、試料中の含有量（セルロース、キシラン）を算出する。
本発明において誘導剤として使用するバイオマスの量は特に制限はされないが、５重量％から２０重量％が好ましく、より好ましくは８重量％から１５重量％であり、さらに好ましくは８重量％から１２重量％である。
本発明で製造されたセルラーゼ組成物の使用方法は特に限定されないが、糖の製造に好ましく使用される。さらに好ましくはキシロオリゴ糖の製造に使用され、さらに好ましくはキシロオリゴ糖とグルコースの製造に使用される。
本発明における「キシロオリゴ糖」とは、少なくともキシロースが２個以上β－グリコシド結合で連結したキシロオリゴ糖のことを指す。キシロオリゴ糖の重合度は、特に限定されないが、水溶性が高い２糖（キシロビオース）から６糖（キシロヘキサオース）であることが好ましい。最も好ましくは、腸内細菌が炭素源として資化しやすい、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオースを含むことが好ましい。
本発明においてセルラーゼ組成物はトリコデルマ属真菌を培養して得られ、バイオマスの糖化反応に使用される。セルラーゼ組成物の調整方法は特に限定はされないが、培養液に含まれるトリコデルマ属真菌の菌体が除去、もしくは生育していないことが好ましい。これはセルラーゼ組成物とバイオマスを糖化反応する際に生じるグルコースやキシロオリゴ糖が菌体により消費されるのを防ぐためである。菌体の除去方法としては、遠心分離、膜分離などが例として挙げられる。菌体が生育しないようにする処理方法としては、熱処理、薬剤処理、酸・アルカリ処理、ＵＶ処理などが挙げられる。
次に本発明における加水分解反応について説明する。加水分解反応に使用するバイオマスはセルロースおよびキシランを含むバイオマスであれば特に限定はされず、種子植物、シダ植物、コケ植物、藻類、水草などの植物の他、パルプ、廃建材なども用いることができる。種子植物は、裸子植物と被子植物に分類されるが、どちらも好ましく用いることができる。裸子植物の具体例としては、ソテツ、イチョウ、マツ、モミ、トウヒ、スギなどが挙げられる。被子植物はさらに単子葉植物と双子葉植物に分類されるが、単子葉植物の具体例としては、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わらなどが挙げられ、双子葉植物の具体例としては、ビートパルプ、ユーカリ、ナラ、シラカバなどが好ましく用いられる。
これらのセルロースおよびキシランを含むバイオマスは、加水分解反応が進みやすいように前処理されていてもよい。前処理方法としては、特に限定されないが、具体的には、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界処理、微粉砕処理、蒸煮処理など公知の手法を用いることができる。また、反応ｐＨに関しても特に限定はされないが、ｐＨが３から７付近が好ましく、より好ましくは４から６であり、より好ましくは５付近である。反応温度についても特に限定はされないが、４０℃から７０℃が好ましい。また、反応に使用するセルラーゼ組成物の量についても特に限定はされない。また、反応時間についても特に限定はされない。
本発明の糖化反応から製造される反応後液には、キシロオリゴ糖とグルコースのほかに、セルラーゼ組成物に含まれる加水分解酵素によって生じたマンノース、アラビノース、ガラクトースなどの単糖や、セロビオース、セロテトラオース、マンノビオース、ガラクトビオースなどのオリゴ糖などが含まれていてもよい。
本発明の糖化反応から製造される反応後液には、不純物として、無機塩、アミノ酸、タンパク質、リグニンなども含まれていてもよく、またこれらの不純物を除去するために、精製操作を行ってもよい。精製操作としては、イオン交換、膜分離、晶析、脱塩など公知の手法が適用できる。
本発明により製造された単糖画分（グルコース、キシロース等）とキシロオリゴ糖等画分は後工程により分離されることが好ましい。グルコースは発酵原料として化学品の製造に好ましく使用され、キシロオリゴ糖は飼料や食品、化粧品用途に好ましく使用される。化学品の具体例としては、エタノール、１，３－プロパンジオール、１，４－ブタンジオール、グリセロールなどのアルコール、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸などの有機酸、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、カダベリンなどのアミン化合物を挙げることができる。
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１ タンパク質濃度測定方法
市販のタンパク質濃度測定試薬（Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ製）を使用した。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬２５０μＬに希釈した糸状菌由来セルラーゼ溶液を５μＬ添加し、室温で５分間静置後の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。標準品としてＢＳＡを使用し、検量線に照らし合わせてタンパク質濃度を算出した。
参考例２ β－キシロシダーゼ活性測定方法
β－キシロシダーゼ活性測定方法は具体的には１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－キシロピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ中で酵素希釈液１０μＬを用いて３０℃で反応を行い、３０分後に２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義した。ブランクは １ｍＭｐ-ニトロフェニル-β-キシロピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合し、その後酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。
参考例２ β－グルコシダーゼ活性測定方法
β－グルコシダーゼ活性測定方法は具体的には１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ中で酵素希釈液１０μＬを用いて３０℃で反応を行い、１０分後に２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義した。ブランクは １ｍＭｐ-ニトロフェニル-β-グルコピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合し、その後酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。
参考例３ セロビオハイドロラーゼ活性測定方法
セロビオハイドロラーゼ活性測定方法は具体的には１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬ中で酵素希釈液１０μＬを用いて３０℃で反応を行い、６０分後に２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義した。ブランクは １ｍＭｐ-ニトロフェニル-β-ラクトピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合し、その後酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。
参考例４ 糖濃度の測定
キシロオリゴ糖、グルコース、キシロースは、日立高速液体クロマトグラフ ＬａＣｈｒｏｍ Ｅｉｔｅ（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて、以下の条件で定量分析した。キシロオリゴ糖であるキシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、キシロヘキサオース、およびグルコース、キシロースの標品で作製した検量線をもとに、定量分析した。なお、本実施例で記すキシロオリゴ糖とは、キシロース単位がβグリコシド結合により２～６個結合したキシロオリゴ糖を指す。
カラム：ＫＳ８０２、ＫＳ８０３（Ｓｈｏｄｅｘ）
移動相：水
検出方法：ＲＩ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：７５℃
比較例１ トリコデルマ・リーセイ ＰＣ－３－７株のＢＸＬ１遺伝子破壊組み換え株の作製
相同組み換えで目的遺伝子を破壊する方法としては、マーカー遺伝子を含むＤＮＡの上流及び下流に、導入目的箇所に相同的な部分を付加するようにデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片を糸状菌に形質転換する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
形質転換は、標準的な方法（プロトプラスト－ＰＥＧ法）で行った。宿主はＰＣ－３－７株を使用し、マーカーはアセトアミドダーゼ（ＡｍｄＳ）遺伝子を使用した。
得られた形質転換体へＡｍｄＳ遺伝子導入の確認は、ＰＤＡ培地で培養した形質転換株から、ゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲにより行った。ＰＤＡ培地の組成はＤｉｆｃｏ ポテトデキストロースブロース（ＢＤ社） ２４ｇ／Ｌである。その結果、形質転換体において、ＢＸＬ１遺伝子とＡｍｄＳ遺伝子カセットが置換されていることが確認された。前記工程で得られた、ＢＸＬ１座にＡｍｄＳ遺伝子カセットが導入されたＰＣ－３－７株を、以下、ＰＣ－３－７／△ＢＸＬ１株と称す。この株はＢＸＬ１遺伝子のＯＲＦの３つのドメインを全て失った株である。
実施例１ 変異ＢＸＬ１をコードする遺伝子を有するトリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株の作製
変異ＢＸＬ１遺伝子として配列番号３の塩基配列を使用した。この変異ＢＸＬ１遺伝子はトリコデルマ・リーセイのＢＸＬ１遺伝子（配列番号１）の１９４０番目と１９４１番目の塩基配列が欠失し、その後のアミノ酸配列がフレームシフトしている塩基配列である。この変異ＢＸＬ１遺伝子がコードするアミノ酸配列と配列番号２のＦｎ３－ｌｉｋｅドメインのアミノ酸配列との相同性は０％であった。この変異ＢＸＬ１遺伝子は、人工合成により作成した。
変異ＢＸＬ１遺伝子を含むＤＮＡを染色体中のＢＸＬ１遺伝子のプロモーターの下流に相同組み換えで挿入する方法としては、変異ＢＸＬ１遺伝子を含むＤＮＡの上流及び下流に、導入目的箇所に相同的な部分を付加するようにデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片を糸状菌に形質転換する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
形質転換は、標準的な方法（プロトプラスト－ＰＥＧ法）で行った。宿主はＰＣ－３－７株を使用し、マーカーはアセトアミドダーゼ（ＡｍｄＳ）遺伝子を使用した。図1に分子生物学的操作により作製した変異ＢＸＬ１遺伝子挿入のためのプラスミドを示す。このプラスミドは変異ＢＸＬ１遺伝子（配列番号３）を含み、その後にＢＸＬ１遺伝子の終始コドンの下流５００ｂｐを含んでいる。さらに、アセトアミダーゼ遺伝子カセットと、ＢＸＬ１遺伝子の下流５０１ｂｐから約２.５ｋｂに相同な遺伝子配列も含まれている。このプラスミドから変異ＢＸＬ１遺伝子挿入カセットをＰＣＲで増幅し、組換えに使用した。より具体的には、形質転換方法はＧｅｎｅ，６１，１６５－１７６（１９８７）に記載されたようにして行った。また、変異ＢＸＬ１遺伝子挿入カセットのＰＣＲによる増幅はデザインしたプライマー（配列番５号、配列番号６）を使用して行った。
得られた形質転換体への目的遺伝子導入の確認は、ＰＤＡ培地で培養した形質転換株から、ゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲにより行った。具体的には、デザインしたプライマー（配列番号７、配列番号８）を使用して確認した。その結果、形質転換体において、変異ＢＸＬ１遺伝子カセットがＢＸＬ１遺伝子の開始コドンから導入されていることが確認された。得られたＰＣ－３－７株を、以下、ＰＣ－３－７／変異ＢＸＬ１株と称す。
比較例２ トリコデルマ・リーセイ ＰＣ－３－７株由来セルラーゼ組成物の作製
前培養
トリコデルマ・リーセイ ＰＣ－３－７株の胞子を１．０×１０７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液２．５ｍＬを１Ｌバッフル付フラスコに入れた表１に記した組成で構成される前培養液２５０ｍＬへ接種させた。接種させた前培養液を２８℃、１６０ｒｐｍの培養条件にて３日間培養を行った。
Figure 0007007645000001
＊微量元素溶液は、０．３ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、１．３ｇ／Ｌ （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１０ｇ／Ｌ ＺｎＣｌ２を含む。
＊＊マンデルスは、７ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、３ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む。
本培養
トリコデルマ・リーセイ ＰＣ－３－７株の前培養液２５０ｍＬをそれぞれ５Ｌ容ミニジャーに入れた表２に示した本培養液２．５Ｌ（バイオマス２５０ｇをさらに含む）へ接種させ、２８℃、７００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５の培養条件にて５日間培養を行った。中和は１０％アンモニアと１Ｎ硫酸を使用した。バイオマスは、Ａｒｂｏｃｅｌ(登録商標)（Ｊ．Ｒｅｔｔｅｎｍａｉｅｒ＆Ｓｏｈｎｅ）を使用した。
Figure 0007007645000002
＊微量元素溶液は、０．３ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３、１．３ｇ／Ｌ （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１０ｇ／Ｌ ＺｎＣｌ２を含む。
＊＊マンデルスは、７ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、３ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２、３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む。
＊＊＊Ａｒｂｏｃｅｌは他成分を混合し、メスアップした後に添加する。
培養液の採取
培養開始より２日おきに５００μＬずつ培養液を採取した。そして、１５，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、そのろ液を培養上清液とした。酵素活性測定、糖化反応には培養５日目の培養上清液を使用した（表３）。
Figure 0007007645000003
比較例３ トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７／△ＢＸＬ１株由来セルラーゼ組成物の作製
トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７／△ＢＸＬ１株を使用すること以外は比較例２と同様に行い、培養５日目の培養上清液を酵素活性測定、糖化反応に使用した（表３）。その結果、β－キシロシダーゼ活性が親株のＰＣ－３－７株よりも顕著に減少していた。
実施例２ トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７／変異ＢＸＬ１株由来セルラーゼ組成物の作製
トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７／変異ＢＸＬ１株を使用すること以外は比較例２と同様に行い、培養５日目の培養上清液を酵素活性測定、糖化反応に使用した（表３）。その結果、β－キシロシダーゼ活性がトリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７／△ＢＸＬ１株と同等にまで減少していることが判明した。さらにトリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７／△ＢＸＬ１株よりもβ－グルコシダーゼ活性が増加していることが判明した。
比較例４ トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株由来セルラーゼ組成物を使用した糖化反応によるキシロオリゴ糖とグルコースの製造
比較例２で得られたろ液を使用して糖化反応を行った。糖化反応に使用したバガスはアルカリ処理（前処理）を行ったバガスを使用した。糖化反応は以下のようにして行った。２ｍＬチューブの中にアルカリ処理をしたバガスを乾燥重量５０ｍｇ分入れ、バガスの固形分濃度が反応開始時に５重量％となるように純水を加えつつ、希塩酸を用いてｐＨ５．０に調整した。ｐＨを調製した前処理物に８ｍｇ／ｇ－バイオマスになるようにセルラーゼ組成物を添加して、ヒートブロックローテーターを用いてｐＨ５．０、５０℃の反応条件で反応を開始した。反応中は適宜ｐＨ５になるように調整を行った。８時間後に９９度の湯浴に５分間浸けて反応を停止した。反応液は８，０００×ｇの条件下で５分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、そのろ液を参考例５に従いキシロオリゴ糖とグルコースの分析に供した（表４）。
Figure 0007007645000004
比較例５ トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７／△ＢＸＬ１株由来セルラーゼ組成物を使用した糖化反応によるキシロオリゴ糖とグルコースの製造
比較例３で得られたろ液を使用して糖化反応を行った。糖化反応は比較例４と同様に行った（表４）。その結果、親株のＰＣ－３－７株よりもキシロオリゴ糖の収量が顕著に増加していた。
実施例３ トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７／変異ＢＸＬ１由来セルラーゼ組成物を使用した糖化反応によるキシロオリゴ糖とグルコースの製造
実施例２で得られたろ液を使用し、比較例４と同様に糖化反応を行った（表４）。その結果、トリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７／△ＢＸＬ１株のろ過液と同等のキシロオリゴ糖収量を得ることが判明し、さらにグルコースの収量が増加していることが判明した。
ＢＸＬ１遺伝子のＦｎ３－ｌｉｋｅドメインを欠失することでβ－キシロシダーゼ活性を欠失することができる。さらにＢＸＬ１遺伝子の３つのドメインを全て破壊した株と比較してβ－グルコシダーゼ活性が増加し、キシロオリゴ糖とグルコースを効率良く製造することができる。

Claims (6)

  1. 配列番号２に記載のアミノ酸配列から成るβ－キシロシダーゼ１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成るポリペプチドであってβ－キシロシダーゼ活性を持つポリペプチドにおける糖質加水分解酵素ファミリー３（ＧＨ３）のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインを有し、Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインを欠失し、かつβ－キシロシダーゼ活性が欠失した変異型β－キシロシダーゼ１をコードする変異型ＢＸＬ１遺伝子を有するトリコデルマ属真菌。
  2. 前記変異型ＢＸＬ１遺伝子は、配列番号２に記載のアミノ酸配列から成るβ－キシロシダーゼ１におけるＧＨ３のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインを有し、Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインを欠失した変異型ポリペプチドをコードするものである請求項１記載のトリコデルマ属真菌。
  3. 前記Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインの欠失が、前記Ｃ末端ドメインよりも下流で前記Ｆｎ３－ｌｉｋｅドメインよりも上流の領域をコードする遺伝子領域内の塩基の欠失若しくは挿入によるフレームシフト、又は塩基の置換によるストップコドン変異によるものである、請求項１又は２記載のトリコデルマ属真菌。
  4. 前記トリコデルマ属真菌がトリコデルマ・リーセイである、請求項１～３のいずれか１項に記載のトリコデルマ属真菌。
  5. 請求項１～４のいずれか１項に記載のトリコデルマ属真菌を培養する工程を含む、セルラーゼ組成物の製造方法。
  6. 請求項５記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物を回収する工程と、得られたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する工程を含む、グルコースとキシロオリゴ糖の製造方法。
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